Summary
यह प्रोटोकॉल क्रिस्टल वायलेट का उपयोग करके वायरल अनुमापन की कल्पना करने के लिए एक सटीक और उद्देश्य दृष्टिकोण दिखाता है, इसकी तुलना ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी और इम्यूनोसाइटोकेमिकल स्टेनिंग के साथ करके।
Abstract
वायरल अनुमापन विषाणु विज्ञान अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण परख है। TCID50 assays और पट्टिका बनाने वाली इकाइयों (PFU) assays के माध्यम से साइटोपैथिक प्रभाव (सीपीई) का पता लगाना वायरस स्टॉक के टिटर की गणना करने के लिए दो मुख्य तरीके हैं और अक्सर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए माइक्रोस्कोपी डिटेक्शन या सेल स्टेनिंग पर आधारित होते हैं। TCID50 परख के मामले में, उद्देश्य विज़ुअलाइज़ेशन आमतौर पर माइक्रोस्कोपी के माध्यम से दृश्य सीपीई का पता लगाने के साथ संयुक्त टिटर्स की गणना करने के लिए इंट्रासेल्युलर वायरस के immunocytochemical (आईसीसी) धुंधला पर आधारित है। हालांकि, आईसीसी धुंधला महंगा और समय लेने वाला है। इस अध्ययन में, हमने माइक्रोस्कोपी, आईसीसी स्टेनिंग और क्रिस्टल वायलेट स्टेनिंग के माध्यम से दृश्य सीपीई अवलोकन की तुलना की ताकि दो सीपीई-बनाने वाले वायरस, इन्फ्लूएंजा ए वायरस (आईएवी) के टिटर्स को निर्धारित किया जा सके सूअर मूल और पोर्सिनी प्रजनन और श्वसन सिंड्रोम वायरस (पीआरआरएसवी)। हम दिखाते हैं कि क्रिस्टल वायलेट और आईसीसी स्टेनिंग दोनों दृश्य सीपीई का पता लगाने की तुलना में अधिक सटीक हैं, जो आईएवी और पीआरआरएसवी दोनों पर परिशुद्धता के लगभग समान स्तर प्रस्तुत करते हैं। इस कारण से, यहां हम क्रिस्टल वायलेट स्टेनिंग को एक तेज़ और अधिक किफायती तरीके के रूप में पेश करते हैं ताकि सीपीई के लिए एक TCID50 परख पर वायरल अनुमापन निर्धारित किया जा सके- सेल लाइनों में titrated वायरस बनाने के लिए।
Introduction
TCID50 परख के माध्यम से वायरल अनुमापन संक्रामक रोग अनुसंधान 1 में एक आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक है। यद्यपि इस विधि के पीछे गणित पर विविधताओं को समय 1,2,3,4 के साथ प्रस्तावित किया गया है, संक्रमण का पता लगाने के वर्तमान में लागू तरीके माइक्रोस्कोपी 5 का उपयोग करके साइटोपैथिक प्रभाव (सीपीई) की उपस्थिति के माध्यम से दृश्य पुष्टि पर निर्भर करते हैं। TCID50 assays पर CPE विज़ुअलाइज़ेशन की अधिक निष्पक्ष रूप से पुष्टि करने के लिए, वायरस के प्रोटीन को लक्षित करने वाले immunocytochemical (ICC) इंट्रासेल्युलर स्टेनिंग सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले तरीकों में से एक है क्योंकि विभिन्न वायरस सीपीई के अलग-अलग रूपों का उत्पादन कर सकते हैं। हमारे मामले में, इन्फ्लूएंजा ए वायरस (आईएवी) और पोर्सिनी प्रजनन और श्वसन सिंड्रोम वायरस (पीआरआरएसवी) दोनों से संक्रमित होने पर सेल रूपात्मक परिवर्तन समान होते हैं, जहां संक्रमित कोशिकाएं प्लेट से गोल और अलग होती हैं। पीआरआरएसवी के मामले में, यह एक सीपीई का कारण बनता है जिसे "कुल विनाश" के रूप में जाना जाता है, जहां सभी कोशिकाएं कुएं से अलग हो जाती हैं। दूसरी ओर, आईएवी, कुल विनाश और एक अतिरिक्त सीपीई दोनों को पेश कर सकता है जिसे "उप-कुल विनाश" के रूप में जाना जाता है जहां कोशिकाओं की एक छोटी संख्या संक्रमण के बाद अलग नहीं होती है। हालांकि, यह तकनीक प्रदर्शन करने में समय लेने वाली है और अपेक्षाकृत महंगे अभिकर्मकों