Summary
Denne protokollen viser en nøyaktig og objektiv tilnærming for å visualisere virale titrasjoner ved hjelp av krystallfiolett, ved å sammenligne den med optisk mikroskopi og immunocytokjemisk farging.
Abstract
Viral titrering er en viktig analyse for virologiforskning. Påvisning av cytopatisk effekt (CPE) via TCID50-analyser og plakkdannende enheter (PFU) analyser er de to hovedmetodene for å beregne titeret til et viruslager og er ofte basert på mikroskopideteksjon eller cellefarging for visualisering. Ved TCID50-analyse er objektiv visualisering vanligvis basert på immunocytokjemisk (ICC) farging av intracellulært virus for å beregne titere kombinert med visuell CPE-deteksjon via mikroskopi. Imidlertid er ICC-farging kostbar og tidkrevende. I denne studien sammenlignet vi visuell CPE observasjon via mikroskopi, ICC farging og krystallfiolett farging for å bestemme titers av to CPE-forming virus, Influensa A virus (IAV) av svin opprinnelse og Porcine Reproduktiv og Respiratory Syndrome virus (PRRSV). Vi viser at både krystallfiolett og ICC-farging er mer nøyaktig enn visuell CPE-deteksjon, og presenterer nesten identiske presisjonsnivåer på både IAV og PRRSV. Av denne grunn presenterer vi her krystallfiolett farging som en raskere og rimeligere måte å bestemme virale titrasjoner på en TCID50-analyse for CPE-dannende virus titrert i cellelinjer.
Introduction
Viral titrering via TCID50-analyse er en vanlig brukt teknikk i forskning på smittsomme sykdommer1. Selv om variasjoner på matematikken bak denne metoden har blitt foreslått over tid1,2,3,4, er de for tiden anvendte metodene for infeksjonsdeteksjon avhengig av visuell bekreftelse gjennom tilstedeværelsen av cytopatisk effekt (CPE) ved hjelp av mikroskopi5. For å bekrefte CPE-visualisering mer objektivt på TCID50-analyser, er immunocytokjemisk (ICC) intracellulær farging rettet mot virusets proteiner en av de mest brukte metodene6, da forskjellige virus kan produsere forskjellige former for CPE. I vårt tilfelle er cellemorfologiske endringer like når de er smittet med både Influensa A-virus (IAV) og Porcine Reproduktivt og Respiratorisk syndrom Virus (PRRSV), hvor infiserte celler runder opp og løsner fra platen. Når det gjelder PRRSV, forårsaker det en CPE kjent som "total ødeleggelse", hvor alle celler ender opp med å løsne fra brønnen. IAV derimot, kan presentere både total ødeleggelse og en ekstra CPE kjent som "subtotal ødeleggelse" der et lite antall celler ikke løsner etter infeksjon7. Denne teknikken er imidlertid tidkrevende å utføre og krever bruk av relativt kostbare reagenser. Det er viktig å merke seg at ICC ikke merker CPE, men heller antall celler som er infisert av viruset. Dette innebærer at cellene som ble vellykket smittet ved slutten av inkubasjonen, vil bli sett på som positive selv om infeksjonen ikke har forårsaket CPE ennå, og dermed forventes en høyere prosentandel av ICC-positive celler sammenlignet med CPE. Av den grunn beskriver vi i denne studien en komplementær metode for visuell deteksjon av CPE i en TCID50-analyse basert på krystallfiolett, et kjemikalie med en positiv ladning som festes til cellemembraner og brukes til å fargelegge celler. Krystallfiolett brukes ofte i virologiforskning for å måle plakkdannende enheter, blant andre8.
I denne studien sammenligner vi følsomheten til ikke-farget mikroskopi CPE-deteksjon med krystallfiolett farging og immunocytokjemisk farging basert på viral proteingjenkjenning, som er kjent for å være mer objektiv på grunn av sin høye følsomhet. Denne studien viser at både krystallfiolett og immunocytokjemisk farging er mer nøyaktig enn visuell mikroskopibasert CPE-deteksjon og kan brukes til objektivt å identifisere infiserte brønner i en TCID50-titrering. Gitt deres evne til å nå nesten identisk nøyaktighetsnivå på de cytopatiske virusene som er testet i cellelinjer, presenteres krystallfiolett som en raskere og rimeligere måte å bestemme virale titrasjoner på en TCID50-analyse. Den foreslåtte metoden ved hjelp av krystallfiolett farging tar en total tid på 40 min å utføre, med 15 min for paraformaldehyd (PFA) inkubasjon, 5 min for krystallfiolett inkubasjon og maksimalt 15 min for materialforberedelse, buffervask og tørking. Immunocytokjemiprotokollen som brukes til sammenligning tar en gjennomsnittlig tid på 4 t 30 min og ble utført som tidligere beskrevet9,10. Metoden som foreslås tar sikte på å visualisere en fullført viral titrering. Infeksjons- og inkubasjonstider kan utføres med forskjellig layout avhengig av viruset. Her testet vi to RNA-virus med cytopatisk effekt på cellelinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Titreringsprotokoll
MERK: Bruk et cytopatisk virus som infiserer tilhengerceller. For denne demonstrasjonen ble Influensa A Virus (IAV) av svineopprinnelse (A/California/07/2009/(H1N1)) og Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) Type 2, stamme NC 1-7-4 brukt.
