Summary
यह अध्ययन लाइव-3 डी-सेल इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री का एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो एक बाल चिकित्सा डिफ्यूज मिडलाइन ग्लियोमा सेल लाइन पर लागू होता है, जो 3 डी सेल आक्रमण और प्रवासन जैसी गतिशील प्रक्रियाओं के दौरान प्लाज्मा झिल्ली पर प्रोटीन की अभिव्यक्ति का वास्तविक समय में अध्ययन करने के लिए उपयोगी है।
Abstract
सेल माइग्रेशन और आक्रमण डिफ्यूज मिडलाइन ग्लियोमा (डीएमजी) एच 3 के 27 एम-उत्परिवर्ती ट्यूमर के विशिष्ट लक्षण हैं। हमने पहले से ही त्रि-आयामी (3 डी) सेल-आधारित आक्रमण और माइग्रेशन परख का उपयोग करके इन सुविधाओं का मॉडल तैयार किया है। इस अध्ययन में, हमने लाइव-सेल इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के लिए इन 3 डी परखों को अनुकूलित किया है। एक एंटीबॉडी लेबलिंग अभिकर्मक का उपयोग डीएमजी एच 3 के 27 एम प्राथमिक रोगी-व्युत्पन्न सेल लाइन के पलायन और हमलावर कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली पर आसंजन अणु सीडी 44 की अभिव्यक्ति का वास्तविक समय में पता लगाने के लिए किया गया था। सीडी 44 कैंसर स्टेम सेल फेनोटाइप और ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण से जुड़ा हुआ है और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) बाह्य मैट्रिक्स के साथ प्रत्यक्ष बातचीत में शामिल है। डीएमजी एच 3 के 27 एम सेल लाइन से न्यूरोस्फीयर (एनएस) को बेसल मेम्ब्रेन मैट्रिक्स (बीएमएम) में एम्बेडेड किया गया था या एंटीबॉडी लेबलिंग अभिकर्मक (एएलआर) के साथ संयोजन में एंटी-सीडी 44 एंटीबॉडी की उपस्थिति में बीएमएम की एक पतली कोटिंग परत पर रखा गया था। लाइव-3 डी-सेल इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री छवि विश्लेषण एक लाइव-सेल विश्लेषण उपकरण पर किया गया था ताकि समग्र सीडी 44 अभिव्यक्ति को मात्रात्मक रूप से मापा जा सके, विशेष रूप से माइग्रेटिंग और हमलावर कोशिकाओं पर। विधि माइग्रेटिंग और हमलावर कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली पर सीडी 44 की आंतरायिक अभिव्यक्ति को वास्तविक समय में देखने की अनुमति देती है। इसके अलावा, परख ने डीएमजी एच 3 के 27 एम कोशिकाओं में मेसेनकाइमल से अमीबॉइड संक्रमण में सीडी 44 की संभावित भूमिका में नई अंतर्दृष्टि भी प्रदान की।
Introduction
ट्यूमर कोशिकाओं की आसपास के ऊतकों से बचने और प्रसार करने कीक्षमता कैंसर 1 की एक पहचान है। विशेष रूप से, ट्यूमर सेल गतिशीलता घातक ट्यूमर की एक विशिष्ट विशेषता है, चाहे वह एक मेटास्टैटिक ट्यूमर प्रकार जैसे स्तन2 या कोलोरेक्टल कैंसर3 या स्थानीय रूप से आक्रामक प्रकार जैसे कि डिफ्यूज ग्लियोमा 4,5 हो।
ट्यूमर सेल फेनोटाइप के कई पहलुओं की जांच में इमेजिंग की केंद्रीय भूमिका है; हालांकि, माइग्रेशन और आक्रमण जैसी गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करते समय लाइव-सेल इमेजिंग को निश्चित रूप से प्राथमिकता दी जानी चाहिए, जब आकृति विज्ञान और सेल-सेल इंटरैक्शन 6,7 में परिवर्तन होते हैं और समय के साथ अधिक आसानी से जांच की जा सकती है। लाइव-सेल इमेजिंग के लिए, विभिन्न ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी सिस्टम का उपयोग किया जा सकता है, चरण कंट्रास्ट से कॉन्फोकल फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप तक, और तापमान और सीओ2 नियंत्रण के लिए एक कक्ष से लैस उल्टे माइक्रोस्कोप पर छोटी या लंबी अवधि में किए गए छवि अधिग्रहण, या उच्च-सामग्री छवि विश्लेषण प्रणालियों में जिनमें अंतर्निहित कक्ष होते हैं, या वैकल्पिक रूप से छवि प्रणालियों में जो पूरी अवधि के दौरान कोशिकाओं को परेशान करने की आवश्यकता के बिना इनक्यूबेटर में बैठ सकते हैं। प्रयोग की। उपयोग की जाने वाली प्रणाली की पसंद अक्सर कई कारकों द्वारा निर्धारित की जाती है जैसे कि रिज़ॉल्यूशन की आवश्यकता, समग्र अधिग्रहण समय और समय अंतराल की लंबाई, उपयोग किए गए पोत प्रकार और परख के थ्रूपुट (एकल कक्ष या मल्टी-वेल प्लेट), उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं की संवेदनशीलता (कीमती और / या दुर्लभ कोशिकाएं) और फ्लोरोफोरे मौजूद होने पर कोशिकाओं की फोटोटॉक्सिसिटी।
लाइव मोड में फ्लोरोसेंट इमेजिंग के संबंध में, यह फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए कोशिकाओं को ट्रांसड्यूसिंग करके या तो स्थिर अभिव्यक्ति के लिए या इंड्यूसेबल सिस्टम8 के रूप में, क्षणिक सेल अभिकर्मक द्वारा, या सेल रंगों का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है जो अब लाइव-सेल लेबलिंग7 के लिए उपलब्ध हैं, लाइव-सेल ट्रैकिंग के साथ-साथ उपकोशिकीय ऑर्गेनेल9 को लेबल करने के लिए।
