Summary
Detta protokoll presenterar metodik för att utföra biofilm tillväxt och biomassa mätningar med hjälp av självmonterade djup brunn PCR-plattor enheter för hög genomströmning 96-väl peggade lock statisk biofilm screening.
Abstract
Bakteriella biofilmer är svåra att utrota från ytor med konventionella antimikrobiella ingrepp. Mikroplatemetoder med hög genomströmning 96-brunn används ofta för att odla bakteriella biofilmer för snabb testning av antimikrobiell känslighet för att beräkna minimala biofilm utrotningskoncentration (MBEC) värden. Standardbiofilmsanordningar består av polystyrenlock monterade på 96-brunns mikroplattor och är idealiska för mätning av biofilmbiomassa och MBEC-värden, men dessa enheter begränsas av tillgänglig pegyta för ackumulering och kostnad för biomassa. Här beskriver vi ett protokoll för att använda självmonterad polypropylen 96-brunns djup brunn PCR-platta peggade lock enhet för att växa Escherichia coli BW25113 och Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilmer. En jämförelse av 24-timmars biofilmer som bildas på standard- och djupbrunnsenheter av varje art som använder kristallviolett biomassafärgning och MBEC-bestämningsanalyser beskrivs. Den större ytan av djup brunnsenheter ökade förväntat den totala biofilmbildningen av båda arterna 2-4-faldig. P. aeruginosa bildade betydligt större biomassa/mm2 på djupa brunnspinnar jämfört med standardanordningen. E. coli hade större biomassa/mm2 på vanliga polystyrenanordningar jämfört med djupbrunnsanordningen. Biofilm utrotning analyser med desinfektionsmedel såsom natriumhypoklorit (blekmedel) eller bensalkoniumklorid (BZK) visade att båda föreningarna kunde eliminera E. coli och P. aeruginosa biofilmer från båda enheterna men vid olika MBEC-värden. BZK biofilm utrotning resulterade i variabel E. coli MBEC värden mellan enheter, men blekmedel visat reproducerbara MBEC värden för både arter och enheter. Denna studie ger en hög genomströmning djup brunn metod för att odla större mängder biofilmer på polypropylen enheter för nedströms studier kräver högre mängder statisk biofilm.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa och Escherichia coli är gramnegativa proteobakterier som ofta studeras för deras förmåga att bilda sessila, ytanslutna cellsamhällen som kallas biofilms1. Båda arterna, när de växer som biofilmer, kan utsöndra en matris av extracellulära polymera ämnen (EPS) som främst består av olika polysackarider och proteiner, som också kan inkludera extracellulärt DNA och/eller lipider, vilket ger extra cellulärt skydd och förbättrad överlevnad i hårda, näringsbegränsade miljöer2,3. Biofilmsfysiologi och bildning av båda arterna är av klinisk relevans, eftersom de representerar de fem vanligaste isolerade antimikrobiella resistenta patogenerna från sjukhuspatientblod, urinvägs- och lunginfektioner i Kanada4,5. Det är också viktigt att notera att biofilmer beräknas utgöra nästan 80% av alla kroniska och återkommande infektioner orsakade av dessa bakteriearter6. På grund av de utsöndrade EPS-ämnena och långsammare metabolisk aktivitet7,8 blir etablerade biofilmer svårare att utrota när de bildas på ytor som implanterade medicintekniska produkter, ärrvävnader och i lungorna hos cystisk fibrospatienter9,10, vilket ökar deras antimikrobiella resistens.
De motsträviga tillväxtegenskaperna hos bakteriella biofilmer gör dem ofta mer resistenta mot antimikrobiell hämning och/eller utrotning2,9. In vitro-metoder för att studera antimikrobiell utrotning av bakteriell biofilm är därför av största vikt för att välja ut effektiva föreningar för att utrota infektioner när de bildas på medicinsk plast (t.ex. in-dwelling katetrar) och medicinska implantat. De snabbaste in vitro biofilm antimikrobiella utrotningsmetoderna undersöker biofilmstillväxt som en "statisk" biofilmskultur snarare än "kontinuerliga" kulturer, där statisk bakterietillväxt övervakas i tidiga till sena stadier av biofilmbildning under en kort (24-96 h) tidsram i samma tillväxtmedium. Kontinuerliga biofilmsmetoder är besvärliga för snabb analys eftersom de kräver biofilmstillväxt bedömd över längre tidsramar som odlas i kammare som möjliggör kontinuerligt flöde och ersättning av tillväxtmedier med färre replikat11. På grund av den tid och ansträngning som krävs för att upprätthålla och upprätta kontinuerliga biofilmer är statiska in vitro-biofilmer de mest populära, eftersom de lätt anpassas för höggenomströmningstestning av antimikrobiell känslighet i plast 96-brunnsmikrotiterplattor snarare än utarbetade flödeskammaresystem som begränsar antalet kulturer som testas samtidigt 12 13 . De enklaste statiska "in-well" biofilm mikroplattan analyser använder standard polystyren eller vinyl (300 μL kapacitet) microtiter plattor för att mäta biofilm bildas på sidorna och bottnarna av varje brunn och ofta som ringar på luften till flytande yta gränssnitt. Bakteriell biofilmsbildning i brunnen mäts genom att färga den deponerade biomassan som klibbats vid brunnarna efter att tillväxtmediumvätskan har avlägsnats och biofilmerna tvättats12,13. Dessa analyser är ekonomiskt populära men har ofta reproducerbarhetsproblem på grund av deras inneboende design, eftersom deponerade biofilmer är benägna att skadas eller förloras under sköljning för cellåtervinning och biomassafärgningsförfaranden11,14.
