Summary
Denne protokol præsenterer, hvordan man kvantificerer AAV transduktion effektivitet i musen nethinden ved hjælp af digital dråbe PCR (dd-PCR) sammen med lille skala AAV produktion, intravitreal injektion, retinal billeddannelse, og retinal genomisk DNA isolation.
Abstract
Mange retinale cellebiologi laboratorier nu rutinemæssigt bruge Adeno-associerede vira (AAVs) til genredigering og lovgivningsmæssige applikationer. Effektiviteten af AAV transduktion er normalt kritisk, hvilket påvirker de samlede eksperimentelle resultater. En af de vigtigste determinanter for transduktionseffektivitet er serotypen eller varianten af AAV-vektoren. I øjeblikket, forskellige kunstige AAV serotyper og varianter er tilgængelige med forskellige tilhørsforhold til at være vært celle overflade receptorer. For retinal genterapi resulterer dette i varierende grader af transduktionseffektivitet for forskellige retinale celletyper. Derudover kan injektionsruten og kvaliteten af AAV-produktionen også påvirke den retinale AAV-transduktionseffektivitet. Derfor er det vigtigt at sammenligne effektiviteten af forskellige varianter, batches og metoder. Den digitale dråbe PCR (dd-PCR) metode kvantificerer nukleinsyrer med høj præcision og tillader udførelse af absolut kvantificering af et givet mål uden nogen standard eller en reference. Ved hjælp af dd-PCR er det også muligt at vurdere transduktionseffektiviteten af AAVs ved absolut kvantificering af AAV-genomkopinumre i en injiceret nethinde. Her giver vi en enkel metode til at kvantificere transduktionshastigheden for AAVs i retinale celler ved hjælp af dd-PCR. Med mindre ændringer kan denne metode også danne grundlag for kvantificeringen af mitokondrie-DNA'et med kopinummeret samt vurdering af effektiviteten af baseredigering, kritisk for flere retinale sygdomme og genterapiapplikationer.
Introduction
Adeno associerede vira (AAVs) er nu almindeligt anvendt til en række retinale genterapi undersøgelser. AAVs giver en sikker og effektiv måde at genlevering med mindre immunogenicitet og færre genomintegrationer. AAV-indtræden i målcellen sker gennem endokytose, hvilket kræver binding af receptorer og co-receptorer på celleoverfladen1,2. Derfor afhænger transduktionseffektiviteten af AAVs for forskellige celletyper hovedsageligt af capsid og dens interaktioner med værtscellereceptorerne. AAVs har serotyper og hver serotype kan have forskellige cellulære / væv troper og transduktion effektivitetsgevinster. Der er også kunstige AAV serotyper og varianter genereret af kemisk modifikation af virus capsid, produktion af hybrid capsids, peptid indsættelse, capsid shuffling, rettet evolution, og rationel mutagenese3. Selv mindre ændringer i aminosyresekvens eller capsidstruktur kan have indflydelse på interaktioner med værtscellefaktorer og resultere i forskellige troper4. Ud over capsid varianter, andre faktorer som injektion rute og batch-til-batch variation af AAV produktion kan påvirke transduktion effektivitet AAVs i neuronal nethinden. Derfor er pålidelige metoder til sammenligning af transduktionshastigheder for forskellige varianter nødvendige.
De fleste af metoderne til bestemmelse af AAV transduktion effektivitet stole på reporter genekspression. Disse omfatter fluorescerende billeddannelse, immunohistochemistry, western blot, eller histokemisk analyse af reporter genprodukt5,6,7. På grund af AAVs størrelsesbegrænsning er det imidlertid ikke altid muligt at inkludere reportergener for at overvåge transduktionseffektiviteten. Brug af stærke initiativtagere som hybrid CMV forstærker / kylling beta-actin eller Woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatoriske element (WPRE) som en mRNA stabilisator sekvens yderligere komplicerer størrelsen problem8. Derfor vil det også være gavnligt at definere transduktionshastigheden for injicerede AAVs med en mere direkte metode.
