Summary
Deze bijdrage beschrijft hoe eiwitkristallisatie op kristal-op-kristalapparaten kan worden ingesteld en hoe geautomatiseerde seriële gegevensverzameling bij kamertemperatuur kan worden uitgevoerd met behulp van het on-chip kristallisatieplatform.
Abstract
Biochemische reacties en biologische processen kunnen het best worden begrepen door aan te tonen hoe eiwitten overgaan tussen hun functionele toestanden. Aangezien cryogene temperaturen niet-fysiologisch zijn en de structurele dynamiek van eiwitten kunnen voorkomen, afschrikken of zelfs veranderen, is een robuuste methode voor routinematige röntgendiffractie-experimenten bij kamertemperatuur zeer wenselijk. Het kristal-op-kristalapparaat en de bijbehorende hardware en software die in dit protocol wordt gebruikt, zijn ontworpen om in situ röntgendiffractie bij kamertemperatuur mogelijk te maken voor eiwitkristallen van verschillende groottes zonder enige monstermanipulatie. Hier presenteren we de protocollen voor de belangrijkste stappen van apparaatassemblage, on-chip kristallisatie, optische scanning, kristalherkenning tot röntgenopnameplanning en geautomatiseerde gegevensverzameling. Omdat dit platform geen kristaloogst of andere monstermanipulatie vereist, kunnen honderden tot duizenden eiwitkristallen die op chip worden gekweekt, op een programmeerbare en snelle manier in een röntgenstraal worden geïntroduceerd.
Introduction
Vanwege de ioniserende effecten van röntgenstraling is eiwitkristallografie in de afgelopen drie decennia voor een groot deel beperkt gebleven tot cryogene omstandigheden. Daarom komt de huidige kennis van eiwitbewegingen tijdens zijn functie grotendeels voort uit vergelijkingen tussen statische structuren die in verschillende toestanden onder cryogene omstandigheden worden waargenomen. Cryogene temperaturen belemmeren echter onvermijdelijk de progressie van een biochemische reactie of interconversie tussen verschillende conformatietoestanden terwijl eiwitmoleculen aan het werk zijn. Om de structurele dynamiek van eiwitten direct te observeren bij atomaire resolutie door kristallografie, zijn robuuste en routinematige methoden nodig voor het uitvoeren van diffractie-experimenten bij kamertemperatuur, wat technische innovaties vereist in monsterafgifte, gegevensverzameling en posterieure gegevensanalyse. Daartoe hebben recente ontwikkelingen in seriële kristallografie nieuwe mogelijkheden geboden om de moleculaire beelden van tussenproducten en kortlevende structurele soorten bij kamertemperatuur 1,2,3 vast te leggen. In tegenstelling tot de "one-crystal-one-dataset"-strategie die veel wordt gebruikt in conventionele cryocrystallografie, hanteert seriële kristallografie een strategie voor gegevensverzameling die vergelijkbaar is met die van cryo-elektronenmicroscopie met één deeltje. In het bijzonder worden de experimentele gegevens in seriële kristallografie verzameld in kleine fracties van een groot aantal individuele monsters, gevolgd door intensieve gegevensverwerking waarbij gegevensfracties worden geëvalueerd en gecombineerd tot een volledige dataset voor 3D-structuurbepaling4. Deze "one-crystal-one-shot" strategie verlicht effectief de röntgenstralingsschade aan eiwitkristallen bij kamertemperatuur via een diffractie vóór vernietigingsstrategie5.
Aangezien seriële kristallografie een groot aantal eiwitkristallen vereist om een dataset te voltooien, vormt dit grote technische uitdagingen voor veel biologische systemen waar eiwitmonsters beperkt zijn en / of delicate kristalverwerking betrokken is. Een andere belangrijke overweging is hoe de kristalintegriteit het beste kan worden bewaard in seriële diffractie-experimenten. De in situ diffractiemethoden pakken deze zorgen aan door eiwitkristallen rechtstreeks te laten diffracteren van waar ze groeien zonder de verzegeling van de kristallisatiekamerte verbreken 6,7,8,9. Deze handlingvrije methoden zijn natuurlijk compatibel met grootschalige seriële diffractie. We hebben onlangs het ontwerp en de implementatie gemeld van een kristallisatie-apparaat voor in situ diffractie op basis van een kristal-op-kristalconcept - eiwitkristallen die rechtstreeks op monokristallijn kwartszijn gekweekt 11. Dit "kristal-op-kristal" apparaat biedt verschillende voordelen. Ten eerste beschikt het over een röntgen- en lichttransparant venster gemaakt van een monokristallijn kwartssubstraat, dat weinig achtergrondverstrooiing produceert, wat resulteert in uitstekende signaal-ruisverhoudingen in diffractiebeelden van eiwitkristallen. Ten tweede is het kwarts met één kristal een uitstekend dampscherm dat gelijkwaardig is aan glas, waardoor het een stabiele omgeving biedt voor eiwitkristallisatie. Daarentegen zijn andere kristallisatieapparaten die op polymeren gebaseerde substraten gebruiken gevoelig voor droging als gevolg van dampdoorlaatbaarheid, tenzij het polymeermateriaal een aanzienlijke dikte heeft, wat bijgevolg bijdraagt aan een hoge achtergrondverstrooiing10. Ten derde maakt dit apparaat de levering van een groot aantal eiwitkristallen aan de röntgenstraal mogelijk zonder enige vorm van kristalmanipulatie of oogsten, wat van cruciaal belang is voor het behoud van de kristalintegriteit11.
