Summary
Dit protocol presenteert hoe AAV-transductie-efficiëntie in het netvlies van muizen kan worden gekwantificeerd met behulp van digitale druppel PCR (dd-PCR) samen met kleinschalige AAV-productie, intravitreale injectie, retinale beeldvorming en retinale genomische DNA-isolatie.
Abstract
Veel retinale celbiologische laboratoria gebruiken nu routinematig Adeno-geassocieerde virussen (AAV's) voor genbewerking en regulerende toepassingen. De efficiëntie van AAV-transductie is meestal van cruciaal belang, wat de algehele experimentele resultaten beïnvloedt. Een van de belangrijkste determinanten voor transductie-efficiëntie is het serotype of de variant van de AAV-vector. Momenteel zijn verschillende kunstmatige AAV-serotypen en varianten beschikbaar met verschillende affiniteiten om celoppervlakreceptoren te hosten. Voor retinale gentherapie resulteert dit in verschillende gradaties van transductie-efficiëntie voor verschillende retinale celtypen. Bovendien kunnen de injectieroute en de kwaliteit van de AAV-productie ook van invloed zijn op de retinale AAV-transductie-efficiëntie. Daarom is het essentieel om de efficiëntie van verschillende varianten, batches en methodologieën te vergelijken. De digitale druppel PCR (dd-PCR) methode kwantificeert de nucleïnezuren met hoge precisie en maakt het mogelijk om absolute kwantificering van een bepaald doel uit te voeren zonder enige standaard of referentie. Met behulp van dd-PCR is het ook mogelijk om de transductie-efficiëntie van AAV's te beoordelen door absolute kwantificering van AAV-genoomkopieën in een geïnjecteerd netvlies. Hier bieden we een eenvoudige methode om de transductiesnelheid van AAV's in retinale cellen te kwantificeren met behulp van dd-PCR. Met kleine aanpassingen kan deze methodologie ook de basis vormen voor de kwantificering van het aantal kopieën van mitochondriaal DNA en het beoordelen van de efficiëntie van base editing, cruciaal voor verschillende retinale ziekten en gentherapietoepassingen.
Introduction
Adeno-geassocieerde virussen (AAV's) worden nu vaak gebruikt voor een verscheidenheid aan retinale gentherapiestudies. AAV's bieden een veilige en efficiënte manier van genafgifte met minder immunogeniciteit en minder genoomintegraties. AAV-toegang tot de doelcel vindt plaats door endocytose, die binding van receptoren en co-receptoren op het celoppervlak vereist1,2. Daarom hangt de transductie-efficiëntie van AAV's voor verschillende celtypen voornamelijk af van de capsid en zijn interacties met de gastheercelreceptoren. AAV's hebben serotypen en elk serotype kan verschillende cellulaire / weefseltropismen en transductie-efficiëntie hebben. Er zijn ook kunstmatige AAV-serotypen en varianten gegenereerd door chemische modificatie van de viruscapside, productie van hybride capsiden, peptide-insertie, capsid schuifelen, gerichte evolutie en rationele mutagenese3. Zelfs kleine veranderingen in aminozuurvolgorde of capsidstructuur kunnen een invloed hebben op interacties met gastheercelfactoren en resulteren in verschillende tropismen4. Naast capsid-varianten kunnen andere factoren zoals injectieroute en batch-to-batchvariatie van AAV-productie de transductie-efficiëntie van AAV's in het neuronale netvlies beïnvloeden. Daarom zijn betrouwbare methoden voor de vergelijking van transductiesnelheden voor verschillende varianten noodzakelijk.
De meeste methoden voor het bepalen van de AAV-transductie-efficiëntie zijn afhankelijk van reporter-genexpressie. Deze omvatten fluorescerende beeldvorming, immunohistochemie, western blot of histochemische analyse van het reporter-genproduct5,6,7. Vanwege de groottebeperking van AAV's is het echter niet altijd haalbaar om reportergenen op te nemen om de transductie-efficiëntie te bewaken. Het gebruik van sterke promotors zoals de hybride CMV-versterker / kip beta-actine of Woodchuck hepatitis post-transcriptioneel regulerend element (WPRE) als een mRNA-stabilisatorsequentie compliceert het grootteprobleemverder 8. Daarom zal het ook nuttig zijn om de transductiesnelheid van geïnjecteerde AAV's te definiëren met een meer directe methodologie.
