Summary
Questo protocollo descrive la raccolta, l'espansione e la differenziazione delle cellule epiteliali nasali in modelli organotipici di cellule epiteliali delle vie aeree e la quantificazione della frequenza del battito delle ciglia tramite imaging di cellule vive e script personalizzati.
Abstract
Le misurazioni della funzione delle ciglia (frequenza del battito, pattern) sono state stabilite come strumenti diagnostici per le malattie respiratorie come la discinesia ciliare primaria. Tuttavia, l'applicazione più ampia di queste tecniche è limitata dall'estrema suscettibilità della funzione ciliare ai cambiamenti dei fattori ambientali, ad esempio temperatura, umidità e pH. Nelle vie aeree dei pazienti con fibrosi cistica (FC), l'accumulo di muco impedisce il battito delle ciglia. La funzione delle ciglia è stata studiata in modelli cellulari primari delle vie aeree come indicatore dell'attività del canale CFTR (Transmembrane Conductance Regulator). Tuttavia, una notevole variabilità da paziente a paziente nella frequenza di battitura delle ciglia è stata riscontrata in risposta ai farmaci modulanti CFTR, anche per i pazienti con le stesse mutazioni CFTR . Inoltre, l'impatto della secrezione disfunzionale di cloruro regolata da CFTR sulla funzione ciliare è poco compreso. Attualmente non esiste un protocollo completo che dimostri la preparazione del campione di modelli in vitro delle vie aeree, l'acquisizione di immagini e l'analisi della frequenza del battito delle ciglia (CBF). Le condizioni di coltura standardizzate e l'acquisizione di immagini eseguite in una condizione controllata dal punto di vista ambientale consentirebbero una quantificazione coerente e riproducibile del CBF tra individui e in risposta ai farmaci modulanti CFTR. Questo protocollo descrive la quantificazione del CBF in tre diversi sistemi modello di cellule epiteliali delle vie aeree: 1) fogli epiteliali nativi, 2) modelli di interfaccia aria-liquido ripresi su inserti di supporto permeabili e 3) organoidi tridimensionali incorporati in matrice extracellulare. Questi ultimi due replicano la fisiologia polmonare in vivo , con ciglia battenti e produzione di muco. La funzione ciliare viene catturata utilizzando una videocamera ad alta velocità in una camera controllata dall'ambiente. Per l'analisi di CBF vengono utilizzati script personalizzati. La traduzione delle misurazioni CBF in clinica è considerata un importante strumento clinico per prevedere la risposta ai farmaci modulanti CFTR su base paziente.
Introduction
Le misurazioni della frequenza e del pattern del battito delle ciglia (CBF) sono state stabilite come strumenti diagnostici per malattie respiratorie come la discinesia ciliare primaria (PCD)1. Nella fibrosi cistica (FC), la disfunzione del canale del cloruro CFTR (Transmembrane Conductance Regulator) CFTR causa disidratazione del liquido superficiale delle vie aeree e compromissione della clearance mucociliare2. La funzione ciliare è stata studiata in vitro in modelli cellulari primari delle vie aeree come indicatore dell'attività del canale CFTR3. Tuttavia, esiste una notevole variabilità da paziente a paziente nel CBF in risposta ai farmaci modulanti CFTR, anche per i pazienti con le stesse mutazioni CFTR 3. Inoltre, l'impatto della secrezione disfunzionale di cloruro regolata da CFTR sulla funzione ciliare è poco compreso. Attualmente non esiste un protocollo completo che dimostri la preparazione del campione di modelli in vitro delle vie aeree, l'acquisizione di immagini e l'analisi del CBF.
I fogli epiteliali nasali isolati dalle spazzolature della mucosa nasale sono utilizzati direttamente per le misurazioni della funzione ciliare per la diagnosi di PCD4. Tuttavia, mentre non vi è alcun controllo sulle dimensioni o sulla qualità dei fogli epiteliali nasali ottenuti, il CBF varia a seconda che venga misurato su singole cellule o fogli cellulari e su bordi ciliati del foglio epiteliale che sono interrotti o ininterrotti5. Pertanto, le discinesie secondarie causate da danni alle cellule durante la raccolta delle spazzolature della mucosa nasale possono influenzare il CBF. La coltura cellulare primaria di cellule epiteliali nasali e la loro differenziazione all'interfaccia aria-liquido (ALI) o nella matrice tridimensionale della membrana basale in organoidi epiteliali delle vie aeree ciliate danno origine a ciglia esenti da discinesie secondarie 4,6,7,8. Le cellule epiteliali delle vie aeree differenziate all'ALI (d'ora in poi denominate modelli ALI) sono state considerate un importante aiuto diagnostico secondario che replica i pattern del battito ciliare e la frequenza delle spazzolature ex vivo della mucosa nasale6 e consente l'analisi dell'ultrastruttura ciliare, del pattern del battito e della frequenza del battito mantenendo i difetti specifici del paziente9 . Tuttavia, esistono discrepanze nelle metodologie utilizzate per creare questi modelli cellulari differenziati pseudostratificati e mucociliari. Diversi protocolli di espansione o differenziazione della coltura potrebbero indurre fenotipi epiteliali distinti (ciliati o secretori)10 e determinare differenze significative nel CBF11. La CBF è stata quantificata in spazzolature epiteliali nasali 4,6,12,13,14,15,16, organoidi epiteliali delle vie aeree 14,17,18 e modelli ALI 3,4,6,13,19,20, 21. Tuttavia, tra questi protocolli, ci sono grandi variabilità e spesso molti parametri non sono controllati. Ad esempio, in alcuni studi, il CBF viene ripreso in situ mentre le cellule del modello ALI rimangono sull'inserto di supporto permeabile 3,19,20,21, altre ancora raschiano le cellule dall'inserto di supporto permeabile e le visualizzano sospese nei media 4,6,13.
Inoltre, la più ampia applicazione di tecniche che misurano la funzione ciliare è limitata dall'estrema suscettibilità della funzione ciliare ai cambiamenti dei fattori ambientali. Fattori ambientali come la temperatura22, l'umidità 23,24 e il pH 25,26 influenzano la funzione ciliare e devono essere regolati per quantificare accuratamente il CBF. I vari parametri fisiologici utilizzati in diversi laboratori e il modo in cui influenzano il CBF sono stati rivisti in precedenza27.
In letteratura sono riportate varie tecnologie di imaging e approcci alle misurazioni CBF. Per la diagnostica PCD, la microscopia video viene utilizzata per misurare la funzione ciliare28,29. Recentemente, un algoritmo di analisi video basato sulla microscopia dinamica differenziale è stato utilizzato per quantificare sia il CBF che la coordinazione delle ciglianei modelli ALI 3,30 delle cellule epiteliali delle vie aeree. Questo metodo consente la caratterizzazione del battito ciliare nelle cellule epiteliali delle vie aeree in modo rapido e completamente automatizzato, senza la necessità di segmentare o selezionare regioni. Vari metodi per l'imaging e la quantificazione del CBF possono aggiungere alle differenze riportate in CBF in letteratura (Supplementary File 1).
Un protocollo dalla coltura alla quantificazione per semplificare i metodi esistenti, la standardizzazione delle condizioni di coltura e l'acquisizione di immagini, eseguite in rigorose condizioni di controllo ambientale, consentirebbero una quantificazione coerente e riproducibile del CBF all'interno e tra gli individui.