Om seriële röntgendiffractie-experimenten met behulp van de kristal-op-kristalapparaten te stroomlijnen, hebben we een diffractometerprototype ontwikkeld om eenvoudig schakelen tussen de optische scan- en röntgendiffractiemodi12 te vergemakkelijken. Deze diffractometer heeft een kleine voetafdruk en is gebruikt voor seriële gegevensverzameling op twee bundellijnen van de Advanced Photon Source (APS) in het Argonne National Laboratory. Specifiek gebruikten we BioCARS 14-ID-B voor Laue-diffractie en LS-CAT 21-ID-D voor monochromatische oscillatie. Deze diffractometerhardware is niet vereist als een synchrotron- of röntgenvrije elektronenlaserbundellijn is uitgerust met twee belangrijke mogelijkheden: (1) gemotoriseerde monsterpositionering met een reisbereik van ±12 mm rond de röntgenstraal in alle richtingen; en (2) een on-axis digitale camera voor het bekijken van kristallen onder lichtverlichting die veilig is voor eiwitkristallen die worden bestudeerd. Het monokristallijne kwartsapparaat vormt samen met een draagbare diffractometer en de besturingssoftware voor optische scanning, kristalherkenning en geautomatiseerde in situ gegevensverzameling gezamenlijk het inSituX-platform voor seriële kristallografie. Hoewel deze ontwikkeling voornamelijk wordt gemotiveerd door de dynamische kristallografietoepassingen met behulp van een polychromatische röntgenbron, hebben we het potentieel van deze technologie aangetoond om monochromatische oscillatiemethoden te ondersteunen10,12. Met automatisering biedt dit platform een methode voor het verzamelen van seriële gegevens met hoge doorvoer bij kamertemperatuur met betaalbaar eiwitverbruik.
In deze bijdrage beschrijven we in detail hoe we on-chip kristallisatie in een nat laboratorium kunnen instellen en hoe we seriële röntgengegevensverzameling kunnen uitvoeren op een synchrotron-bundellijn met behulp van het inSituX-platform.
De batchmethode wordt gebruikt om on-chip kristallisatie in te stellen onder een toestand die vergelijkbaar is met die van de dampdiffusiemethode die voor hetzelfde eiwitmonster is verkregen (tabel 1). Als uitgangspunt raden we aan om precipitant te gebruiken met een concentratie van 1,2-1,5x daarvan voor de dampdiffusiemethode. Indien nodig kan de kristallisatieconditie van de batch verder worden geoptimaliseerd via fijnrasterscreening. Kwartswafers zijn niet nodig voor optimalisatieproeven; in plaats daarvan kunnen glazen coverslips worden gebruikt (zie hieronder). Gedeeltelijk geladen kristallisatieapparaten worden aanbevolen om optimalisatieproeven op kleinere schaal te houden. Een aantal eiwitmonsters is met succes gekristalliseerd op dergelijke apparaten met behulp van de batchmethode10 (tabel 1).
Het apparaat zelf bestaat uit de volgende onderdelen: 1) een buitenste ring; 2) twee kwartswafers; 3) een wasmachine-achtige shim van plastic of roestvrij staal; 4) een keerring; 5) microscoop-dompelolie als afdichtmiddel (figuur 1). Het totale volume van de kristallisatieoplossing die op één chip wordt geladen, is afhankelijk van het doel van het experiment. De capaciteit van de kristallisatiekamer kan worden aangepast door een shim van verschillende diktes en /of binnendiameter te kiezen. We zetten routinematig kristallisatieapparaten op met een capaciteit van 10-20 μL met behulp van shims van 50-100 μm in dikte. Een typisch apparaat kan tienduizenden tot duizenden eiwitkristallen produceren die geschikt zijn voor seriële gegevensverzameling (figuur 2).