- Titrate disse virusene i 96 brønnplater i 7 dager i et biosikkerhetsskap som ligger i et Biosafety Level 2 (BSL-2) laboratorium.
- For å utføre disse titrasjonene, frø 96 brønnplater med den nødvendige cellelinjen. For PRRSV bruker du MA-104-cellelinjen og bruker MDCK-cellelinje for IAV. For cellekulturen, bruk DMEM medium supplert med 10% FBS, L-Glutamine og Penicillin-Streptomycin og vokse cellene til samløp.
- Før infeksjon, vask cellene ved hjelp av 200 μL PBS.
- Fortynn viruslagrene ved hjelp av 10 ganger fortynningsserie ved å blande 900 μL medier og 100 μL virus. Sørg for å virvel røret riktig for å sikre riktig blanding av mediet og viruset og for å unngå fortynningsfeil.
- Merk utformingen av platen på lokket. Vask brønnene med 1x fosfat saltvannsbuffer (PBS). Tilsett 50 μL av inokulumet i de tilsvarende brønnene etter tidligere beskrevne titreringsmetoder2,3.
- Inkuber ved 37 °C i en 5 % CO2-inkubator i 7 dager.
2. Vurdering av cytopatisk effekt (CPE) via mikroskopi
- Etter 7-dagers inkubasjon, vask alle brønner med 200 μL 1x PBS to ganger.
- Vurder alle brønnene på platen under et lysmikroskop for å visuelt oppdage CPE. Når det gjelder både PRRSV og IAV, består deres CPE av celledød og påfølgende løsrivelse fra platen, noe som fører til monolayerforstyrrelse. Andre virus kan imidlertid presentere forskjellige typer CPE.
3. Fargingsprotokoll
MERK: Cytopatisk effekt (CPE) ble vurdert via krystallfiolett farging.
- Etter 7-dagers inkubasjon, vask alle brønnene med 200 μL 1x PBS to ganger.
- Fest cellene ved å tilsette 50 μL/brønn på 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS og inkubere i 15 minutter ved romtemperatur (RT).
- Etter inkubasjon, vask cellene to ganger med 200 μL 1x PBS. Tilsett deretter 50 μL/brønn krystallfiolett fortynnet til 4% i vann og inkuber i 5 min ved RT.
MERK: Krystallfiolett kjemisk flekker cellene som forblir festet til platen på tidspunktet for fiksering, forlater delene av brønnen der cellene løsnet som unstained. - Til slutt, aspirert krystallfiolett fra brønnene og eventuelt la platene lufttørke i 2-5 min ved RT eller vask platen med 200 μL vann for å fjerne overflødig flekk før visualisering.
- Bruk tidligere beskrevne metoder for å matematisk beregne titeret. Her ble Karber formel og Muench formel brukt for PRRSV og IAV, henholdsvis2,3. Detaljer om disse ligningene presenteres i den representative resultatdelen.
4. Immunocytokjemisk (ICC) merking
MERK: Immunocytokjemi merking for begge virus ble utført etter tidligere beskrevne metoder9,10,11.
- Etter 7-dagers inkubasjon av titreringen, fest cellene ved hjelp av PFA som beskrevet i trinn 3.2.
- Vask platene med en løsning sammensatt av 100 ml 1 M Tris hydroklorid, 1 g Saponin og 8,5 g NaCl i 900 ml H2O. Deretter fullfører du to ekstra vasker med en blanding av 1x PBS og 5% Fetal Bovine Serum (FBS) og inkuberer med den Tris-Saponin-NaCl-løsningen ved romtemperatur (RT) i 20 minutter.
- Inkuber alle brønnene med det primære antistoffet i 2 timer ved RT.
MERK: Volumet av primære antistoffer for hvert virus var 100 μL og ble tilberedt ved hjelp av en 1:300 fortynning av 2% FBS i 1x PBS. - Vask cellene to ganger med Tris-, Saponin- og NaCl-løsningen som ble utarbeidet i trinn 4.2.