लाइव-सेल इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के लिए हाल ही में एक उपयोगी दृष्टिकोण विकसित किया गया है, जहां पसंद के सतह मार्कर को पहचानने वाले एंटीबॉडी को लेबलिंग अभिकर्मक से बांधा जा सकता है, और कल्चर मीडिया के अलावा, विशिष्ट मार्कर को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को लाइव-सेल इमेजिंग द्वारा वास्तविक समय में आसानी से चित्रित किया जा सकता है। इस तरह की प्रणाली का उपयोग करके मार्कर अभिव्यक्ति का विज़ुअलाइज़ेशन और परिमाणीकरण आसानी से प्राप्त किया जा सकता है जब कोशिकाओं को दो-आयामी (2 डी)संस्कृति स्थितियों में उगाया जाता है।
इस अध्ययन में, हमने लाइव-3 डी-सेल इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री आक्रमण और बाल चिकित्सा डिफ्यूज मिडलाइन ग्लियोमा (डीएमजी) रोगी-व्युत्पन्नकोशिकाओं के प्रवास के लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया। डीएमजी बच्चों को प्रभावित करने वाले अत्यधिक आक्रामक मस्तिष्क ट्यूमर हैं, हिस्टोन एच 3 वेरिएंट में ड्राइवर म्यूटेशन के 27 एम से जुड़े विशाल बहुमत के लिए। डीएमजी मस्तिष्क स्टेम और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के मध्य रेखा क्षेत्रों में उत्पन्न होता है और अत्यधिक घुसपैठ प्रकृति की विशेषता है। इस आक्रामक क्षमता को कम से कम इंट्राट्यूमर विषमता और डीएमजी कोशिकाओं की कैंसर-स्टेम जैसी विशेषताओं द्वारा मध्यस्थ दिखाया गयाहै।
हमारे परख का उदाहरण देने के लिए, सीडी 44 के लिए एंटीबॉडी के साथ संयोजन में एक एंटीबॉडी लेबलिंग अभिकर्मक (एएलआर) का उपयोग किया गया था। सीडी 44 एक ट्रांसमेम्ब्रेन ग्लाइकोप्रोटीन और आसंजन अणु है जो स्टेम सेल और अन्य सेल प्रकारों पर व्यक्त किया जाता है, जो कैंसर स्टेम सेल फेनोटाइप और ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण13 से जुड़ा होता है। प्रोटोकॉल में नमूना तैयारी, ब्राइटफील्ड और फ्लोरोसेंट मोड में छवि अधिग्रहण, और एक लाइव-सेल विश्लेषण उपकरण पर विश्लेषण शामिल है जो 3 डी आक्रमण और माइग्रेशन के दौरान डीएमजी सेल झिल्ली पर समग्र सीडी 44 अभिव्यक्ति को वास्तविक समय में मात्रात्मक रूप से मापने की अनुमति देता है। परख ने प्रवास और आक्रमण करते समय व्यक्तिगत कोशिकाओं पर सीडी 44 के आंतरायिक फ्लोरोसेंट सिग्नल की कल्पना करने की संभावना की भी अनुमति दी। दिलचस्प बात यह है कि एंटी-सीडी 44 एंटीबॉडी का एक प्रभाव भी देखा गया था, जो संभावित रूप से एक अवरुद्ध एंटीबॉडी के रूप में कार्य करता है, सेल माइग्रेशन और आक्रमण को कम करने के साथ-साथ आक्रमण पैटर्न को सामूहिक मेसेनकाइमल जैसे से अधिक एकल-सेल अमीबॉइड-जैसे फेनोटाइप में बदलने के लिए प्रेरित करता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
यह प्रोटोकॉल संस्थानों की मानव अनुसंधान नैतिकता समितियों के दिशानिर्देशों का पालन करता है।
नोट: यह अध्ययन इनक्यूसाइट एस 3 और / या एसएक्स 5 लाइव-सेल विश्लेषण उपकरण (लाइव सेल विश्लेषण उपकरण के रूप में संदर्भित) का उपयोग करके किया गया था।
1. पुन: आकार के ट्यूमर स्फेरॉइड की पीढ़ी
नोट: विंची एट अल 2015 7,12 द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल (अनुभाग 1), कुछ संशोधनों के साथ नीचे दी गई रिपोर्ट के अनुसार उपयोग किया गया था:
- डीएमजी एच 3 के 27 एम-उत्परिवर्ती न्यूरोस्फीयर (एनएस) एकत्र करें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट (मिनट) के लिए 170 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
- उन्हें तोड़ने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 500 μL accutase घोल के साथ NS को इनक्यूबेट करें।
- ट्यूमर स्टेम सेल (टीएसएम) माध्यम7 के साथ एक्यूटेज़ समाधान को बेअसर करें और आरटी पर 5 मिनट के लिए 355 एक्स जी पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
- टीएसएम माध्यम के 1 एमएल में सेल गोली को पुन: निलंबित करें और फिर सेल काउंटिंग चैंबर का उपयोग करके कोशिकाओं की गिनती करें।
- 2.5-5 x 103कोशिकाओं/एमएल को प्राप्त करने के लिए सेल सस्पेंशन को पतला करें और 100 μL/वेल को अल्ट्रा-लो अटैचमेंट (ULA) 96-वेल राउंड-बॉटम प्लेटों में बीज दें ( सामग्री की तालिका देखें)। सेल सीडिंग के 4 दिन बाद ~ 300 μm व्यास के व्यक्तिगत एनएस प्राप्त करने के लिए एक उचित सेल घनत्व का उपयोग करें (अत्यधिक आक्रामक ग्लिओमा कोशिकाओं के लिए 250-500 कोशिकाएं /
- सेल सीडिंग के 4 दिन बाद उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एनएस गठन की पुष्टि करें।
