Summary
Denna studie presenterar ett protokoll för levande 3D-cellimmunocytokemi applicerat på en pediatrisk diffus gliomcellinje, användbar för att studera i realtid uttrycket av proteiner på plasmamembranet under dynamiska processer som 3D-cellinvasion och migration.
Abstract
Cellmigration och invasion är specifika kännetecken för diffusa mittlinjegliom (DMG) H3K27M-mutanta tumörer. Vi har redan modellerat dessa funktioner med hjälp av tredimensionella (3D) cellbaserade invasions- och migrationsanalyser. I denna studie har vi optimerat dessa 3D-analyser för levande cellimmunocytokemi. Ett antikroppsmärkningsreagens användes för att i realtid detektera uttrycket av vidhäftningsmolekylen CD44, på plasmamembranet hos migrerande och invaderande celler i en DMG H3K27M primär patient-härledd cellinje. CD44 är associerat med cancerstamcellsfenotyp och tumörcellsmigration och invasion och är involverat i de direkta interaktionerna med den extracellulära matrisen i centrala nervsystemet (CNS). Neurosfärer (NS) från DMG H3K27M-cellinjen inbäddades i basalmembranmatrisen (BMM) eller placerades på ett tunt beläggningsskikt av BMM, i närvaro av en anti-CD44-antikropp i kombination med antikroppsmärkningsreagenset (ALR). Den levande 3D-cellimmunocytokemiska bildanalysen utfördes på ett levande cellanalysinstrument för att kvantitativt mäta det övergripande CD44-uttrycket, särskilt på de migrerande och invaderande cellerna. Metoden gör det också möjligt att i realtid visualisera det intermittenta uttrycket av CD44 på plasmamembranet hos migrerande och invaderande celler. Dessutom gav analysen också nya insikter om CD44: s potentiella roll i mesenkymal till amoeboidövergång i DMG H3K27M-celler.
Introduction
Tumörcellernas förmåga att undvika och sprida sig genom den omgivande vävnaden är ett kännetecken för cancer1. I synnerhet är tumörcellmotilitet ett karakteristiskt drag hos maligna tumörer, oavsett om det är en metastatisk tumörtyp såsom bröst2 eller kolorektal cancer3 eller en lokalt invasiv typ såsom diffust gliom 4,5.
Avbildning har en central roll i undersökningen av många aspekter av tumörcellfenotyper; Levande cellavbildning är dock definitivt att föredra när man studerar dynamiska cellulära processer som migration och invasion, när förändringar i morfologi och cell-cellinteraktion 6,7 inträffar och lättare kan undersökas över tiden. För levande cellavbildning kan olika optiska mikroskopisystem användas, från faskontrast till konfokala fluorescerande mikroskop, och bildinsamling utförs under en kort eller lång tidsperiod på ett inverterat mikroskop utrustat med en kammare för temperatur och CO2-kontroll, eller i höginnehållsbildanalyssystem som har inbyggda kammare, eller alternativt i bildsystem som kan sitta i inkubatorn utan att behöva störa cellerna under hela tiden av experimentet. Valet av vilket system som används bestäms ofta av ett antal faktorer såsom den upplösning som behövs, längden på den totala förvärvstiden och tidsintervallen, fartygstyp som används och analysens genomströmning (enkammare eller flerbrunnsplatta), känsligheten hos de celler som används (värdefulla och/eller sällsynta celler) och cellernas fototoxicitet om fluoroforer förekommer.
När det gäller fluorescerande avbildning i live-läge kan detta uppnås genom att transducera celler för uttryck av fluorescerande proteiner antingen för stabilt uttryck eller som ett inducerbart system8, genom övergående celltransfektion eller genom att använda cellfärgämnen som nu är tillgängliga för märkning av levande celler7, för spårning av levande celler samt för märkning av subcellulära organeller9.
Ett användbart tillvägagångssätt har nyligen utvecklats för levande cellimmunocytokemi, där en antikropp som känner igen en valfri ytmarkör kan bindas till ett märkningsreagens, och vid tillägg till odlingsmediet kan celler som uttrycker den specifika markören lätt avbildas i realtid genom levande cellavbildning. Visualisering och kvantifiering av marköruttryck med hjälp av ett sådant system kan enkelt uppnås när celler odlas i tvådimensionella (2D) odlingsförhållanden10.
