Summary
В этом протоколе представлена методология для выполнения измерений роста биопленки и биомассы с использованием самосборных ПЦР-пластинчатых устройств глубокой скважины для высокопроизводительного статического скрининга биопленки с 96-луночной крышкой.
Abstract
Бактериальные биопленки трудно искоренить с поверхностей с помощью обычных антимикробных вмешательств. Высокопроизводительные методы 96-луночных микропластин часто используются для культивирования бактериальных биопленок для быстрого тестирования чувствительности к противомикробным препаратам для расчета минимальных значений концентрации эрадикации биопленки (MBEC). Стандартные биопленочные устройства состоят из полистирольных крышек, установленных на 96-луночных микропластинах, и идеально подходят для измерения биомассы биопленки и значений MBEC, но эти устройства ограничены доступной площадью поверхности колышка для накопления биомассы и стоимости. Здесь мы излагаем протокол использования самосборного полипропиленовой 96-луночной ПЦР-пластинчатой привязочной крышки для выращивания биопленок Escherichia coli BW25113 и Pseudomonas aeruginosa PAO1. Описано сравнение 24-часовых биопленок, сформированных на стандартных и глубоких скважинных устройствах каждым видом с использованием окрашивания кристалло-фиолетовой биомассы и анализов определения MBEC. Большая площадь поверхности глубоководных скважинных устройств ожидаемо увеличила общее образование биопленки обоими видами в 2-4 раза. P. aeruginosa образует значительно большую биомассу/мм2 на глубоких колышках скважин по сравнению со стандартным устройством. E. coli имела большую биомассу/мм2 на стандартных полистирольных устройствах по сравнению с устройством глубокой скважины. Анализы эрадикации биопленки с использованием дезинфицирующих средств, таких как гипохлорит натрия (отбеливатель) или бензалкония хлорид (BZK), показали, что оба соединения могут устранить биопленки E. coli и P. aeruginosa из обоих устройств, но при разных значениях MBEC. Уничтожение биопленки BZK привело к переменным значениям E. coli MBEC между устройствами, однако отбеливатель продемонстрировал воспроизводимые значения MBEC как для видов, так и для устройств. Это исследование обеспечивает высокопроизводительный метод глубокой скважины для выращивания больших количеств биопленок на полипропиленовых устройствах для последующих исследований, требующих более высоких количеств статической биопленки.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa и Escherichia coli являются грамотрицательными протеобактериями, которые обычно изучаются на предмет их способности образовывать сидячие, поверхностно-присоединенные клеточные сообщества, известные как биопленки1. Оба вида, при выращивании в виде биопленок, могут секретировать матрицу внеклеточных полимерных веществ (EPS), состоящую в основном из различных полисахаридов и белков, которые также могут включать внеклеточную ДНК и / или липиды, обеспечивая дополнительную клеточную защиту и повышенную выживаемость в суровых, ограниченных питательными веществами средах2,3. Физиология и формирование биопленки обоими видами имеет клиническое значение, поскольку они представляют собой пятерку наиболее часто выделяемых устойчивых к противомикробным препаратам патогенов из крови пациентов больницы, мочевыводящих путей и инфекций легких в Канаде4,5. Также важно отметить, что биопленки, по оценкам, составляют почти 80% всех хронических и рецидивирующих инфекций, вызванных этими видами бактерий6. Из-за секретируемых веществ EPS и более медленной метаболической активности7,8 установленные биопленки становится труднее искоренить, когда они образуются на таких поверхностях, как имплантированные медицинские устройства, рубцовые ткани и в легких пациентов с муковисцидозом9,10, что увеличивает их устойчивость к противомикробным препаратам.
Непокорные свойства роста бактериальных биопленок часто делают их более устойчивыми к антимикробному ингибированию и/или эрадикации2,9. Таким образом, создание методов in vitro для изучения бактериальной биопленочной антимикробной эрадикации имеет первостепенное значение для выбора эффективных соединений для искоренения инфекций, когда они образуются на медицинских пластмассах (например, в обитающих катетерах) и медицинских имплантатах. Наиболее быстрые методы культивирования антимикробной эрадикации биопленки in vitro исследуют рост биопленки как «статическую» культуру биопленки, а не «непрерывные» культуры, где статический рост бактерий контролируется на ранних и поздних стадиях формирования биопленки в течение короткого (24-96 ч) периода времени в той же питательной среде. Методы непрерывной биопленки являются громоздкими для быстрого анализа, поскольку они требуют оценки роста биопленки в течение более длительных периодов времени, выращенных в камерах, которые обеспечивают непрерывный поток и замену питательных сред с меньшим количеством реплик11. Из-за времени и усилий, необходимых для поддержания и создания непрерывных биопленок, статические биопленки in vitro являются наиболее популярными, поскольку они легко адаптируются для высокопроизводительных анализов чувствительности к противомикробным препаратам в пластиковых 96-луночных микротитрных пластинах, а не сложных систем проточных камер, которые ограничивают количество одновременно протестированных культур 12,13 . Простейшие статические «внутрилуночные» микропластинчатые анализы биопленки используют стандартные полистирольные или виниловые (емкость 300 мкл) микротитровые пластины для измерения образования биопленки по бокам и дну каждой скважины и часто в виде колец на границе раздела воздух-поверхность жидкости. Образование бактериальной биопленки в скважине измеряют путем окрашивания осажденной биомассы, прилипшей к лункам после удаления жидкости питательной среды и промывки биопленок12,13. Эти анализы экономически популярны, но часто имеют проблемы с воспроизводимостью из-за присущей им конструкции, поскольку осажденные биопленки подвержены повреждению или потере во время промывки для восстановления клеток и процедур окрашивания биомассы11,14.
