Summary
Этот протокол показывает точный и объективный подход к визуализации титрования вируса с использованием кристаллического фиолетового, сравнивая его с оптической микроскопией и иммуноцитохимическим окрашиванием.
Abstract
Титрование вируса является ключевым анализом для вирусологических исследований. Обнаружение цитопатического эффекта (CPE) с помощью анализов TCID50 и анализов бляшечно-образующих единиц (PFU) являются двумя основными методами расчета титра запаса вируса и часто основаны на микроскопическом обнаружении или окрашивании клеток для визуализации. В случае анализа TCID50 объективная визуализация обычно основана на иммуноцитохимическом (ICC) окрашивании внутриклеточного вируса для расчета титров в сочетании с визуальным обнаружением CPE с помощью микроскопии. Однако окрашивание ICC является дорогостоящим и трудоемким. В этом исследовании мы сравнили визуальное наблюдение CPE с помощью микроскопии, окрашивания ICC и кристаллического фиолетового окрашивания для определения титров двух CPE-образующих вирусов, вируса гриппа A (IAV) свиного происхождения и вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV). Мы показываем, что как кристаллическое фиолетовое, так и ICC окрашивание являются более точными, чем визуальное обнаружение CPE, обеспечивая почти одинаковые уровни точности как на IAV, так и на PRRSV. По этой причине здесь мы представляем кристаллическое фиолетовое окрашивание как более быстрый и доступный способ определения титрования вируса на анализе TCID50 для CPE-образующих вирусов, титрованных в клеточных линиях.
Introduction
Титрование вируса с помощью анализа TCID50 является широко используемым методом в исследованиях инфекционных заболеваний1. Хотя вариации математики, лежащей в основе этого метода, были предложены с течением времени1,2,3,4, применяемые в настоящее время методы обнаружения инфекции основаны на визуальном подтверждении через наличие цитопатического эффекта (CPE) с использованием микроскопии5. Чтобы подтвердить визуализацию CPE более объективно на анализах TCID50, иммуноцитохимическое (ICC) внутриклеточное окрашивание, нацеленное на белки вируса, является одним из наиболее часто используемых методов6, поскольку различные вирусы могут продуцировать различные формы CPE. В нашем случае клеточные морфологические изменения аналогичны при заражении как вирусом гриппа А (IAV), так и вирусом репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV), где инфицированные клетки округляются и отделяются от пластины. В случае PRRSV он вызывает CPE, известный как «полное разрушение», когда все клетки в конечном итоге отделяются от колодца. IAV, с другой стороны, может представлять как полное разрушение, так и дополнительный CPE, известный как «субтотальное разрушение», когда небольшое количество клеток не отделяется после заражения7. Однако этот метод занимает много времени и требует использования относительно дорогостоящих реагентов. Важно отметить, что ICC не маркирует CPE, а скорее количество клеток, успешно инфицированных вирусом. Это означает, что клетки, которые были успешно инфицированы к концу инкубации, будут рассматриваться как положительные, даже если инфекция еще не вызвала CPE, и, таким образом, ожидается более высокий процент положительных клеток ICC по сравнению с CPE. По этой причине в этом исследовании мы описываем дополнительный метод визуального обнаружения CPE в анализе TCID50 на основе кристаллического фиолетового, химического вещества с положительным зарядом, которое прикрепляется к клеточным мембранам и используется для окрашивания адгезивных клеток. Кристаллическая фиалка часто используется в вирусологических исследованиях для измерения бляшечных единиц, среди прочих8.
В этом исследовании мы сравниваем чувствительность обнаружения CPE в неокрашенной микроскопии с окрашиванием кристаллического фиолетового цвета и иммуноцитохимическим окрашиванием на основе распознавания вирусного белка, которое, как известно, является более объективным из-за его высокой чувствительности. Это исследование показывает, что как кристаллическое фиолетовое, так и иммуноцитохимическое окрашивание являются более точными, чем обнаружение CPE на основе визуальной микроскопии, и могут быть использованы для объективной идентификации инфицированных скважин при титровании TCID50. Учитывая их способность достигать почти одинакового уровня точности на цитопатических вирусах, протестированных в клеточных линиях, кристаллический фиолетовый представлен как более быстрый и доступный способ определения титрования вируса на анализе TCID50. Предлагаемый способ с использованием кристаллического фиолетового окрашивания занимает в общей сложности 40 мин для выполнения, с 15 мин для инкубации параформальдегида (PFA), 5 мин для инкубации кристаллической фиалки и максимум 15 мин для подготовки материала, буферной промывки и сушки. Протокол иммуноцитохимии, применяемый для сравнения, занимает в среднем 4 ч 30 мин и был выполнен так, как описано ранее9,10. Предложенный метод направлен на то, чтобы помочь визуализировать завершенное титрование вируса. Время заражения и инкубации может быть выполнено с различной компоновкой в зависимости от вируса. Здесь мы протестировали два РНК-вируса с цитопатическим действием на клеточные линии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Протокол титрования
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте цитопатический вирус, заражающий адгезивные клетки. Для этой демонстрации использовались вирус гриппа А (IAV) свиного происхождения (A/California/07/2009/(H1N1)) и вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV) типа 2, штамм NC 1-7-4.