- Inkuber alle brønnene med sekundært antistoff i 1 time ved RT.
MERK: Volumet av sekundært antistoff var 100 μL og ble tilberedt ved hjelp av en 1:250 fortynning av 2% FBS i 1x PBS. - Vask cellene med Tris- og Saponin- og NaCl-fortynning som beskrevet i trinn 4.2.
- Aspirer den forrige fortynning og inkuber platene med 200 μL/ brønn av aminoetylkarbazol (AEC) løsning ved en endelig fortynning på 1:50 i vann i henhold til produsentens anvisninger i 30 min ved RT.
- Etter inkubasjon, kast AEC-løsningen og tilsett 100 μL/brønn på 1x PBS for avbildning via mikroskopi.
- Matematisk utlede titeret som beskrevet i trinn 3.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ligningene som ble brukt til matematisk beregning av titeret ble tidligere beskrevet2,3.
Kort sagt, for PRRSV bruker vi Karber-metoden:
Titer (TCID50) = 10 T + 1,3 der:
I denne formelen d = negativ logg over den siste fortynning med fullstendig positiv virusrespons: fem positive replikerer; r = logg over fortynningsområde; N = antall replikeringer ved fortynning; n = antall brønner med positiv virusrespons ved neste fortynning.
Når det gjelder IAV, bruker vi Muench-formelen:
For detaljer om hver matematiske metode, se Ramakrishnan et al., (2016) og Reed et al., (1938)2,3.
Som et visuelt eksempel vil titeret som er oppnådd for PRRSV vist i figur 1 , beregnes på følgende måte:
Antall positive brønner oppnådd når ICC (venstre halvdel av platen) og Crystal Violet farging (høyre del av platen) ble sammenlignet var svært likt for både PRRSV (figur 1) og IAV (figur 2) og var i begge tilfeller i stand til å oppdage mellom en og to positive brønner mer enn CPE observert før farging gjennom mikroskopi, selv om disse forskjellene ikke var statistisk signifikante (tabell 1). Mens utgangen oppnådd fra krystallfiolett farging vanligvis er en positiv negativ brønn, er det ved hjelp av ICC en gradvis reduksjon på antall positive celler som blir merket når viruset blir mer fortynnet. Videre krever ICC bruk av et mikroskop for visualisering, mens krystallfiolett lett kan utføres av øyet.
Figur 1: Sammenligning av krystallfiolett farging og immunocytokjemisk merking (ICC) for PRRSV-titrering. (A) Visualisering av titreringsplaten for øyet, med venstre halvdel tilsvarende krystallfiolett farging og høyre halvdel tilsvarende ICC; (B) Skjematisk representasjon av platen med positive brønner indikert med et '+' skilt ved hjelp av krystallfiolett og ICC; (C) Mikroskopi bilde (10x objektiv) av krystallfiolett farging; (D) Mikroskopibilde (10x mål) av positive brønner påvist av ICC. Ti ganger fortynning av viruset fra -1 til -8 log. ble utført. Bilder av positive brønner fra -1 logg til -5 logg. Celler som ikke ble oppdaget, ble brukt som negativ kontroll (referert til som negative). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Sammenligning av krystallfiolett farging og immunocytokjemisk merking (ICC) for IAV-titrering. (A) Visualisering av titreringsplaten for øyet, med venstre halvdel tilsvarende krystallfiolett farging og høyre halvdel tilsvarende ICC; (B) Skjematisk representasjon av platen med positive brønner indikert med et '+' skilt ved hjelp av krystallfiolett og ICC; (C) Mikroskopi bilde (10x objektiv) av krystallfiolett farging; (D) Mikroskopibilde (10x mål) av positive brønner påvist av ICC. Ti ganger fortynning av viruset fra 10-1 til 10-8. ble utført. Bilder av positive brønner fra -1 logg til -5 logg. Celler som ikke ble oppdaget, ble brukt som negativ kontroll (referert til som negative). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Sammenligning av titerne oppnådd for både PRRSV og IAV ved hjelp av de tre visualiseringsmetodene. Titere uttrykt som gjennomsnittlig ± SEM for log10 TCID50/ml i n = 5 replikerer. Det ble ikke funnet statistisk signifikante forskjeller mellom gruppene (p > 0,05). Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Virale titrasjoner brukes rutinemessig i virologiforskning, med PFU-deteksjon og TCID50-analyser som oftest brukes1,2,3,4. Begge metodene er avhengige av påvisning av CPE i infiserte celler, og selv om de kan vurderes visuelt via mikroskopi, brukes en farging vanligvis for å oppnå et mer objektivt resultat eller til og med redusere inkubasjonstider. Når det gjelder TCID50, er et av de mest brukte alternativene til visuell CPE-deteksjon som tilbyr et nøyaktig og objektivt tiltak ICC-farging6, som er tidkrevende og ofte dyrt på grunn av bruken av spesifikke antistoffer9,10. Men selv om denne typen analyse også drar nytte av anvendelsen av krystallfiolett farging for visualisering, er det ingen komparative studier som vurderer forskjellene i følsomhet mellom ICC og krystallfiolett farging. Dermed er protokollen foreslått her et passende alternativ for TCID50-baserte virale bestandstitreringer, da anvendelsen av krystallfiolett viste et sammenlignbart nøyaktighetsnivå til den sensitive immunocytokjemiske intracellulære fargingen rettet mot spesifikt virusprotein. Denne metoden er mindre tidkrevende, generelt enklere å utføre og mer nøyaktig enn CPE-deteksjon via mikroskopi, noe som viser at denne tilnærmingen er gunstig å bruke til virustitreringer som utføres regelmessig.