के उपयोग की आवश्यकता होती है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि आईसीसी सीपीई को लेबल नहीं करता है, बल्कि वायरस से सफलतापूर्वक संक्रमित कोशिकाओं की संख्या है। इसका तात्पर्य यह है कि इनक्यूबेशन के अंत तक सफलतापूर्वक संक्रमित होने वाली कोशिकाओं को सकारात्मक के रूप में देखा जाएगा, भले ही संक्रमण ने अभी तक सीपीई का कारण नहीं बनाया हो, और इस प्रकार, सीपीई की तुलना में आईसीसी सकारात्मक कोशिकाओं का एक उच्च प्रतिशत होने की उम्मीद है। इस कारण से, इस अध्ययन में हम क्रिस्टल वायलेट के आधार पर एक TCID50 परख में सीपीई के दृश्य का पता लगाने की एक पूरक विधि का वर्णन करते हैं, एक सकारात्मक चार्ज के साथ एक रसायन जो सेल झिल्ली से जुड़ता है और अनुयायी कोशिकाओं को दागने के लिए उपयोग किया जाता है। क्रिस्टल वायलेट का उपयोग अक्सर विषाणु विज्ञान अनुसंधान में पट्टिका बनाने वाली इकाइयों को मापने के लिए किया जाता है, दूसरों के बीच 8।
इस अध्ययन में, हम वायरल प्रोटीन मान्यता के आधार पर क्रिस्टल वायलेट स्टेनिंग और इम्यूनोसाइटोकेमिकल स्टेनिंग के साथ गैर-दाग माइक्रोस्कोपी सीपीई का पता लगाने की संवेदनशीलता की तुलना करते हैं, जो इसकी उच्च संवेदनशीलता के कारण अधिक उद्देश्य माना जाता है। इस अध्ययन से पता चलता है कि क्रिस्टल वायलेट और इम्यूनोसाइटोकेमिकल स्टेनिंग दोनों दृश्य माइक्रोस्कोपी-आधारित सीपीई डिटेक्शन की तुलना में अधिक सटीक हैं और इसका उपयोग टीसीआईडी 50 अनुमापन में संक्रमित कुओं की निष्पक्ष पहचान करने के लिए किया जा सकता है। सेल लाइनों में परीक्षण किए गए साइटोपैथिक वायरस पर सटीकता के लगभग समान स्तर तक पहुंचने की उनकी क्षमता को देखते हुए, क्रिस्टल वायलेट को एक TCID50 परख पर वायरल अनुमापन निर्धारित करने के लिए एक तेज़ और अधिक किफायती तरीके के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। क्रिस्टल वायलेट स्टेनिंग का उपयोग करने वाली प्रस्तावित विधि को प्रदर्शन करने में 40 मिनट का कुल समय लगता है, पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) इनक्यूबेशन के लिए 15 मिनट, क्रिस्टल वायलेट इनक्यूबेशन के लिए 5 मिनट और सामग्री तैयार करने, बफर धोने और सुखाने के लिए अधिकतम 15 मिनट। तुलना के लिए लागू इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल में 4 घंटे 30 मिनट का औसत समय लगता है और पहले वर्णित 9,10 के रूप में किया गया था। प्रस्तावित विधि का उद्देश्य एक पूर्ण वायरल अनुमापन की कल्पना करने में मदद करना है। संक्रमण और इनक्यूबेशन बार वायरस के आधार पर अलग-अलग लेआउट के साथ किया जा सकता है। यहां हमने सेल लाइनों पर साइटोपैथिक प्रभाव के साथ दो आरएनए वायरस का परीक्षण किया।
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Protocol
1. अनुमापन प्रोटोकॉल
नोट: अनुयायी कोशिकाओं को संक्रमित करने वाले साइटोपैथिक वायरस का उपयोग करें। इस प्रदर्शन के लिए, सूअर मूल के इन्फ्लूएंजा ए वायरस (आईएवी) (ए / कैलिफोर्निया / 07 / 2009 / (एच 1 एन 1) और पोर्सिनी प्रजनन और श्वसन सिंड्रोम वायरस (पीआरआरएसवी) टाइप 2, स्ट्रेन एनसी 1-7-4 का उपयोग किया गया था।
- एक जैव सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल -2) प्रयोगशाला में स्थित एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में 7 दिनों के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेटों में इन वायरस titrate.