- Титруйте эти вирусы в 96 луночных пластинах в течение 7 дней в шкафу биобезопасности, расположенном в лаборатории уровня биобезопасности 2 (BSL-2).
- Для выполнения этих титрований засейте 96 луночных пластин необходимой клеточной линией. Для PRRSV используйте клеточную линию MA-104, а для IAV используйте клеточную линию MDCK. Для клеточной культуры используйте среду DMEM, дополненную 10% FBS, L-глутамином и пенициллин-стрептомицином, и выращивайте клетки до слияния.
- Перед заражением промывайте клетки, используя 200 мкл PBS.
- Разбавляют запасы вируса с помощью 10-кратного серии разбавлений путем смешивания 900 мкл среды и 100 мкл вируса. Убедитесь, что трубка правильно вихре, чтобы обеспечить правильное смешивание среды и вируса и избежать ошибок разбавления.
- Отметьте расположение пластины на крышке. Промывайте колодцы 1x фосфатным солевым буфером (PBS). Добавьте 50 мкл инокулята в соответствующие скважины, следуя ранее описанным методам титрования2,3.
- Инкубировать при 37 °C в 5% CO2 инкубаторе в течение 7 дней.
2. Оценка цитопатического эффекта (CPE) с помощью микроскопии
- После 7-дневной инкубации дважды промыть все колодцы 200 мкл 1x PBS.
- Оцените все колодцы пластины под световым микроскопом, чтобы визуально обнаружить CPE. В случае как PRRSV, так и IAV, их CPE состоит из гибели клеток и последующего отрыва от пластины, что приводит к разрушению монослоя. Однако другие вирусы могут представлять различные типы CPE.
3. Протокол окрашивания
ПРИМЕЧАНИЕ: Цитопатический эффект (CPE) оценивали с помощью кристаллического фиолетового окрашивания.
- После 7-дневной инкубации промыть все колодцы, используя 200 мкл 1x PBS дважды.
- Зафиксируйте клетки, добавив 50 мкл/лунку 4% параформальдегида (PFA) в 1x PBS и инкубируйте в течение 15 мин при комнатной температуре (RT).
- После инкубации промыть клетки дважды 200 мкл 1x PBS. Затем добавляют 50 мкл/лунку кристаллической фиалки, разведенной до 4% в воде, и инкубируют в течение 5 мин при РТ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кристалло-фиолетовый химический окрашивает клетки, которые остаются прикрепленными к пластине в момент фиксации, оставляя участки колодца, где ячейки отделяются, как незапятнанные. - Наконец, аспирируйте кристалл фиолетового цвета из лунок и необязательно оставьте пластины сушиться на воздухе в течение 2-5 минут на RT или промыть пластину 200 мкл воды, чтобы удалить лишнее пятно перед визуализацией.
- Используйте ранее описанные методы для математического вычисления титра. Здесь формула Карбера и формула Мюнха были применены для PRRSV и IAV соответственно2,3. Подробная информация об этих уравнениях представлена в разделе репрезентативных результатов.
4. Иммуноцитохимическая (ICC) маркировка
ПРИМЕЧАНИЕ: Иммуноцитохимическую маркировку для обоих вирусов проводили по ранее описанным способам9,10,11.
- После 7-дневной инкубации титрования зафиксируйте клетки с помощью PFA, как описано в шаге 3.2.
- Промыть пластины раствором, состоящим из 100 мл 1 М триса гидрохлорида, 1 г сапонина и 8,5 г NaCl в 900 мл H2O. Затем завершите две дополнительные промывки смесью 1x PBS и 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и инкубируйте с этим раствором Tris-Saponin-NaCl при комнатной температуре (RT) в течение 20 минут.
- Инкубируют все лунки с первичным антителом в течение 2 ч при РТ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем первичных антител для каждого вируса составлял 100 мкл и был получен с использованием разведения 1:300 2% FBS в 1x PBS. - Промыть клетки дважды раствором Tris, Saponin и NaCl, приготовленным на этапе 4.2.
