Summary
Denne protokol viser en præcis og objektiv tilgang til at visualisere virale titrationer ved hjælp af krystal violet, ved at sammenligne det med optisk mikroskopi og immunocytokemisk farvning.
Abstract
Viral titrering er en vigtig analyse for virologi forskning. Påvisning af cytopatisk effekt (CPE) via TCID50 assays og plaque-danner enheder (PFU) assays er de to vigtigste metoder til at beregne titer af en virus lager og er ofte baseret på mikroskopi afsløring eller celle farvning til visualisering. I tilfælde af TCID50-analyse er objektiv visualisering almindeligvis baseret på immuncytokemisk (ICC) farvning af intracellulær virus til beregning af titere kombineret med visuel CPE-påvisning via mikroskopi. Men, ICC farvning er dyrt og tidskrævende. I denne undersøgelse sammenlignede vi visuel CPE-observation via mikroskopi, ICC-farvning og krystal violet farvning for at bestemme titerne af to CPE-dannende vira, Influenza A-virus (IAV) af svineoprindelse og porcine reproduktive og respiratoriske syndromvirus (PRRSV). Vi viser, at både krystal violet og ICC farvning er mere præcise end visuel CPE detektion, der præsenterer næsten identiske niveauer af præcision på både IAV og PRRSV. Af denne grund præsenterer vi her krystal violet farvning som en hurtigere og mere overkommelig måde at bestemme virale titreringer på en TCID50-analyse for CPE-dannende vira titreret i cellelinjer.
Introduction
Viral titrering via TCID50 assay er en almindeligt anvendt teknik i infektionssygdomme forskning1. Selv om variationer i matematikken bag denne metode er blevet foreslået over tid1,2,3,4, de aktuelt anvendte metoder til infektion afsløring stole på visuel bekræftelse gennem tilstedeværelsen af cytopatisk effekt (CPE) ved hjælp af mikroskopi5. For at bekræfte CPE visualisering mere objektivt på TCID50 assays, immunocytokemiske (ICC) intracellulære farvning rettet mod proteiner af virus er en af de mest almindeligt anvendte metoder6 som forskellige vira kan producere forskellige former for CPE. I vores tilfælde er cellemorfologiske ændringer ens, når de er inficeret med både Influenza A-virus (IAV) og Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV), hvor inficerede celler runde op og løsner sig fra pladen. I tilfælde af PRRSV forårsager det en CPE kendt som "total ødelæggelse", hvor alle celler ender med at løsne sig fra brønden. IAV på den anden side, kan præsentere både total ødelæggelse og en ekstra CPE kendt som "subtotal ødelæggelse", hvor et lille antal celler ikke løsne efter infektion7. Denne teknik er dog tidskrævende at udføre og kræver brug af relativt dyre reagenser. Det er vigtigt at bemærke, at ICC ikke mærker CPE, men snarere antallet af celler, der med succes er inficeret med virus. Dette indebærer, at de celler, der blev med succes inficeret ved udgangen af inkubationen vil blive betragtet som positive, selv om infektionen ikke har forårsaget CPE endnu, og dermed en højere procentdel af ICC positive celler i forhold til CPE forventes. Af denne grund beskriver vi i denne undersøgelse en komplementær metode til visuel påvisning af CPE i en TCID50-analyse baseret på krystal violet, et kemikalie med en positiv ladning, der tillægger cellemembraner og bruges til at plette klæbende celler. Krystal violet er ofte udnyttet i virologi forskning til at måle plaque-dannende enheder, blandt andre8.
I denne undersøgelse sammenligner vi følsomheden af ikke-farvet mikroskopi CPE-detektion med krystal violet farvning og immunocytokemisk farvning baseret på viral proteingenkendelse, som er kendt for at være mere objektiv på grund af dens høje følsomhed. Denne undersøgelse viser, at både krystal violet og immunocytokemisk farvning er mere præcise end visuel mikroskopi-baseret CPE-påvisning og kan bruges til objektivt at identificere inficerede brønde i en TCID50 titrering. I betragtning af deres evne til at nå næsten identisk niveau af nøjagtighed på cytoppatiske vira testet i cellelinjer, krystal violet præsenteres som en hurtigere og mere overkommelig måde at bestemme virale titreringer på en TCID50 assay. Den foreslåede metode ved hjælp af krystal violet farvning tager en samlet tid på 40 min til at udføre, med 15 min for paraformaldehyd (PFA) inkubation, 5 min for krystal violet inkubation og højst 15 min for materiale forberedelse, buffer vasker, og tørring. Immuncytokemiprotokollen, der anvendes til sammenligning, tager en gennemsnitlig tid på 4 timer og blev udført som tidligere beskrevet9,10. Den foreslåede metode har til formål at hjælpe med at visualisere en afsluttet viral titrering. Infektions- og inkubationstider kan udføres med forskellige layout afhængigt af virussen. Her testede vi to RNA-vira med cytoppatisk effekt på cellelinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Titreringsprotokollen
BEMÆRK: Brug en cytoppatisk virus, der inficerer klæbende celler. Til denne demonstration blev influenza A-virus (IAV) af svineoprindelse (A/California/07/2009/(H1N1)) og Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) Type 2, stamme NC 1-7-4 anvendt.