2. एएलआर / एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स की तैयारी और आक्रमण परख के लिए सेटअप।
नोट: एंटीबॉडी लेबलिंग प्रक्रिया के लिए, लाइव-सेल इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के लिए एंटीबॉडी लेबलिंग डाई प्रोटोकॉल10 का उपयोग कुछ संशोधनों के साथ किया जाता है, जैसा कि नीचे बताया गया है। आक्रमण परख के लिए, विंची एट अल 201512 द्वारा पहले वर्णित प्रोटोकॉल का पालन किया जाता है।
- प्रत्येक अभिकर्मक के लिए आवश्यक मात्रा का विश्लेषण और गणना करने के लिए कुओं की संख्या (जैसे, 60 कुओं) पर विचार करें। नकारात्मक नियंत्रण के लिए कुओं को भी शामिल करें (एएलआर के साथ नमूने लेकिन एंटीबॉडी के बिना)।
- अभिकर्मक को पुन: हाइड्रेट करने के लिए एएलआर में बाँझ पानी के 100 μL जोड़ें (अंतिम एकाग्रता = 0.5 मिलीग्राम / घोल को मिलाने के लिए पिपेट।
नोट: अभिकर्मक प्रकाश-संवेदनशील है; इसलिए, अंधेरे में रखें। बचे हुए अभिकर्मक को एलिकोट करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (ठंड और पिघलने से बचें)। - एक गोल तल मल्टी-वेल प्लेट में या एम्बर ट्यूब में टीएसएम माध्यम (या पसंद की सेल लाइन के लिए उपयुक्त सेल ग्रोथ मीडिया) में एएलआर के साथ एंटीबॉडी मिलाएं और प्रकाश से बचाएं।
- 3x अंतिम परख एकाग्रता पर 25 μL / अच्छी तरह से वितरित करने के लिए माध्यम की पर्याप्त मात्रा तैयार करें। 15 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
नोट: एएलआर के लिए एंटीबॉडी के 1: 3 मोलर अनुपात की सिफारिश की जाती है, जिसमें परीक्षण एंटीबॉडी < 1.5 μg / mL की अंतिम (1x) एकाग्रता होती है। इस प्रोटोकॉल में प्रयोगों के लिए 0.1 μg / mL (3x एकाग्रता = 0.3 μg / mL) की अंतिम एकाग्रता पर एक एंटी-ह्यूमन सीडी 44 माउस एंटीबॉडी (प्रारंभिक एकाग्रता 86 μg / mL) का उपयोग किया जाता है। अभिकर्मकों को निम्नलिखित क्रम में जोड़ें: i) एंटीबॉडी; ii) एएलआर; iii) टीएसएम माध्यम। पाइपटिंग द्वारा मिलाएं। - टीएसएम माध्यम (या पसंद की सेल लाइन के लिए उपयुक्त सेल ग्रोथ मीडिया) में पृष्ठभूमि शमन अभिकर्मक (बीएसआर) को 1.5 एमएम (3 एक्स) पर पतला करें ताकि परख के अंत में 0.5 एमएम की अंतिम एकाग्रता प्राप्त हो सके।
- आक्रमण परख को सीधे यूएलए 96-वेल राउंड-बॉटम प्लेट में निष्पादित करें जहां कोशिकाओं को शुरू में बीज दिया गया था। शुरू करने से पहले एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एनएस को नेत्रहीन रूप से जांचें।
- धीरे से और धीरे-धीरे माध्यम के 75 μL / कुएं को हटा दें, कुएं के तल को छूने से बचें जहां एनएस बैठता है। एनएस की उपस्थिति की दृष्टि से जाँच करें।
- धीरे से प्रत्येक कुएं में बीएसआर के 25 μL जोड़ें।
- धीरे से प्रत्येक कुएं में एएलआर / एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स के 25 μL जोड़ें। एएलआर / एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स को माध्यम के साथ मिश्रण करने के लिए 2 या 3 मिनट प्रतीक्षा करें।
- यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रत्येक एनएस कुएं के तल पर केंद्रीय रूप से स्थित है, एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके नेत्रहीन जांच ें। बुलबुले के गठन से बचें। यदि कोई बुलबुला मौजूद है, तो सुई का उपयोग करके इसे हटा दें।
- प्लेट को बर्फ पर रखें और प्लेट के निचले हिस्से को ठंडा होने देने के लिए 5 मिनट प्रतीक्षा करें।
- प्री-कूल्ड पी 200 टिप के साथ, बेसल मेम्ब्रेन मैट्रिक्स (बीएमएम) के 75 μL / कुएं को वितरित करें, पिपेट टिप को कुएं की आंतरिक दीवार पर रखें और कुएं के तल को छूने से बचें। बुलबुले के गठन से बचें और मौजूदा सुई से बाँझ सुई से हटा दें।
नोट: सुनिश्चित करें कि बीएमएम को रात पहले से 4 डिग्री सेल्सियस पर पिघलाया गया है। - बीएमएम को माध्यम के साथ मिश्रण करने देने के लिए प्लेट को 5 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़ दें। एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एनएस की उपस्थिति की जांच करें और यह कि वे कुएं में केंद्रीय रूप से स्थित हैं। यदि नहीं, तो प्लेट को 5 मिनट के लिए 180 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
- प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, 95% आर्द्रता पर इनक्यूबेटर के भीतर रखे गए लाइव-सेल विश्लेषण उपकरण (सामग्री की तालिका) में स्थानांतरित करें।
एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स की तैयारी और माइग्रेशन परख के लिए सेटअप।
नोट: एंटीबॉडी लेबलिंग प्रक्रिया के लिए, लाइव-सेल इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के लिए लेबलिंग डाई प्रोटोकॉल10 का उपयोग किया जाता है।