- Инкубируют все лунки с вторичным антителом в течение 1 ч при РТ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем вторичного антитела составлял 100 мкл и был получен с использованием разведения 1:250 2% FBS в 1x PBS. - Промыть клетки разбавлением Tris, Saponin и NaCl, как описано в шаге 4.2.
- Аспирировать предыдущее разведение и инкубировать пластины с 200 мкл/лунку раствора аминоэтилкарбазола (АЭК) при окончательном разведении 1:50 в воде по указанию производителя в течение 30 мин при РТ.
- После инкубации отбросьте раствор AEC и добавьте 100 мкл/лунку 1x PBS для визуализации с помощью микроскопии.
- Математически выведите титр, как описано в шаге 3.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Уравнения, используемые для математического вычисления титра, были ранее описаны2,3.
Вкратце, для PRRSV мы применяем метод Карбера:
Титр (TCID50) = 10 T + 1,3 где:
В этой формуле d = отрицательный лог последнего разведения с полным положительным вирусным ответом: пять положительных реплик; r = журнал диапазона разрежения; N = число реплик путем разбавления; n = количество скважин с положительным вирусным ответом на следующие разведения.
В случае IAV мы используем формулу Мюнха:
Для получения подробной информации о каждом математическом методе см. Ramakrishnan et al., (2016) и Reed et al., (1938)2,3.
В качестве наглядного примера титр, полученный для PRRSV, показанный на рисунке 1 , будет рассчитываться следующим образом:
Количество положительных лунок, полученных при сравнении ICC (левая половина пластины) и окрашивания Crystal Violet (правая часть пластины), было очень похожим как для PRRSV (рисунок 1), так и для IAV (рисунок 2) и в обоих случаях было способно обнаружить от одной до двух положительных ям больше, чем CPE, наблюдаемый до окрашивания с помощью микроскопии, даже несмотря на то, что эти различия не были статистически значимыми (таблица 1). В то время как выход, полученный от кристаллического фиолетового окрашивания, обычно является положительно-отрицательным колодцем, при использовании ICC происходит постепенное уменьшение количества положительных клеток, которые маркируются по мере того, как вирус становится более разбавленным. Кроме того, ICC требует использования микроскопа для визуализации, в то время как кристаллический фиолетовый может быть легко выполнен на глаз.
Рисунок 1: Сравнение кристаллического фиолетового окрашивания и иммуноцитохимической маркировки (ICC) для титрования PRRSV. (A) Визуализация пластины титрования на глаз, причем левая половина соответствует кристаллическому фиолетовому окрашиванию, а правая половина соответствует ICC; B) схематическое изображение пластины с положительными лунками, обозначенными знаком "+" с использованием кристаллического фиолетового и ICC; (C) Микроскопическое изображение (10x объектив) кристаллического фиолетового окрашивания; (D) Микроскопическое изображение (10-кратное объективное) положительных скважин, обнаруженных ICC. Выполнены десятикратные разведения вируса от -1 до -8 лог. Изображения положительных скважин от -1 до -5 log. Неинфицированные клетки использовались в качестве отрицательного контроля (называемого отрицательным). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Сравнение кристаллического фиолетового окрашивания и иммуноцитохимической маркировки (ICC) для титрования IAV. (A) Визуализация пластины титрования на глаз, причем левая половина соответствует кристаллическому фиолетовому окрашиванию, а правая половина соответствует ICC; B) схематическое изображение пластины с положительными лунками, обозначенными знаком "+" с использованием кристаллического фиолетового и ICC; (C) Микроскопическое изображение (10x объектив) кристаллического фиолетового окрашивания; (D) Микроскопическое изображение (10-кратное объективное) положительных скважин, обнаруженных ICC. Десятикратные разведения вируса от 10-1 до 10-8. были выполнены. Изображения положительных скважин от -1 до -5 log. Неинфицированные клетки использовались в качестве отрицательного контроля (называемого отрицательным). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Сравнение титров, полученных как для PRRSV, так и для IAV с использованием трех подходов визуализации. Титры, выраженные как среднее ± SEM log10 TCID50/mL в n = 5 репликатах. Статистически значимых различий между группами обнаружено не было (p > 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Титрование вирусов обычно используется в вирусологических исследованиях, при этом наиболее часто используются определения PFU и анализы TCID501,2,3,4. Оба метода основаны на обнаружении CPE в инфицированных клетках, и хотя они могут быть визуально оценены с помощью микроскопии, окрашивание обычно применяется для получения более объективного результата или даже для сокращения времени инкубации. В случае TCID50 одной из наиболее часто используемых альтернатив визуальному обнаружению CPE, которая предлагает точную и объективную меру, является окрашивание ICC6, которое является трудоемким и часто дорогостоящим из-за использования специфических антител9,10. Однако, несмотря на то, что этот тип анализа также выигрывает от применения кристаллического фиолетового окрашивания для визуализации, нет сравнительных исследований, оценивающих различия в чувствительности между ICC и кристаллическим фиолетовым окрашиванием. Таким образом, предложенный здесь протокол является подходящим вариантом для титрования вирусных запасов на основе TCID50, поскольку применение кристаллической фиалки показало сопоставимый уровень точности с чувствительным иммуноцитохимическим внутриклеточным окрашиванием, нацеленным на специфический вирусный белок. Этот метод занимает меньше времени, как правило, проще в выполнении и более точен, чем обнаружение CPE с помощью микроскопии, демонстрируя, что этот подход полезен для использования для титрования вирусов, которое выполняется на регулярной основе.
