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सिलिया बीट आवृत्ति के परिमाणीकरण के लिए प्राथमिक मानव नाक उपकला कोशिका मॉडल का संग्रह, विस्तार और भेदभाव

Published: November 10, 2021 doi: 10.3791/63090
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2, 1,2,3, 4, 5, 1,2,3
1School of Women's and Children's Health, Faculty of Medicine and Health, University of New South Wales, 2Molecular and Integrative Cystic Fibrosis Research Centre (miCF RC), Faculty of Medicine and Health, University of New South Wales, 3Department of Respiratory Medicine, Sydney Children's Hospital, 4Department of Pathology, School of Medical Sciences, University of New South Wales Australia, 5Katharina Gaus Light Microscopy Facility, Mark Wainwright Analytical Centre, University of New South Wales

Summary

यह प्रोटोकॉल नाक उपकला कोशिका संग्रह, विस्तार और ऑर्गेनोटाइपिक वायुमार्ग उपकला कोशिका मॉडल में भेदभाव और लाइव-सेल इमेजिंग और कस्टम-निर्मित स्क्रिप्ट के माध्यम से सिलिया बीट आवृत्ति का परिमाणीकरण का वर्णन करता है।

Abstract

सिलिया फ़ंक्शन (बीट फ्रीक्वेंसी, पैटर्न) के माप को प्राथमिक सिलिअरी डिस्केनेसिया जैसे श्वसन रोगों के लिए नैदानिक उपकरण के रूप में स्थापित किया गया है। हालांकि, इन तकनीकों का व्यापक अनुप्रयोग पर्यावरणीय कारकों जैसे तापमान, आर्द्रता और पीएच में परिवर्तन के लिए सिलिअरी फ़ंक्शन की अत्यधिक संवेदनशीलता से सीमित है। सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) वाले रोगियों के वायुमार्ग में, बलगम संचय सिलिया पिटाई में बाधा डालता है। सीएफ ट्रांसमेम्ब्रेन चालकता नियामक (सीएफटीआर) चैनल गतिविधि के संकेतक के रूप में प्राथमिक वायुमार्ग सेल मॉडल में सिलिया फ़ंक्शन की जांच की गई है। हालांकि, सीएफटीआर-मॉड्यूलेटिंग दवाओं के जवाब में सिलिया बीटिंग आवृत्ति में काफी रोगी-से-रोगी परिवर्तनशीलता पाई गई है, यहां तक कि समान सीएफटीआर उत्परिवर्तन वाले रोगियों के लिए भी। इसके अलावा, सिलिअरी फ़ंक्शन पर निष्क्रिय सीएफटीआर-विनियमित क्लोराइड स्राव का प्रभाव खराब समझा जाता है। वर्तमान में इन विट्रो वायुमार्ग मॉडल, छवि अधिग्रहण और सिलिया बीट फ्रीक्वेंसी (सीबीएफ) के विश्लेषण की नमूना तैयारी का प्रदर्शन करने वाला कोई व्यापक प्रोटोकॉल नहीं है। पर्यावरणीय रूप से नियंत्रित स्थिति में किए गए मानकीकृत संस्कृति की स्थिति और छवि अधिग्रहण व्यक्तियों के बीच सीबीएफ के सुसंगत, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिमाणीकरण और सीएफटीआर-मॉड्यूलेटिंग दवाओं के जवाब में सक्षम करेगा। यह प्रोटोकॉल तीन अलग-अलग वायुमार्ग उपकला कोशिका मॉडल प्रणालियों में सीबीएफ की मात्रा का वर्णन करता है: 1) देशी उपकला शीट, 2) पारगम्य समर्थन सम्मिलित पर चित्रित वायु-तरल इंटरफ़ेस मॉडल, और 3) बाह्य मैट्रिक्स-एम्बेडेड तीन-आयामी ऑर्गेनोइड। बाद के दो विवो फेफड़ों के शरीर विज्ञान में प्रतिकृति करते हैं, जिसमें सिलिया को हरा दिया जाता है और बलगम का उत्पादन होता है। सिलियरी फ़ंक्शन को पर्यावरण-नियंत्रित कक्ष में एक उच्च गति वाले वीडियो कैमरे का उपयोग करके कैप्चर किया गया है। सीबीएफ के विश्लेषण के लिए कस्टम-निर्मित स्क्रिप्ट का उपयोग किया जाता है। क्लिनिक में सीबीएफ माप का अनुवाद प्रति-रोगी आधार पर सीएफटीआर-मॉड्यूलेटिंग दवाओं की प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करने के लिए एक महत्वपूर्ण नैदानिक उपकरण होने की कल्पना की गई है।

Introduction

सिलिया बीट फ्रीक्वेंसी (सीबीएफ) और पैटर्न के माप को प्राथमिक सिलियरी डिस्केनेसिया (पीसीडी) 1 जैसे श्वसन रोगों के लिए नैदानिक उपकरण के रूप में स्थापित किया गया है। सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) में, सीएफ ट्रांसमेम्ब्रेन चालकता नियामक (सीएफटीआर) क्लोराइड चैनल की शिथिलता वायुमार्ग की सतह तरल के निर्जलीकरण और बिगड़ा हुआ म्यूकोसिलरी निकासीका कारण बनती है। प्राथमिक वायुमार्ग सेल मॉडल में सिलियरी फ़ंक्शन की जांच सीएफटीआर चैनल गतिविधि 3 के संकेतक के रूप में की गईहै। हालांकि, सीएफटीआर-मॉड्यूलेटिंग दवाओं के जवाब में सीबीएफ में काफी रोगी-से-रोगी परिवर्तनशीलता मौजूद है, यहां तक कि एक ही सीएफटीआर उत्परिवर्तनवाले रोगियों के लिए भी। इसके अलावा, सिलिअरी फ़ंक्शन पर निष्क्रिय सीएफटीआर-विनियमित क्लोराइड स्राव का प्रभाव खराब समझा जाता है। वर्तमान में इन विट्रो वायुमार्ग मॉडल, छवि अधिग्रहण और सीबीएफ के विश्लेषण की नमूना तैयारी का प्रदर्शन करने वाला कोई व्यापक प्रोटोकॉल नहीं है।

नाक के म्यूकोसल ब्रशिंग से अलग नाक उपकला शीट का उपयोग सीधे पीसीडी निदान के लिए सिलियरी फ़ंक्शन के माप के लिए किया जाताहै। फिर भी, जबकि प्राप्त नाक उपकला शीट के आकार या गुणवत्ता पर कोई नियंत्रण नहीं है, सीबीएफ इस बात पर निर्भर करता है कि क्या इसे एकल कोशिकाओं या सेल शीट पर मापा जाता है और उपकला शीट सिलिएटेड किनारों पर जो बाधित या अबाधितहोते हैं। जैसे, नाक म्यूकोसल ब्रशिंग के संग्रह के दौरान कोशिकाओं को नुकसान के कारण द्वितीयक डिस्केनेसिया सीबीएफ को प्रभावित कर सकता है। नाक उपकला कोशिकाओं की प्राथमिक कोशिका संस्कृति और एयर-लिक्विड इंटरफेस (एएलआई) या तीन आयामी तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में सिलिएटेड वायुमार्ग उपकला ऑर्गेनोइड्स में उनका भेदभाव सिलिया को जन्म देता है जो द्वितीयक डिस्केनेसिया 4,6,7,8 से मुक्त होते हैं। एएलआई (अब से एएलआई मॉडल कहा जाता है) में विभेदित वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं को एक महत्वपूर्ण माध्यमिक नैदानिक सहायता माना गया है जो सिलियरी बीट पैटर्न और एक्स विवो नाक म्यूकोसल ब्रशिंग6 की आवृत्ति को दोहराता है और रोगी-विशिष्ट दोषों को बनाए रखते हुए सिलियरी अल्ट्रास्ट्रक्चर, बीट पैटर्न और बीट आवृत्ति के विश्लेषण को सक्षम करताहै। . फिर भी, इन स्यूडोस्ट्रेटिफाइड, म्यूकोसिलरी विभेदित सेल मॉडल बनाने के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धतियों में विसंगतियां मौजूद हैं। विभिन्न संस्कृति विस्तार या भेदभाव प्रोटोकॉल अलग-अलग उपकला फेनोटाइप (सिलिएटेड या स्रावी) 10 को प्रेरित कर सकते हैं और इसके परिणामस्वरूप सीबीएफ11 में महत्वपूर्ण अंतर हो सकता है। सीबीएफ को नाक के उपकला ब्रशिंग 4,6,12,13,14,15,16, वायुमार्ग उपकला ऑर्गेनोइड्स 14,17,18 और एएलआई मॉडल 3,4,6,13,19,20 में परिमाणित किया गया है। 21. फिर भी, इन प्रोटोकॉल के बीच, बड़ी विविधताएं हैं, और अक्सर कई मापदंडों को नियंत्रित नहीं किया जाता है। उदाहरण के लिए, कुछ अध्ययनों में, सीबीएफ को सीटू में चित्रित किया जाता है, जबकि एएलआई मॉडल की कोशिकाएं पारगम्य समर्थन प्रविष्टि 3,19,20,21 पर रहती हैं, फिर भी अन्य पारगम्य समर्थन सम्मिलित से कोशिकाओं को खुरचते हैं और उन्हें मीडिया 4,6,13 में निलंबित करते हैं।

इसके अलावा, सिलिअरी फ़ंक्शन को मापने वाली तकनीकों का व्यापक अनुप्रयोग पर्यावरणीय कारकों में परिवर्तन के लिए सिलियरी फ़ंक्शन की अत्यधिक संवेदनशीलता से सीमित है। तापमान 22, आर्द्रता23,24, और पीएच 25,26 जैसे पर्यावरणीय कारक सिलिअरी फ़ंक्शन को प्रभावित करते हैं और सीबीएफ को सटीक रूप से मापने के लिए विनियमित किया जाना चाहिए। विभिन्न प्रयोगशालाओं में उपयोग किए जाने वाले विभिन्न शारीरिक मापदंडों और वे सीबीएफ को कैसे प्रभावित करते हैं,की पहले समीक्षा की गई है।