- इन अनुमापनों को करने के लिए, आवश्यक सेल लाइन के साथ बीज 96 अच्छी तरह से प्लेटें। PRRSV के लिए, MA-104 सेल लाइन का उपयोग करें और IAV के लिए MDCK सेल लाइन का उपयोग करें। सेल संस्कृति के लिए, 10% FBS, L-Glutamine और Penicillin-Streptomycin के साथ पूरक DMEM माध्यम का उपयोग करें और कोशिकाओं को confluency में विकसित करें।
- संक्रमण से पहले, पीबीएस के 200 μL का उपयोग करके कोशिकाओं को धोएं।
- मीडिया के 900 μL और वायरस के 100 μL मिश्रण द्वारा 10 गुना dilutions श्रृंखला का उपयोग कर वायरस स्टॉक पतला. माध्यम और वायरस के उचित मिश्रण को सुनिश्चित करने और कमजोर पड़ने की त्रुटियों से बचने के लिए ट्यूब को ठीक से भंवर करना सुनिश्चित करें।
- ढक्कन पर प्लेट के लेआउट को चिह्नित करें। कुओं को 1x फॉस्फेट लवणीय बफर (पीबीएस) से धोएं। पहले से वर्णित अनुमापन विधियों के बाद संबंधित कुओं में इनोकुलम के 50 μL जोड़ें2,3.
- 7 दिनों के लिए 5% CO2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
2. माइक्रोस्कोपी के माध्यम से साइटोपैथिक प्रभाव (सीपीई) मूल्यांकन
- 7-दिवसीय इनक्यूबेशन के बाद, 1x PBS के 200 μL के साथ सभी कुओं को दो बार धोएं।
- नेत्रहीन सीपीई का पता लगाने के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत प्लेट के सभी कुओं का आकलन करें। PRRSV और IAV दोनों के मामले में, उनके सीपीई में सेल की मृत्यु और प्लेट से बाद की टुकड़ी होती है, जिससे मोनोलेयर व्यवधान होता है। हालांकि, अन्य वायरस विभिन्न प्रकार के सीपीई पेश कर सकते हैं।
3. धुंधला प्रोटोकॉल
नोट: साइटोपैथिक प्रभाव (सीपीई) का मूल्यांकन क्रिस्टल वायलेट स्टेनिंग के माध्यम से किया गया था।
- 7-दिवसीय इनक्यूबेशन के बाद, 1x PBS के 200 μL का उपयोग करके दो बार सभी कुओं को धोलें।
- 1x PBS में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (PFA) के 50 μL / अच्छी तरह से जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें और कमरे के तापमान (RT) पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- इनक्यूबेशन बाद, 1x PBS के 200 μL के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं। फिर, पानी में 4% तक पतला क्रिस्टल वायलेट का 50 μL / अच्छी तरह से जोड़ें और आरटी पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
नोट: क्रिस्टल बैंगनी रासायनिक उन कोशिकाओं को दागता है जो निर्धारण के समय प्लेट से जुड़े रहते हैं, अच्छी तरह से उन वर्गों को छोड़ देते हैं जहां कोशिकाएं बिना दाग के रूप में अलग हो जाती हैं। - अंत में, कुओं से एस्पिरेट क्रिस्टल वायलेट और वैकल्पिक रूप से प्लेटों को आरटी पर 2-5 मिनट के लिए हवा में सूखने के लिए छोड़ दें या विज़ुअलाइज़ेशन से पहले अतिरिक्त दाग को हटाने के लिए 200 μL पानी के साथ प्लेट को धो लें।
- गणितीय रूप से टिटर की गणना करने के लिए पहले से वर्णित विधियों का उपयोग करें। यहां, कारबर सूत्र और म्यूएंच सूत्र क्रमशः PRRSV और IAV के लिए लागू किए गए थे, क्रमशः 2,3। इन समीकरणों का विवरण प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में प्रस्तुत किया गया है।
4. Immunocytochemical (आईसीसी) लेबलिंग
नोट: दोनों वायरस के लिए Immunocytochemistry लेबलिंग पहले से वर्णित विधियों9,10,11 के बाद किया गया था।
- अनुमापन के 7-दिवसीय इनक्यूबेशन के बाद, चरण 3.2 में वर्णित PFA का उपयोग करके कक्षों को ठीक करें।