Чтобы уменьшить потери биопленки, стандартные коммерческие устройства биопленки улучшили конструкции микропластин биопленки в скважине путем добавления вставляемой 96-луночно привязанной полистирольной крышки к стандартной конструкции пластины 96 в скважине, называемой «стандартным устройством биопленки» в настоящем описании. Добавление привязной крышки расширяет доступную площадь поверхности в каждой микропластине скважины, обеспечивая улучшенное сцепление с поверхностью и образование биомассы биопленки15,16. Стандартные устройства крышки с привязкой к биопленке позволяют лучше восстанавливать, удалять и промывать биопленку для последующего тестирования чувствительности к антимикробной биопленке и эрадикации, когда привязанные крышки вставляются в новые пластины микротитров, содержащие проблемы с лекарственными средствами или условиями роста. Подобно методам микропластин биопленки в скважине, восстановленные материалы из удаленных и промытых устройств с привязанной крышкой позволяют проводить испытания на выживание клеток и окрашивание биомассы биопленки, как правило, с использованием составов кристалло-фиолетового (CV) красителя 17,18,19. Стандартные устройства биопленки также оптимальны для скрининга антимикробной чувствительности биопленки. Эти анализы контролируют ингибирование роста биопленки двумя способами: 1) Когда противомикробные препараты добавляются к клеткам в начале роста, он может определить минимальное значение концентрации ингибирования биопленки (MBIC). 2) Когда установленные биопленки образуются на колышках через 24 часа, а затем подвергаются воздействию противомикробных препаратов, можно определить минимальную концентрацию эрадикации биопленки (MBEC) 17,20. Подобно устройствам для микропластинчатой биопленки в скважине, стандартные устройства для биопленки имеют некоторые заметные ограничения, такие как их высокая стоимость за устройство, они неавтоклавируемы и менее долговечны для химических растворителей из-за используемого материала полистирольной пластины. Стандартные биопленочные устройства также имеют низкое отношение площади поверхности к привязке, что ограничивает максимальные рабочие объемы в каждой скважине до 200 мкл. Эти факторы могут сделать стандартные устройства биопленки более сложными для использования в исследованиях, которые требуют большего количества биопленки в формате с высокой пропускной способностью.
Здесь мы описываем метод статической биопленки с 96-луночными крышками, разработанный в нашей лаборатории с использованием коммерчески доступных полипропиленовых полупоглиновых 0,5 мл 96-луночных ПЦР-пластин, установленных на 96-луночных микротитрных пластинах, имеющих скважины глубже, чем стандартная пластина (Таблица материалов). Эти собранные устройства имеют максимальный рабочий объем 750 мкл при использовании для выращивания биопленки (здесь известной как «устройство глубокой биопленки»). Преимуществами использования этих устройств для глубокой биопленки являются их более низкая стоимость по сравнению со стандартными биопленочными устройствами, они могут быть стерилизованы путем автоклавирования, и они увеличивают площадь поверхности для образования биопленки на более крупной внешней ПЦР-пластине «трубка / колышки». С помощью этого метода мы показываем применение этих устройств для выращивания и характеристики биомассы биопленки, образованной Escherichia coli BW25113 и P. aeruginosa PAO1. Методы определения значений MBEC с использованием анализов эрадикации биопленки описаны с использованием четвертичного аммониевого соединения дезинфицирующего бензалкония хлорида (BZK) и гипохлорита натрия (отбеливателя) противомикробных препаратов. Антисептическое / дезинфицирующее средство BZK было выбрано, поскольку это соединение часто используется для ингибирования биопленок с загрязненных поверхностей, но, как сообщается, оно менее эффективно для уничтожения хорошо зарекомендовавших себя биопленок21. Отбеливатель является высокоэффективным химическим веществом для уничтожения установленных биопленок и является основой химической дезинфекции 22. Оба дезинфицирующего средства обеспечивают полезное сравнение значений MBEC для каждого устройства биопленки21. Протокол для оценки этого устройства биопленки с использованием анализов окрашивания CV и эрадикации биопленки для определения MBEC кратко изложен в этой статье. Блок-схема протокола была включена для упрощенного обзора рабочего процесса для этих методов (рисунок 1).
Protocol
1. Асептическая подготовка культуры к росту биопленки (Дни 0-1)
- На 0-й день проведите желаемый бактериальный штамм (штаммы) для тестирования из криоконсервированного материала (в глицерине или диметилсульфоксиде (DMSO)) непосредственно на питательную агаровую пластину с антимикробным отбором по мере необходимости штамма. Инкубировать агаровые пластины при оптимальной температуре (37 °C) и времени (18-22 ч) для роста штамма.
- На следующий день (День 1) привить колонию из агаровой пластины в 5 мл питательной среды при оптимальных условиях роста. Эти культуры будут использоваться в качестве стартовых прививок 2-го дня для устройств биопленки (см. шаг 2.2; Рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого исследования E. coli K-12 BW21153 и P. aeruginosa PAO1 выращивали в среде Лурия-Бертани (LB) при 37 °C в течение 18 ч с встряхиванием при 160 оборотах в минуту (об/мин).- Подготовьте по меньшей мере 3 независимо культивируемых штамма для получения биологических реплик для измерения биопленки из-за статистической изменчивости образования биомассы биопленки на устройствах с прикрепленной крышкой.
2. Подготовка и прививка пластин (День 2)
- Наполните наружные колодцы автоклавной 96-луночной полипропиленовой плиты объемом 1,1 мл/лунку стерильной водой объемом 750 мкл/скважина (рисунок 2А). Заполните отрицательные контрольные скважины (скважины с неинокулированными средами; колонка В) упростной средой 750 мкл, а остальные скважины средой роста 675 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этапе 2.1 выше и ниже перечислены соответствующие объемы для устройства биопленки глубокой скважины. При использовании стандартного биопленочного устройства объемы изменяются следующим образом: от 75 мкл культуры инокулята до 20 мкл; 675 мкл питательной среды до 180 мкл; 750 мкл стерильной воды/питательной среды до 200 мкл; 800 мкл CV окрашивания / уксусной кислоты / растворов для полоскания до 210 мкл. Кроме того, для этапа 3.6 ниже, поглощение при 500 нм (A550 нм) может быть считано непосредственно в микропластине полистирола после смешивания при использовании стандартной микропластины биопленочного устройства. - Используя ночные культуры дня 1, стандартизируйте культуры до оптической плотности при 600 нм (OD600 нм) = 1,0 или до стандарта Макфарланда 0,5-1 единицы.
- Создайте 10-кратное последовательное разбавление каждой стандартизированной культуры в пробирках или 96-луночной микротитровой пластине глубиной скважины до тех пор, пока не будет достигнуто 10-3 разбавления.
- Инокулируют среду, содержащую лунки, как показано на фиг.2В , 75 мкл разбавленной культуры 1 х 10-3 для окончательного внутрилуночного бактериального разбавления 10-4.
- Осторожно вставьте автоклавную ПЦР-пластину (привязанную крышку) в инокулированную пластину глубокой скважины. Инкубировать плиты при оптимальных условиях деформации (37 °C) с встряхиванием (максимум 160 об/мин) в инкубаторе с влажностью 50-60% в течение 24 ч.
3. Определение биомассы биопленки с помощью устройств с использованием окрашивания CV (День 3)
- Асептически удаляют биопленочную привязанную крышку с каждого устройства и промывывают, вставляя в автоклавную глубокую колодцевую пластину, приготовленную из 800 мкл стерильного фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) / скважину в течение 30 с для удаления планктонных клеток.