सीबीएफ माप के लिए विभिन्न इमेजिंग प्रौद्योगिकियों और दृष्टिकोणों को साहित्य में बताया गया है। पीसीडी निदान के लिए, वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग सिलियरी फ़ंक्शन28,29 को मापने के लिए किया जाता है। हाल ही में, वायुमार्ग उपकला सेल एएलआई मॉडल3,30 में सीबीएफ और सिलिया समन्वय दोनों को मापने के लिए अंतर गतिशील माइक्रोस्कोपी पर आधारित एक वीडियो विश्लेषण एल्गोरिदम का उपयोग किया गया था। यह विधि क्षेत्रों को विभाजित या चयनित करने की आवश्यकता के बिना, वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं में सिलियरी बीटिंग के लक्षण वर्णन को तेज और पूरी तरह से स्वचालित तरीके से सक्षम बनाती है। सीबीएफ की इमेजिंग और परिमाणीकरण के लिए विभिन्न तरीके साहित्य में सीबीएफ में रिपोर्ट किए गए मतभेदों को जोड़ सकते हैं (पूरक फाइल 1)।

मौजूदा तरीकों को सुव्यवस्थित करने के लिए संस्कृति से परिमाणीकरण तक एक प्रोटोकॉल, संस्कृति की स्थितियों का मानकीकरण, और छवि अधिग्रहण, सख्त पर्यावरणीय रूप से नियंत्रित परिस्थितियों में किया जाता है, व्यक्तियों के भीतर और बीच सीबीएफ के सुसंगत, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिमाणीकरण को सक्षम करेगा।

यह प्रोटोकॉल उपकला कोशिकाओं के संग्रह, विस्तार और भेदभाव संस्कृति की स्थिति, और नाक मूल के तीन अलग-अलग वायुमार्ग उपकला कोशिका मॉडल प्रणालियों में सीबीएफ की मात्रा का पूरा विवरण प्रदान करता है: 1) देशी उपकला शीट, 2) पारगम्य समर्थन आवेषण पर चित्रित एएलआई मॉडल और 3) एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) -एम्बेडेड तीन-आयामी ऑर्गेनोइड्स (चित्रा 1) ). नाक के अवर टर्बिनेट ब्रशिंग से प्राप्त नाक उपकला कोशिकाओं का उपयोग वायुमार्ग उपकला के प्रतिनिधियों के रूप में किया जाता है क्योंकि वे ब्रोन्कियल ब्रशिंग एकत्र करने से जुड़ी आक्रामक प्रक्रिया पर काबू पाने के दौरान ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओंके लिए एक प्रभावी सरोगेट हैं। सशर्त रीप्रोग्रामिंग सेल (सीआरसी) विधि का उपयोग एएलआई मॉडल और त्रि-आयामी ऑर्गेनोइड्स के निर्माण के लिए प्राथमिक वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए किया जाता है। स्टेम सेल जैसी स्थिति में वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं की सशर्त पुन: प्रोग्रामिंग विकास-गिरफ्तार फाइब्रोब्लास्ट फीडर सेल सिस्टम और आरएचओ-संबद्ध किनेज (रॉक) अवरोधक32 के साथ सह-संस्कृति द्वारा प्रेरित होती है। महत्वपूर्ण रूप से, सीआरसी विधि वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं में आबादी को दोगुना करती है, जबकि उनके ऊतक-विशिष्ट भेदभाव क्षमता33,34 को बनाए रखती है। सभी वायुमार्ग उपकला कोशिका मॉडल में, सिलियरी फ़ंक्शन को मानकीकृत छवि अधिग्रहण सेटिंग्स के साथ उच्च गति वाले वीडियो कैमरे का उपयोग करके तापमान-नियंत्रित कक्ष में कैप्चर किया जाता है। सीबीएफ की मात्रा का परिमाणीकरण करने के लिए कस्टम-निर्मित स्क्रिप्ट का उपयोग किया जाता है।

Figure 1
चित्रा 1: वर्कफ़्लो का योजनाबद्ध। प्रतिभागियों के नाक के अवर टर्बिनेट को ब्रश करने के बाद, वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं का उपयोग दो तरीकों में से एक में किया जाता है। या तो वायुमार्ग उपकला शीट को अलग किया जाता है, और सिलिया बीट आवृत्ति को तुरंत चित्रित किया जाता है, या वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं को सशर्त रीप्रोग्रामिंग सेल विधि के माध्यम से विस्तारित किया जाता है। सीआरसी-विस्तारित वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं को वायु-तरल इंटरफ़ेस या वायुमार्ग उपकला ऑर्गेनोइड संस्कृतियों में वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं को स्थापित करने के लिए विभेदित किया जाता है। सिलियरी बीट आवृत्ति की इमेजिंग को हीटिंग और आर्द्रता पर्यावरण कक्ष और एक तेज फ्रेम दर (>100 हर्ट्ज) वैज्ञानिक कैमरे के साथ लाइव-सेल इमेजिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। डेटा विश्लेषण कस्टम-निर्मित स्क्रिप्ट का उपयोग करके किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

अध्ययन अनुमोदन सिडनी चिल्ड्रन हॉस्पिटल नेटवर्क एथिक्स रिव्यू बोर्ड (एचआरईसी / 16 / एससीएचएन / 120) से प्राप्त किया गया था। जैव नमूनों के संग्रह से पहले सभी प्रतिभागियों (या प्रतिभागियों के अभिभावक) से लिखित सहमति प्राप्त की गई थी।

1. वायुमार्ग उपकला कोशिका मॉडल स्थापित करने की तैयारी

  1. 80% डलबेको के मॉडिफाइड ईगल मीडियम और 20% फीटल बोवाइन सीरम के संयोजन से नाक सेल संग्रह मीडिया तैयार करें। स्ट्रेप्टोमाइसिन के 1 μL / mL के साथ पूरक। 3 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. चरण 1.2.1-1.2.4 का पालन करते हुए प्रति-आवश्यकता के आधार पर कोलेजन समाधान के साथ फ्लास्क या पारगम्य समर्थन सम्मिलित करें। कोलेजन-लेपित वाहिकाओं को लंबे समय तक स्टोर न करें।
    1. फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ टाइप 1 कोलेजन समाधान (3 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक) को 0.03 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता तक 1: 100 कमजोर करें। अच्छी तरह मिलाएं।
    2. सेल कल्चर फ्लास्क (खंड 4) को 160 μL/cm2 (यानी, 4 mL प्रति T25 फ्लास्क) और पारगम्य समर्थन सम्मिलित (खंड 5) के साथ 455 μL/cm2 (यानी, 150 μL प्रति 6.5 mm सम्मिलित) के साथ तैयार कोलेजन समाधान के साथ कोट करें।
    3. 2-24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. बीज बोने से पहले पिपेट या वैक्यूम एस्पिरेटर द्वारा कोलेजन समाधान को हटा दें। बीज कोशिकाओं से पहले बर्तन को न धोएं।
  3. तालिका 1 में सूचीबद्धघटक32 के संयोजन से सशर्त रीप्रोग्रामिंग सेल (सीआरसी) मीडिया तैयार करें। बोतल-टॉप वैक्यूम फ़िल्टर सिस्टम का उपयोग करके फ़िल्टर निष्फल करें। 2 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. उपयोग के दिन, मानव एपिडर्मल विकास कारक, रॉक अवरोधक और एंटीबायोटिक्स जोड़ें जैसा कि तालिका 1 में दर्शाया गया है।
घटक आयतन
डीएमईएम, उच्च ग्लूकोज 156.7 mL
डीएमईएम/एफ-12, एचईपीईएस 313.3 एमएल
हाइड्रोकार्टिसोन 55.6 μL
इन्सुलिन 1.25 एमएल
हैजा विष 21 μL
ऐडिनीन 1.2 mL
HI-FBS 25 mL
पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन 5 mL
मानव एपिडर्मल विकास कारक 1 μL/mL
रॉक अवरोधक 1 μL/mL
Fungizone 2 μl/ml
टोब्रामाइसिन 2 μL/mL
Ceftazidime हाइड्रेटe 4 μL/mL
जेंटामाइसिन समाधान 1 μL/mL

तालिका 1: सशर्त रीप्रोग्रामिंग सेल मीडिया के 500 एमएल के लिए घटक

2. नाक के अवर टर्बिनेट ब्रशिंग का संग्रह

नोट: प्रोटोकॉल के इस खंड में नाक सेल संग्रह मीडिया, कोशिका विज्ञान ब्रश, ऊतक और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण के साथ एक संग्रह ट्यूब (50 एमएल) की आवश्यकता होती है। ऊपरी श्वसन पथ के संक्रमण के दौरान ब्रश करने से बचें। रक्तस्राव का एक छोटा जोखिम है, जो सूजन मौजूद होने पर बढ़ जाता है। यदि ब्रशिंग का उद्देश्य पूर्व विवो सीबीएफ माप के लिए वायुमार्ग उपकला शीट प्राप्त करना है, तो ब्रशिंग किसी भी ऊपरी श्वसन संक्रमण के बाद कम से कम 6 सप्ताह बाद होनी चाहिए; आदर्श रूप से, संक्रमण के 10 सप्ताह से अधिक35।