För att minska biofilmförlusterna har vanliga kommersiella biofilmsanordningar förbättrat biofilmsmikroplåtsdesignen i brunnen genom att lägga till ett instickbart 96-väletnat polystyrenlock till standard 96-plåtdesignen, kallad "standardbiofilmsanordningen" häri. Tillsatsen av ett knutet lock utökar den tillgängliga ytan i varje mikroplattabrunn, vilket möjliggör förbättrad yt vidhäftning och biofilmsbiomassabildning15,16. Standard biofilm peggade lock enheter möjliggör större biofilm återvinning, borttagning och sköljning för efterföljande antimikrobiell biofilm mottaglighet och utrotning testning när peggade lock sätts in i nya microtiter plattor som innehåller läkemedels- eller tillväxttillstånd utmaningar. I likhet med mikroplattatekniken för biofilm i brunn möjliggör de återvunna materialen från de borttagna och tvättade peggade lockanordningarna cellöverlevnadstestning och biofilmsfärgning av biomassa, vanligtvis med kristallviolett (CV) färgformuleringar 17,18,19. Standardbiofilmenheter är också optimala för screening av biofilm antimikrobiella känsligheter. Dessa analyser övervakar biofilmtillväxthämning på två sätt: 1) När antimikrobiella medel tillsätts till celler i början av tillväxten kan det bestämma det minsta biofilmhämningskoncentrationen (MBIC). 2) När etablerade biofilmer bildas på pinnarna efter 24 timmar och sedan exponeras för antimikrobiella medel, kan det bestämma det lägsta biofilmsutrotningskoncentrationen (MBEC) till 17,20. I likhet med mikroplatta för biofilm i brunnen har standardbiofilmenheter vissa anmärkningsvärda begränsningar, till exempel deras höga kostnad per enhet, de är icke-autoklaverbara och mindre hållbara för kemiska lösningsmedel på grund av det polystyrenplattamaterial som används. Standardbiofilmenheter har också ett lågt förhållande mellan yta och pinnar, vilket begränsar de maximala arbetsvolymerna i varje brunn till 200 μL. Dessa faktorer kan göra standardbiofilmenheter mer utmanande att använda för studier som kräver större mängder biofilm i ett höggenomströmningsformat.
Här beskriver vi en statisk biofilm peggat lock 96-well metod utvecklad i vårt labb med hjälp av kommersiellt tillgängliga polypropylen halvkjolade 0,5 mL 96-brunn PCR plattor monterade på 96-väl microtiter plattor med brunnar djupare än standardplattan (Tabell av material). Dessa monterade enheter har en maximal arbetsvolym på 750 μL när de används för odling av biofilm (häri känd som "deep well biofilm device"). Fördelarna med att använda dessa djupbrunnbiofilmenheter är deras lägre kostnad jämfört med vanliga biofilmenheter, de kan steriliseras genom autoklavering, och de ökar ytan för biofilmbildning på den större externa PCR-plattan "rör / pinnar". Med denna metod visar vi applikationerna av dessa enheter för odling och karakterisera biofilm biomassa bildas av Escherichia coli BW25113 och P. aeruginosa PAO1. Metoder för att fastställa MBEC-värden med hjälp av biofilmsutrotningsanalyser beskrivs med hjälp av de kvartära ammoniumföreningens desinfektionsmedel bensalkoniumklorid (BZK) och antimikrobiella medel för natriumhypoklorit (blekmedel). Antiseptiska/desinfektionsmedel BZK valdes eftersom denna förening ofta används för att hämma biofilmer från förorenade ytor, men det är enligt uppgift mindre effektivt för att utrota väletablerade biofilmer21. Blekmedel är en mycket effektiv kemikalie för utrotning av etablerade biofilmer och är en stöttepelare i kemisk desinfektion 22. Båda desinfektionsmedlet ger en användbar jämförelse av MBEC-värden för varje biofilmsenhet21. Ett protokoll för denna biofilm enhet bedömning med hjälp av CV färgning och biofilm utrotning analyser för MBEC bestämning sammanfattas i denna artikel. Ett protokollflödesschema har inkluderats för en förenklad översikt över arbetsflödet för dessa metoder (bild 1).
Protocol
1. Aseptisk odlingspreparat för biofilmstillväxt (dag 0-1)
- På dag 0 sträcker du den önskade bakteriestammen för testning från ett kryokonserverat bestånd (i glycerol eller dimetylsulfoxid (DMSO)) direkt på en näringsagarplatta med antimikrobiellt urval som stammen kräver. Inkubera agarplattor vid optimal temperatur (37 °C) och tid (18-22 h) för stamtillväxt.
- Följande dag (dag 1), inokulera en koloni från agarplattan i 5 ml tillväxtmedium vid optimala tillväxtförhållanden. Dessa kulturer kommer att användas som dag 2 med inokuler för biofilmsenheter (se steg 2.2; Figur 1).
OBS: För denna studie odlades E. coli K-12 BW21153 och P. aeruginosa PAO1 i Luria-Bertani (LB) medium vid 37 °C i 18 timmar med skakning vid 160 varv per minut (rpm).- Förbered minst 3 självständigt odlade stammar för att generera biologiska replikat för biofilmsmätning på grund av den statistiska variationen av biofilmbiomassabildning på de peggade lockanordningarna.
2. Beredning och inokulering av plattor (dag 2)
- Fyll de yttre brunnarna i en autoklaverad 96-brunn, 1,1 ml/brunnspolypropylenplatta med 750 μL/välsterilt vatten (figur 2A). Fyll de negativa kontrollbrunnarna (ejinokulerade mediebrunnar; kolumn B) med 750 μL tillväxtmedier och de återstående brunnarna med 675 μL tillväxtmedium.
OBS: Steg 2.1 ovan och steg nedan listar lämpliga volymer för deep well biofilm-enheten. Vid användning av standardbiofilmsanordningen skall volymerna ändras på följande sätt: 75 μL inokulatkultur till 20 μL; 675 μL tillväxtmedium till 180 μL; 750 μL sterilt vatten/tillväxtmedium till 200 μL; 800 μL CV-fläck/ättiksyra/sköljlösningar till 210 μL. Dessutom kan absorbansen vid 500 nm (A550 nm) avläsas direkt i polystyrenmikroplattan efter blandning vid användning av standardmikebiofilmsenhetens mikroplatta. - Använd dag 1 över natten kulturer, standardisera kulturerna till en optisk densitet vid 600 nm (OD600nm) =1,0 eller till en McFarland-standard på 0,5-1 enheter.
- Skapa en 10-faldig seriell utspädning av varje standardiserad kultur i provrör eller en 96-väl djup brunnsmikroterplatta tills en 10-3 utspädning uppnås.
- Inokulera de medier som innehåller brunnar enligt figur 2B med 75 μL av den utspädda odlingen 1 x 10–3 , för en slutlig bakterieutspädning i brunnen på 10–4.
- Sätt försiktigt in en autoklaverad PCR-platta (peggat lock) i den inokulerade djupa brunnsplattan. Inkubera plattor vid optimala belastningsförhållanden (37 °C) med skakningar (högst 160 varv/min) i en inkubator med 50-60% luftfuktighet i 24 timmar.