- 1 M Tris हाइड्रोक्लोराइड के 100 mL, Saponin के 1 g, और H2O के 900 mL में NaCl के 8.5 g द्वारा बनाए गए समाधान के साथ प्लेटों को धोलें। फिर, 1x PBS और 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के मिश्रण के साथ दो अतिरिक्त washes को पूरा करें और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान (RT) पर उस Tris-Saponin-NaCl समाधान के साथ इनक्यूबेट करें।
- आरटी में 2 ज के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सभी कुओं को इनक्यूबेट करें।
नोट: प्रत्येक वायरस के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी की मात्रा 100 μL थी और 1x PBS में 2% FBS के 1: 300 कमजोर पड़ने का उपयोग करके तैयार की गई थी। - चरण 4.2 में तैयार Tris, Saponin, और NaCl समाधान के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं।
- आरटी में 1 ज के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सभी कुओं को इनक्यूबेट करें।
नोट: द्वितीयक एंटीबॉडी की मात्रा 100 μL थी और 1x PBS में 2% FBS के 1: 250 कमजोर पड़ने का उपयोग करके तैयार की गई थी। - चरण 4.2 में वर्णित के रूप में Tris, Saponin, और NaCl कमजोर पड़ने के साथ कोशिकाओं को धोएं।
- पिछले कमजोर पड़ने के एस्पिरेट और 200 μL / अच्छी तरह से aminoethyl carbazole (AEC) समाधान के साथ प्लेटों को इनक्यूबेट करें, जो आरटी पर 30 मिनट के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए पानी में 1: 50 के अंतिम कमजोर पड़ने पर होता है।
- इनक्यूबेशन बाद, एईसी समाधान को छोड़ दें और माइक्रोस्कोपी के माध्यम से इमेजिंग के लिए 100 μL / 1x PBS के कुएं जोड़ें।
- गणितीय रूप से चरण 3.5 में वर्णित के रूप में टिटर व्युत्पन्न।
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Representative Results
गणितीय रूप से टिटर की गणना के लिए उपयोग किए जाने वाले समीकरणों को पहले 2,3 वर्णित किया गया था।
संक्षेप में, PRRSV के लिए, हम कारबर विधि लागू करते हैं:
टिटर (TCID50) = 10 T + 1.3 जहां:
इस सूत्र में डी = पूर्ण सकारात्मक वायरस प्रतिक्रिया के साथ अंतिम कमजोर पड़ने का नकारात्मक लॉग: पांच सकारात्मक प्रतिकृति; r = कमजोर पड़ने की सीमा का लॉग; एन = कमजोर पड़ने से प्रतिकृतियों की संख्या; n = अगले dilutions पर सकारात्मक वायरस प्रतिक्रिया के साथ कुओं की संख्या।
IAV के मामले में, हम Muench सूत्र का उपयोग करें:
प्रत्येक गणितीय विधि के बारे में विवरण के लिए, रामकृष्णन एट अल. (2016) और रीड एट अल. (1938) 2,3 देखें।
एक दृश्य उदाहरण के रूप में, चित्र 1 में दिखाए गए PRRSV के लिए प्राप्त टिटर की गणना निम्नानुसार की जाएगी:
जब आईसीसी (प्लेट का बायां आधा) और क्रिस्टल वायलेट स्टेनिंग (प्लेट का दाहिना हिस्सा) की तुलना की गई थी, तो प्राप्त सकारात्मक कुओं की संख्या PRRSV (चित्रा 1) और IAV (चित्रा 2) दोनों के लिए अत्यधिक समान थी और दोनों मामलों में माइक्रोस्कोपी के माध्यम से धुंधला होने से पहले देखे गए सीपीई की तुलना में एक और दो सकारात्मक कुओं के बीच का पता लगाने में सक्षम थी, भले ही ये अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं थे (तालिका 1)। जबकि क्रिस्टल वायलेट स्टेनिंग से प्राप्त आउटपुट आमतौर पर एक सकारात्मक-नकारात्मक अच्छी तरह से होता है, आईसीसी का उपयोग करके सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या पर धीरे-धीरे कमी होती है जो लेबल हो जाती हैं क्योंकि वायरस अधिक पतला हो जाता है। इसके अलावा, आईसीसी को विज़ुअलाइज़ेशन के लिए माइक्रोस्कोप के उपयोग की आवश्यकता होती है, जबकि क्रिस्टल वायलेट को आसानी से आंखों द्वारा किया जा सकता है।
