Summary
여기서는 마이크로 엑스레이 계산단층 촬영을 사용하여 뮤린 뒷다리 혈관에 대한 시각화 및 정량화 방법을 설명합니다.
Abstract
혈관은 나무와 같은 구조가있는 복잡한 네트워크이며 혈관 네트워크는 순환을 유지하고 장기 기능을 유지하는 데 필수적입니다. 따라서 혈관 형성의 메커니즘을 명확히하는 것은 발달 과정과 병리학 적 메커니즘을 해명하는 데 매우 유용합니다. 뮤린 뒷사지 혈관은 종종 생리학적 및 병리학 적 혈관 신생을위한 모델로 사용됩니다. 평가는 주로 조직 섹션을 사용하여 2차원 방법을 통해 수행됩니다. 그러나, 3차원(3D) 혈관 형태학을 평가하는 방법은 특히 제한적이다. 이 백서는 컴퓨터 단층 촬영(CT)을 사용하여 뮤린 뒷다리를 시각화하는 방법을 소개합니다. 방사선 불투명 수지는 내림차장 대어를 통해 주입되고, 전체 혈관은 염료로 채워집니다. 염료 주입 시간을 조정함으로써 동맥별 충진도 가능하며, 임의의 마이크로 X선 CT 장치로 샘플을 얻을 수 있다. 이 조영 방법은 하부 사지에서 뮤린 혈관의 3D 평가를 위한 기본 기술을 제공한다. 더욱이, 이 방법은 횡격막 의 밑에 있는 모든 혈관을 구상하고 복부 기관에 있는 혈관을 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다.
Introduction
혈관은 나무와 같은 구조가있는 복잡한 네트워크입니다. 혈관 신생 및 새로운 혈관 형성은 장기 항상성의 유지 보수에 필수적인 역할을한다1. 혈관 신생은 허혈성 및 악성 질환의 치료를 위해 조절된다2. 따라서 혈관 신생의 기본 메커니즘을 이해하는 것이 필수적입니다. Murine 뒷사지 혈관은 종종 혈관 연구를위한 유용한 모델로 사용된다3; 일강 또는 대퇴 동맥의 ipsilateral 결찰은 생리학적 및 병리학 적 혈관 신생에서 혈관 신생 및 혈관 리모델링을 평가하는 데 사용되는 알려진 뒷사지 허혈 모델이다4. 그러나, 혈관신생의 평가는 주로 단면 염색에 의해 수행되며, 3D 혈관 형태평가를 평가하는 방법은 특히 제한적이다.
섹션 염색과 비교하여 CT는 3D 시각화를 가능하게 합니다. 최근 Weyers 외는 CT 이미징에 적합한 정교한 프로토콜을 보고하여 뮤린 성 관상 동맥 순환 계통5의 시각화를 가능하게 했다. 우리는 하부 사지 혈관6의 CT 이미징에 적합한 샘플 준비 방법을 만들기 위해 그들의 방법을 수정하였다. 여기서, 방사능 불투명 수지는 내림차순 대오르를 통해 주입되고, 하부 사지에 있는 혈관은 염료로 채워집니다. 염료 주입 시간을 조정함으로써 동맥별 충진도 가능하며, 임의의 마이크로 X선 컴퓨터 단층 촬영 장치로 샘플을 얻을 수 있다. 이 대비 방법은 횡격막 아래와 복부 장기 및 하부 사지에서 뮤린 혈관의 3D 평가를위한 기본 기술을 제공합니다.
Protocol
모든 절차는 구마모토 대학 동물 관리 지침에 따라 수행되었다 (승인 참조 없음. M30-040/A2020-105, 실험실 동물의 치료 및 사용에 대 한 건강 가이드의 미국 국립 학회에 따라 (간행물 번호 85-23, 개정 2011).
1. 준비
- 관혈 장치 및 혈관 확장제 버퍼(4 mg/L 파파베린 염산염, 4 g/L; 아데노신, 1 g/L; 헤파린, 인산완충식식(PBS)의 U/mL 1)을 준비한다.
참고: 역류 장치 및 혈관 확장제 시약은 Weyers 외.5에 의해 보고된 것과 동일합니다. - 22 G 카테터, 2mL 확장 튜브 및 3 방향 스톱콕 (그림 1A)을 연결합니다.