Questo protocollo fornisce una descrizione completa della raccolta di cellule epiteliali, delle condizioni di crescita di espansione e differenziazione e della quantificazione del CBF in tre diversi sistemi modello di cellule epiteliali delle vie aeree di origine nasale: 1) fogli epiteliali nativi, 2) modelli ALI ripresi su inserti di supporto permeabili e 3) organoidi tridimensionali incorporati nella matrice extracellulare (ECM) (Figura 1 ). Le cellule epiteliali nasali ottenute da spazzolature dei turbinati inferiori nasali sono utilizzate come rappresentanti dell'epitelio delle vie aeree poiché sono un surrogato efficace per le cellule epiteliali bronchiali31 superando la procedura invasiva associata alla raccolta di spazzolature bronchiali. Il metodo Conditional Reprogramming Cell (CRC) viene utilizzato per espandere le cellule epiteliali primarie delle vie aeree per la creazione di modelli ALI e organoidi tridimensionali. La riprogrammazione condizionale delle cellule epiteliali delle vie aeree in uno stato simile alle cellule staminali è indotta dalla co-coltura con il sistema cellulare alimentatore di fibroblasti arrestato dalla crescita e l'inibitore della chinasi Rho-associata (ROCK)32. È importante sottolineare che il metodo CRC aumenta il raddoppio della popolazione nelle cellule epiteliali delle vie aeree mantenendo il loro potenziale di differenziazione tessuto-specifico33,34. In tutti i modelli di cellule epiteliali delle vie aeree, la funzione ciliare viene catturata in una camera a temperatura controllata utilizzando una videocamera ad alta velocità con impostazioni di acquisizione delle immagini standardizzate. Per la quantificazione del CBF vengono utilizzati script personalizzati.
Figura 1: Schema del flusso di lavoro. Dopo aver spazzolato il turbinato inferiore nasale dei partecipanti, le cellule epiteliali delle vie aeree vengono utilizzate in uno dei due modi. I fogli epiteliali delle vie aeree sono isolati e la frequenza del battito delle ciglia viene immediatamente visualizzata, oppure le cellule epiteliali delle vie aeree vengono espanse tramite il metodo della cellula di riprogrammazione condizionale. Le cellule epiteliali delle vie aeree espanse con CRC sono differenziate per stabilire cellule epiteliali delle vie aeree in un'interfaccia aria-liquido o colture organoidi epiteliali delle vie aeree. L'imaging della frequenza del battito ciliare viene acquisito utilizzando un microscopio di imaging a cellule vive con una camera ambientale di riscaldamento e umidità e una fotocamera scientifica ad alta frequenza di fotogrammi (>100Hz). L'analisi dei dati viene eseguita utilizzando script personalizzati. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Protocol
L'approvazione dello studio è stata ricevuta dal Sydney Children's Hospital Network Ethics Review Board (HREC/16/SCHN/120). Il consenso scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti (o dal tutore dei partecipanti) prima della raccolta dei campioni biologici.
1. Preparativi per stabilire modelli di cellule epiteliali delle vie aeree
- Preparare i mezzi di raccolta delle cellule nasali combinando l'80% di Modified Eagle Medium di Dulbecco e il 20% di siero bovino fetale. Supplemento con 1 μL/mL di penicillina/streptomicina. Conservare a 4 °C per un massimo di 3 mesi.
- Rivestire i matraccio o gli inserti di supporto permeabili con una soluzione di collagene secondo necessità seguendo le fasi da 1.2.1 a 1.2.4. Non conservare i vasi rivestiti di collagene a lungo termine.
- Effettuare una diluizione 1:100 della soluzione di collagene di tipo I (3 mg/mL di brodo) con soluzione salina tamponata fosfato (PBS) ad una concentrazione finale di 0,03 mg/ml. Mescolare bene.
- Rivestire i palloni per coltura cellulare (sezione 4) con 160 μL/cm 2 (cioè 4 ml per matraccio T25) e inserti di supporto permeabili (sezione 5) con 455 μL/cm2 (cioè 150 μL per inserto da 6,5 mm) della soluzione di collagene preparata.
- Incubare a 37 °C per 2-24 h.
- Rimuovere la soluzione di collagene mediante pipetta o aspiratore sottovuoto prima di seminare le cellule. Non lavare il recipiente prima di seminare le cellule.
- Preparare i supporti CRC (Conditional Reprogramming Cell) combinando i componenti32 elencati nella Tabella 1. Sterilizzare il filtro utilizzando un sistema di filtraggio a vuoto con tappo di bottiglia. Conservare a 4 °C per un massimo di 2 mesi.
- Il giorno dell'uso, aggiungere il fattore di crescita epidermico umano, l'inibitore ROCK e gli antibiotici come indicato nella Tabella 1.
| Componente | Volume |
| DMEM, alto glucosio | 156,7 ml |
| DMEM/F-12, HEPES | 313,3 ml |
| Idrocortisone | 55,6 μL |
| Insulina | 1,25 ml |
| Tossina del colera | 21 μL |
| Adenina | 1,2 ml |
| HI-FBS | 25 ml |
| Penicillina-streptomicina | 5 ml |
| Fattore di crescita epidermico umano | 1 μL/mL |
| Inibitore di ROCK | 1 μL/mL |
| Fungizone | 2 μl/ml |
| Tobramicina | 2 μL/mL |
| Ceftazidima idrato | 4 μL/mL |
| Soluzione di gentamicina | 1 μL/mL |
Tabella 1: Componenti per 500 mL di supporti cellulari di riprogrammazione condizionale
2. Raccolta di spazzole di turbinati inferiori nasali
NOTA: Questa sezione del protocollo richiede una provetta di raccolta (50 ml) con mezzi di raccolta delle cellule nasali, spazzole citologiche, tessuti e dispositivi di protezione individuale appropriati. Evitare di spazzolare durante un'infezione del tratto respiratorio superiore. C'è un piccolo rischio di sanguinamento, che aumenta se è presente l'infiammazione. Se lo scopo della spazzolatura è quello di ottenere fogli epiteliali delle vie aeree per misurazioni ex vivo CBF, la spazzolatura dovrebbe avvenire almeno 6 settimane dopo qualsiasi infezione delle vie respiratorie superiori; Idealmente, più di 10 settimane dopo l'infezione35.
- Preparare il mezzo di raccolta delle cellule nasali (sezione 1) e mantenere il tubo sul ghiaccio.
- Descrivi la procedura al partecipante come scomoda. Spiega che durante la spazzolatura si avverte una sensazione piena nella narice, simile al salto nell'oceano / piscina e all'acqua che scorre nel passaggio nasale. Avvisare i partecipanti che la procedura indurrà la produzione di lacrime come riflesso.
- Valutare quale posizionamento è appropriato per il partecipante. Mettere il partecipante in posizione supina se è disponibile un lettino da esame poiché il posizionamento supino impedisce il movimento della testa del partecipante lontano dal pennello durante la procedura. In alternativa, fai sedere il partecipante vicino a un muro, contro il quale può premere la testa all'indietro.
- Ispezionare il passaggio nasale. Nota la deviazione del setto, i polipi e qualsiasi altra anomalia anatomica che può influenzare il passaggio del pennello nel passaggio nasale e aumentare il rischio di sanguinamento.
- Pulire il naso dal muco in eccesso chiedendo ai partecipanti di soffiare il naso in un tessuto.
- Chiedi al partecipante di respirare attraverso la bocca. Prendi un pennello citologico nella mano dominante. Mentre si appoggia la quinta cifra sul mento del partecipante per ancorare la mano, inserire il pennello citologico nel passaggio nasale del partecipante (Figura 2). Inserire il pennello a ~45° sul viso del partecipante per passare attraverso il meato nasale.
- Ruotare il pennello in posizione verticale in modo che sia perpendicolare al viso del partecipante. Avanzare delicatamente ma con fermezza il pennello contro la parete laterale del naso sotto il turbinato inferiore fino a quando non si trova nella parte medio-posteriore del turbinato inferiore.
NOTA: evitare l'inserimento eccessivo; Se si avverte un improvviso calo della resistenza, è stata inserita la faringe nasale e il pennello deve essere retratto fino a quando la resistenza non viene nuovamente percepita dal proceduralista. - Ruotare il pennello di 360° fino a tre volte. Rimuovere delicatamente il pennello al contrario della manovra di inserimento, in modo che le cellule non vengano spostate dal pennello.