Digitale druppel PCR (dd-PCR) is een krachtige techniek om doel-DNA te kwantificeren uit minuscule hoeveelheden monsters. dd-PCR-technologie is afhankelijk van de inkapseling van het doel-DNA en het PCR-reactiemengsel door oliedruppeltjes. Elke dd-PCR-reactie bevat duizenden druppeltjes. Elke druppel wordt verwerkt en geanalyseerd als een onafhankelijke PCR-reactie9. Analyse van druppels maakt het mogelijk om het absolute aantal doel-DNA-moleculen in elk monster te berekenen door simpelweg het Poisson-algoritme te gebruiken. Omdat de transductie-efficiëntie van de AAV's gecorreleerd is met het kopieaantal AAV-genomen in het neuronale netvlies, gebruikten we de dd-PCR-methode om AAV-genomen te kwantificeren.
Hier beschrijven we een dd-PCR-methodologie om de transductie-efficiëntie van AAV-vectoren te berekenen uit retinaal genomisch DNA6,10. Ten eerste werden AAV's die tdTomato reporter uitdrukken gegenereerd met behulp van het kleinschalige protocol en getiterd door de dd-PCR-methode11. Ten tweede werden AAV's intravitreally geïnjecteerd in het neuronale netvlies. Om de transductie-efficiëntie aan te tonen, hebben we eerst tdTomato-expressie gekwantificeerd met behulp van fluorescerende microscopie en ImageJ-software. Dit werd gevolgd door de isolatie van genomisch DNA voor de kwantificering van AAV-genomen in geïnjecteerde netvliezen met behulp van dd-PCR. Vergelijking van tdTomato-expressieniveaus met de getransduceerde AAV-genomen gekwantificeerd door de dd-PCR toonde aan dat de dd-PCR-methode de transductie-efficiëntie van AAV-vectoren nauwkeurig kwantificeerde. Onze protocollen toonden een gedetailleerde beschrijving van een op dd-PCR gebaseerde methodologie om de efficiëntie van AAV-transductie te kwantificeren. In dit protocol tonen we ook het absolute aantal AAV-genomen dat wordt getransduceerd na intravitreale injecties door simpelweg de verdunningsfactor te gebruiken na genomische DNA-isolatie en de dd-PCR-resultaten. Over het algemeen biedt dit protocol een krachtige methode, die een alternatief zou zijn voor reporterexpressie om transductie-efficiëntie van AAV-vectoren in het netvlies te kwantificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele protocollen werden geaccepteerd door de ethische commissie van de Sabanci University en experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de verklaring van 'The Association for Research in Vision and Ophthalmology' voor het gebruik van dieren in onderzoek
1. Kleinschalige AAV-productie12
- Kweek HEK293T-cellen met behulp van 15 cm platen in volledige 10 ml DMEM / 10% FBS tot 70-80% confluentie.
- Bereid het transfectiemengsel met 20 μg helperplasmide (pHGT1-Adeno1), 7 μg capsidplasmide en 7 μg AAV2-CBA-tdTomato-WPRE-vector en 136 μL PEI-oplossing (1 mg/ml) in 5 ml DMEM.
- Voeg het bereide transfectiemengsel van 5 ml toe aan een celkweekschaal met 10 ml kweekmedia en incubeer de getransfecteerde cellen gedurende 48-60 uur bij 37 °C.
- Verzamel de media 48-60 uur na de transfectie en verteer het met DNase I in een eindconcentratie van 250 E/ml gedurende 30 minuten bij 37 °C.
- Centrifugeer de verteerde media bij 4000 x g,4 °C gedurende 30 minuten en filtreer het vervolgens met een spuitfilter van 0,22 μm in het voorbevochtigde geregenereerde cellulosemembraan gedurende 100 kDa.