- Titrere disse vira i 96 brøndplader i 7 dage i et biosikkerhedsskab placeret i et Biosafety Level 2 (BSL-2) laboratorium.
- For at udføre disse titreringer, frø 96 brøndplader med den krævede cellelinje. Til PRRSV skal du bruge MA-104-cellelinje og til IAV bruge MDCK-cellelinje. Til cellekulturen skal du bruge DMEM medium suppleret med 10% FBS, L-Glutamin og Penicillin-Streptomycin og vokse cellerne til sammenløb.
- Før infektion skal cellerne vaskes med 200 μL PBS.
- Udvand viruslagrene ved hjælp af 10 gange fortyndingsserier ved at blande 900 μL medier og 100 μL virus. Sørg for at hvirvle røret korrekt for at sikre korrekt blanding af medium og virus og for at undgå fortyndingsfejl.
- Markér pladens layout på låget. Vask brøndene med 1x fosfat saltvandsbuffer (PBS). Der tilsættes 50 μL af inoculum i de tilsvarende brønde efter tidligere beskrevne titreringsmetoder2,3.
- Inkuberes ved 37 °C i en 5% CO2-inkubator i 7 dage.
2. Cytoppatisk effekt (CPE) vurdering via mikroskopi
- Efter inkubationen på 7 dage vaskes alle brønde med 200 μL 1x PBS to gange.
- Vurder alle brønde af pladen under et let mikroskop for visuelt at opdage CPE. I tilfælde af både PRRSV og IAV består deres CPE af celledød og efterfølgende løsrivelse fra pladen, hvilket fører til monolayerforstyrrelser. Andre vira kan dog udgøre forskellige typer CPE.
3. Farvning protokol
BEMÆRK: Cytoppatisk effekt (CPE) blev vurderet via krystal violet farvning.
- Efter inkubationen på 7 dage vaskes alle brøndene med 200 μL 1x PBS to gange.
- Fastgør cellerne ved at tilsætte 50 μL/brønd af 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS og inkuber i 15 min ved stuetemperatur (RT).
- Efter inkubation vaskes cellerne to gange med 200 μL på 1x PBS. Derefter tilsættes 50 μL/brønd af krystal violet fortyndet til 4% i vand og inkuberes i 5 minutter på RT.
BEMÆRK: Krystal violet kemisk pletter de celler, der forbliver knyttet til pladen på tidspunktet for fiksering, forlader de dele af brønden, hvor cellerne løsrevet som unstained. - Endelig aspirere krystal violet fra brøndene og eventuelt lade pladerne til lufttørre i 2-5 min på RT eller vaske pladen med 200 μL vand for at fjerne overskydende plet før visualisering.
- Brug tidligere beskrevne metoder til matematisk at beregne titeren. Her blev Karber-formlen og Muench-formlen anvendt til henholdsvis PRRSV og IAV2,3. Nærmere oplysninger om disse ligninger præsenteres i afsnittet om repræsentativt resultat.
4. Immunocytokemisk mærkning (ICC) mærkning
BEMÆRK: Immunocytokemimærkning for begge vira blev udført efter tidligere beskrevne metoder9,10,11.
- Efter 7-dages inkubation af titreringen skal cellerne ved hjælp af PFA være som beskrevet i trin 3.2.
- Pladerne vaskes med en opløsning, der består af 100 ml 1 M Tris hydrochlorid, 1 g Saponin og 8,5 g NaCl i 900 ml H2O. Derefter udfyldes yderligere to vaske med en blanding af 1x PBS og 5% Fosterkvægserum (FBS) og inkuberes med den Tris-Saponin-NaCl-opløsning ved stuetemperatur (RT) i 20 min.
- Inkuber alle brøndene med det primære antistof i 2 timer på RT.
BEMÆRK: Mængden af primære antistoffer for hvert virus var 100 μL og blev forberedt ved hjælp af en fortynding på 1:300 af 2% FBS i 1x PBS. - Cellerne vaskes to gange med Tris,Saponin og NaCl opløsningen fremstillet i trin 4.2.