참고: 동물의 크기에 따라 게이지를 조정합니다. 성인 C57BL/6 마우스의 경우 22G가 최적입니다. - 혈관 확장제 버퍼(도 1A)로 압력 관류 장치를 채웁니다.
참고: 콘트라스트 배지의 충전을 방지하기 위해 거품의 형성을 피하십시오.
2. 관류
- PBS에 U/g 헤파린 1개를 주입하여 수술 30분 전에 복막 내 구멍에 넣습니다.
- 완전히 이소플루란으로 마우스를 마취하고 자궁 경부 탈구로 안락사.
- 참수 후 흉골에 중간 선 절개를하고 핀으로 열린 흉부를 수정합니다.
참고: 대비의 누출을 피하려면 다이어프램을 손상시키지 마십시오. - 오름차순 대자를 잘라 마음을 제거합니다.
- 폐를 제거하고 내림차순 대어를 노출합니다.
참고 : 내림차순 대어를 다치게하지 마십시오. - 내림차순 대동맥을 대각선으로 잘라 단면을 노출시니다(도 1B).
참고 : 대마를 벗기지 마십시오. 대각선 단면도는 카테터 삽입에 더 좋습니다. - 혈관 확장 버퍼를 실행하는 동안 내림차순 대어에 22 G 카테터를 삽입합니다.
참고: 혈관 확장 버퍼를 실행하는 동안 카테터를 삽입하여 공기 오염을 방지합니다. - 카테터의 루트를 고정합니다(그림 1C).
- 역류로 인한 누출을 방지하기 위해 매듭을 만듭니다.
- 13~15kPa 사이의 고정 압력에서 3분 동안 온난한 혈관 확장 용액(파파베린 염산염, 4g/L; 아데노신, 1g/L; 헤파린 1개 U/mL)을 3분 동안 퍼퓨즈합니다.
- 3 분 동안 (PBS)에서 4 % 파라 포름 알데히드의 용액을 Perfuse.
참고: 고정의 성공은 발의 움직임에 의해 확인할 수 있습니다(도 1D). - 관류 직전에 대비 배지를 준비합니다.
참고: 샘플에 따라 희석속도를 조정하는 행위 성인 마우스의 경우 얼룩과 희석제를 1:1의 비율로 섞습니다. - 관류를 중지하고 희석 된 콘트라스트 배지의 2 mL로 연장 튜브를 채웁니다 (도 1E).
참고: 대조 매체는 혈관에 손상을 피하기 위해 천천히 주입되어야 합니다. - 13~15kPa 사이의 고정 압력으로 대비 배지를 퍼퓨즈한다.
- 동맥을 시각화하려면 발톱을 확인하여 대조 매체가 동맥에 도달했는지 확인합니다(도 1F).
- 모든 혈관을 시각화하려면 다이어프램의 열등한 베나 카바를 확인하여 콘트라스트 매체의 완전한 순환을 확인하십시오.
참고: 처음에는 콘트라스트에 혈관 확장 솔루션이 포함되어 있습니다. 따라서 적절한 순환이 필수적입니다.
- 3방향 스톱콕을 닫고 튜브를 제거합니다(그림 1G).
참고: 3방향 스톱콕이 닫히지 않으면 대비가 뒤로 흐르게 됩니다. - 샘플을 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- 피부를 제거하고 10 % 포름 알데히드 용액으로 고정하십시오.
3. 시각화
참고: 시각화 프로토콜은 CT 스캐너에 따라 다릅니다. 이 프로토콜에는 마이크로포커스 X-ray CT 스캐너가 사용되었습니다. 각 CT 스캐너에 따라 이미징 방법을 최적화해야 합니다.
- PBS를 포함하는 50 mL 튜브에서 샘플을 수정합니다.
- 샘플 튜브를 테이블에 놓습니다.
- 50kV의 전압과 600 μA의 전류로 샘플을 스캔하여 75.2mm의 초점-센터 거리를 보장합니다.
참고: 복셀 1의 치수는 이 설정에서 28.7 μm x 28.7 μm x 28.7 μm x 28.7 μm이었다. - 생물학적 이미지 분석을 위한 오픈 소스 플랫폼인 피지(Fiji)로 획득한 이미지 데이터를 로드합니다.
- 위트락혈증 근육을 사용하여 근육 복셀 값을 결정합니다.