- Posizionare il pennello nel tubo di raccolta preparato con il mezzo di raccolta delle cellule nasali. Posizionare il tubo di raccolta sul ghiaccio.
- Ripetere la spazzolatura nella seconda narice se il partecipante è d'accordo / è necessario un gran numero di cellule (ad esempio, per avviare la coltura cellulare).
NOTA: La stessa narice può essere spazzolata di nuovo se non ci fossero cellule del sangue visibili sul pennello, notando, tuttavia, che il rischio di sanguinamento è leggermente aumentato con una seconda spazzolatura nella stessa narice.
Figura 2: Raccolta di cellule epiteliali nasali. Illustrazione della posizione del pennello citologico nella parte medio-posteriore del turbinato inferiore. Questa posizione si raggiunge inserendo il pennello attraverso le narici, ruotando il pennello con un angolo di 90° rispetto al viso e guidando il pennello lungo il passaggio nasale sotto il turbinato inferiore. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
3. Preparazione dei fogli epiteliali delle vie aeree
NOTA: Questa sezione del protocollo richiede un tubo di raccolta (spazzola/i citologia/i + 1 mL di terreno di raccolta delle cellule nasali) (sezione 2) e una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. Se si raccolgono spazzole di turbinato nasale allo scopo di visualizzare i fogli epiteliali delle vie aeree, utilizzare solo 1 ml di mezzi di raccolta delle cellule nasali privi di antibiotici; Altrimenti, i fogli epiteliali saranno troppo dispersi per l'imaging.
- Ruotare delicatamente il tubo di raccolta contenente la/e spazzola/i citologia/i per rimuovere i fogli epiteliali delle vie aeree dallo spazzolino/i.
- Raccogliere tutti i supporti e le celle con una pipetta P1000. Erogare 5-6 gocce in un pozzetto di una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. Ripetere l'operazione per circa sette pozzi.
- Trasferire la piastra al microscopio come da punto 7.1.4 e seguire il resto della sezione 7 per visualizzare la frequenza del battito delle ciglia.
- Immagini di fogli epiteliali (Figura 1) e non singole cellule non attaccate poiché è stato dimostrato che la funzione ciliare differisce tra fogli epiteliali e singole cellule non attaccate5.
4. Espansione e mantenimento delle cellule epiteliali delle vie aeree
- Riprogrammazione condizionale delle vie aeree Coltura di espansione cellulare di riprogrammazione condizionale delle vie aeree
NOTA: Vaso rivestito in soluzione di collagene (sezione 1), cellule di alimentazione embrionale di topo irradiate (NIH-3T3), mezzi di riprogrammazione condizionale (CRC) (sezione 1), spazzole citologiche in terreni di raccolta delle cellule nasali (paragrafo 2).- Cellule alimentatrici irradiate su piastra in recipienti di coltura preparati rivestiti di soluzione di collagene ad una densità di semina di 8.000 cellule/cm 2 almeno2 ore e non più di 72 ore prima della co-coltura con cellule epiteliali delle vie aeree (vedere36 per la coltura cellulare alimentatrice e l'irradiazione).
- Trasferire le cellule spazzolate nel tubo di raccolta (spazzola/i citologia/i + mezzo di raccolta delle cellule nasali) nel vortice sul ghiaccio. A bassa velocità, tubo vortice 10 s on, 10 s off (tenere sul ghiaccio in mezzo) per rimuovere le cellule dalle spazzole. Il vortice vigoroso può ridurre la vitalità cellulare. Ispezionare le spazzole per verificare se il muco è ancora aderente. Se è così, ripeti il vortice.
- Trasferire i tubi sul ghiaccio nell'armadio di biosicurezza. Utilizzare una pipetta sierologica per trasferire il mezzo dalla provetta di raccolta a una nuova provetta (Tube B), lasciando dietro di sé i pennelli citologici. Tubo B da centrifuga a 300 × g per 7 minuti a 4 °C.
- Rimuovere il tubo B dalla centrifuga, eliminare il surnatante. Se il muco è visibile, lavare il pellet con altri 5 ml di terreno di raccolta delle cellule nasali e centrifugare nuovamente.
- Aggiungere 1 mL di materiale CRC per risospendere il pellet cellulare nel tubo B. Utilizzando una pipetta sierologica da 5 ml, far passare le cellule attraverso un setaccio cellulare posto sopra un tubo da 50 ml (tubo C) con un movimento circolare.
- Ripetere più volte per formare una sospensione a cella singola. Raccogliere il materiale residuo dal fondo del setaccio e incorporarlo con il supporto. Scartare il setaccio cellulare.
- Utilizzando una pipetta sierologica da 5 ml, prelevare 1 mL di fluido dal tubo C e trasferirlo in una provetta per microcentrifuga.
- Prelevare 10 μL di questa sospensione cellulare e aggiungerla al tubo della microcentrifuga pre-aliquotato con 10 μL di tripano blu. Mescolare bene e utilizzare immediatamente un contatore automatico delle celle per registrare il conteggio delle cellule e la vitalità.
- Seminare le cellule epiteliali delle vie aeree nel pallone T25 pre-seminato con cellule alimentatrici irradiate.
- Mantenimento e dissociazione delle cellule epiteliali delle vie aeree
NOTA: il materiale CRC deve essere riscaldato a 37 °C collocandolo in un bagno d'acqua da laboratorio a temperatura controllata o in un dispositivo a bagno di perline prima di essere aggiunto alle celle.- Controllare regolarmente le cellule sotto il microscopio per colture cellulari (lente obiettiva 4×) per l'attaccamento, la contaminazione, la morfologia e la confluenza.
- Cambia i supporti CRC ogni due giorni. Quando si osservano cellule riprogrammate (Figura 1) e non è presente alcuna contaminazione, ridurre o sospendere gli antibiotici.
- Quando le cellule raggiungono il 90% di confluenza, utilizzare un metodo32 a doppia tripsina per dissociare le cellule ed eseguire un conteggio delle cellule come descritto al punto 4.1.8 (fare riferimento al file supplementare 2 per la dissociazione e il congelamento delle cellule).
5. Semina e differenziamento di cellule epiteliali delle vie aeree e mantenimento di modelli differenziati di ALI
- Semina di cellule epiteliali delle vie aeree in inserti di supporto permeabili
- Trasferire gli inserti di supporto permeabili rivestiti in soluzione di collagene (sezione 1) dall'incubatore di CO2 all'armadio di biosicurezza. Aspirare la soluzione di collagene ed eliminarla. Aggiungere un mezzo di espansione da 750 μL (senza antibiotici) al compartimento basale degli inserti di supporto permeabili.
- Trasferire le cellule dissociate o le cellule scongelate sul ghiaccio nell'armadio di biosicurezza. Aggiungere il volume di mezzo di dilatazione necessario per seminare 200.000-250.000 cellule in 150 μL al compartimento apicale di ciascun inserto di supporto permeabile.
- Fare attenzione a non creare bolle; Mescolare bene per garantire che le cellule siano omogenee e in sospensione. Aggiungere 150 μL della sospensione cellulare sul lato apicale di ciascun inserto di supporto permeabile.
- Risospendere le cellule dopo aver seminato ogni tre inserti di supporto permeabili per mantenere una sospensione cellulare omogenea.
- Ogni due giorni fino a quando non si forma un monostrato a cellule confluenti (di solito entro il giorno 4 dopo la semina), scartare il mezzo e aggiungere un nuovo mezzo di espansione riscaldato a temperatura ambiente (RT, 15-25 °C).
- Differenziazione delle cellule epiteliali delle vie aeree all'interfaccia aria-liquido
- Terreni ALI caldi (senza antibiotici) a RT (15-25 °C).
- Rimuovere il mezzo di dilatazione e passare al mezzo di differenziazione (ALI) su entrambi i compartimenti apicale e basale.
- Dopo 2 giorni di coltura in terreni ALI sommersi, aspirare e scartare i media.
- Aggiungere 750 μL di fluido ALI al compartimento basale solo per creare un'interfaccia aria-liquido.