- Для окрашивания CV биомассы перенесите крышку прикрепленной ПЦР-пластины в новую пластину, приготовленную с 800 мкл/лунку 0,1% (мас./об.) CV в dH2O и окрашивание в течение 5 минут.
- Удалите лишнее пятно, промыв крышку в глубокой пластине, приготовленной с 800 мкл / скважина стерильной PBS. Дайте тарелкам высохнуть в течение 10 минут в шкафу для биобезопасности с колышками, обращенными вверх.
- Перенесите высушенную крышку ПЦР-пластины на пластину, содержащую 800 мкл/30% (v/v) уксусной кислоты, и дайте крышке очиститься в течение 5 минут.
- Снимите очищенную крышку колышка ПЦР и тщательно перемешайте раствор путем пипетки. Перенесите 200 мкл с пластин глубоких скважин на стандартную 96-луночную микропластину и измерьте поглощение раствора для обезболивания на длине волны 550 нм (A550 нм) в ультрафиолетовом (УФ)/видимом (Vis) микропластинном считывателе.
- Используя измеренные значения A550nm , вычтите среднее пустое (отрицательное контрольное) значение A550nm из каждого значения образца биопленки. Усредните усредните каждое значение образца биопленки A550 нм , представляющее биологические реплики образцов.
4. Оспаривание биопленок с противомикробными препаратами для расчета их 24-часового антимикробного значения MBEC (День 3)
- Приготовьте раствор противомикробных препаратов в воде, который в два раза (в 2 раза) превышает концентрацию желаемой самой высокой концентрации противомикробных препаратов, подлежащей тестированию.
- Создайте двукратную серию разведения раствора противомикробного сырья в 2x концентрированных питательных средах, чтобы было 8 концентраций противомикробных препаратов.
- Как показано на рисунке 2B, заполните наружные колодцы автоклавной глубокой плиты скважины стерильной водой 750 мкл/скважина. Заполните колонки B (отрицательный контроль; отсутствие бактерий) и C (положительный контроль; отсутствие антимикробного воздействия) пластины средой роста 750 мкл/скважина. Заполните оставшиеся скважины 750 мкл/лунку серии антимикробного разбавления, как показано на рисунке 2B.
- Снимите и промойте прикрепленную крышку, как описано на этапе 3.1, и перенесите их в противомикробную пластину.
- Инкубируйте пластины с встряхиванием (макс. 160 об/мин) в соответствующих условиях деформации и в течение желаемого периода воздействия.
5. Извлечение биомассы биопленки из прикрепленных крышек (День 4)
- Удалите антимикробные открытые крышки и промойте, как описано в шаге 3.1. Перенесите привязанную крышку на глубокую плиту скважины с 750 мкл/средой извлечения скважины во внутренних скважинах и 750 мкл/скважина стерильным dH2O в наружных скважинах.
- Для приготовления восстановительной среды объемом 70 мл смешайте 35 мл 2x концентрированного LB, 0,7 мл 100% tween-20, 3,5 мл 20x универсального нейтрализующего раствора и 30,8 мл стерильного dH2O в стерильной бутылке.
- Для приготовления 20x концентрированного универсального нейтрализующего раствора добавляют 1,0 г L-гистидина, 1,0 г L-цистеина и 2,0 г восстановленного глутатиона к конечному объему 20 мл dH2O. Фильтруют стерилизовать раствор через фильтр 0,2 мкм и хранить при 4 °C.
- Поместите устройство из шага 5.1 во вторичный бункер, установленный внутри водяной бани с ультразвуком. Обрабатывайте устройства ультразвуком в течение 30 минут, чтобы выбить биопленку из колышков в восстановительную среду.
- После обработки ультразвуком снимите привязанную крышку и поместите стерильную плоскую крышку пластины на пластину глубокой восстановительной среды скважины. Привязанная крышка может быть отброшена.
- Инкубировать пластины с восстановительной средой со стадии 5.3 в оптимальных условиях роста штамма в течение ночи (16-18 ч).
6. Определение значений MBEC устройства (День 5)
- На следующий день перенесите 200 мкл из каждой скважины инкубированной глубокой плиты скважины со стадии 5,4 на новую 96-луночную микротитровую пластину. Считывание OD600 нм каждой скважины с помощью считывателя микропластин UV/Vis.
- Вычтите отрицательные контрольные (неинокализованные заготовки) значения OD600nm из каждой биопленки, содержащей образец скважины.
- Рассчитайте значение MBEC для каждого образца, используя значения OD600nm , где значение MBEC представляет собой самую низкую концентрацию антимикробных препаратов, которая привела к наименьшему значению OD600 нм (неотличимому от неинокализованного контроля) для конкретного образца обработанных антимикробными препаратами видов/штаммов.
Representative Results
Целью данного исследования было предоставление метода для проведения измерений статической биопленки с использованием устройств глубокой скважины с использованием приборов для глубокой скважины. Здесь мы сравнили самосборную полуплавильную ПЦР-пластину, вставленную в микропластину глубокой скважины, известную как устройство глубокой скважины, с широко используемым стандартным устройством с крышкой с привязкой к биопленке для изучения их способности образовывать статические биопленки. Cv-окрашенные анализы биомассы и эрадикации биопленки (MBEC) использовались для оценки образования биопленки обоими устройствами.
Чтобы сравнить образование биопленки различными видами на каждом устройстве, мы оценили биомассы биопленки, образованные E. coli BW25113 и P. aeruginosa PAO1 с использованием протокола окрашивания биопленки CV17. Хотя окрашивание CV обычно сообщается как значения A550 нм, из-за различий в объемах роста каждого устройства и их доступных площадях поверхности мы преобразовали значения CV окрашивания A550 нм в молярные концентрации CV в растворе. Молярные концентрации CV учитывали различия в объеме каждого устройства и позволяли сравнивать концентрации CV, представляющие биомассы, извлеченные из каждого устройства. Результаты показали, что оба вида произвели значительно больше биомассы на устройствах биопленки глубоких скважин (2,1 раза E. coli; 4,1 раза P. aeruginosa) по сравнению со стандартным устройством биопленки (рисунок 3A-B). Этот результат был ожидаемым, учитывая большую площадь поверхности глубокого колышка ПЦР скважины (320,4 мм2) по сравнению со стандартной площадью поверхности колышка устройства (108,9 мм2). Этот вывод также согласуется с увеличением увеличенных объемов (750 мкл), используемых в устройстве биопленки глубоких скважин по сравнению со стандартными луночными скважинами (200 мкл). Следовательно, устройства для глубоких скважин увеличили накопление биомассы биопленки на колышках трубки ПЦР по сравнению с меньшими колышками со стандартными устройствами биопленки.