3. Biofilmsbestämning av biomassa från enheter som använder CV-färgning (dag 3)
- Ta aseptiskt bort det biofilmsettade locket från varje anordning och skölj genom att föra in i en autoklaverad djup brunnsplatta beredd med 800 μL steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) / brunn i 30 s för att avlägsna planktonceller.
- För färgning av biomassa-CV, överför det peggade PCR-plåtlocket till en ny platta beredd med 800 μL/brunn 0,1% (w/v) CV i dH2O och fläck i 5 minuter.
- Ta bort överflödig fläck genom att skölja det peggade locket i en djup brunnsplatta beredd med 800 μL/väl steril PBS. Låt plattorna torka i 10 minuter i ett biosäkerhetsskåp med pinnar vända uppåt.
- Överför det torkade PCR-plattans lock till en tallrik som innehåller 800 μL/brunn 30% (v/v) ättiksyra och låt locket avfläcka i 5 minuter.
- Ta bort det avstätna PCR-peglocket och blanda lösningen noggrant genom pipettering. Överför 200 μL från de djupa brunnsplattorna till en standard 96 väl mikroplatta och mät absorbansen hos avfärgningslösningen vid en våglängd på 550 nm (A550nm) i en ultraviolett (UV)/ synlig (Vis) område mikroplatta läsare.
- Med hjälp av de uppmätta A550nm-värdena subtraherar du det genomsnittliga blanka (negativa kontrollvärdet) A550nm från varje biofilmsprovvärde. Medelvärde för varje tom subtraktaterat A550nm biofilmprovvärde som representerar prover biologiska replikat.
4. Utmanande biofilmer med antimikrobiella medel för att beräkna deras 24 h antimikrobiella MBEC-värde (dag 3)
- Förbered en antimikrobiell stamlösning i vatten som är två gånger (2x) koncentrationen av önskad högsta antimikrobiella koncentration som ska testas.
- Skapa en tvåfaldig utspädningsserie av den antimikrobiella stamlösningen i 2x koncentrerade tillväxtmedier så att det finns 8 antimikrobiella koncentrationer.
- Som visas i figur 2B fyller du de yttre brunnarna på en autoklaverad djup brunnsplatta med 750 μL/välsterilt vatten. Fyll pelarna B (negativ kontroll; inga bakterier) och C (positiv kontroll; ingen antimikrobiell exponering) på plattan med 750 μL/brunnstillväxtmedium. Fyll de återstående brunnarna med 750 μL/brunn av serien för antimikrobiell utspädning enligt figur 2B.
- Ta bort och skölj det peggade locket enligt beskrivningen i steg 3.1 och överför dem till den antimikrobiella utmaningsplattan.
- Inkubera plattor med skakningar (max 160 varv/min) under lämpliga belastningsförhållanden och för önskad exponeringstid.
5. Återvinning av biomassa av biofilm från knutna lock (dag 4)
- Ta bort antimikrobiella exponerade peggade lock och skölj enligt beskrivningen i steg 3.1. Överför det peggade locket till en djup brunnsplatta med 750 μL/brunnsåtervinningsmedium i de inre brunnarna och 750 μL/väl steril dH2O i de yttre brunnarna.
- För att förbereda 70 ml återhämtningsmedier, kombinera 35 ml 2x koncentrerad LB, 0,7 ml 100% interpolering-20, 3,5 ml 20x universell neutraliserande lösning och 30,8 ml steril dH2O i en steril flaska.
- För att förbereda 20x koncentrerad universell neutraliserande lösning, tillsätt 1,0 g L-histidin, 1,0 g L-cystein och 2,0 g reducerad glutation till en slutlig volym på 20 ml dH2O. Filter sterilisera lösningen genom ett 0,2 μm-filter och förvara vid 4 °C.
- Lägg enheten från steg 5.1 i en sekundär behållare monterad i ett sonljuderande vattenbad. Sonikera enheterna i 30 minuter för att lossa biofilmen från pinnar till återhämtningsmediet.
- Efter ultraljudsbehandling, ta bort det peggade locket och placera en steril platt platta lock på den djupa brunn återhämtning media plattan. Det peggade locket kan kasseras.
- Inkubera plattor med återvinningsmedium från steg 5,3 vid optimala stamtillväxtförhållanden över natten (16-18 h).
6. Bestämning av enhetens MBEC-värden (dag 5)
- Följande dag överför du 200 μL från varje brunn på den inkuberade djupa brunnsplattan från steg 5,4 till en ny 96-väl mikrotiterplatta. Läs OD600nm för varje brunn med hjälp av en UV/ Vis-serie mikroplatta läsare.
- Subtrahera negativa kontroll (ejinokulerade tomma) OD600nm värden från varje biofilm som innehåller provbrunn.
- Beräkna MBEC-värdet för varje prov med hjälp av OD600nm-värden , där MBEC-värdet är den lägsta antimikrobiella koncentrationen som resulterade i det lägsta OD600nm-värdet (oskiljbart från den oinokulerade kontrollen) för en specifik antimikrobiell behandlad art/stamprov.
Representative Results
Syftet med denna studie var att tillhandahålla en metod för att genomföra större volym, hög genomströmning (96-brunn), statiska biofilmsapparater med hjälp av djupbrunn biofilmsenheter. Här jämförde vi en självmonterad halvkjolad PCR-platta som satts in i en djup brunnsmikroplatta, känd som djupbrunnanordningen, med en vanlig standardbiofilm peggad lockenhet för att undersöka deras förmåga att bilda statiska biofilmer. CV-färgade biomassa och biofilm utrotning analyser (MBEC) användes för att bedöma biofilm bildandet av båda enheterna.
För att jämföra biofilmbildning av olika arter på varje enhet bedömde vi biofilmsbiomassa som bildats av E. coli BW25113 och P. aeruginosa PAO1 med hjälp av biofilm CV färgningsprotokoll17. Även om CV färgning rapporteras generellt som A550nm värden, på grund av skillnaderna i tillväxt volymer av varje enhet och deras tillgängliga ytor vi konverterade CV fläck A550nm värden till molar CV koncentrationer i lösning. Molar CV-koncentrationer stod för volymskillnaderna för varje produkt och gjorde det möjligt att jämföra CV-koncentrationer som representerade biomassa som återvunnits från varje enhet. Resultaten visade att båda arterna producerade betydligt mer biomassa på biofilmsapparater för djupa brunnar (2,1 gånger E. coli; 4,1 gånger P. aeruginosa) jämfört med standardbiofilmsanordningen (figur 3A-B). Detta resultat förväntades med tanke på den större ytan av den djupa brunn pcr-pinnen (320,4 mm2) jämfört med standardanordningens pegyta (108,9 mm2). Detta konstaterande överensstämmer också med de ökade volymer (750 μL) som används i biofilmsanordningen för djup brunn jämfört med standardanordningens brunnar (200 μL). Därför ökade djupbrunnsenheter biofilmsansamlingen av biomassa på PCR-rörpinnar jämfört med mindre pinnar med vanliga biofilmsenheter.