I denna studie optimerade vi protokoll för invasion av levande 3D-cellsimmunocytokemi och migration av pediatriska diffusa midlinegliom (DMG) patienthärledda celler11,12. DMG är mycket aggressiva hjärntumörer som drabbar barn, för de allra flesta associerade med drivarmutationen K27M i histon H3-varianter. DMG uppstår i hjärnstammen och mittlinjeregionerna i centrala nervsystemet (CNS) och kännetecknas av en mycket infiltrativ natur. Denna invasiva kapacitet har visat sig åtminstone delvis medieras av intratumor heterogenitet och cancerstamliknande egenskaper hos DMG-celler7.
För att exemplifiera våra analyser användes ett antikroppsmärkningsreagens (ALR) i kombination med en antikropp för CD44. CD44 är en transmembranglykoprotein och adhesionsmolekyl uttryckt på stamceller och andra celltyper, associerad med cancerstamcellsfenotyp och tumörcellmigration och invasion13. Protokollen inkluderar provberedning, bildförvärv i ljusfält och fluorescerande läge och analysen på ett levande cellanalysinstrument som gjorde det möjligt att kvantitativt mäta i realtid det övergripande CD44-uttrycket på DMG-cellmembranet under 3D-invasion och migration. Analyserna möjliggjorde också möjligheten att visualisera den intermittenta fluorescerande signalen från CD44 på enskilda celler under migrering och invasion. Intressant nog observerades också en effekt av anti-CD44-antikroppen, som potentiellt fungerade som en blockerande antikropp, tycktes också minska cellmigration och invasion samt inducera en förändring av invasionsmönstret från en kollektiv mesenkymalliknande till en mer encellig amoeboidliknande fenotyp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll följer riktlinjerna från institutionernas etiska kommittéer för humanforskning.
OBS: Denna studie utfördes med Incucyte S3 och / eller SX5 Live-Cell Analysis Instrument (refererad som levande cellanalysinstrument).
1. Generering av reproducerbara tumörsfäroider
OBS: Protokollet (avsnitt 1) som beskrivs av Vinci et al. 2015 7,12, användes enligt nedan, med vissa ändringar:
- Samla upp DMG H3K27M-mutanta neurosfärer (NS) och centrifugera vid 170 x g i 10 minuter (min) vid rumstemperatur (RT).
- Inkubera NS med 500 μl accutaslösning i 3 minuter vid 37 °C för att bryta upp dem.
- Neutralisera accutaslösningen med tumörstamcellsmedium7 och centrifugera cellsuspensionen vid 355 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Resuspendera cellpelleten i 1 ml TSM-medium och räkna sedan cellerna med hjälp av en cellräkningskammare.
- Späd cellsuspensionen för att erhålla 2,5-5 x 103celler/ml och frö 100 μl/brunn till 96-brunnsplattor med 96 brunnar rundbotten (se materialtabell). Använd en korrekt celldensitet för att erhålla individuell NS med ~ 300 μm diameter, 4 dagar efter cellsådd (250-500 celler / brunn för mycket aggressiva gliomceller).
- Bekräfta visuellt NS-bildningen genom att använda ett inverterat mikroskop 4 dagar efter cellsådd.
2. Förberedelse av ALR / antikroppskomplexet och inställning för invasionsanalysen
OBS: För antikroppsmärkningsproceduren används antikroppsmärkningsprotokoll10 för levande cellimmunocytokemi med vissa modifieringar, som rapporterats nedan. För invasionsanalysen följs protokollet som tidigare beskrivits av Vinci et al. 201512 .
- Tänk på antalet brunnar (t.ex. 60 brunnar) för att analysera och beräkna volymen som behövs för varje reagens. Inkludera även brunnarna för den negativa kontrollen (prover med ALR men utan antikroppar).
- Tillsätt 100 μL sterilt vatten till ALR för att rehydrera reagenset (slutlig koncentration = 0,5 mg/ml). Pipett för att blanda lösningen.
Reagenset är ljuskänsligt. Håll dig därför i mörkret. Alikvotera det kvarvarande reagenset och förvara vid -80 °C (undvik frysning och upptining). - Blanda antikroppen med ALR i TSM-mediet (eller lämpligt celltillväxtmedium för den cellinje du väljer) i en rund bottenplatta med flera brunnar eller i ett bärnstensrör och skydda mot ljus.
- Bered tillräckligt med mängd av mediet för att dosera 25 μl/brunn vid 3x den slutliga analyskoncentrationen. Inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter.