Оба устройства биопленки образовали воспроизводимые биопленки, когда мы сравнили биологически реплицированные биопленки, образованные E. coli и P. aeruginosa (рисунок 3A-B). Несмотря на наблюдаемую большую изменчивость технических реплицированных значений CV-окрашенного M A550nm для любого штамма, выращенного на устройстве глубокой скважины, не было статистически значимых различий, когда мы сравнивали медианные значения CV M для биологических реплик каждого вида на глубокой скважине или стандартных устройствах с использованием попарного двустороннего анализа дисперсии (ANOVA) или Т-тестов Стьюдена (оба p > 0,05). Это открытие показывает, что образование биопленки глубоким колодцем и стандартными устройствами образует воспроизводимые биопленки. Тем не менее, результаты CV-окрашивания также показали, что, когда мы учитывали различия в площади поверхности колышка на каждом устройстве, образование биомассы биопленки E. coli и P. aeruginosa показало статистически значимые различия в накоплении биомассы (таблица 1). Расчет средней cv-окрашенной биомассы (M) на площадь поверхности колышка в мм2 (CV M/mm2) для E. coli показал, что образование биопленки было в 1,5 раза ниже на полипропиленовых устройствах глубоких скважин по сравнению со стандартным устройством биопленки (таблица 1). Однако противоположный результат был получен для P. aeruginosa, который продемонстрировал в 1,4 раза более высокий CV M/mm2 на полипропиленовых глубоководных устройствах по сравнению со стандартными биопленочными устройствами (таблица 1). Несмотря на наблюдаемые видоспецифические различия в накоплении биомассы биопленки с каждым устройством, устройство глубокой скважины все же продемонстрировало большее общее (2-4-кратное увеличение) образование биомассы биопленки каждым видом (рисунок 3).
Чтобы определить применение тестирования чувствительности к противомикробным препаратам устройства для глубокой биопленки, мы сравнили два широко используемых дезинфицирующих средства, BZK и отбеливатель, на предмет их потенциала уничтожения биопленки. Оба химических вещества обычно используются для предотвращения (BZK) и / или уничтожения (отбеливателя) бактериальных биопленок в клинических и промышленных применениях21,22,23. Каждое соединение добавляли в возрастающих 2-кратных концентрациях к биопленкам, образованным кишечной палочкой и P. aeruginosa на стандартных и глубоколуночных биопленочных устройствах22,23 (Фиг.1, 2В). Самая низкая концентрация BZK или отбеливателя, которая приводила к значениям OD600 нм, которые были неотличимы от отрицательных контрольных скважин, была определена как значение MBEC. Обработка биопленок, образующихся на стандартных биопленочных устройствах отбеливателем, приводила к получению одинаковых значений MBEC отбеливателя 0,625% для E. coli и P. aeruginosa (таблица 1, рисунок 4A-B). Значения отбеливателя MBEC, определенные для биопленки E. coli и P. aeruginosa, образованной на приборах глубоких скважин, показали в 2-4 раза более низкие значения MBEC по обоим видам (E. coli; 0,156%; P. aeruginosa 0,313%) по сравнению со стандартными приборами (табл. 1). 2-кратная разница в значениях MBEC отбеливателя между видами была отмечена для устройства глубокой скважины, где P. aeruginosa требовала 2-кратно более высокой концентрации отбеливателя для уничтожения биопленок по сравнению с E. coli (рисунок 4A-B, таблица 1). 2-кратная разница MBEC отбеливателя между P. aeruginosa и E. coli в устройстве глубокой скважины, по-видимому, обратно коррелирует с 1,5-кратным увеличением образования биомассы, окрашенной CV, P. aeruginosa по сравнению с E. coli (рисунок 3A-B). Большее количество биомассы, образующейся P. aeruginosa на колышках устройства глубоких скважин, может также объяснить, почему для уничтожения биопленок P. aeruginosa требовалась более высокая концентрация отбеливателя по сравнению с кишечной палочкой на глубоких скважинах (рисунок 3A-B, таблица 1). Следовательно, анализы эрадикации биопленки с помощью глубокой скважины показывают, что оба вида были восприимчивы к отбеливанию, но при более низких (в 2-4 раза) концентрациях отбеливателя по сравнению со стандартными устройствами. Это обратно коррелирует с 3-кратной большей площадью поверхности колышка и объемами глубокой скважины устройства ПЦР пластинчатых колышков. Это говорит о том, что при воздействии отбеливателя большая площадь поверхности биомассы может снизить концентрации отбеливателя, необходимые для уничтожения биопленки.
Тестирование на эрадикацию биопленки BZK показало большую изменчивость восстановленного роста (значения OD600 нм) и значений MBEC по каждому виду по сравнению с результатами отбеливания (рисунок 4C-D). Эта изменчивость не является неожиданной, основываясь на предыдущих исследованиях, показывающих, что BZK был более эффективен в предотвращении образования биопленки, чем искоренение хорошо зарекомендовавших себя биопленок24,25,26. Используя стандартное устройство биопленки, только биопленки P. aeruginosa, обработанные BZK, показали последовательное значение MBEC (2560 мкг/мл), которое было в 8 раз ниже значения MBEC (20480 мкг/мл), полученного для этой деформации в устройстве глубокой скважины (таблица 1, рисунок 4C). Эти результаты могут отражать различия в количествах биомассы P. aeruginosa, образующейся на глубоких хорошо привязанных поверхностях и пластиковых композициях по сравнению со стандартными колышками устройства. Искоренение BZK биопленок, образованных кишечной палочкой как на глубокой скважине, так и на стандартных устройствах, было одинаково плохим, что привело к широкому диапазону значений BZK MBEC от 2560-40960 мкг/мл для устройства глубокой скважины и 320-10240 мкг/мл на стандартном устройстве (рисунок 4D). Для E. coli эта изменчивость объяснялась редким случаем, когда 1-2 реплицируемые скважины показали низкий, но статистически значимый рост восстановительных сред, что увеличило погрешность и снизило точность определения BZK MBEC с помощью любого устройства (рисунок 4D, таблица 1). Эта изменчивость подчеркивает неэффективность использования BZK в искоренении биопленок E. coli, как отмечалось ранее в исследованиях24,25,26. Напротив, биопленки P. aeruginosa могут быть надежно уничтожены BZK при определенной концентрации с обоими устройствами, но с 8-кратной разницей концентраций BZK (рисунок 4C). Таким образом, значения MBEC эрадикации BZK биопленок, образованных P. aeruginosa, показывают различные значения MBEC с каждым устройством, однако оба устройства одинаково плохо различают точные фенотипы эрадикации BZK E. coli.