Båda biofilmsenheterna bildade reproducerbara biofilmer när vi jämförde biologiskt replikerade biofilmer bildade av E. coli och P. aeruginosa (figur 3A-B). Trots att man observerade större variationer i tekniska replikat CV-färgade M A550nm-värden för endera stammen som odlades på djupbrunnsanordningen, fanns det inga statistiskt signifikanta skillnader när vi jämförde median-CV M-värdena för varje arts biologiska replikat på djupbrunnen eller standardenheter med hjälp av tvåvägsanalys av varians (ANOVA) eller Students T-tester (båda p > 0,05). Denna slutsats visar att biofilm bildas av djupa brunn och standard enheter bildar reproducerbara biofilmer. Resultaten av CV-färgning visade emellertid också att när vi redovisade skillnader i pegytan på varje enhet visade biofilmbiomassabildningen av E. coli och P. aeruginosa statistiskt signifikanta skillnader i ackumulering av biomassa (tabell 1). Beräkningen av genomsnittlig CV-färgad biomassa (M) per peg yta i mm2 (CV M/mm2) för E. coli visade att biofilmsbildningen var 1,5 gånger lägre på polypropylen djupbrunnsenheter jämfört med standardbiofilmanordningen (tabell 1). Det motsatta resultatet erhölls dock för P. aeruginosa, som visade 1,4 gånger högre CV M/mm2 på polypropylen djup brunn enheter jämfört med standard biofilm enheter (tabell 1). Trots de observerade artspecifika skillnaderna i biofilmsansamling av biomassa med varje anordning visade djupbrunnsanordningen fortfarande större övergripande (2-4-faldig ökning) biofilmbiomassabildning av varje art (figur 3).
För att bestämma de antimikrobiella känslighetstestapplikationerna för djupbrunnbiofilmsanordningen jämförde vi två vanliga desinfektionsmedel, BZK och blekmedel, för deras biofilmsutplåningspotential. Båda kemikalierna används ofta för att förebygga (BZK) och/eller utrota (blekmedel) bakteriella biofilmer i kliniska och industriella tillämpningar21,22,23. Varje förening tillsattes i ökande 2-faldiga koncentrationer till biofilmer som bildats av E. coli och P. aeruginosa på standard- och djupbrunnbiofilmsenheter22,23 (figurerna 1, 2B). Den lägsta koncentrationen av BZK eller blekmedel som resulterade i OD600nm värden som var oskiljbara från negativa kontrollbrunnar definierades som MBEC-värdet. Behandling av biofilmer som bildats på standardbiofilmsapparater med blekmedel resulterade i samma blekmedel MBEC värden på 0,625% för E. coli och P. aeruginosa (Tabell 1, figur 4A-B). Blekmedel MBEC värden bestäms för E. coli och P. aeruginosa biofilm bildas på djupa brunn enheter visade 2-4 gånger lägre MBEC värden av båda arterna (E. coli; 0,156%; P. aeruginosa 0,313%) jämfört med standardenheter (tabell 1). En 2-faldig skillnad i blekmedel MBEC värden mellan arter noterades för djup brunn enhet, där P. aeruginosa krävde en 2-faldig högre koncentration av blekmedel för att utrota biofilmer jämfört med E. coli (figur 4A-B, tabell 1). Den 2-faldiga blekmedel MBEC skillnaden mellan P. aeruginosa och E. coli i djup brunn enhet verkar omvänt korrelera med 1,5-faldig ökad CV-färgade biomassa bildas av P. aeruginosa jämfört med E. coli (figur 3A-B). Den större mängden biomassa som bildas av P. aeruginosa på djup brunnsanordningar kan också förklara varför en högre blekmedelskoncentration krävdes för att utrota P. aeruginosa biofilmer jämfört med E. coli på djupa brunnar (figur 3A-B, tabell 1). Därför visar biofilmsutrotningsanalyser för djup brunnsanordningar att båda arterna var mottagliga för blekmedel men vid lägre (2-4-faldiga) blekmedelskoncentrationer jämfört med standardanordningar. Detta korrelerar omvänt med den 3-faldiga större pegytan och volymerna av den djupa brunnsenheten PCR-pinnar. Detta tyder på att för blekmedelsexponering kan större biomassayta sänka de blekmedelskoncentrationer som är nödvändiga för utrotning av biofilm.
BZK biofilm utrotning testning visade större variationer i återvunnen tillväxt (OD600nm värden) och MBEC värden av varje art jämfört med blekmedel resultat (figur 4C-D). Denna variabilitet är inte oväntad baserat på tidigare studier som visar att BZK var mer effektivt för att förhindra biofilmbildning än att utrota väletablerade biofilmer24,25,26. Med hjälp av standardbiofilmsanordningen visade endast P. aeruginosa biofilms som behandlats med BZK ett konsekvent MBEC-värde (2560 μg/mL) som var 8 gånger lägre än mbec-värdet (20480 μg/ml) som erhölls för denna stam i djupbrunnsanordningen (tabell 1, figur 4C). Dessa resultat kan återspegla skillnader i mängden P. aeruginosa biomassa som bildas på djupa väl knutna ytor och plastsammansättningar jämfört med standardanordningarna. BZK utrotning av biofilmer som bildats av E. coli på både den djupa brunnen och standardanordningarna var lika dålig, vilket resulterade i ett brett spektrum av BZK MBEC-värden från 2560-40960 μg/mL för djupbrunnanordningen och 320-10240 μg/ml på standardanordningen (figur 4D). För E. coli förklarades denna variabilitet av enstaka fall där 1-2 replikatbrunnar visade låg men statistiskt signifikant tillväxt i återhämtningsmedier, som ökade fel och minskade BZK MBEC-bestämningsnoggrannhet med någon av anordningarna (figur 4D, tabell 1). Denna variabilitet belyser ineffektiviteten i att använda BZK för att utrota E. coli biofilmer som tidigare noterats i studier24,25,26. P. aeruginosa biofilms kan däremot på ett tillförlitligt sätt utrotas av BZK vid en definierad koncentration med båda enheterna, men med en 8-faldig BZK-koncentrationsskillnad (figur 4C). Sammanfattningsvis visar BZK utrotning MBEC värden av biofilmer som bildas av P. aeruginosa distinkta MBEC värden med varje enhet, men båda enheterna är lika dålig på att särskilja E. coli exakta BZK utrotning fenotyper.