NOTA: Se dopo 1 settimana di coltura, il monostrato non è confluente e si osservano ancora dei fori, le cellule potrebbero non avere più la capacità di espandersi nelle regioni vuote, considerare lo scarto delle cellule epiteliali delle vie aeree.
- Mantenimento del modello ALI differenziato e rimozione del muco
- Cambiare i mezzi apicali e basali ogni due giorni fino alla completa differenziazione (giorno 21-25 post-creazione dell'interfaccia aria-liquido).
- Una volta alla settimana, lavare il muco dal lato apicale seguendo i passaggi 5.3.3-5.3.4.
- PBS caldo a RT (15-25 °C).
- Aggiungere 200 μL di PBS al compartimento apicale. Incubare nell'incubatore CO2 per 10 min. Utilizzare un dispositivo di aspirazione o una pipetta per rimuovere il PBS.
6. Organoidi epiteliali tridimensionali delle vie aeree
- Preparati per la coltura di organoidi epiteliali delle vie aeree
- Collocare una o più piastre a 24 pozzetti in un incubatore a CO2 per riscaldarle a 37 °C durante la notte.
- Scongelare una fiala da 10 mL di ECM (Table of Materials) sul ghiaccio secondo le istruzioni del produttore. Preparare aliquote da 500 μL (uso una tantum) per ridurre al minimo il numero di cicli di congelamento-scongelamento.
NOTA: Si raccomanda l'uso di ECM con concentrazione proteica >10,5 mg/ml per ottenere i migliori risultati di coltura. Una concentrazione inferiore accelererà la disintegrazione della cupola ECM e aumenterà la presenza di organoidi rivolti verso l'esterno. - Utilizzare il kit organoidi delle vie aeree (tabella dei materiali) per preparare Airway Organoid Seeding Media (AOSM) e Differentiation Media (AODM) secondo le istruzioni del produttore.
- Preparare i mezzi basali organoidi delle vie aeree come da Tabella 2.
| Componente | Volume |
| DMEM/F-12 avanzato | 500 ml |
| HEPES | 5 ml |
| Alanil-glutammina | 5 ml |
| Penicillina-streptomicina | 5 ml |
Tabella 2: Componenti dei mezzi basali organoidi delle vie aeree
- Utilizzare il numero di cellule epiteliali vive delle vie aeree dissociate nella sezione 4.2 per calcolare quanti pozzetti possono essere seminati con una densità di semina di 10.000 cellule (vedere Tabella 3).
- Calcolare il volume totale di ECM e AOSM necessario per creare 1 x 50 μL di cupola ECM al 90% (45 μL di ECM e 5 μL di AOSM) per pozzetto.
NOTA: La densità di semina raccomandata di 10.000 cellule per pozzetto è per le cellule epiteliali nasali espanse con CRC nel passaggio 1. Le celle di passaggio successivo possono richiedere una maggiore densità di semina per ottenere la formazione dello stesso numero di organoidi.
| Numero di pozzi | Numero di celle | Numero di cupole | Vol di Matrigel ECM | Vol di AOSM |
| 1 | 10.000 cellule | 1 | 45 μL x 1,1 | 5 μL x 1,1 |
| 2 | 20.000 cellule | 2 | 90 μL x 1,1 | 10 μL x 1,1 |
| 5 | 50.000 cellule | 5 | 225 μL x 1,1 | 25 μL x 1,1 |
| ......... | ......... cellule | ......... | .........μL x 1,1 | .........μL x 1,1 |
Tabella 3: Calcoli per la semina di cellule epiteliali delle vie aeree nelle cupole ECM
- Semina di cellule epiteliali delle vie aeree nelle cupole ECM
NOTA: Mantenere l'ECM sul ghiaccio in ogni momento ed eseguire tutte le fasi che coinvolgono l'ECM sul ghiaccio, poiché l'ECM inizierà a solidificarsi a temperature >10 ° C.- Risospendere le cellule epiteliali delle vie aeree dissociate nel paragrafo 4.2 con il volume calcolato del 90% di ECM come da Tabella 3.
- Tenendo la pipetta con un angolo di 90° (verticale) il più vicino possibile al fondo del pozzetto, erogare 50 μL (fino al primo stop per evitare di creare bolle) della sospensione della cella ECM al centro del pozzetto. Evitare di toccare il muro del pozzo.
- Incubare la piastra a 37 °C per 20 minuti fino a quando l'ECM non si solidifica. Mentre l'ECM si sta solidificando, riscaldare AOSM a RT (15-25 °C) per evitare che causi la ri-liquefazione e la disintegrazione della cupola ECM dopo l'aggiunta.
- Aggiungere 500 μL di AOSM riscaldato a ciascun pozzetto erogando lungo la parete del pozzetto. Non pipettare i fluidi direttamente sulla cupola ECM.
- Cambiare il supporto ogni 2 giorni per 4-7 giorni. Per aspirare il fluido, inclinare la piastra con un angolo di 45° e aspirare dal bordo inferiore del pozzo lontano dalla cupola ECM.
- Dopo 4-7 giorni, iniziare la differenziazione organoide aggiungendo 500 μL di AODM (15-25 °C) a ciascun pozzetto e cambiare terreno ogni 2 giorni per 7 giorni.
- Riplaccatura degli organoidi epiteliali delle vie aeree al Giorno 7 della differenziazione
NOTA: La riplaccatura degli organoidi epiteliali delle vie aeree è necessaria perché il bordo delle cupole ECM si disintegra gradualmente durante il periodo di coltura di 2 settimane. Gli organoidi epiteliali delle vie aeree sul bordo della cupola possono essere persi (spostati nei media) o avere un orientamento apicale rivolto verso l'esterno quando non completamente incorporati nella ECM. La fase di riplaccatura "pulisce" anche la cupola ECM rimuovendo cellule / detriti che non formano con successo organoidi.- Aspirare il supporto da ciascun pozzetto. Aggiungere 500 μL di mezzi basali organoidi delle vie aeree fredde (d'ora in poi denominati mezzi basali) a ciascun pozzetto.
- Utilizzare la pipetta P1000 poiché questa punta della pipetta ha l'orifizio più grande e riduce la probabilità di scoppio di organoidi durante il pipettaggio. Regolare la pipetta a 350 μL per evitare di creare bolle, quindi pipettare delicatamente su e giù per interrompere la cupola ECM in ciascun pozzetto. Raccogliere tutti i mezzi ECM/basali in una provetta da centrifuga da 15 ml.
- Risciacquare abbondantemente con 500 μL di mezzo basale freddo. Raccogliere i mezzi basali contenenti eventuali ECM e organoidi rimanenti nella stessa provetta da centrifuga da 15 mL di cui sopra.
- Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Dei tre strati visibili dopo la centrifugazione - (1) surnatante, (2) ECM contenente detriti cellulari (soffici) e (3) pellet contenente organoidi - scartare lo strato di surnatante e ECM e preservare il pellet organoide.
- Aggiungere 1 mL di mezzo basale freddo al pellet organoide e pipettare delicatamente su e giù per separare eventuali residui di ECM. Aggiungere 6 ml di mezzo basale freddo al tubo e mescolare delicatamente.
- Centrifugare a 300 × g per 5 min a 4 °C. Scartare il surnatante.
- Se l'ECM in eccesso è ancora visibile, ripetere i passaggi 6.3.5-6.3.6 per eseguire un altro lavaggio.
- Risospendere il pellet organoide con un volume appropriato di ECM al 90% (utilizzare AODM anziché AOSM) per placcare ~ 30 organoidi per 50 μL della cupola.
- Controllare la densità degli organoidi al microscopio per colture cellulari (lente obiettivo 4x) dopo aver placcato la prima cupola. Se troppo denso, aggiungere un ulteriore 90% ECM per ottenere la densità desiderata di ~ 30 organoidi.