Критическими этапами для этого кристаллического фиолетового окрашивания являются правильная фиксация клеток после 7-дневного инкубационного периода для титрования и нанесение достаточного количества кристаллического фиолетового для покрытия всей поверхности скважин. Чтобы добиться успешного окрашивания, убедитесь, что неинфицированные клетки были должным образом покрыты кристаллической фиалкой, и что все колодцы окрашены. Это указывает на то, что клетки были здоровы, и протокол работал так, как ожидалось.
В заключение, использование кристаллического фиолетового окрашивания предлагается в качестве более быстрой и менее дорогостоящей альтернативы для объективного обнаружения CPE на анализах TCID50 с точностью, аналогичной конкретной внутриклеточной маркировке ICC, обычно применяемой во время этого типа титрования. Тем не менее, могут быть случаи, когда патоген-специфические антитела способны обнаруживать положительные лунки, которые останутся незамеченными нашим кристально-фиолетовым методом, поскольку ICC-положительные результаты покажут успешно инфицированные клетки, даже до того, как инфекция приведет к CPE. Поэтому, несмотря на то, что мы не обнаружили существенных различий между ними, настоятельно рекомендуется протестировать оба метода для оценки уровня чувствительности при титровании каждого вируса для определения потенциальных различий и последующих корректировок перед обычным использованием этого окрашивания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить доктора Фрэнка Шолле за его полезные комментарии в рукописи, Хлою Мариант за ее помощь с микроскопическими изображениями и Терезу М. Тидже за ее полезную английскую редакцию.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plates | Genesee | 25-221 | Clear, flat bottom |
| AEC solution | Thermo Fisher | 1122 | |
| Crystal violet | Thermo Fisher | C581-25; C581-100 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1480 | |
| Paraformaldehide | Thermo Fisher | J19943 | |
| Primary Influenza Antibody | Bioss | BS-0344R | |
| Primary PRRSV Antibody | Bioss | BS-10043R | |
| Saponin | Thermo Scientific | AAA1882014 | |
| Secondaty antibody | Invitrogen | 31460 | |
| Tris Hydrochloride | Thermo Scientific | AM9856 |
References
- Kärber, G. Contribution to the collective treatment of pharmacological series experiments. Naunyn-Schmiedeberg's Archive for Experimental Pathology and Pharmacology. 162 (4), 480-483 (1931).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. American Journal of Epidemiology. 27 (3), 493-497 (1938).
- Spearman, C. The method of right and wrong cases (constant stimuli) without Gauss's formulae. British Journal of Psychology. 2 (3), 227 (1908).
- Darling, A. J., Boose, J. A., Spaltro, J. Virus assay methods: accuracy and validation. Biologicals. 26 (2), 105-110 (1998).
- Kim, J., Chae, C. A comparison of virus isolation, polymerase chain reaction, immunohistochemistry, and in situ hybridization for the detection of porcine circovirus 2 and porcine parvovirus in experimentally and naturally coinfected pigs. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 16 (1), 45-50 (2004).
- Suchman, E., Blair, C.
- Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yángüez, E. Influenza Virus. , Springer. 59-88 (2018).
- Tingstedt, J. -E., Nielsen, J. Cellular immune responses in the lungs of pigs infected in utero with PRRSV: an immunohistochemical study. Viral Immunology. 17 (4), 558-564 (2004).
- Guarner, J., et al. Immunohistochemical and in situ hybridization studies of influenza A virus infection in human lungs. American Journal of Clinical Pathology. 114 (2), 227-233 (2000).
- Nicholls, J. M., et al. Detection of highly pathogenic influenza and pandemic influenza virus in formalin fixed tissues by immunohistochemical methods. Journal of Virological Methods. 179 (2), 409-413 (2012).