- Centrifugeer het membraan van geregenereerde cellulose bij 4000 x g,4 °C gedurende 30 minuten en gooi de media weg.
- Was en centrifugeer het geregenereerde cellulosemembraan met PBS dat 0,001% Pluronic F-68 bevat driemaal bij 4000 x g,4 °C gedurende 30 minuten. Gooi de PBS bij elke stap weg.
- Verzamel geconcentreerde AAV's uit het bovenste deel van het geregenereerde cellulosemembraan en aliquot voor verder gebruik.
- Verteer 5 μL vers gemaakte AAV met DNase I (0,2U/μl) gedurende 15 minuten bij 37 °C voor titering. Dit wordt gevolgd door 10 min bij 95 °C incubatie voor zowel het inactiveren van de DNase I als het afbreken van de virale capsiden.
- Bereid een 10-voudige seriële verdunning van verteerde AAV's met behulp van 0,05% Pluronic F-68. Gebruik AAV2-ITR en WPRE primers voor titratie(tabel 1). De titers werden berekend door dd-PCR-resultaten te vermenigvuldigen met de verdunningsfactoren. De resultaten werden omgezet in genoomkopie/ml (GC/ml).
OPMERKING: AAV-concentraties voor kleinschalige AAV-productie zullen naar verwachting ongeveer 1 x 1012 GC / ml zijn. Dit protocol is niet van toepassing op AAV-stammen die AAV's niet efficiënt vrijgeven in media zoals AAV213.
2. Intravitreale injectie van AAV
-
Voorbereiding van apparatuur
- Bereid voordat u begint 10 μL microsyringe met een stompe naald van 36 G. Spoel vijf keer met 70% EtOH, vijf keer in ddH2O en ten slotte vijf keer met PBS.
- Laad de juiste hoeveelheid AAV in de microsyringe voor elke injectie.
- Bereid de chirurgische naald (hechtdraad, zijde, 6/0), tape, tang en schaar voor.
-
Intravitreale injectie
- Breng 1 druppel van 0,5% tropicamide en 2,5% fenylefrinehydrochloride (bijv. Mydfrine) met oogdruppel aan vóór anesthesie om pupillen te verwijden.
- Anesthetiseer muizen met isofluraan 5% (1 l/min) en ga verder met 1,5% isofluraan (1 l/min) tijdens de procedure. Een kleine isofluraankamer wordt gebruikt voor de eerste inductie.
- Controleer de diepte van de anesthesie door het verlies van de rechtreflex, de ontwenningsreflex en de staartknijpreactie.
- Breng 0,3% tobramycine en 0,1% dexamethason steriele oftalmische oplossing aan op elk oog vóór de injectieprocedure. Toepassing van oogdruppel voorkomt droogheid en oefent ontstekingsremmende en antibacteriële effecten uit.
- Gebruik de chirurgische haak om het bovenste ooglid te stabiliseren. Trek iets naar achteren om het dorsale deel van het oog bloot te leggen. Plak de haak vast aan de bank om hem op zijn plaats te houden.
- Verwijder conjunctiva (minder dan 1 mm2) met de gebogen irisschaar om de sclera van het oog onder de ontleedmicroscoop bloot te leggen. Gebruik een verse en steriele insulinespuit (30 G) om de sclera te doorboren.
- Steek de naald van de microsyringe door dezelfde punctie met behulp van een micromanipulator. Plaats de punt van de naald achter de lens in het midden van de oogschelp.
- Injecteer 1 μL AAV2/BP2 en AAV2/PHP. S-vectoren met concentraties van 1,63 x10 12 GC/ml en 1,7 x10 12 GC/ml langzaam in het glasvocht van het oog. De volumeregeling van het injectievolume gebeurt handmatig. Laat de naald 1 minuut op zijn plaats en trek de naald langzaam terug.