- Seguire i passaggi 6.2.3- 6.2.4 per solidificare la ECM e alimentare le cellule ogni due giorni con 500 μL di AODM riscaldato in ciascun pozzetto per altri 14 giorni fino a raggiungere la maturità (dopo 21 giorni di differenziazione) con formazione di lume circondato da epitelio pseudostratificato rivolto verso l'interno contenente cellule basali, cellule ciliate e cellule caliciformi.
NOTA: Gli organoidi epiteliali delle vie aeree qui descritti sono differenziati terminalmente e non possono essere fatti passare o crioconservati.
7. Imaging della frequenza del battito delle ciglia
NOTA: questa sezione del protocollo richiede un microscopio di imaging a cellule vive con una camera ambientale di riscaldamento e umidità, una fotocamera scientifica con frame rate rapido (>100 Hz), un obiettivo a lunga distanza di lavoro 20x e un software di imaging (fare riferimento alla Tabella dei materiali per le apparecchiature consigliate utilizzate in questo protocollo).
- Configurazione del microscopio
- Assicurarsi che il sistema di riscaldamento del microscopio sia acceso e bilanciato a 37 °C. Accendi il microscopio. Regolare il gas al 5% di CO 2 tramite il miscelatore di gas CO2/aria.
- Rabboccare la bottiglia del modulo di umidità che la CO2 attraversa con acqua purificata. Impostare l'umidità relativa all'85% tramite il controller superiore dello stadio in modo che l'acqua venga riscaldata e le celle siano alimentate con aria umidificata. Equilibrare la camera per 30 min.
- Posizionare l'inserto della piastra del microscopio nel supporto del microscopio.
- Trasferire i modelli di cellule epiteliali delle vie aeree dall'incubatore al microscopio su un blocco termico o sfere termiche equilibrate a 37 °C per mantenere il campione a una temperatura fisiologica.
- Posizionare la piastra di coltura contenente i modelli di cellule epiteliali delle vie aeree nell'inserto della piastra del microscopio. Chiudere la camera ambientale del microscopio.
- Lasciare equilibrare il campione nella camera del microscopio preriscaldata a 37 °C, riempita al 5% di CO2 per 30 minuti.
NOTA: un tempo di equilibrio più breve può essere sufficiente. Questo può essere determinato eseguendo un esperimento per identificare il tempo necessario per la stabilizzazione del CBF (fare riferimento alla Figura 3).
Figura 3: Stabilizzazione della frequenza del battito ciliare nel microscopio di imaging a cellule vive. Grafici a punti della frequenza media di battimento delle ciglia (CBF) nelle cellule epiteliali delle vie aeree all'interfaccia aria-liquido (modelli ALI) dopo il trasferimento in un microscopio di imaging a cellule vive con una camera ambientale. La camera è stata equilibrata e mantenuta a 37 °C, 5% di CO2 e umidità relativa dell'85% per 30 minuti prima di aprire lo sportello della camera e posizionare la piastra di coltura nell'inserto della piastra del microscopio. I modelli cellulari sono stati ripresi per 60 minuti a intervalli indicati. I modelli ALI sono stati derivati da due partecipanti con CF. Sono state acquisite sei immagini del campo visivo (FOV) per modello ALI. Ogni punto (blu) rappresenta la media CBF in 12-36 immagini FOV. I dati sono rappresentati come media ± SEM, con media collegata da una linea tratteggiata. L'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) è stata utilizzata per determinare le differenze statistiche. P < 0.0001, ns: nessuna significatività. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
- Durante il periodo di equilibrio, al computer, aprire il software di acquisizione. Selezionare l'obiettivo a lunga distanza di lavoro 20x.
- All'oculare del microscopio, concentrarsi sul modello cellulare (~Z = 8000 μm).
- Assicurarsi che il microscopio sia impostato per l'illuminazione Kohler in modo che i filamenti della lampadina della sorgente luminosa di trasmissione non siano focalizzati sul piano del campione, evitando artefatti nell'imaging. Per questo seguire i passaggi 7.1.10-7.1.13
- Chiudere completamente il diaframma del diaframma del diaframma del campo sopra il condensatore. Aprire lentamente il diaframma del diaframma del diaframma del campo e spostare il condensatore verso l'alto / verso il basso fino a quando non appare una forma ottagonale.
- Se il diaframma del diaframma del diaframma di campo non è allineato (cioè, l'ottagono non è al centro del campo visivo (FOV)), allinearlo al centro usando i tasti a brugola.
- Una volta allineato il diaframma del diaframma del diaframma di campo, regolare la messa a fuoco del condensatore per mettere a fuoco l'ottagono.
- Aprire il diaframma dell'iride di campo fino a quando non può più essere visto all'interno del FOV.
- Utilizzando il software di acquisizione, fare clic su L100 per commutare il percorso della luce sulla porta in cui è montata la telecamera. Fare clic sul pulsante verde play (Esegui) per visualizzare il FOV del microscopio tramite il software. Controllare che le ciglia siano a fuoco e regolare se necessario.
- Utilizzando il software di acquisizione, impostare il microscopio con le seguenti impostazioni: Filtri: vuoto; Condensatore: vuoto; Formato: no binning; Tempo di esposizione: 0,003 s; Modalità di lettura: rolling shutter; ROI: 512 × 512 pixel.
NOTA: il tempo di esposizione si basa sulla frequenza più alta che deve essere misurata poiché 1/tempo di esposizione deve essere almeno il doppio di questa frequenza. Ad esempio, se l'intervallo fisiologico massimo di battito delle ciglia = 30 Hz, allora 1/tempo di esposizione = 60 e il tempo di esposizione deve essere ≤ 0,016 s. Il ROI dipende dalle specifiche del frame rate della fotocamera. Seleziona un ROI che acquisisca frame rate >100 Hz.
- Acquisizione di immagini
- Per acquisire immagini time-lapse dal menu, fare clic su Acquisisci e quindi fare clic su Fast Time Lapse. Nella finestra popup, selezionare un percorso di salvataggio e un nome file. Acquisisci 1000 fotogrammi.
- Fare clic su Applica. Fare clic sul pulsante verde play (Esegui) per visualizzare in anteprima le ciglia nel FOV del microscopio e regolare la messa a fuoco Z se necessario. Fare clic su Esegui ora per acquisire il time-lapse veloce.
- Una volta catturato il time-lapse veloce, fare clic sul pulsante verde di riproduzione (Esegui) per visualizzare il FOV del microscopio. Utilizzando il joystick del microscopio, spostarsi lungo l'asse X/Y verso un altro FOV.
- Regolare la messa a fuoco Z per mettere a fuoco le ciglia. Fai clic su Esegui ora per catturare un altro time-lapse veloce.
- Ripetere i passaggi 7.2.3-7.2.4. Per i modelli ALI e gli organoidi delle vie aeree, immagine 6x FOV in ciascuno dei 3 campioni replicati. Per i fogli epiteliali delle vie aeree, immagine di almeno 4 immagini replicate per partecipante.
8. Analisi dei dati e quantificazione del CBF
- Preparativi per l'analisi dei dati
NOTA: questa sezione del protocollo richiede script di analisi personalizzati (file supplementare 3), file di immagini raw (acquisiti nella sezione 7.2), un software di elaborazione e un software di analisi.- Installare il software informatico, preferibilmente la versione più recente, sul computer di analisi. Assicurarsi che siano installati toolbox software di elaborazione standard (elmat, ops, datafun, uitools, datatypes, iofun, iotools, audiovideo) e toolbox di elaborazione di immagini e segnali.
- Copiare gli script di analisi personalizzati 'BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m' e 'LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m' e 'support scripts' nell'unità locale del computer.
- Nel software informatico, fare clic sulla scheda Home. Quindi fare clic su Imposta percorso (Figura 4A-B).
- Nella finestra pop-up, fare clic su Aggiungi con sottocartelle (Figura 4C). In 'Percorso di ricerca MATLAB', selezionare le cartelle mostrate in Figura 4D, quindi fare clic su Salva e chiudi (Figura 4E-F).