Wanneer succesvol, zal on-chip kristallisatie tientallen tot honderden of zelfs duizenden eiwitkristallen produceren op elk kwartsapparaat dat klaar is voor röntgendiffractie. Bij een synchrotronbundellijn wordt een dergelijk apparaat met behulp van een kinematisch mechanisme op een drieassige translatiefase van de diffractometer gemonteerd. Het kristallisatievenster van een gemonteerd apparaat wordt optisch gescand en afgebeeld in tientallen tot honderden microfoto's. Deze microfoto's worden vervolgens gestikt tot een montage met hoge resolutie. Voor lichtgevoelige kristallen kan optisch scannen worden uitgevoerd onder infrarood (IR) licht om onbedoelde foto-activering te voorkomen. Er is computer vision-software ontwikkeld om eiwitkristallen te identificeren en te lokaliseren die willekeurig op het apparaat zijn verdeeld. Deze kristallen worden vervolgens gerangschikt op basis van hun grootte, vorm en positie om de strategie voor gegevensverzameling in seriële kristallografie te informeren of te begeleiden. Er kunnen bijvoorbeeld enkele of meerdere opnamen op elk gericht kristal worden gevonden. Gebruikers konden een enkele pas of meerdere routes door gerichte kristallen plannen. We hebben software geïmplementeerd om verschillende reisroutes te berekenen. De kortste route wordt bijvoorbeeld berekend met behulp van algoritmen die het probleem van de reizende verkoper aanpakken13. Voor pomp-sonde dynamische kristallografische toepassingen kunnen de timing en duur van laser(pomp) en röntgenfoto's (sonde) worden gekozen. Een geautomatiseerde seriële gegevensverzameling is geprogrammeerd om elk gericht kristal achter elkaar in de röntgenstraal te transloceren.
De belangrijkste componenten van de insituX diffractometer zijn: 1) een apparaathouder; 2) een drieassige vertaalfase; 3) een lichtbron voor optisch scannen; 4) een röntgenstraalstop; 5) pomplasers als lichtgevoelige eiwitten worden bestudeerd; 6) Raspberry Pi microcomputer uitgerust met een IR-gevoelige camera; 7) besturingssoftware om motoren, camera, lichtbronnen, pomplaser te synchroniseren en te communiceren met beamline-bedieningselementen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voormontage van het apparaat
- Label de buitenste ring (30 mm diameter) voor monsteridentificatie. Vermeld indien nodig de projectnaam, het apparaatnummer, de kristallisatievoorwaarde en de datum (figuur 1A). Plaats de buitenste ring ondersteboven op een schoon oppervlak (figuur 1B) en plaats voorzichtig een kwartswafer in de ring (figuur 1C). Deze eerste kwartswafer dient als toegangspoort voor de incidentele röntgenfoto's.
- Giet een kleine hoeveelheid microscoop-dompelolie (viscositeit van 150 cSt) in een petrischaaltje. Dompel een shim in de olie en zorg ervoor dat beide zijden van de shim goed geolied zijn (figuur 1D). Verwijder de overtollige olie door de shim op een schoon oppervlak te deppen.
- Plaats de geoliede shim op de eerste kwartswafer (figuur 1E).
OPMERKING: Dompelolie is een uitstekende kit die de kristallisatiekamer beschermt tegen mogelijk dampverlies. Goed geassembleerde chips gaan meestal weken mee zonder zichtbaar te drogen. Deze voormontagestap wordt uitgevoerd onder ruimtelicht. Voor lichtgevoelige monsters moeten alle volgende stappen, met inbegrip van het laden van monsters, de opslag van het apparaat en observatie, onder veiligheidslicht worden uitgevoerd.
2. Monster laden en apparaatassemblage
- Gebruik een pipet om de eiwitoplossing en kristallisatiebuffer op de eerste kwartswafer grondig te mengen. De volumeverhouding tussen het eiwitmonster en de buffer varieert doorgaans van 2:1 tot 1:2 (figuur 1F). Zorg ervoor dat het totale volume van de kristallisatieoplossing de maximale capaciteit van de kristallisatiekamer, bepaald door de grootte en dikte van de shim, niet overschrijdt. Vermijd luchtbellen tijdens het mengen.
OPMERKING: De samenstelling van een kristallisatiebuffer varieert van experiment tot experiment. Raadpleeg tabel 1 voor kristallisatiecondities. - Plaats de tweede kwartswafer over de gemengde oplossing terwijl de oplossing zich begint uit te spreiden (figuur 1G). Deze tweede kwartswafer dient als uitgang van de gediffracteerde röntgenstralen.