- Inkuber alle brøndene med det sekundære antistof i 1 time på RT.
BEMÆRK: Mængden af sekundært antistof var 100 μL og blev forberedt ved hjælp af en fortynding på 1:250 af 2% FBS i 1x PBS. - Cellerne vaskes med Tris, Saponin og NaCl fortynding som beskrevet i trin 4.2.
- Aspirere den tidligere fortynding og inkubere pladerne med 200 μL/brønd af aminoethylcarbazol (AEC) opløsning ved en endelig fortynding af 1:50 i vand efter fabrikantens anvisninger i 30 min på RT.
- Efter inkubation kasseres AEC-opløsningen og tilsættes 100 μL/brønd af 1x PBS til billeddannelse via mikroskopi.
- Matematisk udlede titer som beskrevet i trin 3,5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De ligninger, der anvendes til matematisk beregning titer blev tidligere beskrevet2,3.
Kort sagt anvender vi For PRRSV Karber-metoden:
Titer (TCID50) = 10 T + 1,3 hvor:
I denne formel d = negativ log af den sidste fortynding med komplet positiv virusrespons: fem positive replikerer; r = log over fortyndingsområde N = antal gentagelser ved fortynding; n = antal brønde med positiv virusrespons på de næste fortyndinger.
I tilfælde af IAV bruger vi Muench-formlen:
For detaljer om hver matematisk metode henvises til Ramakrishnan et al., (2016) og Reed et al., (1938)2,3.
Som et visuelt eksempel beregnes den titer, der er opnået for PRRSV vist i figur 1 , på følgende måde:
Antallet af positive brønde opnået, når ICC (venstre halvdel af pladen) og Crystal Violet farvning (højre del af pladen) blev sammenlignet var meget ens for både PRRSV (figur 1) og IAV (figur 2) og var i begge tilfælde i stand til at opdage mellem en og to positive brønde mere end CPE observeret før farvning gennem mikroskopi, selv om disse forskelle ikke var statistisk signifikante (tabel 1). Mens output fra krystal violet farvning er normalt en positiv-negativ brønd, ved hjælp af ICC der er et gradvist fald på antallet af positive celler, der får mærket som virus bliver mere fortyndet. Desuden kræver ICC brug af et mikroskop til visualisering, mens krystal violet let kan udføres af øjet.
Figur 1: Sammenligning af krystal violet farvning og immuncytokemisk mærkning (ICC) for PRRSV titrering. (A) Visualisering af titreringspladen med øjet, med venstre halvdel svarende til krystal violet farvning og højre halvdel svarende til ICC; (B) Skematisk repræsentation af pladen med positive brønde angivet med et '+' tegn ved hjælp af krystal violet og ICC; C) Mikroskopibillede (10x mål) af krystal violet farvning (D) Mikroskopi billede (10x mål) af positive brønde opdaget af ICC. Ti gange fortyndinger af virusset fra -1 til -8 log. Billeder af positive brønde fra -1 log til -5 log. Ikke-inficerede celler blev brugt som negativ kontrol (kaldet negativ). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Sammenligning af krystal violet farvning og immuncytokemisk mærkning (ICC) for IAV titrering. (A) Visualisering af titreringspladen for øjet, med venstre halvdel svarende til krystal violet farvning og højre halvdel svarende til ICC; (B) Skematisk repræsentation af pladen med positive brønde angivet med et '+' tegn ved hjælp af krystal violet og ICC; C) Mikroskopibillede (10x mål) af krystal violet farvning (D) Mikroskopi billede (10x mål) af positive brønde opdaget af ICC. Ti gange fortyndinger af virus fra 10-1 til 10-8. blev udført. Billeder af positive brønde fra -1 log til -5 log. Ikke-inficerede celler blev brugt som negativ kontrol (kaldet negativ). Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: Sammenligning af de titere, der er opnået for både PRRSV og IAV ved hjælp af de tre visualiseringsmetoder. Titere udtrykt som den gennemsnitlige ± SEM af log10 TCID50/mL i n = 5 repliker. Der blev ikke konstateret statistisk signifikante forskelle mellem grupperne (p > 0,05). Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Viral titreringer rutinemæssigt anvendes i virologi forskning, med PFU detektion og TCID50 assays mest almindeligt anvendte1,2,3,4. Begge metoder er afhængige af påvisning af CPE i inficerede celler, og selvom de kan vurderes visuelt via mikroskopi, anvendes en farvning normalt for at opnå et mere objektivt resultat eller endda reducere inkubationstiderne. I tilfælde af TCID50, en af de mest almindeligt anvendte alternativer til visuel CPE detektion, der tilbyder en præcis og objektiv foranstaltning er ICC farvning6, som er tidskrævende og ofte dyrt på grund af udnyttelsen af specifikke antistoffer9,10. Men selv om denne type assay også nyder godt af anvendelsen af krystal violet farvning til visualisering, der er ingen sammenlignende undersøgelser vurdere forskellene i følsomhed mellem ICC og krystal violet farvning. Således er den protokol, der foreslås her, en passende mulighed for TCID50-baserede virale bestandstrimler, da anvendelsen af krystal violet viste et sammenligneligt niveau af nøjagtighed til den følsomme immuncytokemiske intracellulære farvning rettet mod specifikt virusprotein. Denne metode er mindre tidskrævende, generelt lettere at udføre og mere præcis end CPE-detektion via mikroskopi, hvilket viser, at denne tilgang er gavnlig at bruge til virustriter, der udføres regelmæssigt.