- Verificare che gli script di analisi siano collegati al software di elaborazione controllando che appaiano nel pannello di sinistra (Figura 4G).
- Trasferire i file di immagine raw (formato ambiente di microscopia aperta (OME)) acquisiti nella sezione 7.2 sull'unità locale del computer.
NOTA: è possibile accedere ai file di immagine raw di esempio all'indirizzo: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.16649878.v1.
Figura 4: Configurazione del software di elaborazione per l'analisi dei dati. (A) Aprire la scheda Home . (B) Selezionare Imposta percorso. (C) Selezionare Aggiungi con sottocartelle. (D) Selezionare le cartelle contenenti gli script di analisi. (E) Selezionare Salva. (f) Selezionare Chiudi. (G) Gli script di analisi appariranno nel pannello di sinistra. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
- Quantificazione del CBF mediante rilevazione del picco dello spettro di intensità dei singoli pixel
- Aprire il software informatico. Fare clic sul file di script di analisi 'BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m' (Figura 5A).
- Fare clic sulla scheda Editor e quindi fare clic sul pulsante verde di riproduzione (Esegui) per eseguire lo script (Figura 5B-C). Nella finestra del prompt, selezionare i file di immagine raw da analizzare (Figura 5D).
- Immettere il tempo di esposizione dal punto 7.1.15 nella finestra del prompt per il tempo di acquisizione per fotogramma, quindi fare clic su OK (Figura 5E).
- Attendere ~ 15 minuti per file mentre lo script calcola e restituisce il CBF nel file 'AveSpectrum' (file supplementare 4), che viene automaticamente salvato nella stessa cartella dei file di immagine raw. Visualizzare l'avanzamento tramite la barra di avanzamento (Figura 5F).
Figura 5: Esecuzione di script di analisi mediante software informatico. (A) Aprire lo script per l'analisi di CBF ('BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m') o la creazione di un filmato di battitura delle ciglia ('LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m'). (B) Aprire la scheda Editor. (C) Selezionare il pulsante verde di riproduzione (Esegui) per eseguire lo script di analisi. (D) Una finestra di prompt richiederà la selezione dei file per l'analisi o la creazione di filmati. (E) Durante l'esecuzione dello script 'BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m', verrà visualizzato un prompt per inserire manualmente il tempo di acquisizione per fotogramma (i) nel caso in cui lo script di lettura dei file non legga correttamente i metadati. (F) Barra di avanzamento che indica la frequenza del battito delle ciglia calcolata. (G) Durante l'esecuzione dello script 'LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m', verrà visualizzato un prompt per inserire manualmente il tipo di filmato da produrre (mp4 o avi), il frame rate del filmato (fps), se il componente immobile viene rimosso dai dati del filmato ('y' o 'n'), il tempo fotogramma (s) e la dimensione dei pixel (micron) dei dati esportati nel filmato. Si consiglia di utilizzare 'y' per il filtraggio immobile in quanto rimuoverà il muco o qualsiasi altro strato immobile che ostruisce i dati. (H) Barra di avanzamento per indicare il filmato in esportazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
- Eseguire lo script 'GetFirstAmplitude.m' sulla cartella che contiene i file 'AveSpectrum' utilizzando il processo nei passaggi 8.2.1-8.2.2. Attendi che lo script produca il file 'FirstAmplitudeStacked.xlsx', che contiene la frequenza che ha la massima ampiezza e rientra nell'intervallo fisiologico del battito delle ciglia dell'epitelio delle vie aeree, ≥3 e <30 Hz.
- Copiare i valori di frequenza dal file 'FirstAmplitudeStacked.xlsx' e tracciare utilizzando un software di analisi scientifica.
NOTA: una spiegazione di come lo script di analisi personalizzato quantifica CBF è fornita nel file supplementare 5. È possibile accedere ai set di dati analizzati di esempio all'indirizzo: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.16649815.
- Esportazione di un video di ciglia che battono
- Aprire il software informatico. Fare clic sul file di script 'LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m' (Figura 5A) per caricare lo script.
- Fare clic sulla scheda Editor e quindi fare clic sul pulsante verde di riproduzione (Esegui) per eseguire lo script (Figura 5C). Nella finestra del prompt, selezionare i file di immagine raw da esportare in file filmato (Figura 5D).
- Inserire le impostazioni dettagliate nella Tabella 4 nella finestra pop-up "Crea filmato" (Figura 5G).
- Attendere ~ 8 minuti per file mentre lo script crea i file del filmato e li restituisce nella posizione dei file di immagine raw. Visualizza l'avanzamento tramite la barra di avanzamento (Figura 5H).
| Ingressi filmati | Descrizione |
| Tipo di file | Inserisci il tipo di file che desideri esportare (mp4 o avi). |
| Frequenza fotogrammi | Immettere la frequenza fotogrammi alla quale il filmato deve essere esportato. Se hai acquisito ~ 1000 fotogrammi per serie temporale, si consiglia di impostare la frequenza fotogrammi ~ 30 fps. |
| Filtraggio immobile | Le opzioni sono 'y' o 'n'. Il valore predefinito è 'y' e lo script di filtraggio temporale rimuove, utilizzando lo spazio di Fourier, tutti i componenti immobili dai dati del filmato. Tipicamente, qualsiasi strato di cellule sotto le ciglia o il muco immobile contribuirà a una componente di offset a frequenza zero o una componente invariante nel tempo nel segnale che può essere filtrato. |
| Tempo di acquisizione per fotogramma | Il tempo di acquisizione per frame dei dati acquisiti. Viene utilizzato per visualizzare un timestamp nel filmato in pochi secondi. |
| Dimensione pixel | La dimensione in pixel in micrometri viene utilizzata per visualizzare una barra di scala nel filmato in micrometri. |
Tabella 4: impostazioni di input per la creazione di filmati
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Representative Results
Per dimostrare l'efficienza di questo protocollo nella quantificazione del CBF, vengono presentati i risultati del CBF misurati in modelli ALI di cellule epiteliali delle vie aeree derivati da tre partecipanti con FC e tre partecipanti sani di controllo. Il giorno 14 della differenziazione della cultura, erano presenti ciglia battenti (Figura 6). Dal giorno 14 al 21 della differenziazione della cultura, è stato osservato un aumento statisticamente significativo (P < 0,0345) del CBF all'interno di entrambe le coorti. Il giorno 21 della differenziazione culturale, il CBF medio per i partecipanti sani di controllo (7,61 ± 0,11 Hz) era significativamente più alto di quello dei partecipanti con FC (6,75 ± 0,17 Hz). Per comprendere la misura in cui l'accumulo e la rimozione del muco influiscono sul CBF, il CBF è stato ripreso negli stessi modelli cellulari dopo la rimozione del muco. Nei modelli ALI sia di individui sani che di quelli con FC, c'è stato un aumento statisticamente significativo (P < 0,0001) del CBF quando il muco è stato rimosso (Figura 6).