Digital dråbe PCR (dd-PCR) er en kraftfuld teknik til at kvantificere mål-DNA fra små mængder prøver. dd-PCR-teknologi afhænger af indkapsling af mål-DNA- og PCR-reaktionsblandingen ved hjælp af oliedråber. Hver dd-PCR-reaktion indeholder tusindvis af dråber. Hver dråbe behandles og analyseres som en uafhængig PCR-reaktion9. Analyse af dråber gør det muligt at beregne det absolutte kopiantal af mål-DNA-molekyler i enhver prøve ved blot at bruge Poisson-algoritmen. Da transduktionseffektiviteten af AAVs er korreleret med kopinummeret af AAV-genomer i neuronal nethinden, brugte vi dd-PCR-metoden til at kvantificere AAV-genomer.
Her beskriver vi en dd-PCR-metode til beregning af transduktionseffektiviteten af AAV-vektorer fra retinal genomisk DNA6,10. For det første blev AAVs, der udtrykker tdTomato-reporter, genereret ved hjælp af protokollen i lille skala og titered af dd-PCR-metoden11. For det andet blev AAVs intravitreally injiceret i neuronal nethinden. For at demonstrere transduktionseffektiviteten kvantificerede vi først tdTomato-udtrykket ved hjælp af fluorescerende mikroskopi og ImageJ-software. Dette blev efterfulgt af isolering af genomisk DNA til kvantificering af AAV-genomer i injicerede nethinder ved hjælp af dd-PCR. Sammenligning af tdTomato-ekspressionsniveauer med de transduced AAV-genomer kvantificeret ved dd-PCR viste, at dd-PCR-metoden nøjagtigt kvantificerede AAV-vektorernes transduktionseffektivitet. Vores protokoller viste en detaljeret beskrivelse af en dd-PCR-baseret metode til at kvantificere AAV transduktionseffektivitet. I denne protokol viser vi også det absolutte antal AAV-genomer, der overføres efter intravitreale injektioner ved blot at bruge fortyndingsfaktoren efter genomisk DNA-isolering og dd-PCR-resultaterne. Samlet set giver denne protokol en kraftfuld metode, som ville være et alternativ til reporter udtryk til at kvantificere transduktion effektivitetsgevinster af AAV vektorer i nethinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle protokoller blev accepteret af Sabanci Universitys etiske komité, og forsøg blev udført i overensstemmelse med erklæringen fra 'The Association for Research in Vision and Oftalmology' til brug af dyr i forskning
1. Mindre AAV produktion12
- Kultur HEK293T celler ved hjælp af 15 cm plader i komplet 10 mL AF DMEM/10% FBS indtil 70-80% sammenløb.
- Transfektionsblandingen forberedes med 20 μg hjælperplasmid (pHGT1-Adeno1), 7 μg capsid plasmid og 7 μg AAV2-CBA-tdTomato-WPRE-vektor og 136 μL PEI-opløsning (1 mg/mL) i 5 mL DMEM.
- Tilsættes den 5 mL tilberedte transfektionsblanding til en cellekulturskål, der indeholder 10 mL kulturmedier, og inkuberes de transfected celler i 48-60 timer ved 37 °C.
- Saml mediet ved 48-60 h efter transfektion og fordøje det med DNase I ved en endelig koncentration på 250 U /mL i 30 min ved 37 °C.
- Centrifugere de fordøjede medier ved 4000 x g, 4 °C i 30 min og derefter filtrere det med en 0,22 μm sprøjte filter i den forfugtede regenererede cellulosemembran i 100 kDa.
- Centrifugere den regenererede cellulosemembran ved 4000 x g, 4 °C i 30 min og kassér mediet.
- Vask og centrifugering den regenererede cellulosemembran med PBS indeholdende 0,001% Pluronic F-68 tre gange ved 4000 x g, 4 °C i 30 min. Kassér PBS ved hvert trin.
- Saml koncentrerede AAVs fra den øverste del af den regenererede cellulosemembran og aliquot til yderligere brug.
- Fordøje 5 μL frisklavet AAV med DNase I (0,2U/μl) i 15 min ved 37 °C til titering. Dette efterfølges af 10 min ved 95 °C inkubation for både inaktivering af DNase I og nedværdigende viral capsids.
- Forbered en 10-fold seriel fortynding fra fordøjede AAVs ved hjælp af 0,05% Pluronic F-68. Brug AAV2-ITR- og WPRE-primere til titrering (tabel 1). Titerne blev beregnet ved at multiplicere dd-PCR-resultater med fortyndingsfaktorerne. Resultaterne blev konverteret til genomkopi/mL (GC/mL).