  1. नाक सेल संग्रह मीडिया (अनुभाग 1) तैयार करें और ट्यूब को बर्फ पर रखें।
  2. प्रतिभागी को प्रक्रिया को असुविधाजनक के रूप में वर्णन करें। बता दें कि ब्रश करने के दौरान नाक में पूरी सनसनी महसूस होती है, जैसे समुद्र/पूल में कूदना और नाक के मार्ग में पानी दौड़ना। प्रतिभागियों को सलाह दें कि प्रक्रिया एक रिफ्लेक्स के रूप में आँसू के उत्पादन को प्रेरित करेगी।
  3. आकलन करें कि प्रतिभागी के लिए कौन सी स्थिति उपयुक्त है। प्रतिभागी को लापरवाह स्थिति में रखें यदि एक परीक्षा सोफे उपलब्ध है क्योंकि लापरवाह स्थिति प्रक्रिया के दौरान प्रतिभागी के सिर को ब्रश से दूर ले जाती है। वैकल्पिक रूप से, प्रतिभागी को एक दीवार के बगल में बैठाएं, जिसके खिलाफ वे अपना सिर वापस दबा सकते हैं।
  4. नाक मार्ग का निरीक्षण करें। सेप्टल विचलन, पॉलीप्स और किसी भी अन्य शारीरिक असामान्यताओं पर ध्यान दें जो नाक मार्ग में ब्रश के पारित होने को प्रभावित कर सकते हैं और रक्तस्राव के जोखिम को बढ़ा सकते हैं।
  5. प्रतिभागियों को अपनी नाक को ऊतक में उड़ाने के लिए कहकर अतिरिक्त बलगम की नाक को साफ करें।
  6. प्रतिभागी को अपने मुंह से सांस लेने के लिए कहें। प्रमुख हाथ में एक कोशिका विज्ञान ब्रश लें। हाथ को लंगर देने के लिए प्रतिभागी की ठोड़ी पर पांचवें अंक को आराम देते समय, प्रतिभागी के नाक मार्ग में कोशिका विज्ञान ब्रश डालें (चित्रा 2)। नाक के मांस से गुजरने के लिए प्रतिभागी के चेहरे पर ~ 45 ° पर ब्रश डालें।
  7. ब्रश को सीधा रखें ताकि यह प्रतिभागी के चेहरे के लंबवत हो। ब्रश को धीरे से लेकिन दृढ़ता से हीन टर्बिनेट के नीचे नाक की पार्श्व दीवार के खिलाफ आगे बढ़ाएं जब तक कि यह अवर टर्बिनेट के मध्य से पीछे के हिस्से में न हो।
    नोट: अति-सम्मिलन से बचें; यदि प्रतिरोध में अचानक गिरावट महसूस की जाती है, तो नाक ग्रसनी दर्ज की गई है, और ब्रश को तब तक वापस ले लिया जाना चाहिए जब तक कि प्रतिरोध फिर से प्रक्रियावादी द्वारा महसूस नहीं किया जाता है।
  8. ब्रश को 360° से तीन बार घुमाएं। सम्मिलन पैंतरेबाज़ी के विपरीत ब्रश को धीरे से हटा दें, ताकि कोशिकाओं को ब्रश से हटाया न जाए।
  9. ब्रश को नाक सेल संग्रह मीडिया के साथ तैयार संग्रह ट्यूब में रखें। संग्रह ट्यूब को बर्फ पर रखें।
  10. यदि प्रतिभागी सहमत है / बड़ी संख्या में कोशिकाओं की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, सेल संस्कृति शुरू करने के लिए) तो दूसरी नासिका में ब्रशिंग को दोहराएं।
    नोट: एक ही नथुने को फिर से ब्रश किया जा सकता है यदि ब्रश पर कोई दिखाई देने वाली रक्त कोशिकाएं नहीं थीं, हालांकि, ध्यान दें कि एक ही नाक में दूसरे ब्रश के साथ रक्तस्राव का खतरा थोड़ा बढ़ जाता है।

Figure 2
चित्रा 2: नाक उपकला कोशिकाओं का संग्रह। अवर टर्बिनेट के मध्य से पीछे के हिस्से में कोशिका विज्ञान ब्रश के स्थान का चित्रण। यह स्थिति नरेस के माध्यम से ब्रश को सम्मिलित करके, ब्रश को चेहरे पर 90 ° कोण तक मोड़कर और हीन टर्बिनेट के नीचे नाक मार्ग के साथ ब्रश का मार्गदर्शन करके पहुंच जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3. वायुमार्ग उपकला शीट की तैयारी

नोट: प्रोटोकॉल के इस खंड में संग्रह ट्यूब (साइटोलॉजी ब्रश (ईएस) + नाक सेल संग्रह मीडिया के 1 एमएल) (खंड 2) और 96-अच्छी तरह से फ्लैट-बॉटम प्लेट की आवश्यकता होती है। यदि वायुमार्ग उपकला शीट की इमेजिंग के उद्देश्य से नाक टर्बिनेट ब्रशिंग एकत्र करते हैं, तो केवल 1 एमएल एंटीबायोटिक-मुक्त नाक सेल संग्रह मीडिया का उपयोग करें; अन्यथा, उपकला शीट इमेजिंग के लिए बहुत फैल जाएगी।

  1. ब्रश से वायुमार्ग उपकला चादरों को हटाने के लिए कोशिका विज्ञान ब्रश (ओं) युक्त संग्रह ट्यूब को धीरे से घुमाएं।
  2. पी 1000 पिपेट के साथ सभी मीडिया और कोशिकाओं को इकट्ठा करें। 5-6 बूंदों को 96-अच्छी तरह से सपाट-तल प्लेट के कुएं में वितरित करें। लगभग सात कुओं के लिए दोहराएं।
  3. चरण 7.1.4 के अनुसार माइक्रोस्कोप पर प्लेट स्थानांतरित करें और सिलिया बीट आवृत्ति की छवि बनाने के लिए अनुभाग 7 के शेष का पालन करें।
  4. छवि उपकला शीट (चित्रा 1) और एक भी असंबद्ध कोशिकाएं नहीं क्योंकि यह प्रदर्शित किया गया है कि पित्त संबंधी कार्य उपकला शीट और एकल असंबद्ध कोशिकाओं के बीच भिन्न होताहै।

4. वायुमार्ग उपकला कोशिका विस्तार और रखरखाव

  1. वायुमार्ग उपकला सशर्त रीप्रोग्रामिंग सेल विस्तार संस्कृति
    नोट: कोलेजन समाधान लेपित पोत (खंड 1), विकिरणित माउस भ्रूण फीडर कोशिकाएं (एनआईएच -3 टी 3), सशर्त रीप्रोग्रामिंग सेल (सीआरसी) मीडिया (खंड 1), नाक सेल संग्रह मीडिया में कोशिका विज्ञान ब्रश (ई) (खंड 2)।
    1. प्लेट ने तैयार कोलेजन समाधान लेपित कल्चर पोत (ओं) में 8,000 कोशिकाओं / सेमी 2 के सीडिंग घनत्व पर कम से कम2 घंटे और वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति से पहले 72 घंटे से अधिक नहीं (फीडर सेल कल्चर और विकिरण के लिए36 देखें) में फीडर कोशिकाओं को विकिरणित किया।
    2. संग्रह ट्यूब (साइटोलॉजी ब्रश (ईएस) + नाक सेल संग्रह मीडिया) में ब्रश की गई कोशिकाओं को बर्फ पर भंवर में स्थानांतरित करें। कम गति पर, भंवर ट्यूब 10 सेकंड पर, 10 सेकंड दूर (बीच में बर्फ पर रखें) ब्रश से कोशिकाओं को हटाने के लिए। जोरदार भंवर सेल व्यवहार्यता को कम कर सकता है। यह जांचने के लिए ब्रश (ओं) का निरीक्षण करें कि बलगम अभी भी पालन किया गया है या नहीं। यदि हां, तो भंवर को दोहराएं।
    3. बर्फ पर ट्यूब (ओं) को जैव सुरक्षा कैबिनेट में वापस स्थानांतरित करें। मीडिया को संग्रह ट्यूब से एक नई ट्यूब (ट्यूब बी) में स्थानांतरित करने के लिए एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें, साइटोलॉजी ब्रश को पीछे छोड़ दें। सेंट्रीफ्यूज ट्यूब बी 300 × ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए।
    4. सेंट्रीफ्यूज से ट्यूब बी को हटा दें, सुपरनैटेंट को त्याग दें। यदि बलगम दिखाई दे रहा है, तो गोली को एक और 5 एमएल नाक सेल संग्रह मीडिया और सेंट्रीफ्यूज के साथ फिर से धो लें।
    5. ट्यूब बी में सेल पेलेट को पुन: निलंबित करने के लिए 1 एमएल सीआरसी मीडिया जोड़ें। 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, एक गोलाकार गति में 50 एमएल ट्यूब (ट्यूब सी) के शीर्ष पर रखी सेल छलनी के माध्यम से कोशिकाओं को पास करें।
    6. एकल सेल निलंबन बनाने के लिए कई बार दोहराएं। छलनी के नीचे से अवशिष्ट मीडिया एकत्र करें और इसे मीडिया के साथ शामिल करें। सेल छलनी को त्याग दें।
    7. 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, ट्यूब सी से 1 एमएल मीडिया लें और इसे माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    8. इस सेल सस्पेंशन का 10 μL लें और इसे माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 10 μL ट्रिपैन ब्लू के साथ प्री-एलिकोट करें। अच्छी तरह से मिलाएं और तुरंत सेल गिनती और व्यवहार्यता रिकॉर्ड करने के लिए एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करें।
    9. वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं को विकिरणित फीडर कोशिकाओं के साथ पूर्व-बीज ति टी 25 फ्लास्क में बीज दें।
  2. वायुमार्ग उपकला कोशिका रखरखाव और पृथक्करण
    नोट: कोशिकाओं में जोड़े जाने से पहले सीआरसी मीडिया को तापमान-नियंत्रित प्रयोगशाला जल स्नान या एक मोती स्नान उपकरण में रखकर 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाना चाहिए।
    1. संलग्नक, संदूषण, आकृति विज्ञान और संगम के लिए नियमित रूप से सेल कल्चर माइक्रोस्कोप (4× उद्देश्य लेंस) के तहत कोशिकाओं की जांच करें।
    2. हर दूसरे दिन सीआरसी मीडिया बदलें। जब पुन: प्रोग्राम की गई कोशिकाओं को देखा जाता है (चित्रा 1) और कोई संदूषण मौजूद नहीं होता है, तो एंटीबायोटिक दवाओं को कम करें या वापस ले लें।
    3. जब कोशिकाएं 90% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाती हैं, तो कोशिकाओं को अलग करने के लिए डबल ट्रिप्सिन विधि32 का उपयोग करें और चरण 4.1.8 में वर्णित सेल गिनती करें (सेल पृथक्करण और ठंड के लिए पूरक फ़ाइल 2 देखें)।

5. वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं का बीजारोपण और विभेदन और विभेदित एएलआई मॉडल का रखरखाव