Следовательно, способ устройства для глубокой биопленки, описанный в настоящем описании, одинаково эффективен для формирования воспроизводимых биопленок по сравнению со стандартным устройством биопленки.
Рисунок 1. Схематический обзор эксперимента. День 0 выделение одиночных колоний из криоконсервированного запаса; 1 день прививка питательных сред одиночными колониями; 2 день инокуляции биопленочной пластины; День 3 Окрашивание сердечно-сосудистых заболеваний или антимикробный вызов; День 4 биопленка ультразвуком в восстановительные среды; и день 5 считывание OD600 нм пластины восстановления для определения значений MBEC. Некоторые изображения на рисунке предоставлены Servier Medical Art (smart.servier.com). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Примеры компоновки пластин, показанные для различных этапов протокола. А) Окончательная установка пластины для первоначального роста биопленки за 24 ч с использованием бактериальных культур дня 1 из двух бактериальных штаммов (E. coli и P. aeruginosa), каждый из которых имеет три биологических репликата. Отрицательные контрольные колодцы (серые) используются в качестве контроля стерильности (без добавления бактерий). B) Установка пластин для антимикробного вызова биопленок. Темнеющие цвета указывают на повышение концентрации противомикробных препаратов. Отрицательный контроль - это скважины без добавления бактерий (серый), а положительные контрольные - биопленки без антимикробного воздействия (оранжевый). Крышки колышков биопленки, взятые с панели А, переносятся на эту глубокую пластину скважины для антимикробного воздействия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Молярная концентрация (М) CV-окрашенной кишечной палочки BW25113. (A) и P. aeruginosa PAO1 (B) биомасса биопленки, извлеченная из стандартных (круги) и глубоких скважин (треугольников) устройств. Окрашивание CV измеряли путем считывания поглощения CV при 550 нм (A550 нм), а показания глубокой скважины A550 нм были скорректированы в 3,809 раза (800 мкл / 210 мкл) для учета различий в объеме между устройствами. Молярная концентрация CV (M) определялась по закону Бира-Ламберта (CV Концентрация = A550nm/εl); где длина пути (л) 210 мкл в 96-луночной микротитровой пластине с плоским дном была определена как 0,56 см, а коэффициент вымирания (ε) CV в воде при A550 нм 251500 см-1М-139. Результаты представляют собой 9 технических реплик из трех биологических реплик каждого штамма, выращенных в виде биопленки, и медианное значение каждой биологической реплики показано в виде горизонтальной полосы на каждом участке. Статистически значимые различия в биомассе между устройствами были определены между биологическими медианными значениями репликации с помощью двуххвостого парного t-теста (E. coli p= 0,008-0,018 (*); P. aeruginosa p= 0,002-0,009 (**)) показаны в виде полос со звездочками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. Определение концентрации противомикробных препаратов MBEC. Определение концентрации противомикробного MBEC для отбеливателя (A,B) и BZK (C,D) для P. aeruginosa PAO1 (A, C) и E. coli BW25113 (B,D) при выращивании на стандартных (белые полосы) и глубоких скважинах (серые полосы) биопленочных привязанных устройствах. Результаты были определены путем считывания OD600 нм биопленки, восстановленной после обработки ультразвуком в восстановительных средах и ночной инкубации. Глубокая скважина OD600nm была скорректирована в 3,75 раза (750 мкл / 210 мкл) для учета разницы в объемах между устройствами. Результаты являются репрезентативными для трех биологических реплик, а полосы ошибок показывают стандартное отклонение между репликациями при каждой концентрации противомикробных препаратов39. Звездочки (*) над каждым штриховым графиком указывают на статистически значимые различия в значениях OD600nm от пустых элементов управления с p-значениями < 0,05 с использованием двухсторонних вычислений Т-теста Student. Символы круга (o) над каждым штриховым графиком указывают на измерения, в которых только 1 или 2 реплики имели статистически значимые значения OD600nm из пустых элементов управления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| БЗК МБЭК (мкг/мл) | Отбеливатель MBEC (% v/v) | |||
| Испытано на деформацию | Устройство глубокой скважины | Стандартное устройство | Устройство глубокой скважины | Стандартное устройство |
| Кишечная палочка БВ25113 | 2560-40960 | 320-10240 | 0.156 | 0.625 |
| P. aeruginosa ПАО1 | 20480 | 2560 | 0.313 | 0.625 |
| Устройство глубокой скважины | Стандартное устройство | p-значение** | Смена складки (Глубокая скважина/ Стандартная) | |
| Испытано на деформацию | Среднее значение CV M*/ mm2 ± SD | Среднее значение CV M*/ mm2 ± SD | ||
| Кишечная палочка БВ25113 | 1,99 х 10-8 ± 3,25 х 10-9 | 3,03 х 10-8 ± 3,31 х 10-9 | 0.0176 | -1.52 |
| P. aeruginosa ПАО1 | 8,01 х 10-8 ± 9,42 х 10-9 | 5,72 x 10-8 ± 9,42 x 10-9 | 0.034 | 1.4 |
Таблица 1. Резюме E. coli BW25113 и P. aeruginosa PAO1 означают значения CV-окрашенной биомассы M/mm2 и значения MBEC для уничтожения биопленки для BZK и отбеливателя на различных устройствах.
*Средние значения CV M/mm2 рассчитаны с использованием медианных биологических реплицированных значений CV M (рисунок 3).