- प्रत्येक अभिकर्मक के लिए आवश्यक मात्रा का विश्लेषण और गणना करने के लिए कुओं की संख्या पर विचार करें। नकारात्मक नियंत्रण के लिए आवश्यक कुओं को भी शामिल करें। शुरू करने से पहले एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एनएस को नेत्रहीन रूप से जांचें।
- फ्लैट-बॉटम 96-वेल प्लेटों का उपयोग करें। विंची एट अल, 201314 द्वारा वर्णित कोटिंग प्रक्रिया करें। इस अध्ययन के लिए, बीएमएम का उपयोग पतली कोटिंग के रूप में किया जाता है।
- एक बार कोटिंग तैयार हो जाने के बाद, पी 200 टिप के साथ बीएमएम कोटिंग की अधिकता को कुएं के किनारे में रखें और नीचे को छूने से बचें। यदि कई कुओं के साथ काम कर रहे हैं, तो मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें।
- एक पी 200 टिप काटें, प्रत्येक चयनित कुएं से सेल माध्यम + एनएस का 50 μL लें, और इसे एक लेपित फ्लैट तल कुएं में स्थानांतरित करें। प्रत्येक कुएं में एनएस की उपस्थिति और स्थिति की जांच करें।
नोट: प्रत्येक एनएस कुएं में केंद्रीय रूप से स्थित होना चाहिए। स्थानांतरण के दौरान कुएं के किनारे पर नोक पर झुकने से बचें, लेकिन नीचे को छूने के बिना माध्यम को कुएं में केंद्रीय रूप से गिरा दें। अत्यधिक प्रवासी कोशिकाओं के लिए, मानक तीन प्रतिकृतियों की तुलना में अधिक संख्या में प्रतिकृति पर विचार करें। ऐसा इसलिए है क्योंकि जब एनएस कुएं के किनारे के बहुत करीब बैठता है, तो माइग्रेटिंग कोशिकाएं कुएं के एक छोटे से क्षेत्र को कवर कर सकती हैं। - ऊपर वर्णित एएलआर को पुन: हाइड्रेट करें (चरण 2.2-2.3)।
नोट: अभिकर्मक प्रकाश संवेदनशील है। अच्छी हैंडलिंग प्रक्रियाओं के लिए ऊपर देखें। - एंटीबॉडी को एएलआर के साथ उपयुक्त पूर्ण सेल ग्रोथ मीडिया में एक गोल तल मल्टी-वेल प्लेट में या एम्बर ट्यूब में मिलाएं और प्रकाश से बचाएं। 3x अंतिम परख एकाग्रता पर 50 μL / अच्छी तरह से वितरित करने के लिए पर्याप्त मात्रा तैयार करें। 15 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
नोट: ऊपर दिए गए क्रम में अभिकर्मकों को जोड़ें (चरण 2.4)। - चरण 2.5 में रिपोर्ट की गई समान प्रक्रिया का पालन करें।
- धीरे से प्रत्येक कुएं में बीएसआर के 50 μL जोड़ें।
- धीरे से प्रत्येक कुएं में एएलआर / एंटीबॉडी के 50 μL जोड़ें। अभिकर्मकों को मिश्रण करने के लिए 2 या 3 मिनट प्रतीक्षा करें और एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके नेत्रहीन जांच करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि अधिकांश प्रतिकृति एनएस कुएं में केंद्रीय रूप से स्थित हैं।
- बुलबुले के गठन से बचें और सुई का उपयोग करके किसी भी मौजूदा को हटा दें। इनक्यूबेटर के भीतर 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, 95% आर्द्रता पर रखे गए लाइव-सेल विश्लेषण उपकरण में प्लेट को धीरे से स्थानांतरित करें।
4. छवि अधिग्रहण के लिए लाइव-सेल विश्लेषण उपकरण सेटिंग
- चरण 2.14 के बाद क्रमशः आक्रमण और माइग्रेशन परख के समय बिंदु शून्य (टी0) से शुरू होने वाले स्कैनिंग अंतराल के साथ लाइव-सेल विश्लेषण उपकरण (विनिर्देशों के लिए, सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके प्लेटों को स्कैन करें। और 3.10. 96 घंटे तक।
नोट: आक्रमण और माइग्रेशन परख की शुरुआत के तुरंत बाद लाइव-सेल विश्लेषण उपकरण का निपटान करने में सक्षम होना सुनिश्चित करें। ट्यूमर प्रकार के आधार पर, कोशिकाएं परख सेटअप से 1 घंटे के भीतर पहले से ही एनएस से आक्रमण या पलायन करना शुरू कर सकती हैं। - लाइव-सेल विश्लेषण उपकरण सॉफ़्टवेयर पर, प्राप्त करने के लिए अनुसूची विकल्प का चयन करें। + टैब पर क्लिक करें और शेड्यूल पर स्कैन विकल्प का चयन करें।
- सॉफ़्टवेयर विंडो पर पोत बनाएँ या पुनर्स्थापित करें, नया विकल्प पर क्लिक करें.
- आक्रमण और माइग्रेशन अधिग्रहण के लिए लाइव-सेल विश्लेषण उपकरण में विशिष्ट अनुप्रयोग का चयन करें। आक्रमण परख के लिए स्फेरॉइड स्कैन प्रकार, 4x उद्देश्य, चरण + ब्राइटफील्ड और ग्रीन छवि चैनल का चयन करें। माइग्रेशन परख के लिए कमजोर क्लोनिंग स्कैन प्रकार, 4x उद्देश्य और चरण और हरे रंग का चयन करें।
- प्लेट प्रकार का चयन करें और प्लेट मानचित्र पर उन्हें उजागर करके स्कैन किए जाने वाले कुओं को परिभाषित करें।
- स्कैनिंग आवृत्ति सेट अप करें (इस प्रोटोकॉल में प्रयोगों के लिए स्कैनिंग आवृत्ति आक्रमण के लिए 15 मिनट और माइग्रेशन के लिए 30 मिनट थी)।
- शेड्यूल में जोड़ें पर क्लिक करें और स्कैन शुरू करें।
5. छवि विश्लेषण के लिए लाइव-सेल विश्लेषण उपकरण सेटिंग
- नई विश्लेषण परिभाषा बनाएँ टैब का चयन करें.