- Tik de tweede kwartswafel lichtjes op de rand om de olie te verspreiden terwijl je lucht naar buiten duwt. Bevestig het apparaat door een bevestigingsring in de buitenste ring te schroeven (figuur 1H). Gebruik indien nodig een aanhaalgereedschap (figuur 1I). Houd er rekening mee dat te strak aanspannen ervoor kan zorgen dat delicate kwartswafers vervormen of zelfs barsten.
3. Optimalisatie van apparaatopslag en kristallisatie
- Bewaar de geassembleerde apparaten (figuur 1J) in een doos bij kamertemperatuur of in een incubator met temperatuurregeling.
OPMERKING: Eiwitkristallen kunnen verschijnen in een paar uur tot dagen nadat een kristallisatieapparaat is geassembleerd. Typische resultaten van on-chip kristallisatie worden getoond voor verschillende representatieve eiwitmonsters (figuur 2). - Monitor de kristalgroei door het kristallisatieapparaat onder een microscoop te observeren. Optimaliseer indien nodig de kristallisatiecondities door iteraties van secties 1-3.
4. Kalibratie
OPMERKING: De programma's en opdrachten die in de onderstaande secties worden genoemd, worden uitgevoerd in inSituX-software.
- Installeer een dun kristal van gedopeerde yttrium aluminium granaat op de chiphouder (figuur 3). Installeer de balkstop. Maak röntgenfluorescentiebeelden van de directe bundel door het programma uit te voeren:
burnmark.py.param
waarbijeen door de gebruiker geselecteerde naam is voor het kristallisatieapparaat. .param is een bestandsnaam die apparaatspecifieke besturingsparameters bevat. De standaardwaarden worden geleidelijk vervangen door specifieke waarden langs het protocol. Een voorbeeld.param wordt weergegeven in Aanvullend bestand 1. - Vind de precieze positie van de directe röntgenstraal door het bundelprofielaanpassingsprogramma uit te voeren:
beam.py-d
waarbijde bestandsnaam is van de röntgenfluorescentieafbeelding (figuur 4).
OPMERKING: Dit programma berekent de precieze directe straalposities en de straalgrootte. De straalpositie markeert de translocatiebestemming voor alle kristallen van hetzelfde apparaat. De balkgrootte wordt ook gebruikt voor doelplanning.
5. Optisch scannen
- Plaats een kristallisatieapparaat in de chiphouder en bevestig het apparaat met een duimschroef (figuur 3A).
- Monteer de chiphouder op de vertaalfase van de diffractometer via een kinematisch mechanisme (figuur 3B).
- Installeer een goede lichtbron voor het maken van microfoto's vanuit het optische venster van het apparaat. Wit licht, IR-licht of ander licht naar keuze kan worden gebruikt, afhankelijk van de lichtgevoeligheid van het eiwitmonster en het doel van het experiment.
- Voer het scanprogramma uit:
scan.py.param
Dit programma legt een set micrografieën vast die automatisch worden overgebracht naar opgegeven gebruikerscomputers. - Voer het tegelprogramma uit op een gebruikerscomputer:
tile.py-x -y
waarbij
OPMERKING: Stap 5.4 en 5.5 duren meestal enkele minuten. Het totale aantal microfoto's varieert van enkele tientallen tot honderden, afhankelijk van het scangebied en de vergroting. - Voer het kristalzoekprogramma uit:
findX.py-c -w -x
waarhet betegelde beeld is. Dit programma voert kristalherkenning en shotplanning uit. en geven de te vinden kristalgrootte aan. Als de gebruiker kleinere kristallen wil vermijden, kan worden gebruikt als afsnijding door een getal in te stellen dat groter is dan de grootte van ongewenste kleine kristallen. is een hoekwaarde die de tolerantie voor kristallen van onregelmatige vorm instelt. verwijst naar de directe straalgrootte die wordt verkregen uit de profielfitting hierboven (stap 4.2; Figuur 4). Ook kan een nominale waarde door gebruikers worden ingesteld om gerichte opnamen verder uit te plaatsen. Deze belangrijke parameters maken specifieke kristalselectie en doelplanning mogelijk (figuur 6).
6. Röntgendiffractie
- Verwijder de lichtbron en installeer de bundelstop. Stel een geschikte detectorafstand in. Volg het veiligheidsprotocol beamline om het röntgenhok te doorzoeken. Open de röntgensluiter en lasersluiter indien van toepassing.