- 직사각형 도구를 사용하여 위트로테뉴근육을 선택합니다.
- 히스토그램의 평균 및 표준 편차(SD)를 확인합니다(| 분석 히스토그램).
- 위트락혈증 근육의 평균 + 2SD로 근육 복셀 밀도를 정의합니다.
- 근육 복셀 밀도를 낮은 임계값 수준으로 설정합니다(이미지 | 조정할 | | 임계값 | | 설정 낮은 임계값 수준).
참고: 혈관 영역과 뼈 영역은 임계값을 설정한 후에도 바이나드된 데이터에 남아 있습니다.
Representative Results
이 프로토콜이 올바르게 수행되는 경우 하부 사지의 모든 선박을 시각화할 수 있습니다(그림 2A). 뒷사지 허혈 모델에서, 비계 대퇴동맥은 대퇴정맥(도 2B)과 평행하게 실행되며, 회개한 대퇴동맥은 대조의 매체(도 2C)의 중단에 의해 확인할 수 있다. 그 결과 부수적 선박의 개발(그림 2D)이 나타났습니다. 부수적 인 순환은 공래 동맥과 하부 다리 부위의 동맥및 대퇴 동맥의 복부 및 등쪽 측면에 근접성 사이에 형성됩니다. 골반의 등쪽 쪽에 열등한 둔부 동맥 시작과 허벅지의 측면에서 실행 - 허혈성 측에 강력하게 확장.
대비로 채워진 용기는 콘트라스트 배지(도 2E)로 채워져 있습니다. 대조적으로 중단은 비대조성 매체(예: 혈액, 혈관 확장제 버퍼 또는 거품)의 혼합 또는 콘트라스트의 불충분한 관류(도 2F)를 나타낸다. 혈관 확장 및 고정 은 혈관이 축소 된 경우 잘 작동하지 않을 것입니다. CT 이미징은 콘트라스트 배지만 시각화할 수 있지만, 거시적 또는 입체적 관찰(도 2G)에 의해 신체 표면의 동맥을 볼 수 있다. 따라서, 콘트라스트 배지를 사용하여 결함을 평가하기가 더 용이하다(도 2H).
도 1: 절차의 개요. (A) 압력 관류 장치 및 22 G 카테터는 2 mL 확장 튜브 및 3 방향 스톱콕을 통해 연결됩니다. (B) 오름차순 대동맥은 단면(노란색 화살표)을 노출시키기 위해 대각선으로 절단된다. (C) 카테터는 두 개의 핀(노란색 화살표)을 사용하여 고정되었습니다. (D) 고정된 하반신은 고정(노란색 화살표)에 따라 확장됩니다. (E) 3 방향 스톱콕을 통해 대비의 주입. 사출 방향은 노란색 화살표로 표시됩니다. (F) 뒷사지 손톱은 대비(노란색 화살표)로 채워져 있습니다. (G) 스톱콕은 관혈 장치에서 닫혀 제거된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 선박의 이미지입니다. (A) 뒷다리 뼈와 혈관의 전체 이미지. (B) 대퇴동맥(적색 화살표) 및 정맥(파란색 화살표). (C) 대퇴동맥(노란색 화살표)을 계회합니다. 주변은 장애물(노란색 점선)에 의해 중단됩니다. (D) 계측측(노란색 화살표)의 부수적 인 혈관. 노란색 점선은 중단된 대퇴동맥을 나타냅니다. (E) 사페누스 동맥 (적색 화살표) 및 정맥 (파란색 화살표)의 잘 채워진 샘플. (F) 부적당한 관류는 사페누스 혈관 (노란색 점선)의 중단으로 이어집니다. (G) 대표적인 샘플의 스테레오현미경 관찰. 오른쪽 대퇴동맥(노란색 화살표)은 대비 가미로 채워져 있습니다. (H) 실패한 시료의 스테레오 현미경 관찰. 오른쪽 대퇴동맥(노란색 화살표)에는 대비가 부족합니다. 스케일 바 = 1mm(B-F), 2mm(G, H), 10mm(A). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 보고서는 하체에서 혈관을 시각화하는 정교한 방법을 소개합니다. 이 과정에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다: 첫 번째는 콘트라스트 배지의 주입 전에 프리퍼퓨전입니다. 충분한 혈액이 제거되지 않으면 콘트라스트가 시스템을 채우지 않습니다. 또한 기포가 포함되면 대비가 충만됩니다. 따라서 회로의 공기는 완전히 제거되어야 합니다. 더욱이, 콘트라스트 배지는 주입 직후에 응고되지 않기 때문에, 샘플을 과도하게 이동해서는 안 된다.