- टैब पर क्रमशः आक्रमण और माइग्रेशन के लिए स्फेरॉइड इनवेसियोएन या बेसिक एनालाइज़र एप्लिकेशन का चयन करें।
- छवि चैनल में आक्रमण और माइग्रेशन उपयुक्त चैनलों (आक्रमण के लिए: चरण + ब्राइटफील्ड-ग्रीन; माइग्रेशन के लिए: फेज-ग्रीन) का चयन करें।
- विश्लेषण सेटिंग का पूर्वावलोकन और परिष्करण करने के लिए 3-4 कुओं से कुछ प्रतिनिधि छवियों का चयन करें।
- आक्रमण परख के लिए, विश्लेषण परिभाषा टैब में, पूरे स्फेरॉइड और हमलावर कोशिकाओं के बीच एक सटीक विभाजन उत्पन्न करने के लिए निम्नलिखित सेटिंग के साथ ब्राइटफील्ड और ग्रीन चैनलों में एप्लिकेशन सेटिंग्स को समायोजित करें ( चित्रा 5; नीला मास्क देखें):
ब्राइटफील्ड विभाजन: संपूर्ण स्फेरॉइड संवेदनशीलता = 50; हमलावर सेल संवेदनशीलता = 100; क्लीन अप = डिफ़ॉल्ट।
संपूर्ण स्फेरॉइड फ़िल्टर: सभी पैरामीटर डिफ़ॉल्ट के रूप में सेट करें।
हमलावर कक्ष फ़िल्टर: सभी पैरामीटर डिफ़ॉल्ट रूप से सेट करें.
ग्रीन विभाजन: त्रिज्या = 900। - माइग्रेशन परख के लिए, निम्नलिखित सेटिंग के साथ संगम और हरी कोशिकाओं (चित्रा 5, पीले और गुलाबी मास्क देखें) के बीच एक सटीक विभाजन उत्पन्न करने के लिए चरण और हरे चैनलों में एप्लिकेशन सेटिंग्स को समायोजित करें:
चरण: सभी पैरामीटर डिफ़ॉल्ट के रूप में सेट करें।
ग्रीन विभाजन: त्रिज्या = 300; सीमा = 1000
सफाई: छेद भरना = 400; फ़िल्टर = डिफ़ॉल्ट.
पूरी तरह से ठीक है: सभी पैरामीटर डिफ़ॉल्ट के रूप में सेट करें। - कई कुओं पर यादृच्छिक रूप से क्लिक करके जांचें कि विश्लेषण सेटिंग्स एनएस के लिए सही हैं। विभाजन को स्फेरॉइड को रेखांकित करना चाहिए। यदि नहीं, तो तदनुसार सेटिंग समायोजित करें।
- विश्लेषण करने के लिए कुओं और समय बिंदुओं का चयन करें।
- विश्लेषण परिभाषा सहेजें और समाप्त करें पर क्लिक करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
आक्रमण और माइग्रेशन के लिए लाइव-3 डी-सेल इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल को चित्रा 1 में एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य वर्कफ़्लो में संक्षेपित किया गया है। यूएलए 96-अच्छी तरह से गोल-नीचे प्लेटों में डीएमजी कोशिकाओं को सीडिंग करके, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य आकार के एनएस प्राप्त किए जाते हैं और प्रदर्शित चरणों में उपयोग किए जाते हैं। जब एनएस ~ 300 μm (लगभग 4 दिन बाद सीडिंग) के आदर्श आकार तक पहुंच जाता है, तो आक्रमण12 और माइग्रेशन14 परख शुरू किए जाते हैं। एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स के अलावा, व्यक्तिगत एनएस के माध्यम में पृष्ठभूमि शमनकर्ता के साथ, कोशिका झिल्ली पर विशिष्ट मार्कर अभिव्यक्ति का पालन करने की अनुमति देता है, लाइव इमेजिंग में और समय के साथ। सेल आक्रमण और माइग्रेशन के दौरान सतह मार्कर अभिव्यक्ति को लाइव-सेल विश्लेषण उपकरण का उपयोग करके टी = 0 से 96 घंटे तक के अंतराल पर आसानी से निगरानी की जाती है। यह इमेजिंग सिस्टम पूरी तरह से स्वचालित छवि विश्लेषण की अनुमति देता है।
एक प्राथमिक रोगी-व्युत्पन्न सेल लाइन, क्यूसीटीबी-आर 059, का उपयोग बाल चिकित्सा डीएमजी ट्यूमर प्रसार के आक्रमण और प्रवासन का उदाहरण देने के लिए किया गया था। क्यूसीटीबी-आर 059 को मूल रूप से एक बाल चिकित्सा थैलेमिक ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) सेल लाइन15 के रूप में इंगित किया गया था। बाद में, इसे H3-K27M थैलेमिक ग्लियोमा सेल लाइन 16 या डिफ्यूज मिडलाइन ग्लियोमा (DMG) H3-K27M सेल लाइन11 के रूप में इंगित किया गया है, जो 2016 के विश्व स्वास्थ्य संगठन के ब्रेन ट्यूमर के वर्गीकरण के बाद DMG H3F3A K27M-उत्परिवर्ती को एक नई इकाई17 के रूप में पेश करता है।
सीडी 44, एक आसंजन अणु जिसे सेल माइग्रेशन और आक्रमण में शामिल होने के लिए जाना जाता है, की जांच की गई थी। सीडी 44 को क्यूसीटीबी-आर 059 कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किया जाता है जैसा कि 3 डी सेल माइग्रेशन (चित्रा 2) पर इम्यूनोफ्लोरोसेंट (आईएफ) धुंधला होने और (चित्रा 3) बीएमएम में आक्रमण की कॉन्फोकल छवियों द्वारा प्रदर्शित किया गया है।
इस बात को ध्यान में रखते हुए कि 3 डी आक्रमण और माइग्रेशन दोनों गैर-स्थैतिक प्रक्रियाएं हैं, हमने समय के साथ सीडी 44 की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए सोचा जब कोशिकाएं आंदोलन में होती हैं। ऐसा करने के लिए हमने लाइव-सेल इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री परख को नियोजित किया और 3 डी परख के लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया। एंटी-सीडी 44 एंटीबॉडी के साथ कॉम्प्लेक्स में एएलआर का उपयोग करके, हम वास्तविक समय में सीडी 44 की अभिव्यक्ति का पालन करने में सक्षम हैं जब प्रोटीन कोशिका झिल्ली पर व्यक्त किया जाता है, जबकि कोशिकाएं न्यूरोस्फीयर से बचती हैं और बीएमएम पर और उसमें फैलती हैं।