**p-значения, определяемые с помощью Т-теста двуххвостого студента.
Discussion
В данном исследовании описываются методы использования статического устройства для роста биопленки большого объема с высокой пропускной способностью с использованием полипропиленовой глубокой микропластины, оснащенной полузамкнутой крышкой ПЦР-пластины для формирования биопленки (устройство глубокой биопленки; Таблица материалов). Мы сравнили биопленки, полученные с помощью этого устройства, с коммерчески доступным стандартным устройством биопленки из полистирола (Таблица материалов). Метод устройства глубокой скважины использует те же методологические этапы и решения, что и стандартное устройство17, при регулируемых объемах, модифицированных для устройств глубоких скважин, что делает это устройство идеальным для крупномасштабного формирования биопленки и экспериментального анализа. Рост E. coli BW25113 и P. aeruginosa PAO1, двух грамотрицательных видов, которые, как известно, образуют биопленки, были исследованы на предмет их образования биомассы и дезинфицирующих (BZK / отбеливателей) значений MBEC с использованием на обоих устройствах. Сравнение CV-окрашенной биомассы, образованной на колышках от каждого устройства, показало, что как E. coli, так и P. aeruginosa образовывали биопленки с более высокой биомассой на устройстве биопленки глубокой скважины по сравнению со стандартным устройством (рисунок 3A-B). Увеличение биомассы биопленки отражало большую площадь поверхности колышков глубоких скважин по сравнению со стандартной площадью поверхности колышка устройства. Когда мы учитывали различия в площадях поверхности колышков (мм2) с обоими устройствами, были отмечены различия в образовании биомассы, где E. coli образовывала значительно большую биомассу CV на мм2 на колышках стандартного полистирольного устройства, чем с ПЦР-трубчатыми колышками устройства глубокой скважины (таблица 1). P. aeruginosa образует большую CV-окрашенную биомассу/колышек мм2 по сравнению со стандартными устройствами (таблица 1). Эти результаты могут подчеркнуть видовые различия в образовании биомассы биопленки на различных устройствах.
Следует отметить, что эрадикация отбеливателем биопленок E. coli и P. aeruginosa на устройствах глубоких скважин происходила в 2-4 раза более низких концентрациях, чем в стандартном устройстве (рис. 4А-В, таблица 1). На различия в значениях MBEC отбеливателя, идентифицированных из каждого устройства, вероятно, влияют различия в формах колышков устройства (глубокие «колышки» скважины представляют собой конические трубки, а стандартные колышки цилиндрические), различия в составе пластика (полипропилен против полистирола) и различия в объеме (750 мкл против 200 мкл). Например, P. aeruginosa имела большую cv M биомассу / мм2 на колышках устройства глубокой скважины по сравнению со стандартными устройствами, но E. coli имела меньшую биомассу на глубоких колышках скважины (рисунок 3). Это говорит о том, что на концентрации дезинфицирующих средств, необходимые для уничтожения биопленки, может влиять биомасса, образуемая каждым видом, а также доступная площадь поверхности. Кроме того, различия в форме колышка устройства могут влиять на различные условия роста для конкретных видов. В нашем исследовании P. aeruginosa может образовывать большую биомассу на глубоких колышках скважин из-за их большей площади поверхности и аэрации, поскольку этот вид является облигатным аэробом в отличие от E. coli, который является факультативным анаэробом. На сегодняшний день мы не выявили каких-либо опубликованных исследований, которые непосредственно сравнивали бы образование биопленки E. coli и P. aeruginosa вместе на материалах полипропилена27,28,29 и полистирола30,31. Тем не менее, сообщения о прочном образовании биопленки E. coli и P. aeruginosa были отмечены в независимых исследованиях, изучающих полипропиленовые или полистирольные материалы. Что касается pseudomonads, многие Pseudomonas spp. могут использовать пластмассы, такие как полипропилен, в качестве потенциальных источников углерода32. Следовательно, наличие этого полипропиленового устройства для глубокой биопленки является полезным шагом вперед в исследованиях статической биопленки. Полипропилен химически более долговечен, чем полистирол, и является клинически значимым материалом, поскольку он часто используется в медицинских имплантатах, швах и сетках для грыж или тазовых операций33,34.
Хотя биомасса биопленки была сформирована обоими устройствами, устройство глубокой скважины имело несколько более высокую изменчивость биомассы на основе метода окрашивания CV и значений MBEC для уничтожения биопленки OD600 нм для отбеливателя и BZK. Это можно объяснить 3 основными факторами: 1) Устройства глубокой скважины имеют большую площадь поверхности колышка, чем стандартные устройства, которые были наклонены по сравнению со стандартными колышками устройств. 2) Оба тестируемых вида могут иметь различные способности прилипать к полипропиленовым и полистирольным материалам каждого устройства. 3) Объемы питательных сред, используемых в каждом устройстве (глубина скважины 750 мкл, стандарт 200 мкл) и расстояние между вставленным колышком и боковыми стенками скважины различаются. Эти проблемы не являются проблемой, если для всех экспериментов с биопленкой используется только один тип устройства, однако, если выбраны оба устройства, то сравнения, которые мы провели здесь, должны быть выполнены для выявления различий36,37. Из-за различий в пластиковом материале, используемом в каждом устройстве, значения биомассы биопленки CV и MBEC не следует напрямую сравнивать между различными устройствами. Однако если методы и эксперименты проводятся на одном приборе (глубоком колодце или стандартном), то результаты, полученные для тестируемых видов и противомикробных препаратов, сопоставимы.
Этот протокол показывает, что самосборные устройства ПЦР-пластины глубокой скважины представляют собой устройство для биопленки большего объема для измерения образования и эрадикации биопленки, что также является экономически эффективным. С точки зрения стоимости, стандартные биопленочные устройства с 96 хорошо привязанными крышками продаются по цене 29-36 долларов США за устройство (Таблица материалов). Стандартные биопленочные устройства из полистирола не являются автоклавируемыми и менее устойчивы к растворителям / кислотам из-за его химических свойств пластика. Самосборные полипропиленовые пластины глубоких скважин, описанные в настоящем описании, снабженные отдельной полугонтовой 96-луночной ПЦР-пластиной (Таблицей материалов), стоят в общей сложности 14 долларов США за собранное устройство, что составляет половину стандартной стоимости биопленочного устройства. Следует отметить, что цены могут варьироваться в зависимости от региона, дистрибьютора и доступности, а наши затраты после институциональных скидок составили до 9 долларов США / устройство глубокой скважины. Эти самосборные глубоководные полипропиленовые ПЦР-пластинчатые устройства имеют дополнительное преимущество в том, что они автоклавируемы для стерилизации и предлагают в 2-4 раза больше биомассы биопленки, чем стандартные устройства.
В заключение, этот протокол и репрезентативные результаты сравнения роста биопленки глубокой скважины и стандартных устройств биопленки показывают, что оба устройства способны культивировать бактериальные биопленки, но устройства с глубокими лунками образуют в 2-4 раза больше биопленки. Устройство для глубокой биопленки предлагает жизнеспособную и доступную альтернативу для экспериментов по образованию биопленки с высокой пропускной способностью большего объема, таких как скрининговые исследования чувствительности к лекарственным средствам. Этот метод может генерировать биопленки, полезные для последующей экстракции '-omics' (протеомной, метаболомической, транскриптомной) или экспериментальных анализов (ферментативных, флуоресцентных), которые могут потребовать больших количеств биопленочных материалов для анализа. Устройство для глубокой биопленки рекомендуется для лабораторий, которые хотели бы изучать биопленки в высокопроизводительном анализе из 96 скважин с использованием более дешевых, более объемных, химически прочных пластиковых материалов, которые имеют клиническое значение.