Därför är den djupa brunnsbiofilmenhetsmetoden som beskrivs häri lika effektiv för att bilda reproducerbara biofilmer jämfört med en vanlig biofilmanordning..
Figur 1. Schematisk översikt över experimentet. Dag 0 isolering av enskilda kolonier från kryopreserverade bestånd; Dag 1 inokulering av tillväxtmedier med enstaka kolonier; Dag 2 inokulering av biofilmplatta; Dag 3 CV färgning eller antimikrobiell utmaning; Dag 4 biofilm ultraljudsbehandling i återhämtning media; och dag 5 läser OD600nm av återställningsplattan för att bestämma MBEC-värden. Några bilder i figur från Servier Medical Art (smart.servier.com). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2. Exempel på plåtlayouter som visas för olika steg i protokollet. A) Den slutliga plåtuppsättningen för den första 24-h biofilmstillväxten med hjälp av dag 1 bakteriekulturer från två bakteriestammar (E. coli och P. aeruginosa), var och en med tre biologiska replikat. Negativa kontrollbrunnar (grå) används som sterilitetskontroller (inga bakterier tillsätts). B) Plåtinställning för antimikrobiell utmaning av biofilmer. Mörkare färger indikerar ökande antimikrobiell koncentration. Negativ kontroll är brunnar utan tillsatta bakterier (Grå) och positiva kontroller är biofilmer utan antimikrobiell exponering (orange). Biofilm peg lock tas från panel A överförs till denna djupa brunn tallrik för antimikrobiell exponering. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3. Molarkoncentrationen (M) av CV-färgade E. coli BW25113. A) och P. aeruginosa PAO1 (B) biofilmbiomassa som återvunnits från standardenheter (cirklar) och djup brunn (trianglar). CV färgning mättes genom att läsa absorbansen av CV vid 550 nm (A550nm), och djupa brunn A550nm avläsningar justerades med en faktor på 3.809 (800 μL / 210 μL) för att ta hänsyn till volymskillnaderna mellan enheterna. CV molarkoncentration (M) fastställdes av Beer-Lambert-lagen (CV-koncentration =A550nm/εl); där pathlength (l) på 210 μL i 96 väl punkterad mikrotallplatta fastställdes till 0,56 cm och utdöendekoefficienten (ε) CV i vatten vid A550nm på 251500 cm-1M-139. Resultaten representerar 9 tekniska replikat från tre biologiska replikat av varje stam som odlas som biofilm och varje biologisk replikats medianvärde visas som en horisontell stapel i varje område. Statistiskt signifikanta skillnader i biomassa mellan produkterna fastställdes mellan biologiska replikat medianvärden med hjälp av ett tvåsidigt parat t-test (E. coli p= 0,008-0,018 (*). P. aeruginosa p= 0,002-0,009 (**)) visas som staplar med asterisker. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4. Bestämning av antimikrobiell MBEC-koncentration. Bestämning av antimikrobiell MBEC-koncentration för blekmedel (A, B) och BZK (C,D) för P. aeruginosa PAO1 (A, C) och E. coli BW25113 (B,D) när de odlas på standard (vita stänger) och djupa brunnsbiofilm (grå barer) biofilm peggade enheter. Resultaten bestämdes genom läsning av OD600nm av biofilm återhämtade sig efter ultraljudsbehandling i återvinning media och övernattning inkubation. Djup brunn OD600nm justerades med en faktor på 3,75 (750 μL /210 μL) för att ta hänsyn till volymskillnader mellan enheterna. Resultaten är representativa för tre biologiska replikat och felstaplar visar standardavvikelsen mellan replikat vid varje antimikrobiell koncentration39. Asterisker (*) ovanför varje stapeldiagram anger statistiskt signifikanta skillnader i OD600nm-värden från tomma kontroller med p-värden < 0,05 med hjälp av tvåsidiga Students T-testberäkningar. Cirkelsymboler (o) ovanför varje stapeldiagram anger mätningar där endast 1 eller 2 replikat hade statistiskt signifikanta OD600nm-värden från tomma kontroller. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| BZK MBEC (μg/mL) | Blekmedel MBEC (% v/v) | |||
| Ansträngd | Djup brunn Enhet | Standardenhet | Djup brunn Enhet | Standardenhet |
| E. coli BW25113 | 2560-40960 | 320-10240 | 0.156 | 0.625 |
| P. aeruginosa PAO1 | 20480 | 2560 | 0.313 | 0.625 |
| Djup brunn Enhet | Standardenhet | p-värde** | Vikbyte (Djup brunn/ Standard) | |
| Ansträngd | Medelvärde CV M*/ mm2 ± SD | Medelvärde CV M*/ mm2 ± SD | ||
| E. coli BW25113 | 1,99 x 10-8 ± 3,25 x 10-9 | 3,03 x 10-8 ± 3,31 x 10-9 | 0.0176 | -1.52 |
| P. aeruginosa PAO1 | 8,01 x 10-8 ± 9,42 x 10-9 | 5,72 x 10-8 ± 9,42 x 10-9 | 0.034 | 1.4 |
Tabell 1. En sammanfattning av E. coli BW25113 och P. aeruginosa PAO1 medelvärden för CV-färgade biomassa M/ mm2 värden och biofilm utrotning MBEC värden för BZK och blekmedel på olika enheter.
*Medelvärdet CV M/mm2-värden beräknade med hjälp av medianvärden för biologiskt replikerat CV M (figur 3).