- Laat het ooglid los en breng ontstekingsremmende en antibacteriële topische gelbehandeling aan met 0,3% tobramycine en 0,1% dexamethason op de oogschelp. Monitor en evalueer de muizen in de volgende dagen volgens het scoreblad in termen van uiterlijk (heldere ogen, verzorgde vacht, gebogen), gedrag (activiteit, immobilisatie, zelfverminking) en lichaamsgewicht op een schaal van 0 tot 3. Elke voorwaarde heeft een score van 0-3 en een totale score van 3 of hoger is een beëindigingscriterium.
- Plaats de dieren na herstel in de kooi.
3. Fluorescentie en fundus beeldvorming
- Zeef de muis en verwijd de pupil door druppels van 0,5% tropicamide en 2,5% fenylefrinehydrochloride in elk oog te plaatsen.
- Verdoof het dier met de bovenstaande procedure met isofluraan. Beoordeel de diepte van de anesthesie zorgvuldig door in de poten te knijpen.
- Plaats de muis op het beeldvormingsstadium en controleer de juiste verwijding door de funduscamera te controleren. Breng topische gel (0,2% carbomeer 980) aan op het oppervlak van de ogen om de ogen te beschermen tegen uitdroging onder anesthesie en om het te gebruiken als een koppelingsgel voor beeldvorming.
- Manipuleer de beeldvormingsfase om uit te lijnen met het neusstuk van het objectief. Pas het podium indien nodig aan om het muisoog te centreren. Zodra het oog gecentreerd is, beweegt u het doel langzaam totdat het contact maakt met het oog.
- Voer fundus- en fluorescentiebeeldvorming uit op beide ogen om de tdTomato-expressie op te volgen 1 week en 2 weken na intravitreale injectie (figuur 3B)14. Neem fundus- en fluorescentiebeelden op identieke instellingen voor vergelijking van de expressie van de verslaggever.
4. Retina-isolatie
- Euthanaseer dieren na fundus- en fluorescentiebeeldvorming door CO 2-inhalatie voor netvliesverzameling op een tijdstip van 2 weken.
- Schuif de oogbol naar voren met behulp van een splittertang van 13,5 cm.
- Verwijder de lens samen met het overgebleven glasvocht door zachte druk uit te oefenen met de tang.
- Knip de verbinding van de oogbol met de oogzenuw met een nauwkeurig gebogen tang en knijp zachtjes in het netvlies met dezelfde gebogen tang.
- Breng ontleedde netvliezen over in een microcentrifugebuis.
- Snap freeze retina door de buisjes in de vloeibare stikstof te plaatsen.
5. Weefsel genomische DNA isolatie
- Isoleer genomisch DNA met een gecommercialiseerde Proteinase K-verteringsgebaseerde weefselgenomische DNA-kit.
- Verteer het netvlies bij 55 °C, 200 x g gedurende 30 minuten met Proteinase K, dat al in de kit wordt geleverd.
- Voer de RNase-incubatiestap uit, wasstappen met wasbuffer I en II en ten slotte de elutiestap volgens het protocol van de fabrikant.
- Voeg na de laatste wasbeurt een extra spinstap toe om resterende ethanol te verwijderen.
- Meet de concentratie van genomisch DNA en bewaar monsters bij -20 °C.
6. Druppel digitale PCR-analyse van muizen retina monsters voor kwantificering van virale genomen
- Verdun genomische DNA's van geïnjecteerde netvliezen in 0,05% Pluronic F-68-oplossing om een eindconcentratie van 1 ng/μL voor elk monster te bereiken.
- Voer afzonderlijke reacties uit voor WPRE en 18S met behulp van doelspecifieke primers met een eindconcentratie van 125 nM voor elke primer.
- Voer druppelgeneratie uit in een PCR-reactiemix van 20 μL, waaronder 1 ng genomisch DNA, 125 nM-primers en 2x evagreen supermix.
- Plaats de monstermix in het middelste deel van de cartridge voor het genereren van druppels.
- Nadat het monster in de cartridge is geladen, voegt u 70 μL van de druppelgeneratieolie toe aan de onderste rij van de cartridge.
- Plaats de pakking bovenop de patroon en plaats deze in de druppelgenerator. Zorg ervoor dat er geen opening is tussen de pakking en de patroon.