De kritiske trinnene for denne krystallfiolette fargingen er en riktig fiksering av cellene etter den 7-dagers inkubasjonsperioden for titrering og påføring av nok krystallfiolett til å dekke hele overflaten av brønnene. For å oppnå vellykket farging, sørg for at ikke-infiserte celler var riktig dekket med krystallfiolett, og at alle brønner er farget. Dette indikerer at cellene var friske, og protokollen fungerte som forventet.
Til slutt foreslås bruken av krystallfiolett farging som et raskere og mindre kostbart alternativ for objektiv deteksjon av CPE på TCID50-analyser, med lignende nøyaktighet som den spesifikke ICC-intracellulær merking som vanligvis brukes under denne typen titrering. Imidlertid kan det være tilfeller der de patogenspesifikke antistoffene er i stand til å oppdage positive brønner som vil gå uoppdaget av vår krystallfiolette metode, siden ICC-positive vil vise vellykkede infiserte celler, selv før infeksjonen fører til CPE. Derfor, selv om vi ikke fant signifikante forskjeller mellom de to, anbefales det sterkt å teste begge metodene for å vurdere følsomhetsnivået i hvert virustitrering for å bestemme potensielle forskjeller og påfølgende justeringer før du bruker denne fargingen rutinemessig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfattere vil gjerne anerkjenne Dr. Frank Scholle for hans nyttige kommentarer i manuskriptet, Chloe Mariant for hennes hjelp med mikroskopibildene og Teresa M. Tiedge for hennes hjelpsomme engelske revisjon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plates | Genesee | 25-221 | Clear, flat bottom |
| AEC solution | Thermo Fisher | 1122 | |
| Crystal violet | Thermo Fisher | C581-25; C581-100 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1480 | |
| Paraformaldehide | Thermo Fisher | J19943 | |
| Primary Influenza Antibody | Bioss | BS-0344R | |
| Primary PRRSV Antibody | Bioss | BS-10043R | |
| Saponin | Thermo Scientific | AAA1882014 | |
| Secondaty antibody | Invitrogen | 31460 | |
| Tris Hydrochloride | Thermo Scientific | AM9856 |
References
- Kärber, G. Contribution to the collective treatment of pharmacological series experiments. Naunyn-Schmiedeberg's Archive for Experimental Pathology and Pharmacology. 162 (4), 480-483 (1931).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. American Journal of Epidemiology. 27 (3), 493-497 (1938).
- Spearman, C. The method of right and wrong cases (constant stimuli) without Gauss's formulae. British Journal of Psychology. 2 (3), 227 (1908).
- Darling, A. J., Boose, J. A., Spaltro, J. Virus assay methods: accuracy and validation. Biologicals. 26 (2), 105-110 (1998).
- Kim, J., Chae, C. A comparison of virus isolation, polymerase chain reaction, immunohistochemistry, and in situ hybridization for the detection of porcine circovirus 2 and porcine parvovirus in experimentally and naturally coinfected pigs. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 16 (1), 45-50 (2004).
- Suchman, E., Blair, C.
- Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yángüez, E. Influenza Virus. , Springer. 59-88 (2018).
- Tingstedt, J. -E., Nielsen, J. Cellular immune responses in the lungs of pigs infected in utero with PRRSV: an immunohistochemical study. Viral Immunology. 17 (4), 558-564 (2004).
- Guarner, J., et al. Immunohistochemical and in situ hybridization studies of influenza A virus infection in human lungs. American Journal of Clinical Pathology. 114 (2), 227-233 (2000).
- Nicholls, J. M., et al. Detection of highly pathogenic influenza and pandemic influenza virus in formalin fixed tissues by immunohistochemical methods. Journal of Virological Methods. 179 (2), 409-413 (2012).