चित्रा 1: PRRSV अनुमापन के लिए क्रिस्टल वायलेट स्टेनिंग और इम्यूनोसाइटोकेमिकल लेबलिंग (ICC) की तुलना। (A) आंखों द्वारा अनुमापन प्लेट का विज़ुअलाइज़ेशन, बाएं-आधे क्रिस्टल वायलेट स्टेनिंग के अनुरूप और दाएं-आधे आईसीसी के अनुरूप; (बी) क्रिस्टल वायलेट और आईसीसी का उपयोग करके '+' चिह्न के साथ इंगित सकारात्मक कुओं के साथ प्लेट का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व; (सी) क्रिस्टल वायलेट धुंधला की माइक्रोस्कोपी छवि (10x उद्देश्य); (घ) आईसीसी द्वारा पता लगाए गए सकारात्मक कुओं की माइक्रोस्कोपी छवि (10x उद्देश्य)। -1 से -8 लॉग तक वायरस के दस गुना dilutions प्रदर्शन किया गया था। सकारात्मक कुओं की छवियों से -1 लॉग करने के लिए -5 लॉग. असंक्रमित कोशिकाओं का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण (नकारात्मक के रूप में संदर्भित) के रूप में किया जाता था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: IAV अनुमापन के लिए क्रिस्टल वायलेट स्टेनिंग और इम्यूनोसाइटोकेमिकल लेबलिंग (ICC) की तुलना। (A) आंखों द्वारा अनुमापन प्लेट का विज़ुअलाइज़ेशन, क्रिस्टल वायलेट स्टेनिंग के अनुरूप बाएं-आधे और ICC के अनुरूप दाएं-आधे के साथ; (बी) क्रिस्टल वायलेट और आईसीसी का उपयोग करके '+' चिह्न के साथ इंगित सकारात्मक कुओं के साथ प्लेट का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व; (सी) क्रिस्टल वायलेट धुंधला की माइक्रोस्कोपी छवि (10x उद्देश्य); (घ) आईसीसी द्वारा पता लगाए गए सकारात्मक कुओं की माइक्रोस्कोपी छवि (10x उद्देश्य)। 10-1 से 10-8 तक वायरस के दस गुना कमजोर पड़ने। किया गया। सकारात्मक कुओं की छवियों से -1 लॉग करने के लिए -5 लॉग. असंक्रमित कोशिकाओं का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण (नकारात्मक के रूप में संदर्भित) के रूप में किया जाता था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
तालिका 1: तीन विज़ुअलाइज़ेशन दृष्टिकोणों का उपयोग करके PRRSV और IAV दोनों के लिए प्राप्त टिटर्स की तुलना। titers के औसत ± SEM के रूप में व्यक्त log10 TCID50/ समूहों के बीच कोई सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया (पी > 0.05)। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
वायरल अनुमापन नियमित रूप से वायरोलॉजी अनुसंधान में उपयोग किया जाता है, जिसमें PFU का पता लगाने और TCID50 assays सबसे अधिक उपयोग किया जाता है1,2,3,4। दोनों विधियां संक्रमित कोशिकाओं में सीपीई का पता लगाने पर निर्भर करती हैं, और भले ही उन्हें माइक्रोस्कोपी के माध्यम से नेत्रहीन रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है, आमतौर पर अधिक उद्देश्य परिणाम प्राप्त करने या यहां तक कि इनक्यूबेशन बार को कम करने के लिए एक धुंधला लागू किया जाता है। TCID50 के मामले में, दृश्य सीपीई का पता लगाने के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले विकल्पों में से एक जो एक सटीक और उद्देश्य उपाय प्रदान करता है, वह है आईसीसी धुंधला 6, जो विशिष्ट एंटीबॉडी 9,10 के उपयोग के कारण