लाइव-3 डी-सेल इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री सीडी 44 अभिव्यक्ति (पूरक वीडियो 1 और पूरक वीडियो 2) को विज़ुअलाइज़ करने की अनुमति देता है। माइग्रेशन और आक्रमण दोनों के लिए टाइम-लैप्स के प्रतिनिधि फ्रेम (चित्रा 4 ए, बी), कोशिका झिल्ली पर सीडी 44 की आंतरायिक अभिव्यक्ति को अधिक विस्तार से दिखाते हैं। विशेष रूप से, समय के साथ देखे गए एक ही सेल पर हरे फ्लोरोसेंट सिग्नल को चालू (ग्रीन सर्कल) और फिर ऑफ (ब्लैक सर्कल) देखना संभव है, यह सुझाव देते हुए कि सीडी 44 की अभिव्यक्ति चालू और बंद है, जबकि कोशिकाएं पलायन कर रही हैं और आक्रमण कर रही हैं।
माइग्रेशन और आक्रमण प्रक्रियाओं का पालन 96 घंटे से अधिक किया जाता है, और जैसा कि चित्रा 5 में दिखाया गया है, क्यूसीटीबी-आर 059 कोशिकाएं सीडी 44 का एक उच्च स्तर दिखाती हैं, यह दर्शाता है कि कुल मिलाकर लाइव-सेल इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के साथ देखी गई अभिव्यक्ति आईएफ द्वारा प्राप्त सीडी 44 की अभिव्यक्ति के अनुरूप है जो चित्रा 2 और चित्रा 3 में कॉन्फोकल छवियों पर दिखाया गया है। दिलचस्प बात यह है कि, हमने यह भी देखा कि जब एंटी-सीडी 44 एंटीबॉडी का उपयोग जीवित कोशिकाओं पर किया जाता है, तो यह कोशिका आकृति विज्ञान को प्रभावित करता है, जिससे मेसेनकाइमल जैसे से अमीबॉइड जैसे आक्रमण में संक्रमण होता है। यह इन कोशिकाओं की आक्रामक और प्रवासी क्षमता में कमी लाता है (पूरक चित्र 1)। हालांकि, हम इस बात से इनकार नहीं कर सकते हैं कि सेल माइग्रेशन और आक्रमण में कमी भी सेल प्रसार के निषेध के कारण है।
लाइव-सेल विश्लेषण उपकरण पर किए गए स्वचालित छवि विश्लेषण सीडी 44 अभिव्यक्ति की मात्रा और समय के साथ इसकी वृद्धि को दर्शाता है, जिसे माइग्रेशन और आक्रमण दोनों के लिए एएलआर (चित्रा 5 बी, सी) से जुड़े समग्र हरे फ्लोरोसेंट सिग्नल द्वारा मापा जाता है। परिमाणीकरण चित्र 5 बी और चित्रा 5 सी में उदाहरण के रूप में प्राप्त किया जाता है, जिसमें स्वचालित छवि विश्लेषण सीडी 44 ग्रीन-माइग्रेटेड कोशिकाओं (चित्रा 4 बी) द्वारा कवर किए गए सभी क्षेत्र और सीडी 44 ग्रीन-आक्रमण वाली कोशिकाओं द्वारा कवर किए गए सभी प्रसार क्षेत्र को विभाजित करने के लिए सेट किया गया है, लेकिन न्यूरोस्फीयर कोर (चित्रा 5 सी) को छोड़कर।
चित्रा 1: लाइव-3 डी-सेल इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री परख का योजनाबद्ध वर्कफ़्लो। वर्कफ़्लो 3 डी आक्रमण और माइग्रेशन लाइव इमेजिंग विधियों में शामिल चरणों को दर्शाता है, जिसमें (शीर्ष पैनल; टी = 96 एच) में आक्रमण के बाद बाल चिकित्सा प्राथमिक डीएमजी रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं (क्यूसीटीबी-आर 059) की प्रतिनिधि छवियां और (नीचे पैनल; टी = 96 एच) बीएमएम पर माइग्रेशन शामिल हैं। सलाखों = 800 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: 3 डी ट्यूमर सेल माइग्रेशन में सीडी 44 अभिव्यक्ति। बीएमएम पर माइग्रेशन पर प्राथमिक डीएमजी रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं (क्यूसीटीबी-आर 059) में सीडी 44 अभिव्यक्ति की प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरोसेंट कॉन्फोकल छवियां। टाइमपॉइंट = 96 घंटे (लाल: सीडी 44; नीला: नाभिक)। स्केल बार: 500 μm (ऊपरी पैनल) और 200 μm (निचला पैनल)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: 3 डी ट्यूमर सेल आक्रमण में सीडी 44 अभिव्यक्ति। बीएमएम में आक्रमण पर प्राथमिक डीएमजी रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं (क्यूसीटीबी-आर 059) में सीडी 44 अभिव्यक्ति की प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरोसेंट कॉन्फोकल छवियां। समय बिंदु = 96 घंटे (लाल: सीडी 44; नीला: नाभिक)। स्केल बार: 250 μm (ऊपरी पैनल) और 100 μm (निचला पैनल)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: समय के साथ सीडी 44 अभिव्यक्ति। QCTB-R059 माइग्रेशन (A) और आक्रमण (B) टाइम-लैप्स के चयनित फ़्रेम. लाइव-सेल इमेजिंग उपकरण पर चित्र प्राप्त किए गए थे। ग्रीन सर्कल सीडी 44 की अभिव्यक्ति को इंगित करता है, काला सर्कल समय के साथ देखे गए एक ही सेल की कोशिका झिल्ली पर कोई सीडी 44 अभिव्यक्ति नहीं दर्शाता है। स्केल बार: 200 μm (A) और 100 μm (B)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: सीडी 44 के लिए लाइव-3 डी-सेल इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री परख: प्रवासन और आक्रमण। (ए) प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड, फ्लोरोसेंट (एंटी-सीडी 44 एंटीबॉडी के साथ एएलआर), और क्यूसीटीबी-आर 059 सेल इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री माइग्रेशन, और आक्रमण (96 एच) की विलय छवियां दिखाई गई हैं। स्केल बार: 400 μm. (B) लाइव-सेल इमेजिंग उपकरण पर ALR-एंटी-CD44 छवि विश्लेषण द्वारा निर्धारित माइग्रेशन (B) और आक्रमण (C) के लिए अपेक्षाकृत CD44 समग्र अभिव्यक्ति का परिमाणीकरण। वक्र समय के साथ सीडी 44 अभिव्यक्ति की ग्रीन मीन तीव्रता दिखाते हैं। मान SD ± मतलब हैं। भूखंडों में दो छोटे आंकड़े माइग्रेशन (बी) के विश्लेषण के लिए लागू विभाजन को प्रदर्शित करते हैं जहां सभी क्षेत्र पर विचार किया गया था और आक्रमण (सी) जिसके लिए एनएस कोर भाग को बाहर रखा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक चित्र 1: सेल आकृति विज्ञान और सेल गतिशीलता की डिग्री पर एंटी-सीडी 44 एंटीबॉडी का