BEMÆRK: AAV-koncentrationer til små AAV-produktioner forventes at være omkring 1 x 1012 GC/mL. Denne protokol gælder ikke for AAV-stammer, der ikke effektivt frigiver AAVs i medier som AAV213.
2. Intravitreal injektion af AAV
-
Klargøring af udstyr
- Før du starter, forberedes 10 μL microsyringe med en 36 G stump nål. Skyl fem gange med 70% EtOH, fem gange i ddH2O, og endelig fem gange med PBS.
- Læg den passende mængde AAV i mikrosyringe for hver injektion.
- Forbered den kirurgiske nål (sutur, silke, 6/0), tape, sammentak og saks.
-
Intravitreal injektion
- Påfør 1 fald på 0,5% tropicamid og 2,5% phenylephrinehydrochlorid (f.eks Mydfrin), der indeholder øjendråbe før anæstesi for at spile eleverne.
- Bedøve mus med isoflurane 5% (1 L/min) og fortsætte med 1,5% isoflurane (1 L/min) under proceduren. Et lille isofluranekammer bruges til den første induktion.
- Kontroller dybden af anæstesi ved tab af højre refleks, tilbagetrækning refleks, og hale knivspids svar.
- Påfør 0,3 % tobramycin og 0,1 % dexamethason sterilt oftalmologisk opløsning på hvert øje før injektionsproceduren. Anvendelse af øjendråbe forhindrer tørhed og udøver antiinflammatoriske og antibakterielle virkninger.
- Brug den kirurgiske krog til at stabilisere det øverste øjenlåg. Træk lidt tilbage for at eksponere den dorsale del af øjet. Tape krogen til bænken for at holde den på plads.
- Fjern bindehinden (mindre end 1 mm2) med den buede irissaks for at eksponere øjets sclera under dissekeringmikroskopet. Brug en frisk og steril insulinsprøjte (30 G) til at punktere scleraen.
- Indsæt nålen af mikrosyringe gennem den samme punktering ved hjælp af en mikromanipulator. Placer spidsen af nålen bag linsen i midten af øjestykket.
- Indsprøjt 1 μL AAV2/BP2 og AAV2/PHP. S vektorer med 1,63 x 1012 GC/mL og 1,7 x 1012 GC/mL koncentrationer langsomt ind i glaslegemet i øjet. Kontrol af injektionsvolumen udføres manuelt. Lad nålen stå på plads i 1 min og træk langsomt nålen tilbage.
- Slip øjenlåget og anvende antiinflammatorisk og antibakteriel aktuel gel behandling, der indeholder 0,3% tobramycin og 0,1% dexamethason til øjekop. Overvåg og vurder musene i de følgende dage i henhold til scorearket med hensyn til udseende (lyse øjne, præpareret frakke, fornemmelse), adfærd (aktivitet, immobilisering, selvlemlæstelse) og kropsvægt på en skala fra 0 til 3. Hver betingelse har en score fra 0-3 og en samlet score på 3 eller derover er et opsigelseskriterium.
- Placer dyrene i buret efter genopretning.
3. Fluorescens og fundus imaging
- Spænd musen og spil pupillen ved at placere dråber på 0,5% tropicamid og 2,5% phenylephrinehydrochlorid i hvert øje.
- Bedøve dyret med ovenstående procedure med isoflurane. Vurder dybden af anæstesi omhyggeligt ved at klemme poterne.
- Placer musen på billeddannelse scenen og kontrollere den korrekte udvidelse ved at kontrollere gennem fundus kameraet. Påfør aktuel gel (0,2% carbomer 980) på overfladen af øjnene for at beskytte øjnene mod dehydrering under anæstesi og for at bruge det som en koblingsgel til billeddannelse.
- Manipulere billeddannelse fase til linje op med næsestykket af målet. Juster scenen efter behov for at centrere museøjet. Når øjet er centreret, langsomt flytte målet, indtil det kommer i kontakt med øjet.
- Udfør fundus- og fluorescensbilleddannelse på begge øjne for at følge op på tdTomato-udtrykket 1 uge og 2 uger efter intravitreal injektion (Figur 3B)14. Tag fundus og fluorescens billeder på identiske indstillinger for sammenligning af reporter udtryk.