- Neem voorzichtig ongeveer 40 μL druppeltjes die in de bovenste put worden gegenereerd. Voeg de druppeloplossing toe aan de semi-omrande 96-well PCR-reactieplaat.
- Sluit de PCR-plaat af met een PCR-platensealer met behulp van aluminium afdichtfolie.
- Plaats de PCR-plaat in een 96-well warmtedichte thermische cycler. Gebruik het PCR-protocol; 95 °C gedurende 5 min, 40 cycli van 95 °C gedurende 30 s, 60 °C gedurende 1 min, 4 °C gedurende 5 min, 90 °C gedurende 5 minuten en 4 °C oneindig vasthouden. Pas 2 °C/s ramp rate toe bij elke cyclus om ervoor te zorgen dat de druppels de juiste temperatuur bereiken voor elke stap tijdens de cyclus
- Plaats de PCR-plaat in de druppellezer om druppels te kwantificeren met behulp van dd-PCR-software. Een sjabloon wordt ingesteld met behulp van specifieke instellingen voor evagreen.
- Analyseer gegevens met behulp van een 1D-plotgrafiek met elk monster voor fluorescentie-intensiteit versus druppelgetal. De drempelwaarde is zo gerangschikt dat de druppels boven de drempel als positief en de onderste als negatief worden toegewezen. Dit wordt gevolgd door de toepassing van het Poisson-algoritme om de startconcentratie van doel-DNA in eenheden van kopieën / μL te bepalen. De verhouding van WPRE versus 18S wordt berekend voor het meten van AAV-transductie-efficiëntie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kleinschalige AAV-productie is een snelle en efficiënte methode die vectoren levert voor intravitreale injecties(figuur 1). Kleinschalige AAV-productie geeft meestal titers binnen het bereik van 1 x 1012 GC / ml, wat voldoende is om reporterexpressie in het netvlies te detecteren(figuur 2). Titering van AAV met behulp van dd-PCR geeft consistente resultaten. ITR2- en WPRE-specifieke primers worden routinematig gebruikt en de startconcentratie van elk doelmolecuul werd berekend met dd-PCR-software door modellering als een Poisson-verdeling. Berekeningen werden afgerond door vermenigvuldiging van verdunningsfactoren en omgezet in genoomkopie per ml. AAV's die voor dit protocol worden geproduceerd, hadden titers van respectievelijk 1,63 x10 12 GC/ml en 1,7x10 12 GC/ml voor AAV2/BP2 en AAV2/PHP.S7,15. Ter vergelijking werden identieke tdTomato-expressieconstructen gebruikt voor beide stammen. We injecteerden ongeveer gelijke titers van AAV voor de kwantificering van AAV-transductie-efficiëntie. Na injectie van 1 μL uit de bovengenoemde concentraties AAV's werden dieren in beeld gebracht op tijdstippen van 1 week en 2 weken. Een fundus- en fluorescentiebeeldvormingssysteem werd gebruikt voor zowel AAV2/ BP2 als AAV2 / PHP. S geïnjecteerde netvliezen genereren vergelijkbare reporter expressieprofielen behalve retina #1(Figuur 3A,B). TdTomato-expressie werd gekwantificeerd met behulp van ImageJ-software voor gemiddelde grijswaarde (gemiddelde fluorescentie-intensiteit) om transductie-efficiëntie en reporterexpressie te vergelijken (Figuur 3A,B). Dit is in feite de som van de grijswaarden van alle pixels in de selectie gedeeld door het aantal pixels16. Fluorescerende beelden van Retina #1 toonden slechts een klein gebied van tdTomato-expressie, hoogstwaarschijnlijk als gevolg van terugstroming of lekkage na intravitreale injecties. In overeenstemming met deze bevinding was de fluorescentie-intensiteit van retina # 1 0,9, wat het laagste was in vergelijking met alle netvliezen die intravitreaal werden geïnjecteerd en in beeld gebracht. De gemiddelde fluorescentie-intensiteit lag tussen 4 - 11. Hieruit bleek dat de kwantificering van fluorescerende beelden van tdTomato-expressie succesvol was en correleerde met de getoonde beelden (Figuur 3A,B).