प्रभाव। क्यूसीटीबी-आर 059 आक्रमण और माइग्रेशन परख की प्रतिनिधि छवियां लाइव-3 डी-सेल इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटी-सीडी 44 एंटीबॉडी के प्रभाव को दिखाती हैं। कोशिकाएं कम आक्रमण और प्रवासन क्षमता के साथ-साथ नकारात्मक नियंत्रण (एंटी-सीडी 44 एंटीबॉडी के बिना) और सीडी 44 (प्लस एंटी-सीडी 44 एंटीबॉडी) के बीच अधिक मेसेनकाइमल जैसे से अमीबॉइड जैसे आक्रमण पैटर्न में संक्रमण प्रदर्शित करती हैं। निचला पैनल उच्च शक्ति आवर्धन दिखाता है जो अनुपस्थिति में कोशिकाओं की रूपात्मक उपस्थिति और एंटी-सीडी 44 एंटीबॉडी (सफेद तीर) की उपस्थिति पर अधिक स्पष्ट दृश्य प्रदर्शित करता है। स्केल बार: 800 μm ऊपरी पैनल और 100 μm निचला पैनल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक वीडियो 1: एंटी-सीडी 44 एंटीबॉडी की उपस्थिति में बीएमएम पर क्यूसीटीबी-आर 059 3 डी सेल माइग्रेशन का टाइम-लैप्स वीडियो। फ्लोरोसेंट ग्रीन सिग्नल, कोशिका झिल्ली पर सीडी 44 की अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करता है, एएलआर के साथ एंटी-सीडी 44 एंटीबॉडी के संयुग्मन द्वारा समय के साथ कल्पना की जाती है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
पूरक वीडियो 2: एंटी-सीडी 44 एंटीबॉडी की उपस्थिति में बीएमएम में क्यूसीटीबी-आर 059 3 डी सेल आक्रमण का टाइम-लैप्स वीडियो। फ्लोरोसेंट ग्रीन सिग्नल, कोशिका झिल्ली पर सीडी 44 की अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करता है, एएलआर के साथ एंटी-सीडी 44 एंटीबॉडी के संयुग्मन द्वारा समय के साथ कल्पना की जाती है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
लाइव-3 डी-सेल इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री जिसे हमने बाल चिकित्सा डीएमजी आक्रमण और प्रवास के लिए यहां अपनाया है, उसे आसानी से स्तन और कोलन कैंसर सेल लाइनों सहित अन्य अत्यधिक आक्रामक ट्यूमर सेल प्रकारों के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है।
पहले किए गए लाइव-2 डी-सेल इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री परख10 से अलग, 3 डी में काम करते समय, कुछ महत्वपूर्ण चरणों पर ध्यान देने का सुझाव दिया जाता है। विशेष रूप से, हमारे द्वारा वर्णित आक्रमण परख के लिए, यह सलाह दी जाती है कि बीएमएम को जोड़ने से पहले, प्रत्येक कुएं में एनएस के साथ सीधे माध्यम में एएलआर / एंटीबॉडी मिश्रण जोड़ें, न कि बीएमएम में या बीएमएम के शीर्ष पर। यह माध्यम के साथ अभिकर्मकों के अच्छे मिश्रण की अनुमति देना है और सेल की सतह पर अभिकर्मकों की अधिक प्रत्यक्ष पहुंच सुनिश्चित करना है। इसके अलावा, इमेजिंग की बेहतर गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए, हालांकि प्रोटोकॉल में बीएसआर का उपयोग शामिल है, हम फिनोल लाल-मुक्त माध्यम और बीएमएम का उपयोग करने की सलाह देते हैं।
लाइव-सेल इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के लिए विचार करने के लिए एक और बिंदु यह है कि जीवित कोशिकाओं पर एक बाह्य झिल्ली प्रोटीन को बांधने वाला कोई भी एंटीबॉडी इसकी रचना को बदलकर या आसन्न कोशिका पर एक लिगैंड या प्रोटीन की बाध्यकारी साइट पर कब्जा करके प्रोटीन फ़ंक्शन को प्रभावित कर सकता है, इसलिए "ब्लॉकिंग एजेंट" के रूप में कार्य कर सकता है। हालांकि यह दृष्टिकोण चिकित्सीय रणनीति19 के रूप में उपयोगी हो सकता है, यह किसी भी प्रयोगात्मक सेटअप का प्राथमिक लक्ष्य नहीं हो सकता है। इसलिए, प्रयोगों के एक बड़े सेट को करने से पहले, एक ही प्रोटीन के अलग-अलग एपिटोप्स को बांधने वाले विभिन्न एंटीबॉडी का परीक्षण किसी भी संभावित "अवरुद्ध" प्रभाव को सत्यापित करने के लिए किया जाना चाहिए। इस अध्ययन में, हमने 3 डी आक्रमण और प्रवासन में अत्यधिक आक्रामक बाल चिकित्सा डीएमजी सेल लाइन की कोशिका झिल्ली पर सीडी 44 की अभिव्यक्ति का वास्तविक समय में पालन करने के लिए एक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग किया। उपयोग किए गए प्रोटोकॉल ने हमें आक्रमण और पलायन करने वाली कोशिकाओं पर समय के साथ सीडी 44 की अभिव्यक्ति को मात्रात्मक रूप से मापने की अनुमति दी। दिलचस्प बात यह है कि एंटी-सीडी 44 एंटीबॉडी की उपस्थिति में, हमने एएलआर के साथ कोशिकाओं की तुलना में सेल गतिशीलता में कमी भी देखी लेकिन एंटीबॉडी की अनुपस्थिति में। हम सेल प्रसार पर निरोधात्मक प्रभाव के बावजूद बाहर नहीं कर सकते हैं। एंटी-सीडी 44 एंटीबॉडी की उपस्थिति में मेसेनकाइमल जैसे से अमीबॉइड जैसी कोशिका आकृति विज्ञान20 में स्विच के साथ एक अलग आक्रमण पैटर्न का अधिग्रहण भी देखा गया था। इन अप्रत्याशित परिणामों से पता चलता है कि सीडी 44 को अवरुद्ध करने से बाल चिकित्सा डीएमजी में मेसेनकाइमल से अमीबॉइड संक्रमण में योगदान हो सकता है।
इस प्रोटोकॉल की सीमाओं के संबंध में, इनक्यूसाइट लाइव-सेल एनालिसिस इंस्ट्रूमेंट के सीसीडी कैमरे के रिज़ॉल्यूशन और इसकी सीमित जेड-स्टैक क्षमता को ध्यान में रखते हुए, लाइव-3 डी-सेल इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री परख के लिए हम जो सेटअप प्रस्तुत करते हैं, उसका उपयोग प्रारंभिक दृष्टिकोण के रूप में किया जा सकता है, बड़े पैमाने पर मल्टी-वेल प्रारूप पर, अधिक शक्तिशाली फ्लोरोसेंट इमेजिंग सिस्टम (जैसे, कोन्फोकल माइक्रोस्कोप और उच्च-सामग्री इमेजिंग सिस्टम जैसे कि ऑपेरेटा सीएलएस या ओपेरा फोनिक्स) या रिपोर्टर परख21 के माध्यम से सतह प्रोटीन की अभिव्यक्ति का वास्तविक समय में अध्ययन करने के लिए एक अधिक परिष्कृत दृष्टिकोण।