Figura 6: Effetto della rimozione del muco sulla frequenza del battito delle ciglia. Grafici a punti della frequenza media del battito delle ciglia (CBF) nelle cellule epiteliali delle vie aeree all'interfaccia aria-liquido (modelli ALI), acquisiti pre- e post-lavaggio del muco nei giorni 14 e 21 della differenziazione della coltura. Il lavaggio del muco è stato eseguito lavando la superficie della cellula apicale con 200 μL di PBS riscaldato. I modelli ALI sono stati derivati da partecipanti sani (n = 3) e partecipanti con FC (n = 3). I dati sono rappresentati come media ± SEM. Ogni punto rappresenta un singolo campo visivo dell'immagine. Sono state acquisite sei immagini del campo visivo in tre modelli ALI replicati. Ogni partecipante è codificato con un colore diverso. L'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) è stata utilizzata per determinare le differenze statistiche. P < 0,0001, ** P < 0,01, * P < 0,05. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
File supplementare 1: Riassunto di 18 pubblicazioni che mostrano la diversità dei parametri di coltura e di imaging delle cellule vive utilizzati per quantificare la frequenza del battito delle ciglia nei modelli organotipici dell'epitelio delle vie aeree. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 2: Dissociazione delle cellule epiteliali delle vie aeree per differenziamento o crioconservazione Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 3: Script di analisi personalizzati Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 4: File di dati generati dallo script di analisi Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 5: Descrizione dell'algoritmo di analisi CBF Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Ci sono molteplici fattori che potrebbero oscurare la quantificazione del CBF nei fogli epiteliali nasali. I fogli epiteliali devono essere visualizzati entro 3-9 ore dalla raccolta del campione poiché la funzione ciliare è più stabile durante questo periodo37. Meno globuli rossi e detriti sono più ottimali per l'imaging poiché interferiscono con l'acquisizione dei dati. Quando si seleziona un ROI per l'imaging, è importante selezionare un foglio epiteliale che non sia stato danneggiato o interrotto durante la raccolta del campione e non una singola cellula epiteliale non attaccata, poiché è stato dimostrato che queste variabili influenzano CBF5. È inoltre necessario che il foglio epiteliale sia fermo perché i movimenti possono oscurare l'acquisizione dei dati. I fogli epiteliali nei media spesso si orientano in direzioni diverse27. Poiché è stato precedentemente dimostrato che le variazioni nella qualità del campione, come i bordi epiteliali interrotti, influiscono sul CBF5, è probabile che anche l'orientamento del foglio epiteliale possa influenzare il CBF. Una limitazione di questo protocollo è che l'impatto dell'orientamento del foglio epiteliale non è stato valutato. Si prevede che questa sarà un'importante area di studio per un'ulteriore standardizzazione.
I modelli ALI maturi hanno un epitelio pseudostratificato con presenza di cellule caliciformi che producono muco34. L'abbondanza e la viscosità del muco influiscono sulla funzione ciliare 2,38. Recentemente è stato dimostrato che la rimozione del muco accumulato dai modelli di cellule ALI epiteliali nasali ha causato un aumento del CBF3. È stato descritto un processo ciclico, in cui la rigenerazione del muco in un periodo di 24 ore ha compromesso il CBF fino a quando il muco non è stato rimosso e il CBF è aumentato di nuovo. Per dimostrare che la ripetibilità delle misurazioni del CBF dipende dalla regolazione dell'ambiente fisiologico delle ciglia, è stato valutato l'impatto della rimozione del muco sul CBF. Una variazione statisticamente significativa di 3,5 Hz nel CBF è stata osservata dopo la rimozione del muco. Rispetto a questi risultati, un recente studio che ha testato la risposta delle ciglia ai composti modulanti CFTR3 ha riportato un cambiamento nel CBF non maggiore di quello causato dalla rimozione del muco nel nostro sistema modello. Ciò sottolinea l'importanza di regolare le variabili ambientali che influenzano il CBF, soprattutto se questo sistema modello deve essere stabilito come piattaforma per studiare la risposta specifica del paziente ai trattamenti in futuro. Pertanto, si raccomanda di essere coerenti nel rimuovere il muco o nel non rimuoverlo prima dell'imaging al fine di controllare l'influenza di questa variabile ambientale delle quantificazioni del CBF.
La temperatura è il fattore dominante che causa fluttuazioni nel CBF. Le ciglia hanno precedentemente dimostrato di essere sensibili alle fluttuazioni della temperatura fisiologica nelle fette polmonari di topo e nelle biopsie nasali39,40. Pertanto, è fondamentale osservare i passaggi che riducono al minimo le fluttuazioni della temperatura ambientale durante la manipolazione dei campioni per l'acquisizione delle immagini e garantire che le cellule siano stabilizzate nella camera del microscopio a 37 °C prima dell'imaging. Durante l'imaging delle ciglia, le ciglia dovrebbero essere messe a fuoco appena sopra il monostrato cellulare. Se il battito delle ciglia non è osservabile tramite microscopia ottica, la rimozione del muco accumulato mediante lavaggio con PBS riscaldato può aumentare il battito delle ciglia poiché è noto che il muco ostruisce il battito delle ciglia3. Un'altra situazione non ottimale sarà se c'è un movimento di muco sulle cellule, in quanto ciò ostacolerà l'acquisizione dei dati. Una soluzione potrebbe essere quella di selezionare un ROI senza il movimento visibile del muco. Tuttavia, nella situazione in cui ciò è inevitabile, si raccomanda di rimuovere il muco mediante lavaggio.
Un avvertimento importante da considerare è la selezione di una fotocamera e di un obiettivo appropriati per soddisfare il campionamento di Nyquist temporale e spaziale. L'obiettivo a lunga distanza di lavoro impiegato in questo protocollo di studio consente di catturare un campo visivo relativamente ampio. Ciò consente di acquisire immagini CBF in colture ALI intatte, con una risoluzione spaziale di ~ 500 nm (NA0.45). Come tale, il fascio ciliare può essere risolto spazialmente. Tuttavia, una limitazione di questo protocollo è che l'intero modello ALI non può essere visualizzato con una risoluzione suscettibile di analisi. Di conseguenza, è necessario selezionare un ROI per l'acquisizione dei dati. Per limitare la distorsione associata alla selezione di un ROI, si consiglia di selezionare sei ROI da zone diverse all'interno di ciascun inserto di supporto permeabile. Questo è importante in quanto è stato precedentemente dimostrato che le ciglia non battono in modo sincrono all'interno di un campione e il CBF varia tra i diversi bordi e il ROI16,41, il che implica che ROI diversi probabilmente hanno valori medi di CBF diversi. Inoltre, è essenziale avere accesso a telecamere ad alta velocità con un frame rate di almeno 100 Hz in modo che qualsiasi evento temporale che si verifichi a una frequenza di 50 Hz possa essere risolto con il criterio di campionamento di Nyquist. Si consiglia una fotocamera sCMOS veloce con rumore estremamente basso che consente la misurazione di singole molecole. Tuttavia, questo protocollo non è limitato dall'uso di questo tipo di fotocamera, purché la fotocamera soddisfi i requisiti di campionamento temporale e catturi le fluttuazioni di intensità dei pixel derivanti dal battito ciliare.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo i partecipanti allo studio e le loro famiglie per i loro contributi. Apprezziamo l'assistenza del dipartimento respiratorio di Randwick del Sydney Children's Hospitals (SCH) nell'organizzazione e nella raccolta di campioni biologici dei pazienti - un ringraziamento speciale al Dr. John Widger, alla dottoressa Yvonne Belessis, Leanne Plush, Amanda Thompson e Rhonda Bell. Riconosciamo l'assistenza di Iveta Slapetova e Renee Whan della Katharina Gaus Light Microscopy Facility all'interno del Mark Wainwright Analytical Centre presso UNSW Sydney. Questo lavoro è supportato dal National Health and Medical Research Council (NHMRC) Australia (GNT1188987), CF Foundation Australia e Sydney Children's Hospital Foundation. Gli autori desiderano riconoscere Luminesce Alliance - Innovation for Children's Health per il suo contributo e supporto. Luminesce Alliance - Innovation for Children's Health è una joint venture cooperativa senza scopo di lucro tra il Sydney Children's Hospitals Network, il Children's Medical Research Institute e il Children's Cancer Institute. È stato istituito con il supporto del governo del NSW per coordinare e integrare la ricerca pediatrica. Luminesce Alliance è anche affiliata con l'Università di Sydney e l'Università del New South Wales Sydney. KMA è supportata da una borsa di studio del programma di formazione per la ricerca del governo australiano. LKF è sostenuta dal Rotary Club di Sydney Cove/Sydney Children's Hospital Foundation e dalle borse di studio post-laurea dell'UNSW University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | 10 mg/mL |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Alanyl-glutamine | Sigma-Aldrich | G8541 | 200 mM |