  1. पारगम्य समर्थन प्रविष्टियों के लिए वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं को सीडिंग करना
    1. सीओ2 इनक्यूबेटर से कोलेजन समाधान लेपित पारगम्य समर्थन सम्मिलित (खंड 1) को जैव सुरक्षा कैबिनेट में स्थानांतरित करें। कोलेजन समाधान को एस्पिरेट करें और छोड़ दें। पारगम्य समर्थन सम्मिलित के बेसल डिब्बे में 750 μL विस्तार माध्यम (एंटीबायोटिक-मुक्त) जोड़ें।
    2. बर्फ पर विघटित कोशिकाओं या पिघली हुई कोशिकाओं को जैव सुरक्षा कैबिनेट में स्थानांतरित करें। प्रत्येक पारगम्य समर्थन सम्मिलित के एपिकल डिब्बे में 150 μL में 200,000-250,000 कोशिकाओं को बीज करने के लिए आवश्यक विस्तार माध्यम की मात्रा जोड़ें।
    3. बुलबुले न बनाने के लिए सावधान रहना; यह सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से मिलाएं कि कोशिकाएं समरूप और निलंबन में हैं। प्रत्येक पारगम्य समर्थन सम्मिलित के एपिकल पक्ष में सेल निलंबन का 150 μL जोड़ें।
    4. एक समरूप सेल निलंबन को बनाए रखने के लिए हर तीन पारगम्य समर्थन सम्मिलित करने के बाद कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    5. हर दूसरे दिन जब तक कि एक कॉन्फ्लुएंट सेल मोनोलेयर का गठन न हो जाए (आमतौर पर सीडिंग के बाद दिन 4 तक), मीडिया को छोड़ दें और कमरे के तापमान (आरटी, 15-25 डिग्री सेल्सियस) में गर्म ताजा विस्तार माध्यम जोड़ें।
  2. वायु-तरल इंटरफ़ेस पर वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं का विभेदन
    1. गर्म एएलआई मीडिया (एंटीबायोटिक मुक्त) से आरटी (15-25 डिग्री सेल्सियस)।
    2. विस्तार माध्यम को हटा दें और एपिकल और बेसल दोनों डिब्बों पर भेदभाव मीडिया (एएलआई) में बदलें।
    3. जलमग्न अली मीडिया में संस्कृति के 2 दिनों के बाद, मीडिया को शांत करें और त्याग दें।
    4. केवल एक एयर-लिक्विड इंटरफ़ेस बनाने के लिए बेसल डिब्बे में 750 μL ALI मीडिया जोड़ें।
      नोट: यदि संस्कृति के 1 सप्ताह के बाद, मोनोलेयर स्थिर नहीं है और छेद अभी भी देखे जाते हैं, तो कोशिकाओं में अब शून्य क्षेत्रों में विस्तार करने की क्षमता नहीं हो सकती है, तो वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं को छोड़ने पर विचार करें।
  3. विभेदित एएलआई मॉडल और बलगम हटाने का रखरखाव
    1. पूर्ण विभेदन (दिन 21-25 पोस्ट एयर-लिक्विड इंटरफ़ेस स्थापना) तक हर दूसरे दिन एपिकल और बेसल मीडिया को बदलें।
    2. प्रति सप्ताह एक बार, चरण 5.3.3-5.3.4 का पालन करते हुए एपिकल साइड से बलगम धोएं।
    3. गर्म पीबीएस से आरटी (15-25 डिग्री सेल्सियस)।
    4. एपिकल डिब्बे में पीबीएस के 200 μL जोड़ें। सीओ2 इनक्यूबेटर में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। पीबीएस को हटाने के लिए एस्पिरेशन डिवाइस या पिपेट का उपयोग करें।

6. त्रि-आयामी वायुमार्ग उपकला ऑर्गेनोइड्स

  1. वायुमार्ग उपकला ऑर्गेनोइड संस्कृति के लिए तैयारी
    1. सीओ 2 इनक्यूबेटर में 24-वेल प्लेट (ओं) को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने के लिए रखें।
    2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार बर्फ पर ईसीएम (सामग्री की तालिका) की 10 मिलीलीटर शीशी को पिघलाएं। फ्रीज-पिघलाव चक्रों की संख्या को कम करने के लिए 500 μL एलिकोट (एक बार का उपयोग) तैयार करें।
      नोट: सर्वोत्तम संस्कृति परिणामों के लिए प्रोटीन एकाग्रता >10.5 मिलीग्राम / एमएल के साथ ईसीएम का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। कम सांद्रता ईसीएम गुंबद के विघटन को तेज करेगी और एपिकल-फेसिंग-आउटवर्ड ऑर्गेनोइड्स की घटना को बढ़ाएगी।
    3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एयरवेज ऑर्गेनॉइड सीडिंग मीडिया (एओएसएम) और भेदभाव मीडिया (एओडीएम) तैयार करने के लिए एयरवेज ऑर्गेनोइड किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग करें।
    4. तालिका 2 के अनुसार वायुमार्ग ऑर्गेनॉइड बेसल मीडिया तैयार करें।
घटक आयतन
उन्नत DMEM/F-12 500 mL
HEPES 5 mL
एलानिल-ग्लूटामाइन 5 mL
पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन 5 mL

तालिका 2: वायुमार्ग ऑर्गेनॉइड बेसल मीडिया के घटक

  1. धारा 4.2 में अलग किए गए जीवित वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं की संख्या का उपयोग करके गणना करें कि 10,000 कोशिकाओं के बीज घनत्व पर कितने कुओं को बीज दिया जा सकता है ( तालिका 3 देखें)।
  2. 90% ईसीएम गुंबद (ईसीएम का 45 μL और AOSM का 5 μL) बनाने के लिए आवश्यक ईसीएम और एओएसएम की कुल मात्रा की गणना करें।
    नोट: प्रति कुएं 10,000 कोशिकाओं का अनुशंसित सीडिंग घनत्व सीआरसी-विस्तारित नाक उपकला कोशिकाओं के लिए मार्ग 1 पर है। बाद में मार्ग कोशिकाओं को समान संख्या में ऑर्गेनोइड्स के गठन को प्राप्त करने के लिए उच्च सीडिंग घनत्व की आवश्यकता हो सकती है।
कुओं की संख्या कोशिकाओं की संख्या गुंबदों की संख्या मैट्रिगेल ईसीएम की मात्रा AOSM की मात्रा
1 10,000 कोशिकाएं 1 45 μL x 1.1 5 μL x 1.1
2 20,000 कोशिकाएं 2 90 μL x 1.1 10 μL x 1.1
5 50,000 कोशिकाएं 5 225 μL x 1.1 25 μL x 1.1
......... ......... कोशिकाएँ ......... .........μL x 1.1 .........μL x 1.1

तालिका 3: ईसीएम गुंबदों में वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं को सीडिंग के लिए गणना

  1. ईसीएम गुंबदों में वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं को सीडिंग करना
    नोट: हर समय ईसीएम को बर्फ पर रखें और बर्फ पर ईसीएम से जुड़े सभी चरणों का प्रदर्शन करें, क्योंकि ईसीएम >10 डिग्री सेल्सियस तापमान पर जमना शुरू कर देगा।
    1. तालिका 3 के अनुसार 90% ईसीएम की गणना की मात्रा के साथ खंड 4.2 में वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं को अलग किया गया।
    2. पिपेट को यथासंभव कुएं के तल के करीब 90 डिग्री कोण (ऊर्ध्वाधर) पर पकड़कर, ईसीएम सेल निलंबन के 50 μL (बुलबुले बनाने से बचने के लिए पहले स्टॉप तक) कुएं के केंद्र में वितरित करें। कुएं की दीवार को छूने से बचें।
    3. ईसीएम जमने तक 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें। जबकि ईसीएम ठोस हो रहा है, एओएसएम को आरटी (15-25 डिग्री सेल्सियस) में गर्म करें ताकि इसे अतिरिक्त होने पर ईसीएम गुंबद के पुन: द्रवीकरण और विघटन से रोका जा सके।
    4. कुएं की दीवार को हटाकर प्रत्येक कुएं में 500 μL गर्म AOSM जोड़ें। मीडिया को सीधे ईसीएम गुंबद पर न डालें।
    5. 4-7 दिनों के लिए हर 2 दिनों में मीडिया बदलें। मीडिया को एस्पिरेट करने के लिए, प्लेट को 45 ° कोण पर झुकाएं और ईसीएम गुंबद से दूर कुएं के निचले किनारे से एस्पिरेटेड करें।
    6. 4-7 दिनों के बाद, प्रत्येक कुएं में 500 μL AODM (15-25 डिग्री सेल्सियस) जोड़कर ऑर्गेनॉइड भेदभाव शुरू करें और 7 दिनों के लिए हर 2 दिन में मीडिया बदलें।
  2. विभेदन के दिन 7 पर वायुमार्ग उपकला ऑर्गेनोइड्स को फिर से तैयार करना
    नोट: वायुमार्ग उपकला ऑर्गेनोइड्स को पुन: व्यवस्थित करना आवश्यक है क्योंकि ईसीएम गुंबदों का किनारा धीरे-धीरे 2 सप्ताह की संस्कृति अवधि में विघटित हो जाता है। गुंबद के किनारे पर वायुमार्ग उपकला ऑर्गेनोइड खो सकते हैं (मीडिया में उतर सकते हैं) या ईसीएम में पूरी तरह से एम्बेडेड नहीं होने पर एपिकल-फेसिंग-आउटवर्ड ओरिएंटेशन हो सकते हैं। रिप्लेटिंग चरण कोशिकाओं / मलबे को हटाकर ईसीएम गुंबद को "साफ" करता है जो सफलतापूर्वक ऑर्गेनोइड नहीं बनाता है।
    1. हर कुएं से मीडिया को शांत करें। प्रत्येक कुएं में 500 μL ठंडा वायुमार्ग ऑर्गेनॉइड बेसल मीडिया (अब से बेसल मीडिया कहा जाता है) जोड़ें।
    2. पी 1000 पिपेट का उपयोग करें क्योंकि इस पिपेट टिप में सबसे बड़ा छिद्र होता है और पिपेटिंग के दौरान ऑर्गेनोइड्स के फटने की संभावना कम हो जाएगी। बुलबुले बनाने से बचने के लिए पिपेट को 350 μL में समायोजित करें, फिर प्रत्येक कुएं में ईसीएम गुंबद को बाधित करने के लिए धीरे से ऊपर और नीचे पिपेट करें। बेसल मीडिया को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एकत्र करें।
    3. प्रत्येक कुएं को 500 μL ठंडे बेसल मीडिया के साथ धो लें। किसी भी शेष ईसीएम और ऑर्गेनोइड वाले बेसल मीडिया को उसी 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एकत्र करें जैसा कि ऊपर बताया गया है।
    4. सेंट्रीफ्यूज 300 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। सेंट्रीफ्यूजिंग के बाद दिखाई देने वाली तीन परतों में से - (1) सतह पर तैरने वाला, (2) सेलुलर मलबे (फ्लफी) युक्त ईसीएम और (3) ऑर्गेनोइड युक्त गोली - सतह पर तैरने वाला और ईसीएम परत को त्याग दें और ऑर्गेनॉइड गोली को संरक्षित करें।
    5. किसी भी शेष ईसीएम को अलग करने के लिए ऑर्गेनॉइड पेलेट और पिपेट को धीरे-धीरे ऊपर और नीचे 1 एमएल ठंडा बेसल मीडिया जोड़ें। ट्यूब में 6 एमएल ठंडा बेसल मीडिया जोड़ें और धीरे से मिलाएं।
    6. सेंट्रीफ्यूज 300 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
    7. यदि अतिरिक्त ईसीएम अभी भी दिखाई दे रहा है, तो एक और धोने के लिए चरण 6.3.5- 6.3.6 दोहराएं।
    8. गुंबद के प्रति 50 μL पर ~ 30 ऑर्गेनोइड्स को प्लेट करने के लिए 90% ईसीएम (एओएसएम के बजाय एओडीएम का उपयोग करें) की उचित मात्रा के साथ ऑर्गेनोइड गोली को फिर से निलंबित करें।
    9. पहले गुंबद को चढ़ाने के बाद सेल कल्चर माइक्रोस्कोप (4x उद्देश्य लेंस) के तहत ऑर्गेनोइड्स के घनत्व की जांच करें। यदि बहुत घना है, तो ~ 30 ऑर्गेनोइड्स के वांछित घनत्व को प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त 90% ईसीएम जोड़ें।
    10. चरण 6.2.3- 6.2.4 का पालन करें ताकि ईसीएम को ठोस बनाया जा सके और कोशिकाओं को हर दूसरे दिन 500 μL गर्म AODM के साथ अगले 14 दिनों तक प्रत्येक कुएं में खिलाया जा सके जब तक कि वे परिपक्वता तक नहीं पहुंच जाते (भेदभाव के 21 दिनों के बाद) लुमेन गठन के साथ आंतरिक-सामने स्यूडोस्ट्रेटिफाइड एपिथेलियम से घिरा होता है जिसमें बेसल कोशिकाएं, सिलिएटेड कोशिकाएं और गोब्लेट कोशिकाएं होती हैं।
      नोट: यहां वर्णित वायुमार्ग उपकला ऑर्गेनोइड्स टर्मिनल रूप से विभेदित हैं और उन्हें पारित या क्रायोसंरक्षित नहीं किया जा सकता है।