이 방법은 부수적 인 순환과 같은 혈관 및 순환의 증가 된 형성을 평가하는 데 유용합니다. 반대로, 협착증과 항암형 배지의 인위적 감소를 구별하는 것은 어렵기 때문에 좁은 혈관을 평가하기는 어렵다. 또한, 혈액과 뼈의 분리가 어렵기 때문에 뼈에서 혈관을 평가하는 것은 어렵습니다.
3D 시각화를 위한 또 다른 방법은 면역염색입니다. 조직 정리 기술을 사용하여 3D 이미징7에 여러 가지 방법을 사용할 수 있습니다. 면역 염색은 항체를 사용하여 특정 단백질의 염색을 허용하기 때문에 유리합니다. 최근 보고서는 면역 스테인닝8에 근거를 둔 전신 화상 진찰에 도전합니다; 그러나 CT 기반 이미징은 조직 제거 전처리를 필요로하지 않습니다.
이 방법은 복부 기관을 포함하여 다이어프램 아래의 모든 혈관의 시각화를 가능하게 합니다. 복부 기관에 있는 혈관신생은 항상성을 유지하고 질병을 개발하는 데 강한 충격이 있습니다9,10. 이 프로토콜은 하부 사지 혈관의 평가에 최적화되었기 때문에, 장기 특이적 프라이밍은 염증 이나 종양과 같은 모든 요인과 관련된 혈관 신생의 시각화를 가능하게 할 것이다.
Disclosures
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
동물 실험에서 뛰어난 기술적 지원을 해주신 기무라 야스요, 나가히로 메구미, 토쿠나가 사에코에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | TERUMO | SS-01T | |
| 10% Formalin Solution | Fujifilm-Wako | 068-03841 | |
| 10x phosphate-buffered saline (-) (PBS) | Fujifilm-Wako | 163-25265 | Prepare 1x PBS |
| 22 G catheter (22 G S5 x 1" V(F)) | MEDIKIT | HP2140 | Only catheter is used. |
| 23 G needle | TERUMO | NN-2325R | Use as a pin |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Fujifilm-Wako | 163-20145 | |
| 5 mL syringe | |||
| 5-0 Suture with needle | Alfresa Pharma Corporation | ER1205SB45 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251-5G | For vasodilating solution |
| Dumont #55 Forceps | FST | No.11255-20 | |
| Extension tube | TOP | X2-FL50 | |
| Falcon 50 mL tube | CORNING | 352098 | |
| Graefe Forceps | FST | No.11051-10 | |
| Heparin Sodium 5,000 units/5 mL | Mochida Co. Ltd. | 224122458 | |
| Isoflurane | Fujifilm-Wako | 099-06571 | |
| Microfil Injection Compounds | Flow Tech Inc. | MV-117 | Mix liquid MV-Compound (stain) and MV-Diluent 1: 1 |
| Papaverine hydrochloride | Fujifilm | 164-18002 | For vasodilating solution |
| Small Animal Anesthetizer | Muromachi Kikai Co. Ltd. | MK-A100ecoW-ST | |
| Spring Scissors - Angled to Side | FST | No.15006-09 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | FST | No.14001-12 | |
| three-way cock | TERUMO | TS-TR1K | |
| Transfer pipette | SAMCO SCIENTIFIC | SM262-1S | Use for mixing contrast medium |
| X-ray CT scanner | Toshiba IT & Control Systems Corporation | TOSHIBA TOSCANNER 32300 FPD |
References
- Folkman, J.
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS One. 8 (12), 84047 (2013).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3740 (2012).
- Arima, Y., et al. Evaluation of collateral source characteristics with 3-dimensional analysis using micro-X-ray computed tomography. Journal of the American Heart Association. 7 (6), 007800 (2018).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Fernandez, M., et al.
- Li, S., et al. Angiogenesis in pancreatic cancer: current research status and clinical implications. Angiogenesis. 22 (1), 15-36 (2019).