Na beeldvorming van netvliezen werd genomisch DNA geïsoleerd uit geïnjecteerde netvliezen op een tijdstip van 2 weken. dd-PCR werd uitgevoerd met behulp van WPRE-primers voor AAV-genoomkwantificering. Muis 18S werd gebruikt voor de normalisatie van AAV-genomen naar het muizengenoom (Figuur 3C)17. In overeenstemming met de gemiddelde fluorescentie-intensiteit en afbeeldingen had retina # 1 een zeer laag AAV-genoomkopienummer ten opzichte van 18S, 0,011 keer lager in vergelijking met retina # 2. Bovendien geven netvliezen # 2, 3, 4 en 5 vergelijkbare vouwniveauverschillen. De vouwverschillen in vergelijking met retina # 2 voor netvliezen # 3, 4 en 5 waren respectievelijk 1,75, 0,55 en 0,99. Daarvan gaf retina # 3 beide de hoogste fluorescerende intensiteit en het AAV-genoomkopienummer. Hieruit bleek al dat kwantificering van getransduceerde AAV-genomen met dd-PCR correleert met de fluorescentie-intensiteit en dus met de waargenomen tdTomato-expressie. De dd-PCR-methode stelde ons ook in staat om absolute kwantificering van getransduceerde AAV's uit te voeren. Absolute kwantificering van het totale AAV-genoom per netvlies werd eenvoudig berekend door het totale aantal geïdentificeerd uit dd-PCR en de verdunningsfactor voor genomisch DNA te vermenigvuldigen. Dit leverde vergelijkbare resultaten op in vergelijking met 18S genormaliseerde AAV-genoomtransductie-efficiëntie (figuur 3D).
Figuur 1: Stroomschema van de experimentele procedures. Kleinschalige AAV-productie wordt gevolgd door dd-PCR-gebaseerde AAV-titering. AAV's worden intravitreaal geïnjecteerd in het volwassen netvlies. Follow-up van dieren werd uitgevoerd met behulp van een fundus- en fluorescerend beeldvormingssysteem om de expressie van de verslaggever te analyseren. Fundus- en fluorescerende beelden werden genomen op tijdstippen van 1 week en 2 weken. Genomisch DNA wordt geïsoleerd uit geïnjecteerde netvliezen voor analyse met dd-PCR om het totale AAV-genoom te kwantificeren dat aanwezig is in de geïnjecteerde netvliezen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: AAV-titering met behulp van de dd-PCR-methode. (A) De Dd-PCR-methode profiteert van ingekapselde PCR-reacties in een druppel. Na pcr-reactie met behulp van evagreenchemie werden positieve en negatieve druppels voor het doelgen geanalyseerd om het absolute aantal doel-DNA's in een oplossing te bepalen. (rode vakjes in groene druppels). (B) Representatieve dd-PCR-gegevens voor AAV-titering. Verschillende partijen AAV's werden getiterd met behulp van ITR2-primers. Positieve en negatieve druppels worden boven en onder de drempel gescheiden (paarse lijn). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Kwantificering van getransduceerde AAV-genomen in het netvlies door dd-PCR. 16 weken oude wilde dieren werden intravitreally geïnjecteerd met AAV2/BP2 en AAV2/PHP. S-vectoren met respectievelijk 1,63 x10 12 GC/ml en 1,7x10 12 GC/ml. Beide AAV's hadden de identieke tdTomato-expressieconstructie en het injectievolume voor alle AAV's was 1 μL. Geïnjecteerde netvliezen (1-7) werden opgevolgd met fundus- en fluorescentiebeeldvorming. Foto's die zijn gemaakt, zijn gekwantificeerd met behulp van Image J-software. Ondanks het capsid-verschil hadden alle dieren een fluorescentiegemiddelde