7. इमेजिंग सिलिया बीट आवृत्ति

नोट: प्रोटोकॉल के इस खंड में हीटिंग और आर्द्रता पर्यावरण कक्ष, एक तेज फ्रेम दर (>100 हर्ट्ज) वैज्ञानिक कैमरा, 20 x लंबी कामकाजी दूरी उद्देश्य और इमेजिंग सॉफ्टवेयर (इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले अनुशंसित उपकरणों के लिए सामग्री की तालिका देखें) के साथ एक लाइव-सेल इमेजिंग माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है।

  1. माइक्रोस्कोप सेट अप
    1. सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप हीटिंग सिस्टम चालू है और 37 डिग्री सेल्सियस तक बराबर है। माइक्रोस्कोप चालू करें। एयर गैस मिक्सरके माध्यम से गैस को 5% सीओ2 में समायोजित करें।
    2. आर्द्रता मॉड्यूल बोतल को ऊपर उठाएं जो सीओ2 शुद्ध पानी के साथ गुजरता है। स्टेज टॉप कंट्रोलर के माध्यम से सापेक्ष आर्द्रता को 85% तक सेट करें ताकि पानी गर्म हो और कोशिकाओं को ह्यूमिडिफाइड हवा की आपूर्ति हो। कक्ष को 30 मिनट के लिए बराबर करें।
    3. माइक्रोस्कोप प्लेट को माइक्रोस्कोप धारक में डालें।
    4. शारीरिक तापमान पर नमूने को बनाए रखने के लिए वायुमार्ग उपकला कोशिका मॉडल को इनक्यूबेटर से माइक्रोस्कोप में गर्मी ब्लॉक या थर्मल मोतियों पर 37 डिग्री सेल्सियस तक स्थानांतरित करें।
    5. माइक्रोस्कोप प्लेट डालने में वायुमार्ग उपकला कोशिका मॉडल युक्त संस्कृति प्लेट रखें। माइक्रोस्कोप पर्यावरण कक्ष को बंद करें।
    6. नमूने को 30 मिनट के लिए पूर्व-गर्म 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2-भरे माइक्रोस्कोप कक्ष में बराबर करने की अनुमति दें।
      नोट: एक छोटा संतुलन समय पर्याप्त हो सकता है। यह सीबीएफ के स्थिरीकरण के लिए आवश्यक समय की पहचान करने के लिए एक प्रयोग करके निर्धारित किया जा सकता है (चित्रा 3 देखें)।

Figure 3
चित्रा 3: लाइव-सेल इमेजिंग माइक्रोस्कोप में सिलियरी बीट आवृत्ति का स्थिरीकरण। एक पर्यावरणीय कक्ष के साथ लाइव-सेल इमेजिंग माइक्रोस्कोप में स्थानांतरण के बाद एयर-लिक्विड इंटरफेस (एएलआई मॉडल) पर वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं में औसत सिलिया बीट आवृत्ति (सीबीएफ) के डॉट प्लॉट। चैंबर के दरवाजे को खोलने और माइक्रोस्कोप प्लेट डालने से पहले चैंबर को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 और 85% की सापेक्ष आर्द्रता पर 30 मिनट के लिए बराबर और बनाए रखा गया था। सेल मॉडल को संकेतित अंतराल पर 60 मिनट के लिए चित्रित किया गया था। ALI मॉडल CF के साथ दो प्रतिभागियों से प्राप्त किए गए थे। प्रति ALI मॉडल में छह फील्ड ऑफ व्यू (FOV) छवियों का अधिग्रहण किया गया था। प्रत्येक बिंदु (नीला) 12-36 एफओवी छवियों में औसत सीबीएफ का प्रतिनिधित्व करता है। डेटा को एसईएम ± माध्य के रूप में दर्शाया जाता है, जिसका माध्य एक बिंदीदार रेखा से जुड़ा होता है। सांख्यिकीय अंतर निर्धारित करने के लिए विचरण (एनोवा) के एक-तरफ़ा विश्लेषण का उपयोग किया गया था। पी < 0.0001, एनएस: कोई महत्व नहीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. संतुलन अवधि के दौरान, कंप्यूटर पर, अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खोलें। 20x लंबी कार्य दूरी उद्देश्य लेंस का चयन करें।
  2. माइक्रोस्कोप आईपीस पर, सेल मॉडल (~ जेड = 8000 μm) पर ध्यान केंद्रित करें।
  3. सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप कोहलर रोशनी के लिए स्थापित किया गया है ताकि ट्रांसमिशन लाइट सोर्स बल्ब फिलामेंट्स नमूना विमान पर केंद्रित न हों, इमेजिंग में कलाकृतियों से बचें। इसके लिए चरण 7.1.10-7.1.13 का पालन करें
  4. कंडेनसर के ऊपर क्षेत्र आइरिस डायाफ्राम को पूरी तरह से बंद करें। धीरे-धीरे क्षेत्र आइरिस डायाफ्राम खोलें और कंडेनसर को तब तक ऊपर / नीचे ले जाएं जब तक कि एक अष्टकोणीय आकार दिखाई न दे।
  5. यदि क्षेत्र आइरिस डायाफ्राम संरेखित नहीं है (यानी, अष्टकोणीय दृश्य क्षेत्र (एफओवी) के केंद्र में नहीं है), तो एलन कुंजियों का उपयोग करके इसे केंद्र में संरेखित करें।
  6. एक बार जब क्षेत्र आइरिस डायाफ्राम संरेखित हो जाता है, तो अष्टकोण को तेज फोकस में लाने के लिए कंडेनसर फोकस को समायोजित करें।
  7. क्षेत्र आइरिस डायाफ्राम खोलें जब तक कि इसे एफओवी के भीतर नहीं देखा जा सके।
  8. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, लाइट पथ को पोर्ट पर स्विच करने के लिए एल 100 पर क्लिक करें जहां कैमरा लगाया गया है। सॉफ्टवेयर के माध्यम से माइक्रोस्कोप एफओवी की कल्पना करने के लिए हरे रंग के प्ले (रन) बटन पर क्लिक करें। जांचें कि सिलिया फोकस में हैं और यदि आवश्यक हो तो समायोजित करें।
  9. अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके, निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ माइक्रोस्कोप सेट करें: फ़िल्टर: खाली; कंडेनसर: खाली; प्रारूप: कोई बिनिंग नहीं; एक्सपोजर समय: 0.003 एस; रीडआउट मोड: रोलिंग शटर; ROI: 512 × 512 पिक्सेल।
    नोट: एक्सपोज़र समय उच्चतम आवृत्ति पर आधारित है जिसे मापा जाना चाहिए क्योंकि 1/एक्सपोज़र समय इस आवृत्ति से कम से कम दोगुना होना चाहिए। उदाहरण के लिए, यदि सिलिया बीटिंग की अधिकतम शारीरिक सीमा = 30 हर्ट्ज, तो 1/एक्सपोज़र समय = 60, और एक्सपोज़र समय 0.016 एस ≤ होना चाहिए। एक ROI का चयन करें जो फ्रेम दरों >100 Hz कैप्चर करता है।
  1. छवि अधिग्रहण
    1. मेनू से टाइम-लैप्स छवियां प्राप्त करने के लिए, अधिग्रहण पर क्लिक करें और फिर फास्ट टाइम लैप्स पर क्लिक करें। पॉप-अप विंडो में, सहेजें स्थान और फ़ाइल नाम का चयन करें. 1000 फ्रेम प्राप्त करें।
    2. अप्लाई पर क्लिक करें। माइक्रोस्कोप एफओवी में सिलिया का पूर्वावलोकन करने के लिए हरे रंग के प्ले (रन) बटन पर क्लिक करें और यदि आवश्यक हो तो जेड फोकस समायोजित करें। तेज़ टाइम-लैप्स को कैप्चर करने के लिए अभी चलाएँ क्लिक करें.
    3. एक बार फास्ट टाइम-लैप्स कैप्चर हो जाने के बाद, माइक्रोस्कोप एफओवी की कल्पना करने के लिए ग्रीन प्ले (रन) बटन पर क्लिक करें। माइक्रोस्कोप जॉयस्टिक का उपयोग करके, एक्स / वाई अक्ष के साथ दूसरे एफओवी में जाएं।
    4. सिलिया को फोकस में लाने के लिए जेड फोकस समायोजित करें। एक और तेज़ टाइम-लैप्स को कैप्चर करने के लिए रन नाउ पर क्लिक करें।
    5. चरण 7.2.3-7.2.4 दोहराएँ। एएलआई मॉडल और वायुमार्ग ऑर्गेनोइड्स के लिए, 3 एक्स प्रतिकृति नमूनों में से प्रत्येक में छवि 6x FOV। वायुमार्ग उपकला शीट के लिए, प्रति प्रतिभागी न्यूनतम 4x प्रतिकृति छवियों की छवि बनाएं।