**p-värden bestäms med hjälp av Tvåsidig elevs T-test.
Discussion
Denna studie beskriver metoder för att använda en större volym 96-väl hög genomströmning statisk biofilm tillväxt enhet som omfattar en polypropylen djup brunn mikroplatta utrustad med en halvkjol pcr-platta lock för biofilm bildandet (djup brunn biofilm enhet; Tabell över material). Vi jämförde biofilmer som genereras med denna enhet med en kommersiellt tillgänglig biofilmenhet av polystyrenstandard (Table of Materials). Metoden för djup brunnsanordning använder samma metodologiska steg och lösningar som standardenheten17 vid justerade volymer modifierade för djupbrunnsenheterna, vilket gör denna enhet idealisk för storskalig biofilmbildning och experimentell analys. Tillväxten av E. coli BW25113 och P. aeruginosa PAO1, två gramnegativa arter som är kända för att bilda biofilmer, undersöktes för deras biomassabildning och desinfektionsmedel (BZK/blekmedel) MBEC-värden som används på båda enheterna. Jämförelse av CV-färgad biomassa som bildas på pinnar från varje enhet visade att både E. coli och P. aeruginosa bildade biofilmer med högre biomassa på biofilmanordningen för djup brunn jämfört med standardanordningen (figur 3A-B). Ökad biofilmbiomassa återspeglade den större ytan av djupa brunnspinnar jämfört med standardenhetens pegyta. När vi räknade med skillnader i pegytor (mm2) med båda enheterna noterades skillnader i biomassabildning, där E. coli bildade betydligt större CV-biomassa per mm2 på polystyrenstandardenhetspinnar än med djupbrunnanordningens PCR-rörpinnar (tabell 1). P. aeruginosa bildade större CV-färgad biomassa/ peg mm2 jämfört med standardanordningar (tabell 1). Dessa fynd kan belysa artspecifika skillnader i biofilm biomassa bildas på de olika enheterna.
Det bör noteras att blekmedelsutrotning av biofilmer av E. coli och P. aeruginosa på djup brunnsanordningar inträffade vid 2-4-faldiga lägre koncentrationer än standardanordningen (figur 4A-B, tabell 1). De skillnader i blekmedel MBEC-värden som identifieras från varje anordning påverkas sannolikt av skillnader i enhetens pegformer (djupa brunnspinnar är avsmalnande rör och standardpinnar är cylindriska), skillnader i plastsammansättning (polypropylen kontra polystyren) och volymskillnader (750 μL jämfört med 200 μL). P. aeruginosa hade till exempel större CV M biomassa/ mm2 på djup brunnsanordningar jämfört med standardanordningar, men E. coli hade mindre biomassa på djupbrunnspinnar (figur 3). Detta tyder på att desinficeringskoncentrationer som krävs för utrotning av biofilm kan påverkas av den biomassa som bildas av varje art samt den tillgängliga ytan. Dessutom kan skillnader i enhetens pegform påverka olika tillväxtförhållanden för vissa arter. I vår studie kan P. aeruginosa bilda större biomassa på djupa brunnspinnar på grund av deras större yta och luftning, eftersom denna art är en obligatorisk aerobe i motsats till E. coli, som är en fakultetsageni. Hittills har vi inte identifierat några publicerade studier som direkt har jämfört E. coli och P. aeruginosa biofilmbildning tillsammans på både polypropylen27,28,29 och polystyren30,31 material. Rapporter om robust E. coli och P. aeruginosa biofilm bildandet har dock noterats i oberoende studier som undersöker antingen polypropylen eller polystyren material. När det gäller Pseudomonads kan många Pseudomonas spp. använda plast som polypropylen som potentiella kolkällor32. Därför är tillgängligheten av denna polypropylen djup brunn biofilm enhet ett användbart framsteg i statiska biofilm studier. Polypropylen är kemiskt mer hållbart än polystyren och är ett kliniskt relevant material, eftersom det ofta används i medicinska implantat, suturer och maskor för bråck- eller bäckenoperationer33,34.
Även om biofilm biomassa bildades av båda enheterna, hade djup brunnsanordningen något högre variabilitet i biomassa baserat på CV färgningsmetod och OD600nm biofilm utrotning MBEC värden för blekmedel och BZK. Detta kan förklaras av 3 huvudfaktorer: 1) Djupbrunnsenheter har större pegyta än standardenheter som vinklades jämfört med vanliga enhetspinnar. 2) Båda de testade arterna kan ha olika förmåga att hålla fast vid polypropylen- och polystyrenmaterial i varje anordning. 3) Volymerna av tillväxtmedier som används i varje anordning (750 μL djup brunn, 200 μL-standard) och avståndet mellan den insatta pinnen till brunnens sidoväggar skiljer sig åt. Dessa problem är inte ett problem om endast en typ av enhet används för alla biofilmsexperiment, men om båda enheterna väljs bör de jämförelser vi utförde häri utföras för att identifiera skillnader36,37. På grund av skillnaderna i plastmaterial som används i varje anordning bör de CV-färgade biofilmsbiomassan och MBEC-värdena inte jämföras direkt mellan olika enheter. Om metoder och experiment utförs på samma anordning (djup brunn eller standard) är dock de resultat som erhållits för testade arter och antimikrobiella medel jämförbara.
Detta protokoll visar att självmonterade pcr-plattor med djupa brunnar är biofilmsanordningar med större volym för mätning av biofilmsbildning och utrotning som också är kostnadseffektivt. Ur ett kostnadsperspektiv varierar standardbiofilmenheter med 96 väl knutna lock detaljhandel till $ 29-36 US-dollar (USD) per enhet (Table of Materials). Polystyrenstandardbiofilmsapparater är inte autoklaverbara och är mindre toleranta mot lösningsmedel/syror på grund av dess kemiska plastegenskaper. De självmonterade polypropylendjupa brunnsplattorna som beskrivs häri, utrustade med en separat halvkjolad 96-brunn PCR-platta (Table of Materials) kostar totalt $ 14 USD per monterad enhet, vilket är hälften av standardkostnaden för biofilmsenheten. Det bör noteras att priserna kan variera beroende på region, distributör och tillgänglighet, och våra kostnader efter institutionella rabatter utarbetades till $ 9 USD / djup brunnsenhet. Dessa självmonterade djupbrunn polypropylen PCR-plattor har den extra fördelen att de är autoklaverbara för sterilisering och erbjuder 2-4 gånger mer biofilmbiomassa än standardenheter.
Sammanfattningsvis visar detta protokoll och de representativa resultaten från biofilmstillväxtjämförelser av djup brunnen och standardbiofilmenheter att båda enheterna kan odla bakteriell biofilm, men djup brunnsenheter bildar 2-4 gånger mer biofilm. Deep well biofilm-enheten erbjuder ett livskraftigt och prisvärt alternativ för större volym biofilmsbildningsexperiment med hög genomströmning, såsom screeningstudier av läkemedelskänslighet. Denna teknik kan generera biofilmer som är användbara för nedströms "-omics" extraktioner (proteomiska, metabolomiska, transkriptomiska) eller experimentella analyser (enzymatiska, fluorescerande) som kan kräva större mängder biofilmsmaterial för analyser. Djupbrunnbiofilmsanordningen rekommenderas för laboratorier som vill studera biofilmer i en 96-well-analys med hög genomströmning med hjälp av billigare, större volym, kemiskt hållbara plastmaterial som är kliniskt relevanta.