intensiteitswaarde(gemiddelde grijswaarde)variërend van 4 tot 11, behalve retina # 1 met de laagste intensiteit, 0,9 en zwakke tdTomato-expressie. Rode en grijze kolommen zijn AAV2/BP2 en AAV2/PHP. S geïnjecteerde netvliezen, respectievelijk (A-B). dd-PCR werd uitgevoerd met behulp van WPRE-primers voor AAV-genoom en 18S-primer voor normalisatie op een tijdstip van 2 weken. Retina # 1 toonde ook opvallend lagere AAV-kopieernummers per 18S-kopieën(C). Totale AAV-genomen per retina werden ook berekend met behulp van WPRE-kopienummer en verdunningsfactor voor genomische DNA-isolatie(D). Rode en grijze vierkanten zijn AAV2/BP2 en AAV2/PHP. S geïnjecteerde netvliezen, respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| ddPCR Primers | | |
| ITR2 F | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT |
| ITR2 R | CGGCCTCAGTGAGCGA |
| WPRE F | GGCTGTTGGGCACTGACAA |
| WPRE R | CCAAGGAAAGGACGATGATTTC |
| 18S F | GGCCGTTCTTAGTTGGTGGA |
| 18s R | CCCGGACATCTAAGGGCATC |
Tabel 1: dd-PCR primersequenties. Reeksen van voorwaartse en achterwaartse primers voor WPRE, ITR2 en muis 18S.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol hebben we twee AAV-vectoren gegenereerd die verschillende capsid-eiwitten hebben en ze vervolgens dienovereenkomstig getiterd. Een van de meest cruciale stappen van dit protocol is het produceren van voldoende hoeveelheden AAV's die detecteerbare reporterexpressie opleveren na de transductie12,13.
Titering van AAV's is ook een belangrijke factor om de doseringen van AAV voor intravitreale injecties aan te passen. Zodra deze belangrijke criteria zijn bereikt, is het mogelijk om de transductie-efficiëntie van AAV's te kwantificeren met behulp van de dd-PCR-methodologie.
Veel laboratoria gebruiken de kwantitatieve PCR (qPCR) methode voor AAV titering. qPCR-gebaseerde absolute kwantificeringsmethode vereist een standaardcurve met verdunningen van bekende hoeveelheden doel-DNA18. Dd-PCR vereist echter geen standaardcurve omdat deze rechtstreeks het totale aantal doelmoleculen in een bepaald monster kwantificeert door de positieve druppels te detecteren die ten minste één kopie van het doel-DNA hebben. Aangezien dd-PCR een eindpuntanalyse is en er geen standaardcurve vereist is, zijn de efficiëntieproblemen die zich tijdens de qPCR-reactie hebben voorgedaan minder zorgwekkend voor dd-PCR zoals pcr's met een laag rendement of de kwaliteit van standaardcurven 9. De dd-PCR-methodologie kan worden toegepast op monsters die al zijn voorbereid op qPCR. Zoals al werd vermeld in de sectie Methoden voor AAV-titering, vereist dd-PCR verdunde monsters. Dit is een cruciale stap omdat de monsterconcentratie zo moet worden aangepast dat er voldoende negatieve druppels zijn om het Poisson-algoritme uit te voeren. Met andere woorden, het is niet mogelijk om de dd-PCR-reactie uit te voeren met monsters met te hoge concentraties doel-DNA die geen negatieve druppels opleveren.
Voor zowel AAV-titering als transductie-efficiëntiemetingen zijn verschillende doelensets mogelijk om te gebruiken. Voor AAV-titering gebruiken we voornamelijk AAV2 ITR-specifieke primers vanwege de AAV2-backbone in onze constructies. Het is ook mogelijk om WPRE en andere genspecifieke doelen te gebruiken, afhankelijk van het AAV-construct dat is geanalyseerd.