8. डेटा विश्लेषण और सीबीएफ का परिमाणीकरण

  1. डेटा विश्लेषण के लिए तैयारी
    नोट: प्रोटोकॉल के इस खंड के लिए कस्टम विश्लेषण स्क्रिप्ट (पूरक फ़ाइल 3), कच्ची छवि फ़ाइलें (अनुभाग 7.2 में अधिग्रहित), एक कंप्यूटिंग सॉफ्टवेयर और विश्लेषण सॉफ़्टवेयर की आवश्यकता होती है।
    1. विश्लेषण कंप्यूटर पर कंप्यूटिंग सॉफ़्टवेयर, अधिमानतः नवीनतम संस्करण स्थापित करें। सुनिश्चित करें कि मानक कंप्यूटिंग सॉफ़्टवेयर टूलबॉक्स (elmat, ops, datafun, uitools, datatypes, iofun, iotools, ऑडियोवीडियो) और छवि और सिग्नल प्रोसेसिंग टूलबॉक्स स्थापित हैं।
    2. कस्टम विश्लेषण स्क्रिप्ट 'BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m' और 'LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m' और 'समर्थन स्क्रिप्ट' फ़ोल्डर को कंप्यूटर के स्थानीय ड्राइव पर कॉपी करें।
    3. कंप्यूटिंग सॉफ्टवेयर पर, होम टैब पर क्लिक करें। फिर सेट पथ (चित्रा 4 ए-बी) पर क्लिक करें।
    4. पॉप-अप विंडो में, सबफ़ोल्डर्स के साथ जोड़ें (चित्रा 4 सी) पर क्लिक करें। 'MATLAB खोज पथ' के अंतर्गत, चित्र 4D में दिखाए गए फ़ोल्डरों का चयन करें, फिर सहेजें और बंद करें (चित्र 4E-F) पर क्लिक करें.
    5. पुष्टि करें कि विश्लेषण स्क्रिप्ट कंप्यूटिंग सॉफ़्टवेयर से जुड़े हुए हैं, यह जांचकर कि वे बाएं हाथ के पैनल (चित्रा 4 जी) में दिखाई देते हैं।
    6. अनुभाग 7.2 में प्राप्त कच्ची छवि फ़ाइलों (ओपन माइक्रोस्कोपी वातावरण (ओएमई) प्रारूप) को कंप्यूटर की स्थानीय ड्राइव पर स्थानांतरित करें।
      नोट: उदाहरण कच्ची छवि फ़ाइलों को यहाँ पहुँचा जा सकता है: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.16649878.v1.

Figure 4
चित्रा 4: डेटा विश्लेषण के लिए कंप्यूटिंग सॉफ्टवेयर स्थापित करना। (A) होम टैब खोलें. (B) पथ सेट करें का चयन करें. (C) सबफ़ोल्डर के साथ जोड़ें का चयन करें. (डी) विश्लेषण स्क्रिप्ट वाले फ़ोल्डरों का चयन करें। (E) सहेजें का चयन करें. (एफ) बंद का चयन करें। (जी) विश्लेषण स्क्रिप्ट बाएं हाथ के पैनल में दिखाई देंगे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. एकल पिक्सेल की तीव्रता के स्पेक्ट्रम का अधिकतम पता लगाकर सीबीएफ का परिमाणीकरण
    1. कंप्यूटिंग सॉफ्टवेयर खोलें। 'BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.एम' विश्लेषण स्क्रिप्ट फ़ाइल (चित्रा 5 ए) पर क्लिक करें।
    2. संपादक टैब पर क्लिक करें, और फिर स्क्रिप्ट (चित्रा 5B-C) चलाने के लिए हरे रंग के प्ले (रन) बटन पर क्लिक करें। प्रॉम्प्ट विंडो में, विश्लेषण की जाने वाली कच्ची छवि फ़ाइलों का चयन करें (चित्रा 5 डी)।
    3. प्रति फ्रेम अधिग्रहण समय के लिए प्रॉम्प्ट विंडो में चरण 7.1.15 से एक्सपोज़र समय दर्ज करें, फिर ओके (चित्रा 5 ई) पर क्लिक करें।
    4. प्रति फ़ाइल ~ 15 मिनट प्रतीक्षा करें, जबकि स्क्रिप्ट 'एवेस्पेक्ट्रम' फ़ाइल (पूरक फ़ाइल 4) में सीबीएफ की गणना और आउटपुट करती है, जो स्वचालित रूप से कच्ची छवि फ़ाइलों के समान फ़ोल्डर में सहेजी जाती है। प्रगति पट्टी (चित्रा 5 एफ) के माध्यम से प्रगति की कल्पना करें।

Figure 5
चित्र 5: कंप्यूटिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण स्क्रिप्ट चलाना। (A) CBF ('BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m') के विश्लेषण के लिए स्क्रिप्ट खोलें या सिलिया बीटिंग मूवी ('LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m') का निर्माण करें। (B) संपादक टैब खोलें। (C) विश्लेषण स्क्रिप्ट चलाने के लिए हरे रंग के प्ले (रन) बटन का चयन करें। (डी) एक त्वरित विंडो को विश्लेषण या फिल्म निर्माण के लिए फ़ाइलों के चयन की आवश्यकता होगी। (E) 'BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m' स्क्रिप्ट चलाते समय, फ़ाइल-रीडिंग स्क्रिप्ट मेटाडेटा को ठीक से नहीं पढ़ने की स्थिति में प्रति फ्रेम (ओं) अधिग्रहण समय को मैन्युअल रूप से इनपुट करने के लिए एक संकेत दिखाई देगा। (च) सिलिया बीट आवृत्ति दर्शाने वाली प्रगति पट्टी की गणना की जा रही है। (छ) 'LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.एम' स्क्रिप्ट चलाते समय, एक प्रॉम्प्ट मैन्युअल रूप से आउटपुट किए जाने वाले मूवी के प्रकार (एमपी 4 या एवी), मूवी फ्रेम रेट (एफपीएस), चाहे फिल्म डेटा ('वाई' या 'एन'), फ्रेम टाइम (एस), और मूवी में निर्यात किए गए डेटा के पिक्सेल आकार (माइक्रोन) से हटा दिया गया हो। गतिहीन फ़िल्टरिंग के लिए 'वाई' का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि यह डेटा में बलगम या किसी अन्य बाधा डालने वाली गतिहीन परतों को हटा देगा। (ज) निर्यात की जा रही फिल्म को इंगित करने के लिए प्रगति सीमा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. चरण 8.2.1-8.2.2 में प्रक्रिया का उपयोग करके 'AveSpectrum' फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर पर 'GetFirstAmplitude.m' स्क्रिप्ट चलाएँ। स्क्रिप्ट को 'फर्स्ट एम्प्लिट्यूडस्टैक्ड.xlsx' फ़ाइल आउटपुट करने के लिए प्रतीक्षा करें, जिसमें आवृत्ति होती है जिसमें उच्चतम आयाम होता है और वायुमार्ग उपकला सिलिया बीटिंग, ≥3 और <30 हर्ट्ज की शारीरिक सीमा के भीतर होता है।
  2. 'FirstAmplitudeStacked.xlsx' फ़ाइल से आवृत्ति मानों की प्रतिलिपि बनाएँ और एक वैज्ञानिक विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्लॉट करें।
    नोट: कस्टम विश्लेषण स्क्रिप्ट सीबीएफ को कैसे निर्धारित करती है, इसका स्पष्टीकरण पूरक फ़ाइल 5 में प्रदान किया गया है। उदाहरण विश्लेषण किए गए डेटासेट को यहां एक्सेस किया जा सकता है: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.16649815।
  1. सिलिया की पिटाई का वीडियो निर्यात करना
    1. कंप्यूटिंग सॉफ्टवेयर खोलें। स्क्रिप्ट लोड करने के लिए 'LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.एम' स्क्रिप्ट फ़ाइल (चित्रा 5 ए) पर क्लिक करें।
    2. संपादक टैब पर क्लिक करें, और फिर स्क्रिप्ट (चित्रा 5C) चलाने के लिए हरे रंग के प्ले (रन) बटन पर क्लिक करें। प्रॉम्प्ट विंडो में, चलचित्र फ़ाइलों (चित्रा 5D) में निर्यात की जाने वाली कच्ची छवि फ़ाइलों का चयन करें।
    3. तालिका 4 में दी गई सेटिंग्स को 'मूवी बनाएं' पॉप-अप विंडो (चित्रा 5 जी) में इनपुट करें।
    4. स्क्रिप्ट मूवी फ़ाइलों को बनाते समय ~ 8 मिनट प्रति फ़ाइल प्रतीक्षा करें और उन्हें कच्ची छवि फ़ाइलों के स्थान पर आउटपुट करें। प्रगति पट्टी (चित्रा 5 एच) के माध्यम से प्रगति की कल्पना करें।
मूवी इनपुट वर्णन
फ़ाइल प्रकार उस फ़ाइल प्रकार को इनपुट करें जिसे आप निर्यात करना चाहते हैं (एमपी 4 या avi)।
फ़्रेम दर फ्रेम दर इनपुट करें जिस पर फिल्म निर्यात की जानी चाहिए। यदि आपके पास ~ 1000 फ्रेम प्रति समय श्रृंखला अधिग्रहित है, तो फ्रेम दर ~ 30 एफपीएस सेट करने की सिफारिश की जाती है।
Immobile filtering विकल्प 'y' या 'n' हैं। डिफ़ॉल्ट 'y' है, और टाइम फ़िल्टरिंग स्क्रिप्ट फूरियर स्पेस का उपयोग करके, मूवी डेटा से किसी भी स्थिर घटक को हटा देती है। आमतौर पर, सिलिया या गतिहीन बलगम के तहत कोशिकाओं की कोई भी परत सिग्नल में शून्य-आवृत्ति ऑफसेट घटक या समय परिवर्तनीय घटक का योगदान करेगी जिसे फ़िल्टर किया जा सकता है।
अधिग्रहण का समय प्रति सीमा अर्जित डेटा की प्रति सीमा अधिग्रहण समय। इसका उपयोग सेकंड में फिल्म में टाइम स्टैम्प प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है।
पिक्सेल आकार माइक्रोमीटर में पिक्सेल आकार का उपयोग माइक्रोमीटर में फिल्म में स्केल बार प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है।