| Andor Zyla 4.2 sCMOS | Oxford Instruments | Fast frame rate (>100 Hz) scientific camera | |
| Bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431098 | |
| Ceftazidime hydrate | Sigma-Aldrich | A6987 | 50 mg/mL |
| Cell Culture Microscope | Olympus | CKX53 | |
| CFI S Plan Fluor ELWD 20XC | Nikon Instruments Inc. | MRH08230 | Long working distance objective lens. NA0.45 WD 8.2-6.9 |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052-1MG | 200 µg/mL |
| Corning Gel Strainer 40 UM | Sigma-Aldrich | CLS431750 | Pore size 40 μm |
| Corning Matrigel Matrix (Phenol red-free) | Corning | 356231 | Extracellular matrix (ECM) |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431098 | |
| Corning CoolCell LX Cell Freezing Container | Sigma-Aldrich | CLS432002 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3470 | Permeable support inserts. 6.5 mm Transwell with 0.4 μm pore polyester membrane insert. |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Cytology brushes | McFarlane Medical | 33009 | |
| DMEM/F12-Ham | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | |
| DMEM/F12-Ham | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | |
| DMEM-High Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11965-092 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Eclipse Ti2-E | Nikon | Live-cell imaging microscope. | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Fungizone (Amphotericin B) | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | 250 µg/mL |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL |
| Graphpad Prism | Graphpad | Scientific analysis software | |
| Greiner Cryo.s vials | Sigma-Aldrich | V3135 | Cryogenic vials |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M |
| HI-FBS | Thermo Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 3.6 mg/mL |
| Incubator NL Ti2 BLACK 2000 | PeCon | Microscope environmental chamber. Allows warm air incubation and local CO2 and O2 gassing | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | 2 mg/mL |
| Lab Armor 74220 706 Waterless Bead Bath 6L | John Morris Group | 74220 706 | Bead bath |
| Lab Armor Beads | Thermo Fisher Scientific | A1254302 | Thermal beads |
| MATLAB | MathWorks | Computing software | |
| Microsoft Excel | Microscoft | Spreadsheet software | |
| NIH/3T3 | American Type Culture Collection | CRL-1658 | Irradiated NIH-3T3 mouse embryonic feeder cells |
| NIS-Elements AR | Nikon Instruments Inc. | Image acquisition software | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| PneumaCult Airway Organoid Kit | StemCell Technologies | 5060 | Airway Organoid Kit |
| PneumaCult-ALI Medium | StemCell Technologies | 5001 | |
| PneumaCult-Ex Plus Medium | StemCell Technologies | 5040 | |
| PureCol-S | Advanced BioMatrix | 5015 | Type I Collagen solution |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | |
| rhEGF (Epidermal Growth Factor, human) | Sigma-Aldrich | E9644 | 25 µg/mL |
| Y-27632 2HCl (ROCK inhibitor) | Selleckchem | S1049 | 10 mM |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | 100 mg/mL |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% |
| UNO Stage Top Incubator | Okolab | Microscope incubator. Allows temperature, humidity and CO2 conditioning |
References
- Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. European Respiratory Journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).
- Chioccioli, M., Feriani, L., Kotar, J., Bratcher, P. E., Cicuta, P. Phenotyping ciliary dynamics and coordination in response to CFTR-modulators in Cystic Fibrosis respiratory epithelial cells. Nature Communications. 10 (1), 1763 (2019).
- Hirst, R. A., Rutman, A., Williams, G., O'Callaghan, C. Ciliated air-liquid cultures as an aid to diagnostic testing of primary ciliary dyskinesia. Chest. 138 (6), 1441-1447 (2010).
- Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. European Respiratory Journal. 34 (2), 401-404 (2009).
- Coles, J. L., et al. A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia. Journal of Clinical Medicine. 9 (11), (2020).
- Pifferi, M., et al. Simplified cell culture method for the diagnosis of atypical primary ciliary dyskinesia. Thorax. 64 (12), 1077-1081 (2009).
- Pifferi, M., et al. Rapid diagnosis of primary ciliary dyskinesia: cell culture and soft computing analysis. European Respiratory Journal. 41 (4), 960-965 (2013).
- Lee, D. D. H., et al. Higher throughput drug screening for rare respiratory diseases: Readthrough therapy in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 58 (4), 2000455 (2021).
- Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), (2020).
- Awatade, N. T., et al. Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).
- Dabrowski, M., Bukowy-Bieryllo, Z., Jackson, C. L., Zietkiewicz, E. Properties of non-aminoglycoside compounds used to stimulate translational readthrough of PTC mutations in primary ciliary dyskinesia. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), (2021).
- Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air-liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative diagnostic aid. PloS One. 9 (2), 89675 (2014).
- Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 6, 3 (2017).
- Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
- Chilvers, M. A., Rutman, A., O'Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
- Castillon, N., et al. Polarized expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and associated epithelial proteins during the regeneration of human airway surface epithelium in three-dimensional culture. Laboratory Investigation. 82 (8), 989-998 (2002).
- Jorissen, M., Bessems, A. Normal ciliary beat frequency after ciliogenesis in nasal epithelial cells cultured sequentially as monolayer and in suspension. Acta Oto-Laryngologica. 115 (1), 66-70 (1995).
- Conger, B. T., et al. Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures. JAMA Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).
- Pique, N., De Servi, B. Rhinosectan((R)) spray (containing xyloglucan) on the ciliary function of the nasal respiratory epithelium; results of an in vitro study. Allergy, Asthma & Clinical Immunology. 14, 41 (2018).
- Chen, Q., et al. Host antiviral response suppresses ciliogenesis and motile ciliary functions in the nasal epithelium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 581340 (2020).
- Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell. 76 (3), 335-338 (1992).
- Ballenger, J. J., Orr, M. F. Quantitative measurement of human ciliary activity. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 72, 31-39 (1963).
- Mercke, U. The influence of varying air humidity on mucociliary activity. Acta Oto-Laryngologica. 79 (1-2), 133-139 (1975).
- Sutto, Z., Conner, G. E., Salathe, M. Regulation of human airway ciliary beat frequency by intracellular pH. Journal of Physiology. 560, 519-532 (2004).
- Salathe, M.
- Kempeneers, C., Seaton, C., Garcia Espinosa, B., Chilvers, M. A. Ciliary functional analysis: Beating a path towards standardization. Pediatric Pulmonology. 54 (10), 1627-1638 (2019).
- Kempeneers, C., Seaton, C., Chilvers, M. A. Variation of ciliary beat pattern in three different beating planes in healthy subjects. Chest. 151 (5), 993-1001 (2017).
- Jackson, C. L., et al. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
- Feriani, L., et al. Assessing the collective dynamics of motile cilia in cultures of human airway cells by multiscale DDM. Biophysical Journal. 113 (1), 109-119 (2017).
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), (2018).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).
- Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).
- Martinovich, K. M., et al. Conditionally reprogrammed primary airway epithelial cells maintain morphology, lineage and disease specific functional characteristics. Scientific Reports. 7 (1), 17971 (2017).
- Wong, J. Y., Rutman, A., O'Callaghan, C. Recovery of the ciliated epithelium following acute bronchiolitis in infancy. Thorax. 60 (7), 582-587 (2005).
- Gentzsch, M., et al. Pharmacological rescue of conditionally reprogrammed cystic fibrosis bronchial epithelial cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (5), 568-574 (2017).
- Sommer, J. U., Gross, S., Hormann, K., Stuck, B. A. Time-dependent changes in nasal ciliary beat frequency. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 267 (9), 1383-1387 (2010).
- Ratjen, F., et al.
- Delmotte, P., Sanderson, M. J. Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 35 (1), 110-117 (2006).
- Smith, C. M., et al. Cooling of cilia allows functional analysis of the beat pattern for diagnostic testing. Chest. 140 (1), 186-190 (2011).
- Raidt, J., et al. Ciliary beat pattern and frequency in genetic variants of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 44 (6), 1579-1588 (2014).