Om de transductie-efficiëntie van AAV's in het neuronale netvlies te evalueren, pasten we de dd-PCR-methode toe met behulp van hele netvliesmonsters om de totale hoeveelheid AAV-genomen per netvlies te kwantificeren. We beoordeelden de nauwkeurigheid van de methodologie met behulp van een AAV-vector die tdTomato reporter uitdrukt. Vergelijking van dd-PCR-resultaten met tdTomato-expressieniveaus correleerde behalve de twee uitschieters. Retinas #6 en #7 leverden overtollige AAV-genoomkopieën op, ondanks het vertonen van vergelijkbare fluorescentie-intensiteiten in vergelijking met retinas #2,3 4 of 5. Dit kan zijn omdat deze netvliezen hogere transductiesnelheden hebben met beperkte expressieniveaus of gedeeltelijk gerelateerd kunnen zijn aan blijvende AAV-deeltjes of vector-DNA in het glasvocht of neuronale netvlies19,20. Over het algemeen was dit de enige beperkende factor voor onze methode en kan gemakkelijk worden geïdentificeerd tussen andere monsters. We hebben ook het totale aantal AAV-genomen per netvlies gekwantificeerd, wat een van de sterke punten van deze methodologie was. Dit maakt het mogelijk om gegevens tussen verschillende laboratoria en partijen dieren te vergelijken. Daarom kan deze methode eenvoudig worden toegepast om de transductie-efficiëntie van een nieuw serotype, variant of batch-naar-batchvariatie te beoordelen voor AAV-vectoren die geen reporterexpressie hebben en ons helpen om gegevens bij verschillende instellingen te vergelijken. Dit is van cruciaal belang voor AAV-vectoren die de expressie van een melder niet toestaan vanwege groottebeperkingen.
Deze methode biedt ook een basis voor andere soorten gevoelige testen die gebruik maken van doel-DNA. Met behulp van de identieke protocollen kunnen we mitochondriale genoomkopieën kwantificeren met geschikte primers. Verdere verbeteringen zijn ook mogelijk, waaronder dissociatie van het netvlies en flowcytometrie sorteerstappen om het doel-DNA in afzonderlijke cellen of batches cellen te kwantificeren. Bovendien is het ook mogelijk om de correctie-efficiëntie van basisbewerking te beoordelen met behulp van deze methode21,22, die ook van cruciaal belang is voor verschillende netvliesaandoeningen en gentherapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen Oezkan Keles, Josephine Jüttner en Prof. Botond Roska, Institute of Molecular and Clinical Ophthalmology Basel, Complex Viruses Platform bedanken voor hun hulp en ondersteuning voor de productie van AAV. We willen ook Prof. Jean Bennett, Perelman School of Medicine, de Universiteit van Pennsylvania bedanken voor de AAV8 / BP2-stam. Dierwerk wordt uitgevoerd in de dierenfaciliteit van de Gebze Technical University. Daarvoor bedanken we Leyla Dikmetas en Prof. Uygar Halis Tazebay voor technische assistentie en ondersteuning voor de veehouderij. We willen ook Dr. Fatma Ozdemir bedanken voor haar commentaar op het manuscript. Dit werk wordt ondersteund door TUBITAK, subsidienummers 118C226 en 121N275, en Sabanci University Integration grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
| Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
| C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
| C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
| DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
| DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
| DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
| DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
| Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
| Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
| FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
| Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
| Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
| Isoflurane | ADEKA ILAC SANAYI VE TICARET | N01AB06 | anesthetic |
| Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
| Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
| Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
| Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
| Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
| PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
| Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
| Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
| Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
| PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
| QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
| SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER - LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
| Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
| Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
| Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
| Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS. | S01FA06 | pupil dilation |
| Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
| Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |
References
- Herrmann, A. K., Grimm, D. High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious. Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).
- Pillay, S., Carette, J. E. Host determinants of adeno-associated viral vector entry. Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).
- Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids. Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).
- Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. AAV capsid structure and cell interactions. Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).
- Han, I. C., et al. Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats. Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).
- Muraine, L., et al. Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle. Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).
- Cronin, T., et al. Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter. EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).
- Higashimoto, T., et al. The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors. Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Albayrak, C., et al. Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells. Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Juttner, J., et al. Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans. Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).
- Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
- Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12 (2018).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).
- Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. Open source tools for biological image analysis. Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).
- Parks, M. M., et al. Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression. Science Advances. 4 (2), (2018).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Maclachlan, T. K., et al. Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration. Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).
- Stieger, K., et al. Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates. Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).
- Gyorgy, B., et al. Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss. Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).
- Cox, D. B. T., et al.