De kritiske trin for denne krystal violet farvning er en ordentlig fiksering af cellerne efter 7-dages inkubationstid for titreringen og anvendelsen af nok krystal violet til at dække hele overfladen af brøndene. For at opnå vellykket farvning skal du sikre dig, at ikke-inficerede celler var korrekt dækket af krystal violet, og at alle brønde er farvede. Dette indikerer, at cellerne var sunde, og protokollen fungerede som forventet.
Afslutningsvis foreslås udnyttelsen af krystal violet farvning som et hurtigere og billigere alternativ til objektiv påvisning af CPE på TCID50-analyser med samme nøjagtighed som den specifikke intracellulære mærkning, der almindeligvis anvendes under denne type titrering. Der kan dog være tilfælde, hvor de patogenspecifikke antistoffer er i stand til at opdage positive brønde, der ville gå uopdaget af vores krystal violette metode, da ICC-positiver vil vise vellykkede inficerede celler, selv før infektionen fører til CPE. Derfor, selvom vi ikke fandt signifikante forskelle mellem de to, anbefales det stærkt at teste begge metoder for at vurdere følsomhedsniveauet i hver virustituration for at bestemme potentielle forskelle og efterfølgende justeringer, før du bruger denne farvning rutinemæssigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfattere vil gerne anerkende Dr. Frank Scholle for hans nyttige kommentarer i manuskriptet, Chloe Mariant for hendes hjælp med mikroskopi billeder og Teresa M. Tiedge for hendes nyttige engelske revision.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well cell culture plates | Genesee | 25-221 | Clear, flat bottom |
| AEC solution | Thermo Fisher | 1122 | |
| Crystal violet | Thermo Fisher | C581-25; C581-100 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1480 | |
| Paraformaldehide | Thermo Fisher | J19943 | |
| Primary Influenza Antibody | Bioss | BS-0344R | |
| Primary PRRSV Antibody | Bioss | BS-10043R | |
| Saponin | Thermo Scientific | AAA1882014 | |
| Secondaty antibody | Invitrogen | 31460 | |
| Tris Hydrochloride | Thermo Scientific | AM9856 |
References
- Kärber, G. Contribution to the collective treatment of pharmacological series experiments. Naunyn-Schmiedeberg's Archive for Experimental Pathology and Pharmacology. 162 (4), 480-483 (1931).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. American Journal of Epidemiology. 27 (3), 493-497 (1938).
- Spearman, C. The method of right and wrong cases (constant stimuli) without Gauss's formulae. British Journal of Psychology. 2 (3), 227 (1908).
- Darling, A. J., Boose, J. A., Spaltro, J. Virus assay methods: accuracy and validation. Biologicals. 26 (2), 105-110 (1998).
- Kim, J., Chae, C. A comparison of virus isolation, polymerase chain reaction, immunohistochemistry, and in situ hybridization for the detection of porcine circovirus 2 and porcine parvovirus in experimentally and naturally coinfected pigs. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 16 (1), 45-50 (2004).
- Suchman, E., Blair, C.
- Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yángüez, E. Influenza Virus. , Springer. 59-88 (2018).
- Tingstedt, J. -E., Nielsen, J. Cellular immune responses in the lungs of pigs infected in utero with PRRSV: an immunohistochemical study. Viral Immunology. 17 (4), 558-564 (2004).
- Guarner, J., et al. Immunohistochemical and in situ hybridization studies of influenza A virus infection in human lungs. American Journal of Clinical Pathology. 114 (2), 227-233 (2000).
- Nicholls, J. M., et al. Detection of highly pathogenic influenza and pandemic influenza virus in formalin fixed tissues by immunohistochemical methods. Journal of Virological Methods. 179 (2), 409-413 (2012).