4. Retina isolation
- Aflive dyr efter fundus og fluorescens billeddannelse ved CO2 indånding for nethinden indsamling på 2 ugers tid punkt.
- Hold øjeæblet fremad ved hjælp af en 13,5 cm splitter-sammentak.
- Fjern linsen sammen med de resterende glasagtige ved at anvende blidt tryk med sammentvingerne.
- Skær forbindelsen af øjeæblet til synsnerven med præcision buede sammenkrikken og klem forsigtigt nethinden med de samme buede sammenkrikken.
- Overfør dissekerede nethinder til et mikrocentrifugerør.
- Snap fryse nethinden ved at placere rørene i det flydende nitrogen.
5. Væv genomisk DNA-isolation
- Isoler genomisk DNA med et kommercialiseret Proteinase K fordøjelsesbaseret vævsgenomisk DNA-kit.
- Fordøje nethinden ved 55 °C, 200 x g i 30 min med Proteinase K, som allerede leveres i sættet.
- Udfør RNase inkubation trin, vaske trin med vask buffer I og II, og endelig elution trin i henhold til producentens protokol.
- Tilsæt et ekstra spintrin efter den sidste vask for at fjerne resterende ethanol.
- Måle koncentrationen af genomisk DNA og opbevare prøver ved -20 °C.
6. Droplet digital PCR analyse af mus nethinden prøver til kvantificering af virale genomer
- Fortynd genomiske DNAs fra injicerede nethinder i 0,05% Pluronic F-68 opløsning for at nå en endelig koncentration på 1 ng/μL for hver prøve.
- Udfør separate reaktioner for WPRE og 18S ved hjælp af målspecifikke primere med en endelig koncentration på 125 nM for hver primer.
- Udfør dråbegenerering i en 20 μL PCR-reaktionsblanding, herunder 1 ng genomisk DNA, 125 nM primere og 2x evagreen supermix.
- Læg prøveblandingen i den midterste del af patronen til dråbegenerering.
- Når prøveindlæsningen er færdig, tilsættes 70 μL af dråbegenerationsolien i patronens nederste række.
- Sæt pakningen oven på patronen og læg den i dråbegeneratoren. Sørg for, at der ikke er mellemrum mellem pakningen og patronen.
- Tag forsigtigt ca. 40 μL dråber, der genereres i top godt. Tilsæt dråbeløsningen til den halvskørte 96-brønd PCR-reaktionsplade.
- Forsegl PCR-pladen med PCR-pladeforsegling ved hjælp af aluminiumsforseglingsfolie.
- Placer PCR-plade i 96-godt varmeforseglet termisk cycler. Brug PCR-protokollen. 95 °C i 5 min, 40 cyklusser på 95 °C i 30 s, 60 °C i 1 min, 4 °C i 5 min, 90 °C i 5 min og 4 °C uendeligt hold. Påfør 2 °C/s rampehastighed ved hver cyklus for at sikre, at dråberne når den korrekte temperatur for hvert trin under cyklingen
- Placer PCR-plade i dråbelæseren for at kvantificere dråber ved hjælp af dd-PCR-software. Der konfigureres en skabelon ved hjælp af bestemte indstillinger for evagreen.