Disclosures
Авторы не могут раскрывать информацию.
Acknowledgments
Финансирование этой работы было обеспечено операционными грантами DCB от Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады Discovery Grant (RGPIN-2016-05891) и MRM и GRG от программы грантов Правительства Канады по исследованиям и разработкам в области геномики (GRDI) (GRDI7 2254557).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic (200/CS) | Fisher Scientific | 13-678-11F | disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer |
| 2 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic, 500/CS | Fisher Scientific | 13-678-11C | disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer |
| Axygen Aerosol Filter Tips, Sterile, 5 racks/ PK, 1000 tips/rack | Fisher Scientific | 14-222-766 | sterile pipettor tips for media aliquoting |
| Axygen deep well storage microplates, round wells, 1.1 mL cap, 5/PK, P-DW-11-C | Fisher Scientific | P-DW-11-C | microplate for 96 well deepwell device biofilm cultivation |
| Axygen Filter tips, 350 µL tips racked, 96/rack, 10 racks, low retention barrier tips | Fisher Scientific | TF-350-L-R-S | sterile pipettor tips for media aliquoting |
| Basin/reservoir natural PS 50 mL, Sterile, 5/bag, 40 bags, CS200 | Avantor/ VWR | 89094-676 | sterile basins/ reservoirs for microplate preparation |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Granulated Agar, 500 g | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | materials for LB agar preparation |
| Biotek Synergy Neo2 multimode plate reader | Biotek | NEO2MB | microplate UV/Vis region plate reader |
| Branson M3800 Ultrasonic Bath, 117 V | Avantor/ VWR | CPX-952-316R | sonicating water bath |
| crystal violet (CV), ACS grade, 100 g | Fisher Scientific | C581-100 | biofilm biomass stain |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), 1 L, ACS grade 99.9%, poly bottle, BDH | Avantor/ VWR | CABDH1115-1LP | media components for cryopreservation |
| Easypet 3, pipet controller | Avantor/ VWR | CA11027-980 | serological pipettor for aseptic media/ culture transfer |
| Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 10-100 µL | Avantor/ VWR | CA89125-338 | multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer |
| Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 30-300 µL | Avantor/ VWR | CA89125-340 | multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer |
| Glacial acetic acid, CAS 64-19-7, 2.5L, ACS grade | Fisher Scientific | A38-212 | CV destain |
| Glass test tubes, 150 mm x 18 mm, 72/Pack, PYREX | Fisher Scientific | 14957H/ 9820-18 | materials for cell culturing |
| Glycerol, 4 L glass bottle ACS | Fisher Scientific | BP229-4 | media components for cryopreservation |
| L-Cysteine, 98%, 250 g | Avantor/ VWR | 97061-204 | universal neutralizing solution |
| L-glutathione reduced, 98%, 25 g | Fisher Scientific | AAJ6216614 | universal neutralizing solution |
| L-Hisitidine, 98%, 100 g | Avantor/ VWR | CA97062-598 | universal neutralizing solution |
| MBEC Assay Inoculator with 96 well tray, 100/CS | Innovotech | 19112 | material for 96 well MBEC device biofilm cultivation |
| McFarland Standard, 0.5 EA | Fisher Scientific | R20410 | cell culture standardization |
| McFarland Standard, 1.0 EA | Fisher Scientific | R20411 | cell culture standardization |
| NUNC 96-well microtiter plates, w/lid, 50/CS | Fisher Scientific | 167008 | microplate for 96 well MBEC device biofilm cultivation and OD measurements |
| PCR plate, semi-skirted 96 well, fast PCR, polypropylene, 25ea/PK | Sarstedt | 72.1981.202 | pegged lid for 96 well deepwell device biofilm cultivation |
| Petri dish, 100 mm x 15 mm, semi-TK CS/500 | Fisher Scientific | FB0875712 | materials for LB agar preparation |
| Potassium phosphate dibasic, ACS 500 g | Fisher Scientific | P288-500 | PBS component/ buffer |
| Sodium chloride, ACS grade, 3 kg | Fisher Scientific | S2713 | media components for LB broth and PBS |
| sodium phosphate monobasic, 1 kg | Fisher Scientific | S369-1 | PBS component/ buffer |
| Syringe filters, Sterile, PES 0.45 um, 25 mm, PK50 | Avantor/ VWR | 28145-505 | non-autoclavable solution sterilization |
| Tin foil, heavy duty, 50 feet | Grocery store | --- | materials for deepwell device sterilization |
| Tryptone (peptone from casein), 2.2 kg/EA | Fisher Scientific | B11922 | media components for LB broth |
| Tween-20, 100 mL | Fisher Scientific | BP337-100 | recovery media solution |
| Ultra-deepwell, 2.5 mL deep well plates (square well), with lid, polypropylene, 10/CS | Avantor/ VWR | 37001-520 | materials for biofilm dilution preparation |
| Yeast Extract, Fisher Bioreagents, 500 g | Fisher Scientific | BP1422-500 | media components for LB broth |
References
- Verderosa, A. D., Totsika, M., Fairfull-Smith, K. E. Bacterial Biofilm Eradication Agents: A Current Review. Frontiers in Chemistry. 7, 1-17 (2019).
- Sharma, D., Misba, L., Khan, A. U. Antibiotics versus biofilm: An emerging battleground in microbial communities. Antimicrobial Resistance and Infection Control. 8 (1), 1-10 (2019).
- Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P.
- Lagacé-Wiens, P. R. S., et al. Trends in antimicrobial resistance over 10 years among key bacterial pathogens from Canadian hospitals: results of the CANWARD study 2007-16. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74, Suppl 4 22-31 (2019).
- Karlowsky, J. A., et al. In vitro susceptibility of urinary Escherichia coli isolates to first- and second-line empirically prescribed oral antimicrobials: CANWARD surveillance study results for Canadian outpatients, 2007-2016. International Journal of Antimicrobial Agents. 54 (1), 62-68 (2019).
- Mah, T. F.
- Amato, S. M., et al. The role of metabolism in bacterial persistence. Frontiers in Microbiology. 5, 1-9 (2014).