- Voer het programma voor gegevensverzameling voor seriële diffractie uit:
collect.py.param -l
Deze opdracht activeert gegevensverzameling waarbij alle geplande opnamen achter elkaar worden bezocht volgens een voorgeprogrammeerde volgorde. Elk gericht kristal wordt getransloceerd naar de straalpositie (stap 4.2). Bij elke stop wordt röntgenblootstelling genomen met of zonder laserverlichting met een geplande tijdsvertraging. Film 1 toont een geautomatiseerde gegevensverzamelingsreeks met een frequentie van 1 Hz. Routinematig worden tientallen tot honderden diffractiebeelden verzameld van een enkel kristallisatieapparaat (film 2).
OPMERKING: Sectie 4 kalibratie en sectie 5 optische scan zijn op zichzelf staand in het inSituX-platform en zijn daarom volledig overdraagbaar naar een andere beamline. Sectie 6 Röntgendiffractie moet enige details bevatten bij de werking van de bundellijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Verschillende representatieve datasets zijn gepubliceerd In de afgelopen jarenzijn 10,12 samen met de kristallografische resultaten en wetenschappelijke bevindingen van een breed scala aan eiwitmonsters gepubliceerd, waaronder fotoreceptoreiwitten en enzymen, bijvoorbeeld een plant UV-Breceptor UVR8, een lichtgestuurde DNA-reparatiefotolyase PhrB10, een nieuw verrood licht detecterend eiwit uit een multi-domein sensorische histidinekinase14 , ligand/licht dual-sensor domeinen, en de fotosensorische kernmodule van een bacteriophytochroom12. Als representatieve resultaten vermelden we de on-chip kristallisatiecondities van deze eiwitten in tabel 1 en vergelijken ze direct met de omstandigheden die worden gebruikt voor de dampdiffusiemethode. Hier tonen we vier aanvullende casestudy's van on-chip kristallisatie (figuur 2) en een verzameling in situ diffractiepatronen in een film (film 2). Representatieve in situ datasets verzameld met behulp van dit protocol zijn samengevat in tabel 2.
In een representatief geval gaf cryocrystallografie aanleiding tot slechte diffractie voor een verrood licht waarnemend fotoreceptoreiwit waarschijnlijk als gevolg van lichtgevoeligheid en een hoog oplosmiddelgehalte (~ 80%) van deze kristallen14. De elektronendichtheden verkregen uit de cryocrystallografiegegevens waren te besmeurd om de chromofoorconformatie op te lossen, die centraal staat in onze wetenschappelijke vraag. Met behulp van het in situ protocol konden we onbedoelde lichtactivering vóór diffractie vermijden en verkregen we een donkere dataset bij kamertemperatuur van meer dan 800 kristallen. Deze donkere dataset van in situ seriële Laue-diffractie resulteerde in beter opgeloste elektronendichtheden, waardoor zelfverzekerde modelvorming van een bilinechromofoor mogelijk werd die een tot nu toe onbekende all-Z,syn-conformatie vertoont (figuur 7A)12,14. Onze dynamische kristallografie-experimenten hebben verder door licht geïnduceerde veranderingen in dit verrode fotoreceptoreiwit onthuld door gegevens te vergelijken van 4.352 kristallen in donkere en 8.287 kristallen na lichtverlichting (figuur 7). Een voorlopige analyse van de licht-geïnduceerde verschilkaarten heeft gecoördineerde bewegingen in de centrale β plaat onthuld, wat het belang suggereert van de π-π stapeling tussen de pyrroolringen van de chromofoor en verschillende aromatische residuen (figuur 7B, C). Een diepgaande analyse en wetenschappelijke bevindingen zullen elders worden gepresenteerd.