तालिका 4: चलचित्र निर्माण के लिए इनपुट सेटिंग्स

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Representative Results

सीबीएफ की मात्रा निर्धारित करने में इस प्रोटोकॉल की दक्षता का प्रदर्शन करने के लिए, सीएफ के साथ तीन प्रतिभागियों और तीन स्वस्थ नियंत्रण प्रतिभागियों से प्राप्त वायुमार्ग उपकला सेल एएलआई मॉडल में मापा गया सीबीएफ के परिणाम प्रस्तुत किए गए हैं। संस्कृति भेदभाव के 14 वें दिन, सिलिया को पीटना मौजूद था (चित्रा 6)। संस्कृति भेदभाव के दिन 14 से 21 तक, सीबीएफ में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण (पी < 0.0345) वृद्धि दोनों समूहों के भीतर देखी गई थी। संस्कृति भेदभाव के दिन 21 पर, स्वस्थ नियंत्रण प्रतिभागियों (7.61 ± 0.11 हर्ट्ज) के लिए औसत सीबीएफ सीएफ (6.75 ± 0.17 हर्ट्ज) वाले प्रतिभागियों की तुलना में काफी अधिक था। यह समझने के लिए कि बलगम संचय और निष्कासन सीबीएफ को किस हद तक प्रभावित करता है, सीबीएफ को बलगम को हटाने के बाद उसी सेल मॉडल में चित्रित किया गया था। स्वस्थ व्यक्तियों और सीएफ वाले दोनों के एएलआई मॉडल में, बलगम को हटाने पर सीबीएफ में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण (पी < 0.0001) वृद्धि हुई थी (चित्रा 6)।

Figure 6
चित्रा 6: सिलिया बीट आवृत्ति पर बलगम हटाने का प्रभाव। एयर-लिक्विड इंटरफेस (एएलआई मॉडल) पर वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं में औसत सिलिया बीट फ्रीक्वेंसी (सीबीएफ) के डॉट प्लॉट, कल्चर भेदभाव के 14 और 21 वें दिन प्री-और पोस्ट-म्यूकस वॉशआउट प्राप्त करते हैं। बलगम वॉशआउट 200 μL गर्म पीबीएस के साथ एपिकल सेल की सतह को धोकर किया गया था। एएलआई मॉडल स्वस्थ प्रतिभागियों (एन = 3) और सीएफ (एन = 3) वाले प्रतिभागियों से प्राप्त किए गए थे। डेटा को एसईएम के माध्य के रूप ± दर्शाया जाता है। प्रत्येक बिंदु दृश्य छवि के एक एकल क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। तीन प्रतिकृति एएलआई मॉडल में छह क्षेत्र की दृश्य छवियों का अधिग्रहण किया गया था। प्रत्येक प्रतिभागी को एक अलग रंग के साथ कोडित किया गया है। सांख्यिकीय अंतर निर्धारित करने के लिए विचरण (एनोवा) के एक-तरफ़ा विश्लेषण का उपयोग किया गया था। P < 0.0001, ** P < 0.01, * P < 0.05. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: वायुमार्ग उपकला के ऑर्गेनोटाइपिक मॉडल में सिलिया बीट आवृत्ति को निर्धारित करने के लिए उपयोग की जाने वाली संस्कृति और लाइव-सेल इमेजिंग मापदंडों की विविधता दिखाने वाले 18 प्रकाशनों का सारांश। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: विभेदन या क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए वायुमार्ग उपकला कोशिका पृथक्करण कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 3: कस्टम विश्लेषण स्क्रिप्ट कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 4: विश्लेषण स्क्रिप्ट द्वारा आउटपुट की गई डेटा फ़ाइलें कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 5: CBF विश्लेषण एल्गोरिथ्म का विवरण कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

ऐसे कई कारक हैं जो नाक उपकला शीट में सीबीएफ की मात्रा का निर्धारण अस्पष्ट कर सकते हैं। एपिथेलियल शीट्स को नमूना संग्रह के 3-9 घंटों के भीतर चित्रित किया जाना चाहिए क्योंकि इस समयके दौरान सिलियरी फ़ंक्शन सबसे स्थिर है। कम लाल रक्त कोशिकाएं और मलबे इमेजिंग के लिए सबसे इष्टतम हैं क्योंकि ये डेटा अधिग्रहण में हस्तक्षेप करते हैं। इमेजिंग के लिए आरओआई का चयन करते समय, एक उपकला शीट का चयन करना महत्वपूर्ण है कि नमूने के संग्रह के दौरान किनारे क्षतिग्रस्त या बाधित नहीं हुआ है, और एक भी असंबद्ध उपकला कोशिका नहीं है, क्योंकि इन चरों को सीबीएफ5 को प्रभावित करने के लिए प्रदर्शित किया गया है। यह भी आवश्यक है कि उपकला शीट स्थिर हो क्योंकि आंदोलन डेटा अधिग्रहण को अस्पष्ट कर सकते हैं। मीडिया में उपकला शीट अक्सर विभिन्न दिशाओं में उन्मुख होतीहैं। चूंकि यह पहले प्रदर्शित किया गया है कि नमूना गुणवत्ता में भिन्नता, जैसे कि बाधित उपकला किनारों, सीबीएफ5 को प्रभावित करती है, इसलिए यह संभावना है कि उपकला शीट का अभिविन्यास सीबीएफ को भी प्रभावित कर सकता है। इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि उपकला शीट अभिविन्यास के प्रभाव का आकलन नहीं किया गया है। यह आगे के मानकीकरण के लिए अध्ययन का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र होने की उम्मीद है।

परिपक्व एएलआई मॉडल में गोब्लेट कोशिकाओं की उपस्थिति के साथ एक स्यूडोस्ट्रेटिफाइड एपिथेलियम होता है जो बलगम34 का उत्पादन करता है। बलगम की प्रचुरता और चिपचिपाहट सिलिअरी फ़ंक्शन 2,38 को प्रभावित करती है। यह हाल ही में दिखाया गया था कि नाक उपकला एएलआई सेल मॉडल से संचित बलगम को हटाने से सीबीएफ3 में वृद्धि हुई। एक चक्रीय प्रक्रिया का वर्णन किया गया था, जिसमें 24 घंटे की अवधि में बलगम के उत्थान ने सीबीएफ से समझौता किया जब तक कि बलगम को हटा नहीं दिया गया और सीबीएफ फिर से बढ़ गया। यह प्रदर्शित करने के लिए कि सीबीएफ माप की पुनरावृत्ति सिलिया के शारीरिक वातावरण के विनियमन पर निर्भर है, सीबीएफ पर बलगम हटाने के प्रभाव का आकलन किया गया था। बलगम हटाने के बाद सीबीएफ में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण 3.5 हर्ट्ज परिवर्तन देखा गया था। इन परिणामों की तुलना में, सीएफटीआर-मॉड्यूलेटिंगयौगिकों 3 के लिए सिलिया प्रतिक्रिया का परीक्षण करने वाले एक हालिया अध्ययन ने सीबीएफ में बदलाव की सूचना दी जो हमारे मॉडल सिस्टम में बलगम हटाने के कारण होने वाले परिवर्तन से अधिक नहीं है। यह सीबीएफ को प्रभावित करने वाले पर्यावरणीय चर को विनियमित करने के महत्व पर जोर देता है, खासकर अगर इस मॉडल प्रणाली को भविष्य में उपचार के लिए रोगी-विशिष्ट प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक मंच के रूप में स्थापित किया जाना है। इस प्रकार, सीबीएफ के परिमाणीकरण के इस पर्यावरणीय चर के प्रभाव को नियंत्रित करने के लिए इमेजिंग से पहले बलगम को हटाने या इसे नहीं हटाने में सुसंगत होने की सिफारिश की जाती है।