- Flemming, H. -C., Neu, T. R., Wozniak, D. J. The EPS matrix: The "house of biofilm cells.". Journal of Bacteriology. 189 (22), 7945-7947 (2007).
- Dela Fuente-Núñez, C., Reffuveille, F., Fernández, L., Hancock, R. E. W. Bacterial biofilm development as a multicellular adaptation: Antibiotic resistance and new therapeutic strategies. Current Opinion in Microbiology. 16 (5), 580-589 (2013).
- Høiby, N., et al. The clinical impact of bacterial biofilms. International Journal of Oral Science. 3 (2), 55-65 (2011).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Current Protocols in Microbiology. 01, Unit 1B.1 (2005).
- Coffey, B. M., Anderson, G. G. Biofilm formation in the 96-well microtiter plate. Methods in Molecular Biology. 1149, 631-641 (2014).
- O'Toole, G. A. Microtiter dish Biofilm formation assay. Journal of Visualized Experiments. (47), e2437 (2010).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Harrison, J. J., Turner, R. J., Ceri, H. High-throughput metal susceptibility testing of microbial biofilms. BMC Microbiology. 5 (53), (2005).
- Ceri, H., et al. The MBEC Assay System: Multiple Equivalent Bioffims for Antibiotic and Biocide Susceptibility Testing. Methods in Enzymology. 337, 377-385 (2001).
- Harrison, J. J., et al. Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening. Nature Protocols. 5 (7), 1236-1254 (2010).
- vanden Driessche, F., Rigole, P., Brackman, G., Coenye, T. Optimization of resazurin-based viability staining for quantification of microbial biofilms. Journal of Microbiological Methods. 98, (2014).
- Sabaeifard, P., Abdi-Ali, A., Gamazo, C., Irache, J. M., Soudi, M. R. Improved effect of amikacin-loaded poly(D,L-lactide-co-glycolide) nanoparticles against planktonic and biofilm cells of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Medical Microbiology. 66 (2), 137-148 (2017).
- Thieme, L., et al. MBEC Versus MBIC: the Lack of Differentiation between Biofilm Reducing and Inhibitory Effects as a Current Problem in Biofilm Methodology. Biological Procedures Online. 21 (1), 18 (2019).
- Jennings, M. C., Ator, L. E., Paniak, T. J., Minbiole, K. P. C., Wuest, W. M. Biofilm-eradicating properties of quaternary ammonium amphiphiles: Simple mimics of antimicrobial peptides. Chembiochem. 15 (15), 2211-2215 (2014).
- Lineback, C. B., et al. Hydrogen peroxide and sodium hypochlorite disinfectants are more effective against Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms than quaternary ammonium compounds. Antimicrobial Resistance & Infection Control. 7 (1), 154 (2018).
- Minbiole, K. P. C., et al. From antimicrobial activity to mechanism of resistance: The multifaceted role of simple quaternary ammonium compounds in bacterial eradication. Tetrahedron. 72 (25), 3559-3566 (2016).
- Mangalappalli-Illathu, A. K., Korber, D. R. Adaptive resistance and differential protein expression of Salmonella enterica serovar enteritidis biofilms exposed to benzalkonium chloride. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3588-3596 (2006).
- El-Banna, T., Abd El-Aziz, A., Sonbol, F., El-Ekhnawy, E. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa clinical isolates to benzalkonium chloride retards its growth and enhances biofilm production. Molecular Biology Reports. 46, 3437-3443 (2019).
- Ebrahimi, A., et al. Effects of benzalkonium Chloride on planktonic growth and biofilm formation by animal bacterial pathogens. Jundishapur Journal of Microbiology. 8 (2), 59764 (2015).
- Reśliński, A., et al. Evaluation of Staphylococcus aureus and Escherichia coli biofilm formation on the surface of polypropylene mesh. Medycyna doświadczalna i mikrobiologia. 63 (1), 21-27 (2011).
- Verhorstert, K. W. J., et al. In vitro bacterial adhesion and biofilm formation on fully absorbable poly-4-hydroxybutyrate and nonabsorbable polypropylene pelvic floor implants. Cite This: ACS Applied Materials & Interfaces. 12, 53646-53653 (2020).
- Arkatkar, A., Juwarkar, A. A., Bhaduri, S., Uppara, P. V., Doble, M. Growth of Pseudomonas and Bacillus biofilms on pretreated polypropylene surface. International Biodeterioration & Biodegradation. 64 (6), (2010).
- Jones, J. F., et al. Oriented adhesion of Escherichia coli to polystyrene particles. Applied and Environmental Microbiology. 69 (11), 6515-6519 (2003).
- Zameer, F., et al. Evaluation of adhesive and anti-adhesive properties of Pseudomonas aeruginosa biofilms and their inhibition by herbal plants. Iranian Journal of Microbiology. 8 (2), 108-119 (2016).
- Arkatkar, A., Juwarkar, A. A., Bhaduri, S., Uppara, P. V., Doble, M. Growth of Pseudomonas and Bacillus biofilms on pretreated polypropylene surface. International Biodeterioration and Biodegradation. 64 (6), 530-536 (2010).
- Dieterich, M., et al. Implant-Based Breast Reconstruction Using a Titanium-Coated Polypropylene Mesh (TiLOOP Bra). Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (1), 8-19 (2013).
- Clavé, A., et al. Polypropylene as a reinforcement in pelvic surgery is not inert: comparative analysis of 100 explants. International Urogynecology Journal. 21 (3), 261-270 (2010).
- Zameer, F., et al. Evaluation of adhesive and anti-adhesive properties of Pseudomonas aeruginosa biofilms and their inhibition by herbal plants. Iranian Journal of Microbiology. 8 (2), 108-119 (2016).
- Chen, R., Liu, X., Han, L., Zhang, Z., Li, Y. Morphology, thermal behavior, rheological, and mechanical properties of polypropylene/polystyrene blends based on elongation flow. Polymers for Advanced Technologies. 31 (11), 2722-2732 (2020).
- Vial Loading Trays Polystyrene vs. polypropylene: Which tubes are best for your research. ChemTech International. , Available from: https://chemtech-us.com/polystyrene-vs-polypropylene-which-tubes-are-best-for-your-research/ (2020).
- Bock, L. J., Hind, C. K., Sutton, J. M., Wand, M. E. Growth media and assay plate material can impact on the effectiveness of cationic biocides and antibiotics against different bacterial species. Letters in Applied Microbiology. 66 (5), 368-377 (2018).
- Prahl, S. Crystal violet. , Available from: https://omic.org/spectra/PhotochemCAD/html/048.html (2017).