- Analyser data ved hjælp af en 1D-plotgraf med hver prøve for fluorescensintensitet vs. dråbetal. Tærskelværdien er arrangeret, så dråberne over tærsklen tildeles som positive og de nedenfor som negative. Dette efterfølges af anvendelsen af Poisson-algoritmen til at bestemme startkoncentrationen af mål-DNA i enheder af kopier/μL. Forholdet mellem WPRE og 18S beregnes til måling af AAV-transduktionseffektivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AAV-produktion i lille skala er en hurtig og effektiv metode, der giver vektorer til intravitreale injektioner (Figur 1). Mindre AAV-produktion giver normalt titere inden for intervallet 1 x 1012 GC/ml, hvilket er tilstrækkeligt til at detektere reporterudtryk i nethinden (Figur 2). Titering af AAV ved hjælp af dd-PCR giver ensartede resultater. ITR2 og WPRE specifikke primere bruges rutinemæssigt, og startkoncentrationen af hvert målmolekyle blev beregnet med dd-PCR-software ved at modellere som en Poisson-distribution. Beregningerne blev færdiggjort ved multiplikation af fortyndingsfaktorer og konverteret til genomkopi pr. ML. AAVs, der er produceret til denne protokol havde titers på 1,63 x 1012 GC/ml og 1.7x 1012 GC/ml for AAV2/BP2 og AAV2/PHP.S7,15, henholdsvis. Til sammenligning blev identiske tdTomato-udtrykskonstruktioner brugt til begge stammer. Vi injicerede omtrent lige titere af AAV til kvantificering af AAV transduktionseffektivitet. Efter injektion af 1 μL fra ovennævnte koncentrationer af AAVs blev dyrene afbildet ved 1 uge og 2 ugers tid. En fundus og fluorescens imaging system blev brugt til både AAV2/BP2 og AAV2/PHP. S injiceres nethinder generere lignende reporter udtryk profiler undtagen nethinden # 1 (Figur 3A, B). TdTomato-udtrykket blev kvantificeret ved hjælp af ImageJ-software for gennemsnitlig grå værdi (middel fluorescensintensitet) for at kryds sammenligne transduktionseffektivitet og reporterudtryk (Figur 3A, B). Dette er dybest set summen af de grå værdier af alle pixel i markeringen divideret med antallet af pixels16. Fluorescerende billeder af Retina # 1 viste kun et lille område af tdTomato udtryk, sandsynligvis på grund af tilbageløb eller lækage efter intravitreal injektioner. I overensstemmelse med dette fund, fluorescens intensitet nethinden # 1 var 0,9, som var den laveste i forhold til alle nethinder, der intravitreally injiceres og afbildes. Den gennemsnitlige fluorescensintensitet var mellem 4 - 11. Dette viste, at kvantificeringen af fluorescerende billeder af tdTomato-udtryk var vellykket og korreleret med de viste billeder (Figur 3A, B).
Efter billeddannelse af nethinder blev genomisk DNA isoleret fra injicerede nethinder på 2-ugers tid. dd-PCR blev udført ved hjælp af WPRE primere til AAV genom kvantificering. Mus 18S blev brugt til normalisering af AAV-genomer til musegenomet (Figur 3C)17. I overensstemmelse med den gennemsnitlige fluorescensintensitet og billeder havde nethinden #1 et meget lavt AAV-genomkopinummer i forhold til 18S, 0,011 gange lavere sammenlignet med nethinden #2. Desuden giver nethinden # 2, 3, 4 og 5 lignende fold niveau forskelle. Foldforskellene i forhold til nethinden #2 for nethinden #3, 4 og 5 var henholdsvis 1,75, 0,55 og 0,99. Blandt dem, nethinden # 3 både gav den højeste fluorescerende intensitet og AAV genom kopi nummer. Dette viste allerede, at kvantificeringen af transduced AAV-genomer med dd-PCR korrelerer med fluorescensintensiteten og dermed tdTomato-ekspressionen, der observeres. DD-PCR-metoden gav os også mulighed for at lave absolut kvantificering af transduced AAVs. Absolut kvantificering af det samlede AAV-genom pr. nethinde blev beregnet blot ved at multiplicere det samlede antal identificeret fra dd-PCR og fortyndingsfaktoren for genomisk DNA. Dette gav lignende resultater sammenlignet med 18S normaliseret AAV-genomtransduktionseffektivitet (Figur 3D).