Disclosures
Författarna har inga avslöjanden att göra.
Acknowledgments
Finansieringen av detta arbete tillhandahölls genom driftsbidrag till DCB från Natural Science and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN- 2016-05891) och till MRM och GRG från regeringen för Canadian Genomics Research and Development Initiative Grant (GRDI) program (GRDI7 2254557).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic (200/CS) | Fisher Scientific | 13-678-11F | disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer |
| 2 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic, 500/CS | Fisher Scientific | 13-678-11C | disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer |
| Axygen Aerosol Filter Tips, Sterile, 5 racks/ PK, 1000 tips/rack | Fisher Scientific | 14-222-766 | sterile pipettor tips for media aliquoting |
| Axygen deep well storage microplates, round wells, 1.1 mL cap, 5/PK, P-DW-11-C | Fisher Scientific | P-DW-11-C | microplate for 96 well deepwell device biofilm cultivation |
| Axygen Filter tips, 350 µL tips racked, 96/rack, 10 racks, low retention barrier tips | Fisher Scientific | TF-350-L-R-S | sterile pipettor tips for media aliquoting |
| Basin/reservoir natural PS 50 mL, Sterile, 5/bag, 40 bags, CS200 | Avantor/ VWR | 89094-676 | sterile basins/ reservoirs for microplate preparation |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Granulated Agar, 500 g | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | materials for LB agar preparation |
| Biotek Synergy Neo2 multimode plate reader | Biotek | NEO2MB | microplate UV/Vis region plate reader |
| Branson M3800 Ultrasonic Bath, 117 V | Avantor/ VWR | CPX-952-316R | sonicating water bath |
| crystal violet (CV), ACS grade, 100 g | Fisher Scientific | C581-100 | biofilm biomass stain |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), 1 L, ACS grade 99.9%, poly bottle, BDH | Avantor/ VWR | CABDH1115-1LP | media components for cryopreservation |
| Easypet 3, pipet controller | Avantor/ VWR | CA11027-980 | serological pipettor for aseptic media/ culture transfer |
| Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 10-100 µL | Avantor/ VWR | CA89125-338 | multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer |
| Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 30-300 µL | Avantor/ VWR | CA89125-340 | multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer |
| Glacial acetic acid, CAS 64-19-7, 2.5L, ACS grade | Fisher Scientific | A38-212 | CV destain |
| Glass test tubes, 150 mm x 18 mm, 72/Pack, PYREX | Fisher Scientific | 14957H/ 9820-18 | materials for cell culturing |
| Glycerol, 4 L glass bottle ACS | Fisher Scientific | BP229-4 | media components for cryopreservation |
| L-Cysteine, 98%, 250 g | Avantor/ VWR | 97061-204 | universal neutralizing solution |
| L-glutathione reduced, 98%, 25 g | Fisher Scientific | AAJ6216614 | universal neutralizing solution |
| L-Hisitidine, 98%, 100 g | Avantor/ VWR | CA97062-598 | universal neutralizing solution |
| MBEC Assay Inoculator with 96 well tray, 100/CS | Innovotech | 19112 | material for 96 well MBEC device biofilm cultivation |
| McFarland Standard, 0.5 EA | Fisher Scientific | R20410 | cell culture standardization |
| McFarland Standard, 1.0 EA | Fisher Scientific | R20411 | cell culture standardization |
| NUNC 96-well microtiter plates, w/lid, 50/CS | Fisher Scientific | 167008 | microplate for 96 well MBEC device biofilm cultivation and OD measurements |
| PCR plate, semi-skirted 96 well, fast PCR, polypropylene, 25ea/PK | Sarstedt | 72.1981.202 | pegged lid for 96 well deepwell device biofilm cultivation |
| Petri dish, 100 mm x 15 mm, semi-TK CS/500 | Fisher Scientific | FB0875712 | materials for LB agar preparation |
| Potassium phosphate dibasic, ACS 500 g | Fisher Scientific | P288-500 | PBS component/ buffer |
| Sodium chloride, ACS grade, 3 kg | Fisher Scientific | S2713 | media components for LB broth and PBS |
| sodium phosphate monobasic, 1 kg | Fisher Scientific | S369-1 | PBS component/ buffer |
| Syringe filters, Sterile, PES 0.45 um, 25 mm, PK50 | Avantor/ VWR | 28145-505 | non-autoclavable solution sterilization |
| Tin foil, heavy duty, 50 feet | Grocery store | --- | materials for deepwell device sterilization |
| Tryptone (peptone from casein), 2.2 kg/EA | Fisher Scientific | B11922 | media components for LB broth |
| Tween-20, 100 mL | Fisher Scientific | BP337-100 | recovery media solution |
| Ultra-deepwell, 2.5 mL deep well plates (square well), with lid, polypropylene, 10/CS | Avantor/ VWR | 37001-520 | materials for biofilm dilution preparation |
| Yeast Extract, Fisher Bioreagents, 500 g | Fisher Scientific | BP1422-500 | media components for LB broth |
References
- Verderosa, A. D., Totsika, M., Fairfull-Smith, K. E. Bacterial Biofilm Eradication Agents: A Current Review. Frontiers in Chemistry. 7, 1-17 (2019).
- Sharma, D., Misba, L., Khan, A. U. Antibiotics versus biofilm: An emerging battleground in microbial communities. Antimicrobial Resistance and Infection Control. 8 (1), 1-10 (2019).
- Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P.
- Lagacé-Wiens, P. R. S., et al. Trends in antimicrobial resistance over 10 years among key bacterial pathogens from Canadian hospitals: results of the CANWARD study 2007-16. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74, Suppl 4 22-31 (2019).
- Karlowsky, J. A., et al. In vitro susceptibility of urinary Escherichia coli isolates to first- and second-line empirically prescribed oral antimicrobials: CANWARD surveillance study results for Canadian outpatients, 2007-2016. International Journal of Antimicrobial Agents. 54 (1), 62-68 (2019).
- Mah, T. F.
- Amato, S. M., et al. The role of metabolism in bacterial persistence. Frontiers in Microbiology. 5, 1-9 (2014).
- Flemming, H. -C., Neu, T. R., Wozniak, D. J. The EPS matrix: The "house of biofilm cells.". Journal of Bacteriology. 189 (22), 7945-7947 (2007).