Figuur 1: Assemblage van kristallisatieapparaten. Elke assemblage kost naar schatting US $ 30 met twee monokristallijne kwartswafers of US $ 10 met twee glazen coverslips. Hardwarecomponenten behalve de shim zijn herbruikbaar. (A) De platte zijde van de buitenste ring is geëtiketteerd voor identificatiedoeleinden. (B) De buitenste ring wordt ondersteboven op een schoon oppervlak geplaatst. (C) Een kwartswafer met een diameter van 1 inch wordt zorgvuldig binnenin geplaatst. Een glazen chip kan in plaats daarvan ook worden gebruikt tijdens kristallisatieproeven, maar is niet compatibel met röntgendiffractie. (D) Beide zijden van de shim zijn geolied. (E) De geoliede shim wordt op de eerste kwartschip geplaatst. (F) Eiwit- en kristallisatieoplossingen worden naar het midden van de chip gepipetteerd en gemengd. (G) Een tweede kwarts- of glaschip bedekt de druppel zodat deze zich gelijkmatig over de chip verspreidt. (H) Een keerring wordt over de tweede kwartswafer geschroefd. (I) Een aanhaalgereedschap wordt gebruikt om de borgring voorzichtig aan te spannen. (J) Een volledig geassembleerd apparaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve eiwitkristallen gekweekt op kwartsapparaten. (A) De fotosensorische kernmodule van een bacteriofoom (Pa497 in tabel 1). (B,C) Verschillende constructies van het derde GAF-domein uit een multi-domein sensorisch histidinekinase (2551g3 en 2551g3Δα1 in tabel 1). (D) De tandem sensorische domeinen van een dual-sensor histidinekinase (RECGAF in tabel 1). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: inSituX diffractometer. (A) In de chiphouder is een kristallisatieapparaat gemonteerd. Hoewel het apparaat verticaal is gemonteerd, zullen kristallen die op chips zijn gegroeid niet vallen, voornamelijk omdat de vloeibare laag in een geassembleerd apparaat erg dun is en kristallen tijdens het groeien aan hun kernen worden verankerd. (B) Er is een IR-lichtbron geïnstalleerd voor de optische scan. De camera legt het inline beeld van de eiwitkristallen langs de röntgenstraal vast via een prismaspiegel (niet zichtbaar op de foto). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Directe bundelprofielfitting. De rode, groene en blauwe kanalen van het röntgenfluorescentiebeeld worden gebruikt om een tweedimensionale Gaussische functie te passen. In de linkerkolom ziet u de onbewerkte afbeelding van de rode, groene en blauwe kanalen. De middelste kolom is het passende resultaat met de precieze balkpositie en -grootte. De rechterkolom toont de fittingresten. Als de amplitude van de fittingresten een klein deel van het onbewerkte beeld beslaat, is de profielaanpassing van de directe bundel succesvol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Beeldtegels. (A) Een reeks kristalmicrografieën wordt vastgelegd tijdens een optische scan. De optische scan en gegevensoverdracht duren meestal 1-2 minuten. Aangrenzende micrografieën delen een strook overlappend gebied, horizontaal en verticaal, zoals gemarkeerd door gele vakken. (B) Micrografieën worden aan elkaar genaaid om een montage met hoge resolutie te maken op basis van de optimale correlatie in de overlappende gebieden. Dit proces duurt meestal een minuut op een laptopcomputer. Het gele vak schetst het gebied dat wordt vastgelegd door 2 x 2 microfoto's weergegeven in (A). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Kristalherkenning en opnameplanning. Elke roze cirkel markeert het primaire schot van een kristal. De gele cirkels markeren extra opnamen als een kristal lang genoeg is om deze opnamen te positioneren. De roze lijnen markeren een route als oplossing voor het probleem van de handelsreiziger. Geclusterde kristallen en kleinere kristallen worden grotendeels vermeden. De agressiviteit van kristalvinding kan als optie worden aangepast om te findX.py (stap 5.6). Een brute force "overkill" -strategie zou geen kristal onbeschot laten, maar zou veel diffractiebeelden kunnen produceren, maar niet verwerkbaar12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Elektronendichtheidskaarten van het ver-rood-licht-detectiedomein van een histidinekinase. (A) De 2Fo-Fc-kaart geprofileerd op 2,5σ toont de elektronendichtheden geassocieerd met de bilinchromofoor in een all-Z,syn conformatie14. Pyrroolringen A tot en met D zijn gemarkeerd. (B en C) Licht-donker verschilkaarten met ±2,5σ in respectievelijk groen en rood, benadrukken de winst en het verlies van elektronendichtheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Vergelijking van kristallisatiecondities tussen dampdiffusie en on-chip batchmethode. Dampdiffusie en batchmethoden voor kristallisatie zijn sterk gecorreleerd 10,14,15,16,17,18,19. Uitgaande van een dampdiffusieconditie kan een vergelijkbare toestand worden geoptimaliseerd voor kristallisatie op de chip. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Samenvatting van in situ datasets die rechtstreeks van kwartsapparaten zijn verzameld. Duizenden Laue-diffractiepatronen kunnen worden verzameld uit verschillende kristallisatieapparaten. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Film 1: Een nepgegevensverzameling. Gerichte kristallen worden getransloceerd in de röntgenstraal zoals gemarkeerd door een rode cirkel. De opeenvolging van de beoogde kristallen in deze film volgt geen oplossing voor het probleem van de reizende verkoper. Laser- en röntgenblootstellingen worden bij elke stop met een geprogrammeerde vertraging afgevuurd. Diffractiebeelden worden verzameld. Klik hier om deze film te downloaden.