Figur 1: Rutediagram over forsøgsprocedurerne. Lille AAV-produktion efterfølges af dd-PCR-baseret AAV-titering. AAVs injiceres intravitreally i den voksne nethinde. Opfølgning af dyr blev udført ved hjælp af en fundus og fluorescerende billeddannelse system for at analysere reporter udtryk. Fundus og fluorescerende billeder blev taget på 1 uge og 2-ugers tid punkter. Genomisk DNA er isoleret fra injicerede nethinder til analyse med dd-PCR for at kvantificere det samlede AAV-genom, der er til stede i de injicerede nethinder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: AAV-titering ved hjælp af dd-PCR-metoden. (A) Dd-PCR-metoden drager fordel af indkapslede PCR-reaktioner i en dråbe. Efter PCR-reaktion ved hjælp af evagreen kemi, positive og negative dråber til målet genet blev analyseret for at bestemme det absolutte antal mål DNAs inden for en løsning. (røde bokse i grønne dråber). (B) Repræsentative dd-PCR-data for AAV-titering. Flere partier af AAVs blev titered ved hjælp af ITR2 primere. Positive og negative dråber adskilles over og under tærsklen (lilla linje). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Kvantificering af transduced AAV-genomer i nethinden af dd-PCR. 16 uger gamle vilde dyr blev intravitreally injiceret med AAV2/BP2 og AAV2/PHP. S vektorer med henholdsvis 1,63 x 1012 GC/mL og 1,7x 1012 GC/mL koncentrationer. Begge AAVs havde den identiske tdTomato udtryk konstruere og injektion volumen for alle AAVs var 1 μL. Injicerede nethinder (1-7) blev fulgt op med fundus og fluorescens billeddannelse. Billeder, der er taget blev kvantificeret ved hjælp af Image J software. På trods af capsid forskel, alle dyr havde en fluorescens middelintensitet værdi (gennemsnitlig grå værdi) spænder mellem 4 til 11 undtagen nethinden # 1, som havde den laveste intensitet, 0,9, og svag tdTomato udtryk. Røde og grå kolonner er AAV2/BP2 og AAV2/PHP. S injicerede nethinder henholdsvis (A-B). dd-PCR blev udført ved hjælp af WPRE primere til AAV genom og 18S primer til normalisering på 2-ugers tid punkt. Retina # 1 viste også markant lavere AAV kopi numre pr 18S kopier (C). Samlet AAV genomer pr nethinden blev også beregnet ved hjælp af WPRE kopi nummer og fortynding faktor for genomisk DNA isolation (D). Røde og grå firkanter er AAV2/BP2 og AAV2/PHP. S injiceres nethinden, henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal.
| ddPCR Primere | |
| ITR2 F | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT |
| ITR2 R | CGGCCTCAGTGAGCGA |
| WPRE F | GGCTGTTGGGCACTGACAA |
| WPRE R | CCAAGGAAAGGACGATGATTTC |
| 18S F | GGCCGTTCTTAGTTGGTGGA |
| 18S R | CCCGGACATCTAAGGGCATC |
Tabel 1: dd-PCR primer sekvenser. Sekvenser af frem- og omvendte primere til WPRE, ITR2 og mus 18S.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol genererede vi to AAV-vektorer, der har forskellige capsidproteiner og titered dem derefter i overensstemmelse hermed. Et af de mest afgørende trin i denne protokol er at producere tilstrækkelige mængder AAVs , der vil give påviselige reporter udtryk efter transduktion12,13.
Titering af AAVs er også en vigtig faktor til at justere doser af AAV for intravitreal injektioner. Når disse vigtige kriterier er opfyldt, er det muligt at kvantificere AAVs transduktionseffektivitet ved hjælp af dd-PCR-metodologi.
Mange laboratorier bruger den kvantitative PCR (qPCR) metode til AAV titering. qPCR-baseret absolut kvantificeringsmetode kræver en standardkurve , der har fortyndinger af kendte mængder mål-DNA18. DD-PCR kræver dog ikke en standardkurve, da den direkte kvantificerer det samlede antal målmolekyler i en given prøve ved at detektere de positive dråber, der har mindst én kopi af mål-DNA. Da dd-PCR er en slutpunktsanalyse, og der ikke kræves nogen standardkurve, er de effektivitetsproblemer, der opstod under qPCR-reaktionen, mindre bekymrende for dd-PCR som pcr med lav effektivitet eller kvaliteten af standardkurver 9. DD-PCR-metoden kan anvendes på prøver, der allerede er forberedt til qPCR. Som det allerede var nævnt i afsnittet Metoder til AAV titering, kræver dd-PCR fortyndede prøver. Dette er et kritisk skridt, da prøvekoncentrationen bør justeres på en sådan måde, at der er tilstrækkelige negative dråber til at udføre Poisson-algoritmen. Med andre ord er det ikke muligt at udføre dd-PCR-reaktionen med prøver med for høje koncentrationer af mål-DNA, der ikke giver negative dråber.
For både AAV titering og transduktion effektivitetsmålinger, forskellige målsæt er mulige at bruge. Til AAV titering bruger vi hovedsageligt AAV2 ITR-specifikke primere på grund af AAV2-rygraden i vores konstruktioner. Det er også muligt at bruge WPRE og andre genspecifikke mål afhængigt af AAV-konstruktionen, der er blevet analyseret.