लाइव-3 डी-सेल इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री का एक व्यापक अनुप्रयोग यहां एक मोनोकल्चर के रूप में प्रस्तुत किया गया है, जो वास्तविक समय के प्रत्यक्ष सेल-सेल इंटरैक्शन में छवि और विश्लेषण करने के लिए स्थापित 3 डी सह-संस्कृति परख हो सकता है। इस मामले में, दो अलग-अलग एएलआर का उपयोग विभिन्न फ्लोरोफोरे के साथ किया जा सकता है ताकि विशेष रूप से विभिन्न सेल प्रकारों (जैसे, ट्यूमर सेल और प्रतिरक्षा कोशिकाओं) पर कोशिका झिल्ली पर व्यक्त प्रोटीन को बांधा जा सके। इस मामले में, दो अलग-अलग एएलआर / एंटीबॉडी परिसरों के सह-स्थानीयकरण द्वारा लाइव इमेजिंग के साथ प्रत्यक्ष सेल-सेल संपर्क का विश्लेषण किया जा सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के पास पांडुलिपि में चर्चा की गई विषय वस्तु या सामग्री के साथ वित्तीय हित या वित्तीय संघर्ष के साथ किसी भी संगठन या इकाई के साथ कोई प्रासंगिक संबद्धता या वित्तीय भागीदारी नहीं है।
Acknowledgments
हम इमेजिंग प्रोटोकॉल के प्रारंभिक सेट अप में इनक्यूसाइट एस 3 लाइव सेल इमेजिंग सिस्टम तक पहुंच के लिए डॉ सिल्विया सोड्डू और डॉ गिलिया फेडेरिकी (सेलुलर नेटवर्क और आणविक चिकित्सीय लक्ष्यों की इकाई, आईआरसीसीएस-रेजिना एलेना नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट, रोम, इटली) को धन्यवाद देना चाहते हैं। इसके अलावा, हम तकनीकी सलाह के लिए बर्नाडेट कोलोज़स्वरी को धन्यवाद देते हैं। अध्ययन को चिल्ड्रन विद कैंसर यूके ग्रांट (16-234) और इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय रिसर्का कोरेंट द्वारा समर्थित किया गया था। एम विंची एक चिल्ड्रन विद कैंसर यूके फेलो हैं। आर फेरेटी फोंडाज़ियोन वेरोनेसी फैलोशिप (2018 और 2019) के प्राप्तकर्ता हैं। लेखक ों ने अपने समर्थन के लिए फोंडाज़िओन हील और क्वींसलैंड चिल्ड्रन ट्यूमर बैंक के वित्तपोषण के लिए चिल्ड्रन हॉस्पिटल फाउंडेशन को स्वीकार किया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well TC-Treated Microplates | Corning | 3595 | size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution for neurosphere dissociation |
| Burker chamber | Mv medical | FFL16034 | cell counting chamber |
| CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
| Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye | Incucyte | 4743 | Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry |
| Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | - | The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays. |
| Inverted Microscope | - | any inverted microscope | |
| Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
| Tumor stem cell (TSM) medium | - | - | growth cell medium (see reference in the text for details) |
| Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, round bottom clear |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
- Magrì, A., Bardelli, A. Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).
- Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
- Caretti, V., et al. Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma. Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).
- Pericoli, G., et al. Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763 (2020).
- Vinci, M., et al. Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells. Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).
- Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies. Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).
- Huang, C. C., et al. Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells. PLoS One. 10 (6), 0128045 (2015).
- Prudner, B. C., et al. Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors. Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).
- Ferretti, R., et al. Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction. Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
- Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 64 (2018).
- Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).
- Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).
- Mount, C. W., et al. Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M. Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Czabanka, M., et al. Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209 (2020).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Panková, K., Rösel, D., Novotný, M., Brábek, J. The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