Film 2: Diffractiebeelden. Honderden diffractiebeelden kunnen worden verzameld van een enkel kristallisatieapparaat. Meerdere apparaten zijn voldoende om een complete en zeer redundante dataset te produceren (tabel 2). Klik hier om deze film te downloaden.
Aanvullend bestand 1: Voorbeeld
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eiwitkristallografie in de beginjaren uitgevoerd bij kamertemperatuur ondervond enorme moeilijkheden bij het bestrijden van röntgenstralingsschade. Het is dus vervangen door de robuustere cryocrystallografiemethode toen synchrotron röntgenbronnen direct beschikbaarkwamen 20. Met de komst van röntgenvrije elektronenlasers is de eiwitkristallografie op kamertemperatuur de afgelopen jaren nieuw leven ingeblazen, met veel nieuwe ontwikkelingen gedreven door de wens om de structurele dynamiek van eiwitten te observeren bij een fysiologisch relevante temperatuur 2,21. De ontwikkeling van het inSituX-platform op basis van de kristal-op-kristal-apparaten is ingegeven door dezelfde ambitie, namelijk het opzetten van routinematige en robuuste methoden voor gegevensverzameling voor dynamische kristallografiestudies bij kamertemperatuur. Deze geautomatiseerde seriële röntgendiffractiemethode is ook van toepassing op statische structuurbepaling voor eiwitkristallen die niet kunnen worden bevroren14. In dit protocol presenteren we belangrijke technische overwegingen samen met kritieke stappen die nodig zijn om gegevensverzameling bij kamertemperatuur te leveren met behulp van dit platform. Deze methode is met name geschikt voor fragiele eiwitkristallen die gevoelig zijn voor mechanische hantering, schade aan röntgenstraling of blootstelling aan lucht.
Het prototype van het platform is uitgebreid getest op twee eiwitkristallografiebundellijnen in de Advanced Photon Source (APS) van het Argonne National Laboratory. Hoewel het vrij eenvoudig is om on-chip kristallisatie in te stellen volgens dit protocol, omvat de stap voor het verzamelen van gegevens verschillende op maat gemaakte hardware- en softwarecomponenten. Als gevolg hiervan kan de toepassing en implementatie van projectspecifieke strategieën voor gegevensverzameling nauwe samenwerking tussen gebruikers en beamline-wetenschappers vereisen. Met andere woorden, deze technologie in zijn huidige vorm is beperkt tot die gebruikers die voldoende toegang hebben tot synchrotrons zoals APS. Niettemin zouden de algemene workflow en de belangrijkste stappen die in dit protocol worden beschreven, dienen als een referentie of gids voor elke onderzoeksgroep die geïnteresseerd is in eiwitkristallografie op kamertemperatuur.
Het belangrijkste voordeel van dit platform is dat er geen kristalmanipulatie zoals montage of bevriezing nodig is, zodat delicate eiwitkristallen in ongerepte omstandigheden worden gediffracteerd. Een ander groot voordeel is dat het gebruik van het monokristallijne kwartssubstraat aanleiding geeft tot zeer weinig achtergrondverstrooiing naar eiwitdiffractiebeelden, terwijl het stabiele omgevingen biedt voor eiwitkristallisatie gedurende een lange tijd (weken tot maanden). Dit platform is echter niet geschikt voor sparse-matrix kristalscreening omdat het bedoeld is voor grootschalige kristalproductie. Als zodanig is voorkennis van kristallisatieomstandigheden vereist om initiële on-chip kristallisatieproeven voor een bepaald eiwitmonster op te zetten.
In de praktijk vinden we dat sommige assemblagestappen van apparaten, zoals het oliën van een shim (stap 1.2) en het verzegelen van een apparaat (stap 2.3), zo triviaal als ze lijken, vaak rechtstreeks van invloed zijn op de uitkomsten van kristallisatie. Een apparaat kan snel uitdrogen als het oliën niet goed wordt gedaan. Bovendien kan het te veel aanspannen van het apparaat in de laatste stap van de montage de kwartswafers vervormen, terwijl onderverstrakking leidt tot mogelijke lekken en / of ongecontroleerde verdamping van het apparaat. Een andere cruciale stap is het plannen van röntgenfoto's. Men moet zorgvuldig omgaan met geclusterde of overvolle kristallen om overlappende diffractiepatronen te voorkomen die vaak moeilijk te verwerken zijn. Dit probleem kan worden verlicht door het gebruik van een micro-focussen röntgenstraal. Mogelijk kan een volledige dataset moeilijk te verkrijgen zijn als de kristalmorfologie een grote dunne plaat is, zodat de meeste platen evenwijdig zijn aan de kwartsvensters. Bovendien kunnen de enkelkristal kwartschips worden gerecycled en hergebruikt na een reinigingsprocedure met zeep en organische oplosmiddelen die olie- en eiwitresten verwijderen. Meestal kan ongeveer 80-90% van deze delicate chips zonder schade worden gereinigd voor de volgende experimenten. In het geval van kleine kristallen op een micro-gerichte bundellijn, wanneer een betere precisie moet worden bereikt in kristalpositionering, kunnen verschillende hardwarecomponenten worden geüpgraded, zoals fijnere motoren, betere camera en optica, grotere vergroting, enz. Geen van deze komt echter in de buurt van de state-of-the-art beperkingen. Daarom is er veel ruimte voor verbetering zonder veel moeite.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ZR is de uitvinder van de kristal-op-kristalchips op het Amerikaanse patent 9632042 verleend aan Renz Research, Inc.