For at evaluere transduktionseffektiviteten af AAVs i neuronal nethinden anvendte vi dd-PCR-metoden ved hjælp af hele nethindenprøver for at kvantificere den samlede mængde AAV-genomer pr. Nethinde. Vi vurderede nøjagtigheden af metoden ved hjælp af en AAV vektor, der udtrykker tdTomato reporter. Sammenligning af dd-PCR-resultater med tdTomato-udtryksniveauer korreleret undtagen de to outliers. Nethinder # 6 og # 7 gav overskydende AAV genom kopier på trods af at vise lignende fluorescens intensiteter i forhold til nethinden # 2,3 4 eller 5. Dette kan skyldes, at disse nethinder har højere transduktionshastigheder med begrænsede udtryksniveauer eller delvis kan være relateret til varige AAV-partikler eller vektor-DNA i glaslegemet eller neuronal nethinden19,20. Samlet set var dette den eneste begrænsende faktor for vores metode og kan nemt identificeres blandt andre prøver. Vi kvantificerede også det samlede antal AAV-genomer pr. nethinde, som var en af styrkerne ved denne metode. Dette gør det muligt at sammenligne data mellem forskellige laboratorier og partier af dyr. Derfor kan denne metode nemt anvendes til at vurdere transduktionseffektiviteten af en ny serotype, variant eller batch til batchvariation for AAV-vektorer, der ikke har noget reporterudtryk og hjælper os med at kryds sammenligne data ved forskellige indstillinger. Dette er afgørende for AAV-vektorer, der ikke tillader udtryk for en reporter på grund af størrelsesbegrænsninger.
Denne metode giver også et grundlag for andre typer af følsomme assays, der udnytter mål DNA. Ved hjælp af de identiske protokoller kan vi kvantificere mitokondriegenomkopinumre med passende primere. Yderligere forbedringer er også mulige, herunder dissociation af nethinden og flow cytometri sorteringstrin til at kvantificere målet DNA i enten enkelte celler eller partier af celler. Desuden er det også muligt at vurdere korrektion effektiviteten af base redigering ved hjælp af denne metode21,22, som også er kritisk for flere retinale sygdomme og genterapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Oezkan Keles, Josephine Jüttner og Prof. Botond Roska, Institut for Molekylær og Klinisk Oftalmologi Basel, Complex Virus Platform for deres hjælp og støtte til AAV produktion. Vi vil også gerne takke Prof. Jean Bennett, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania for AAV8/BP2 stamme. Dyrearbejde udføres på Gebze Technical University dyreanlæg. For det takker vi Leyla Dikmetas og prof. Uygar Halis Tazebay for teknisk bistand og støtte til husdyrhold. Vi vil også gerne takke Dr. Fatma Ozdemir for hendes kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde er støttet af TUBITAK, tilskud numre 118C226 og 121N275, og Sabanci University Integration tilskud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
| Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
| C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
| C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
| DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
| DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
| DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
| DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
| Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
| Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
| FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
| Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
| Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
| Isoflurane | ADEKA ILAC SANAYI VE TICARET | N01AB06 | anesthetic |
| Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
| Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
| Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
| Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
| Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
| PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
| Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
| Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
| Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
| PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
| QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
| SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER - LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
| Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
| Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
| Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
| Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS. | S01FA06 | pupil dilation |
| Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
| Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |
References
- Herrmann, A. K., Grimm, D. High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious. Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).
- Pillay, S., Carette, J. E. Host determinants of adeno-associated viral vector entry. Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).
- Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids. Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).
- Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. AAV capsid structure and cell interactions. Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).
- Han, I. C., et al. Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats. Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).
- Muraine, L., et al. Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle. Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).
- Cronin, T., et al. Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter. EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).
- Higashimoto, T., et al. The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors. Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Albayrak, C., et al. Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells. Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Juttner, J., et al. Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans. Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).
- Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
- Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12 (2018).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).
- Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. Open source tools for biological image analysis. Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).
- Parks, M. M., et al. Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression. Science Advances. 4 (2), (2018).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Maclachlan, T. K., et al. Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration. Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).
- Stieger, K., et al. Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates. Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).
- Gyorgy, B., et al. Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss. Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).
- Cox, D. B. T., et al.