तापमान प्रमुख कारक है जो सीबीएफ में उतार-चढ़ाव का कारण बनता है। सिलिया को पहले माउस फेफड़ों के स्लाइस और नाक बायोप्सी 39,40 में शारीरिक तापमान में उतार-चढ़ावके प्रति संवेदनशील दिखाया गया है। जैसे, उन कदमों का निरीक्षण करना महत्वपूर्ण है जो छवि अधिग्रहण के लिए नमूने संभालते समय पर्यावरणीय तापमान में उतार-चढ़ाव को कम करते हैं और यह सुनिश्चित करते हैं कि इमेजिंग से पहले कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस माइक्रोस्कोप कक्ष में स्थिर किया जाए। सिलिया की इमेजिंग करते समय, सिलिया को सेल मोनोलेयर के ठीक ऊपर ध्यान में आना चाहिए। यदि सिलिया बीटिंग प्रकाश माइक्रोस्कोपी के माध्यम से देखने योग्य नहीं है, तो गर्म पीबीएस से धोने से संचित बलगम को हटाने से सिलिया की धड़कन बढ़ सकती है क्योंकि यह ज्ञात है कि बलगम सिलिया पिटाई में बाधा डालता है। एक और उप-मानक स्थिति तब होगी जब कोशिकाओं पर बलगम की गति होती है, क्योंकि यह डेटा अधिग्रहण में बाधा डालेगा। एक समाधान बलगम के दृश्य आंदोलन के बिना एक आरओआई का चयन करना होगा। हालांकि, ऐसी स्थिति में जहां यह अपरिहार्य है, धोने से बलगम को हटाने की सिफारिश की जाती है।

विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण चेतावनी अस्थायी और स्थानिक नायक्विस्ट नमूनाकरण को पूरा करने के लिए एक उपयुक्त कैमरा और उद्देश्य लेंस का चयन कर रही है। इस अध्ययन प्रोटोकॉल में नियोजित लंबी कार्य दूरी के लेंस अपेक्षाकृत बड़े क्षेत्र को कैप्चर करने की अनुमति देता है। यह सीबीएफ को बरकरार एएलआई संस्कृतियों में चित्रित करने में सक्षम बनाता है, जिसमें ~ 500 एनएम (एनए0.45) का स्थानिक रिज़ॉल्यूशन होता है। जैसे, सिलियरी बंडल को स्थानिक रूप से हल किया जा सकता है। फिर भी, इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि पूरे एएलआई मॉडल को विश्लेषण के लिए उत्तरदायी संकल्प पर चित्रित नहीं किया जा सकता है। नतीजतन, डेटा अधिग्रहण के लिए एक ROI का चयन किया जाना चाहिए। ROI चुनने से जुड़े पूर्वाग्रह को सीमित करने के लिए, यह अनुशंसा की जाती है कि प्रत्येक पारगम्य समर्थन सम्मिलित के भीतर विभिन्न क्षेत्रों से छह ROIs का चयन किया जाए। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि यह पहले प्रदर्शित किया गया है कि सिलिया एक नमूने के भीतर तुल्यकालिक रूप से नहीं धड़कता है, और सीबीएफ विभिन्न किनारों और आरओआई16,41 के बीच भिन्न होता है, जिसका अर्थ है कि विभिन्न आरओआई में अलग-अलग औसत सीबीएफ मान होने की संभावना है। इसके अलावा, कम से कम 100 हर्ट्ज की फ्रेम दर के साथ तेज गति वाले कैमरों तक पहुंच होना आवश्यक है ताकि 50 हर्ट्ज की दर से होने वाली किसी भी अस्थायी घटना को नायक्विस्ट नमूना मानदंड द्वारा हल किया जा सके। बेहद कम शोर के साथ एक तेज एससीएमओएस कैमरा जो एकल-अणु माप की अनुमति देता है, की सिफारिश की जाती है। हालांकि, यह प्रोटोकॉल इस प्रकार के कैमरे के उपयोग से सीमित नहीं है, जब तक कि कैमरा अस्थायी नमूनाकरण आवश्यकताओं को पूरा करता है और सिलियरी बीटिंग के परिणामस्वरूप पिक्सेल तीव्रता में उतार-चढ़ाव को कैप्चर करता है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम अध्ययन प्रतिभागियों और उनके परिवारों को उनके योगदान के लिए धन्यवाद देते हैं। हम संगठन और रोगी जैव नमूनों के संग्रह में सिडनी चिल्ड्रन हॉस्पिटल्स (एससीएच) रैंडविक श्वसन विभाग से सहायता की सराहना करते हैं - डॉ जॉन विडर, डॉ यवोन बेलेसिस, लीन प्लस, अमांडा थॉम्पसन और रोंडा बेल के लिए विशेष धन्यवाद। हम यूएनएसडब्ल्यू सिडनी में मार्क वेनराइट एनालिटिकल सेंटर के भीतर कैथरीना गॉस लाइट माइक्रोस्कोपी सुविधा से इवेता स्लैपेटोवा और रेनी व्हान की सहायता को स्वीकार करते हैं। यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एनएचएमआरसी) ऑस्ट्रेलिया (जीएनटी 1188987), सीएफ फाउंडेशन ऑस्ट्रेलिया और सिडनी चिल्ड्रन हॉस्पिटल फाउंडेशन द्वारा समर्थित है। लेखक अपने योगदान और समर्थन के लिए ल्यूमिनेस एलायंस - बच्चों के स्वास्थ्य के लिए नवाचार को स्वीकार करना चाहते हैं। ल्यूमिनेस एलायंस - बच्चों के स्वास्थ्य के लिए नवाचार सिडनी चिल्ड्रन हॉस्पिटल्स नेटवर्क, चिल्ड्रन मेडिकल रिसर्च इंस्टीट्यूट और चिल्ड्रन कैंसर इंस्टीट्यूट के बीच एक गैर-लाभकारी सहकारी संयुक्त उद्यम है। यह बाल चिकित्सा अनुसंधान के समन्वय और एकीकृत करने के लिए एनएसडब्ल्यू सरकार के समर्थन से स्थापित किया गया है। लुमिनेसे एलायंस सिडनी विश्वविद्यालय और न्यू साउथ वेल्स सिडनी विश्वविद्यालय से भी संबद्ध है। केएमए एक ऑस्ट्रेलियाई सरकार अनुसंधान प्रशिक्षण कार्यक्रम छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित है। एलकेएफ को रोटरी क्लब ऑफ सिडनी कोव / सिडनी चिल्ड्रन हॉस्पिटल फाउंडेशन और यूएनएसडब्ल्यू यूनिवर्सिटी स्नातकोत्तर पुरस्कार छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenine Sigma-Aldrich A2786 10 mg/mL
Advanced DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 12634-010
Alanyl-glutamine Sigma-Aldrich G8541 200 mM
Andor Zyla 4.2 sCMOS Oxford Instruments Fast frame rate (>100 Hz) scientific camera
Bottle-top vacuum filter system Sigma-Aldrich CLS431098
Ceftazidime hydrate Sigma-Aldrich A6987 50 mg/mL
Cell Culture Microscope Olympus CKX53
CFI S Plan Fluor ELWD 20XC Nikon Instruments Inc. MRH08230 Long working distance objective lens. NA0.45 WD 8.2-6.9
Cholera toxin Sigma-Aldrich C8052-1MG 200 µg/mL
Corning Gel Strainer 40 UM Sigma-Aldrich CLS431750 Pore size 40 μm
Corning Matrigel Matrix (Phenol red-free) Corning 356231 Extracellular matrix (ECM)
Corning bottle-top vacuum filter system Sigma-Aldrich CLS431098
Corning CoolCell LX Cell Freezing Container Sigma-Aldrich CLS432002
Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts Sigma-Aldrich CLS3470 Permeable support inserts. 6.5 mm Transwell with 0.4 μm pore polyester membrane insert.
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermo Fisher Scientific C10228
Countess II Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific AMQAX1000 Automated cell counter
Cytology brushes McFarlane Medical 33009
DMEM/F12-Ham Thermo Fisher Scientific 11330032
DMEM/F12-Ham Thermo Fisher Scientific 11330032
DMEM-High Glucose Thermo Fisher Scientific 11965-092
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537
Eclipse Ti2-E Nikon Live-cell imaging microscope.
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States Thermo Fisher Scientific 10082147
Fungizone (Amphotericin B) Thermo Fisher Scientific 15290018 250 µg/mL
Gentamicin solution Sigma-Aldrich G1397 50 mg/mL
Graphpad Prism Graphpad Scientific analysis software
Greiner Cryo.s vials Sigma-Aldrich V3135 Cryogenic vials
HEPES solution Sigma-Aldrich H0887 1 M
HI-FBS Thermo Fisher Scientific 10082-147
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0888 3.6 mg/mL
Incubator NL Ti2 BLACK 2000 PeCon Microscope environmental chamber. Allows warm air incubation and local CO2 and O2 gassing
Insulin Sigma-Aldrich I2643 2 mg/mL
Lab Armor 74220 706 Waterless Bead Bath 6L John Morris Group 74220 706 Bead bath
Lab Armor Beads Thermo Fisher Scientific A1254302 Thermal beads
MATLAB MathWorks Computing software
Microsoft Excel Microscoft Spreadsheet software
NIH/3T3 American Type Culture Collection CRL-1658 Irradiated NIH-3T3 mouse embryonic feeder cells
NIS-Elements AR Nikon Instruments Inc. Image acquisition software
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537
PneumaCult Airway Organoid Kit StemCell Technologies 5060 Airway Organoid Kit
PneumaCult-ALI Medium StemCell Technologies 5001
PneumaCult-Ex Plus Medium StemCell Technologies 5040
PureCol-S Advanced BioMatrix 5015 Type I Collagen solution
ReagentPack Subculture Reagents Lonza CC-5034
rhEGF (Epidermal Growth Factor, human) Sigma-Aldrich E9644 25 µg/mL
Y-27632 2HCl (ROCK inhibitor) Selleckchem S1049 10 mM
Tobramycin Sigma-Aldrich T4014 100 mg/mL
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154 0.4%
UNO Stage Top Incubator Okolab Microscope incubator. Allows temperature, humidity and CO2 conditioning

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References

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चिकित्सा अंक 177
सिलिया बीट आवृत्ति के परिमाणीकरण के लिए प्राथमिक मानव नाक उपकला कोशिका मॉडल का संग्रह, विस्तार और भेदभाव
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