- Dela Fuente-Núñez, C., Reffuveille, F., Fernández, L., Hancock, R. E. W. Bacterial biofilm development as a multicellular adaptation: Antibiotic resistance and new therapeutic strategies. Current Opinion in Microbiology. 16 (5), 580-589 (2013).
- Høiby, N., et al. The clinical impact of bacterial biofilms. International Journal of Oral Science. 3 (2), 55-65 (2011).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Current Protocols in Microbiology. 01, Unit 1B.1 (2005).
- Coffey, B. M., Anderson, G. G. Biofilm formation in the 96-well microtiter plate. Methods in Molecular Biology. 1149, 631-641 (2014).
- O'Toole, G. A. Microtiter dish Biofilm formation assay. Journal of Visualized Experiments. (47), e2437 (2010).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Harrison, J. J., Turner, R. J., Ceri, H. High-throughput metal susceptibility testing of microbial biofilms. BMC Microbiology. 5 (53), (2005).
- Ceri, H., et al. The MBEC Assay System: Multiple Equivalent Bioffims for Antibiotic and Biocide Susceptibility Testing. Methods in Enzymology. 337, 377-385 (2001).
- Harrison, J. J., et al. Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening. Nature Protocols. 5 (7), 1236-1254 (2010).
- vanden Driessche, F., Rigole, P., Brackman, G., Coenye, T. Optimization of resazurin-based viability staining for quantification of microbial biofilms. Journal of Microbiological Methods. 98, (2014).
- Sabaeifard, P., Abdi-Ali, A., Gamazo, C., Irache, J. M., Soudi, M. R. Improved effect of amikacin-loaded poly(D,L-lactide-co-glycolide) nanoparticles against planktonic and biofilm cells of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Medical Microbiology. 66 (2), 137-148 (2017).
- Thieme, L., et al. MBEC Versus MBIC: the Lack of Differentiation between Biofilm Reducing and Inhibitory Effects as a Current Problem in Biofilm Methodology. Biological Procedures Online. 21 (1), 18 (2019).
- Jennings, M. C., Ator, L. E., Paniak, T. J., Minbiole, K. P. C., Wuest, W. M. Biofilm-eradicating properties of quaternary ammonium amphiphiles: Simple mimics of antimicrobial peptides. Chembiochem. 15 (15), 2211-2215 (2014).
- Lineback, C. B., et al. Hydrogen peroxide and sodium hypochlorite disinfectants are more effective against Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms than quaternary ammonium compounds. Antimicrobial Resistance & Infection Control. 7 (1), 154 (2018).
- Minbiole, K. P. C., et al. From antimicrobial activity to mechanism of resistance: The multifaceted role of simple quaternary ammonium compounds in bacterial eradication. Tetrahedron. 72 (25), 3559-3566 (2016).
- Mangalappalli-Illathu, A. K., Korber, D. R. Adaptive resistance and differential protein expression of Salmonella enterica serovar enteritidis biofilms exposed to benzalkonium chloride. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3588-3596 (2006).
- El-Banna, T., Abd El-Aziz, A., Sonbol, F., El-Ekhnawy, E. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa clinical isolates to benzalkonium chloride retards its growth and enhances biofilm production. Molecular Biology Reports. 46, 3437-3443 (2019).
- Ebrahimi, A., et al. Effects of benzalkonium Chloride on planktonic growth and biofilm formation by animal bacterial pathogens. Jundishapur Journal of Microbiology. 8 (2), 59764 (2015).
- Reśliński, A., et al. Evaluation of Staphylococcus aureus and Escherichia coli biofilm formation on the surface of polypropylene mesh. Medycyna doświadczalna i mikrobiologia. 63 (1), 21-27 (2011).
- Verhorstert, K. W. J., et al. In vitro bacterial adhesion and biofilm formation on fully absorbable poly-4-hydroxybutyrate and nonabsorbable polypropylene pelvic floor implants. Cite This: ACS Applied Materials & Interfaces. 12, 53646-53653 (2020).
- Arkatkar, A., Juwarkar, A. A., Bhaduri, S., Uppara, P. V., Doble, M. Growth of Pseudomonas and Bacillus biofilms on pretreated polypropylene surface. International Biodeterioration & Biodegradation. 64 (6), (2010).
- Jones, J. F., et al. Oriented adhesion of Escherichia coli to polystyrene particles. Applied and Environmental Microbiology. 69 (11), 6515-6519 (2003).
- Zameer, F., et al. Evaluation of adhesive and anti-adhesive properties of Pseudomonas aeruginosa biofilms and their inhibition by herbal plants. Iranian Journal of Microbiology. 8 (2), 108-119 (2016).
- Arkatkar, A., Juwarkar, A. A., Bhaduri, S., Uppara, P. V., Doble, M. Growth of Pseudomonas and Bacillus biofilms on pretreated polypropylene surface. International Biodeterioration and Biodegradation. 64 (6), 530-536 (2010).
- Dieterich, M., et al. Implant-Based Breast Reconstruction Using a Titanium-Coated Polypropylene Mesh (TiLOOP Bra). Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (1), 8-19 (2013).
- Clavé, A., et al. Polypropylene as a reinforcement in pelvic surgery is not inert: comparative analysis of 100 explants. International Urogynecology Journal. 21 (3), 261-270 (2010).
- Zameer, F., et al. Evaluation of adhesive and anti-adhesive properties of Pseudomonas aeruginosa biofilms and their inhibition by herbal plants. Iranian Journal of Microbiology. 8 (2), 108-119 (2016).
- Chen, R., Liu, X., Han, L., Zhang, Z., Li, Y. Morphology, thermal behavior, rheological, and mechanical properties of polypropylene/polystyrene blends based on elongation flow. Polymers for Advanced Technologies. 31 (11), 2722-2732 (2020).
- Vial Loading Trays Polystyrene vs. polypropylene: Which tubes are best for your research. ChemTech International. , Available from: https://chemtech-us.com/polystyrene-vs-polypropylene-which-tubes-are-best-for-your-research/ (2020).
- Bock, L. J., Hind, C. K., Sutton, J. M., Wand, M. E. Growth media and assay plate material can impact on the effectiveness of cationic biocides and antibiotics against different bacterial species. Letters in Applied Microbiology. 66 (5), 368-377 (2018).
- Prahl, S. Crystal violet. , Available from: https://omic.org/spectra/PhotochemCAD/html/048.html (2017).