Acknowledgments
Het gebruik van Advanced Photon Source, een Office of Science User Facility die door argonne National Laboratory voor het Amerikaanse ministerie van Energie wordt geëxploiteerd, werd ondersteund door contract DE-AC02-06CH11357. Het gebruik van BioCARS werd ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder subsidienummer R24GM111072. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. Het gebruik van LS-CAT Sector 21 werd ondersteund door Michigan Economic Development Corporation en Michigan Technology Tri-Corridor grant 085P1000817. Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de Universiteit van Illinois in Chicago, National Institutes of Health (R01EY024363) en National Science Foundation (MCB 2017274) aan XY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
References
- Brändén, G., Neutze, R. Advances and challenges in time-resolved macromolecular crystallography. Science. 373, (2021).
- Fischer, M.
- Schaffer, J. E., Kukshal, V., Miller, J. J., Kitainda, V., Jez, J. M. Beyond X-rays: an overview of emerging structural biology methods. Emerging Topics in Life Sciences. 5 (2), 221-230 (2021).
- Nogales, E., Scheres, S. H. W. Cryo-EM: A unique tool for the visualization of macromolecular complexity. Molecular Cell. 58, 677-689 (2015).
- Chapman, H. N., Caleman, C., Timneanu, N.
- Kisselman, G., et al. X-CHIP: an integrated platform for high-throughput protein crystallization and on-the-chip X-ray diffraction data collection. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (6), 533-539 (2011).
- Liang, M., et al. Novel combined crystallization plate for high-throughput crystal screening and in situ data collection at a crystallography beamline. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 77, 319-327 (2021).
- le Maire, A., et al. In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67, 747-755 (2011).
- Perry, S. L., et al. In situ serial Laue diffraction on a microfluidic crystallization device. Journal of Applied Crystallography. 47, 1975-1982 (2014).
- Ren, Z., et al. Crystal-on-crystal chips for in situ serial diffraction at room temperature. Lab on a Chip. 18, 2246-2256 (2018).
- Ren, Z. Single crystal quartz chips for protein crystallization and X-ray diffraction data collection and related methods. US patent. , 9632042 (2017).
- Ren, Z., et al. An automated platform for in situ serial crystallography at room temperature. IUCrJ. 7, 1009-1018 (2020).
- Croes, G. A. A method for solving traveling salesman problems. Operations Research. 6, 791-812 (1958).
- Bandara, S., et al. Crystal structure of a far-red-sensing cyanobacteriochrome reveals an atypical bilin conformation and spectral tuning mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118, 2025094118 (2021).
- Shin, H., Ren, Z., Zeng, X., Bandara, S., Yang, X. Structural basis of molecular logic OR in a dual-sensor histidine kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, 19973-19982 (2019).
- Yang, X., Ren, Z., Kuk, J., Moffat, K. Temperature-scan cryocrystallography reveals reaction intermediates in bacteriophytochrome. Nature. 479, 428-432 (2011).
- Zhang, F., Scheerer, P., Oberpichler, I., Lamparter, T., Krauss, N. Crystal structure of a prokaryotic (6-4) photolyase with an Fe-S cluster and a 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine antenna chromophore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 7217-7222 (2013).
- Zeng, X., et al. Dynamic crystallography reveals early signaling events in ultraviolet photoreceptor UVR8. Nature Plants. 1, 14006 (2015).
- Wang, M., et al. Insights into base selectivity from the 1.8 Å resolution structure of an RB69 DNA polymerase ternary complex. Biochemistry. 50, 581-590 (2011).
- Rodgrs, D. W.
- Zhao, F. -Z., et al. A guide to sample delivery systems for serial crystallography. TheFEBS Journal. 286, 4402-4417 (2019).