समय लेने वाला और अक्सर महंगा होता है। हालांकि, भले ही परख के इस प्रकार भी विज़ुअलाइज़ेशन के लिए क्रिस्टल बैंगनी धुंधला के आवेदन से लाभ, वहाँ आईसीसी और क्रिस्टल बैंगनी धुंधला के बीच संवेदनशीलता में अंतर का आकलन कोई तुलनात्मक अध्ययन कर रहे हैं. इस प्रकार, यहां प्रस्तावित प्रोटोकॉल TCID50-आधारित वायरल स्टॉक अनुमापन के लिए एक उपयुक्त विकल्प है, क्योंकि क्रिस्टल वायलेट के आवेदन ने विशिष्ट वायरस प्रोटीन को लक्षित करने वाले संवेदनशील इम्यूनोसाइटोकेमिकल इंट्रासेल्युलर स्टेनिंग के लिए सटीकता का एक तुलनीय स्तर दिखाया। यह विधि कम समय लेने वाली है, आमतौर पर निष्पादित करने में आसान और माइक्रोस्कोपी के माध्यम से सीपीई का पता लगाने की तुलना में अधिक सटीक है, यह दर्शाता है कि यह दृष्टिकोण नियमित आधार पर किए जाने वाले वायरस अनुमापन के लिए उपयोग करने के लिए फायदेमंद है।
इस क्रिस्टल वायलेट धुंधला के लिए महत्वपूर्ण कदम अनुमापन के लिए 7-दिवसीय इनक्यूबेशन अवधि के बाद कोशिकाओं का एक उचित निर्धारण और कुओं की पूरी सतह को कवर करने के लिए पर्याप्त क्रिस्टल बैंगनी के आवेदन हैं। सफल धुंधला प्राप्त करने के लिए, सुनिश्चित करें कि गैर-संक्रमित कोशिकाओं को क्रिस्टल वायलेट के साथ ठीक से कवर किया गया था, और यह कि सभी कुओं को दाग दिया गया है। यह इंगित करता है कि कोशिकाएं स्वस्थ थीं, और प्रोटोकॉल ने उम्मीद के अनुसार काम किया।
अंत में, क्रिस्टल वायलेट स्टेनिंग का उपयोग TCID50 assays पर सीपीई के उद्देश्य का पता लगाने के लिए एक तेज और कम महंगा विकल्प के रूप में प्रस्तावित किया गया है, जिसमें विशिष्ट आईसीसी इंट्रासेल्युलर लेबलिंग के समान सटीकता आमतौर पर इस प्रकार के अनुमापन के दौरान लागू होती है। हालांकि, ऐसे मामले हो सकते हैं जहां रोगज़नक़-विशिष्ट एंटीबॉडी सकारात्मक कुओं का पता लगाने में सक्षम होते हैं जो हमारे क्रिस्टल वायलेट विधि द्वारा अज्ञात हो जाते हैं, क्योंकि आईसीसी पॉजिटिव सफलतापूर्वक संक्रमित कोशिकाओं को दिखाएंगे, इससे पहले कि संक्रमण सीपीई की ओर जाता है। इसलिए, भले ही हमें दोनों के बीच महत्वपूर्ण अंतर नहीं मिला, फिर भी नियमित रूप से इस दाग का उपयोग करने से पहले संभावित अंतर और बाद के समायोजन को निर्धारित करने के लिए प्रत्येक वायरस अनुमापन में संवेदनशीलता के स्तर का आकलन करने के लिए दोनों तरीकों का परीक्षण करने की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
लेखक पांडुलिपि में अपनी सहायक टिप्पणियों के लिए डॉ फ्रैंक शोले को स्वीकार करना चाहते हैं, माइक्रोस्कोपी छवियों के साथ उनकी मदद के लिए क्लोई मैरिएंट और उनके सहायक अंग्रेजी संशोधन के लिए टेरेसा एम।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plates | Genesee | 25-221 | Clear, flat bottom |
| AEC solution | Thermo Fisher | 1122 | |
| Crystal violet | Thermo Fisher | C581-25; C581-100 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1480 | |
| Paraformaldehide | Thermo Fisher | J19943 | |
| Primary Influenza Antibody | Bioss | BS-0344R | |
| Primary PRRSV Antibody | Bioss | BS-10043R | |
| Saponin | Thermo Scientific | AAA1882014 | |
| Secondaty antibody | Invitrogen | 31460 | |
| Tris Hydrochloride | Thermo Scientific | AM9856 |
References
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