OBS: Ett 1:3 molförhållande mellan antikropp och ALR rekommenderas, med en slutlig (1x) koncentration av testantikroppen <1,5 μg/ml. För experimenten i detta protokoll används en anti-human CD44-musantikropp (startkoncentration 86 μg / ml) vid en slutlig koncentration av 0,1 μg / ml (3x koncentration = 0,3 μg / ml). Tillsätt reagenserna i följande ordning: i) antikropp; ii) ALR. iii) TSM-medium. Blanda genom pipettering. - Späd bakgrundssuppressorreagenset (BSR) i TSM-medium (eller lämpligt celltillväxtmedium för valfri cellinje) vid 1,5 mM (3x) för att i slutet av testet erhålla en slutlig koncentration på 0,5 mM.
- Utför invasionsanalysen direkt i ULA 96-brunnens runda bottenplatta där celler ursprungligen såddes. Kontrollera NS visuellt med ett inverterat mikroskop innan du börjar.
- Ta försiktigt och långsamt bort 75 μl/brunn av mediet och undvik att vidröra botten av brunnen där NS sitter. Kontrollera närvaron av NS visuellt.
- Tillsätt försiktigt 25 μl BSR i varje brunn.
- Tillsätt försiktigt 25 μl ALR/antikroppskomplex till varje brunn. Vänta 2 eller 3 minuter för att låta ALR/antikroppskomplexet blandas med mediet.
- Kontrollera visuellt med hjälp av ett inverterat mikroskop för att säkerställa att varje NS är centralt placerad i botten av brunnen. Undvik bildandet av bubblor. Om det finns någon bubbla, ta bort den med en nål.
- Lägg plattan på is och vänta 5 minuter för att låta plattans botten bli kall.
- Med en förkyld p200-spets, fördela 75 μL/brunn basalmembranmatris (BMM), placera pipettspetsen på brunnens inre vägg och undvik att vidröra brunnens botten. Undvik bildandet av bubblor och ta bort de befintliga med en steril nål.
OBS: Se till att ha tinat BMM vid 4 °C från kvällen innan. - Låt plattan ligga på is i 5 minuter för att låta BMM blandas med mediet. Kontrollera visuellt med hjälp av ett inverterat mikroskop närvaron av NS och att de är centralt belägna i brunnen. Om inte, centrifugera plattan vid 4 °C vid 180 x g i 5 minuter.
- Överför plattan i analysinstrumentet för levande celler (Table of Materials) placerat i inkubatorn vid 37 °C, 5% CO2, 95% luftfuktighet.
3. Förberedelse av ALR/antikroppskomplexet och uppställning för migreringsanalysen
OBS: För antikroppsmärkningsproceduren används Labeling Dyes-protokollet10 för Live-Cell Immunocytochemistry.
- Tänk på antalet brunnar för att analysera och beräkna volymen som behövs för varje reagens. Inkludera även de brunnar som behövs för de negativa kontrollerna. Kontrollera NS visuellt med ett inverterat mikroskop innan du börjar.
- Använd platta bottenplattor med 96 brunnar. Utför beläggningsproceduren enligt beskrivningen av Vinci et al., 201314. För denna studie används BMM som en tunn beläggning.
- När beläggningen är klar, ta bort överskottet av BMM-beläggningen med en p200-spets som placerar spetsen i brunnens kant och undviker att röra botten. Om du arbetar med flera brunnar, använd en flerkanalig pipett.
- Skär en p200-spets, ta 50 μL av cellmediet + NS från varje vald brunn och överför den till en belagd platt bottenbrunn. Kontrollera närvaron och positionen för NS i varje brunn visuellt.
OBS: Varje NS måste vara centralt belägen i brunnen. Undvik att luta dig på spetsen på brunnens kant under överföringen, men släpp mediet centralt i brunnen utan att vidröra botten. För celler med hög migrering bör du överväga ett högre antal replikat än de tre standardreplikaten. Detta beror på att när NS sitter för nära brunnens kant kan de migrerande cellerna täcka ett mindre område av brunnen. - Rehydrera ALR enligt beskrivningen ovan (steg 2.2-2.3).
OBS: Reagenset är ljuskänsligt. Se ovan för bra hanteringsrutiner. - Blanda antikroppen med ALR i lämpliga kompletta celltillväxtmedier i en rund bottenplatta med flera brunnar eller i ett bärnstensrör och skydda mot ljus. Bered tillräckligt med mängd för att dispensera 50 μl/brunn vid 3x den slutliga analyskoncentrationen. Inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter.
Lägg till reagenserna i den ordning som anges ovan (steg 2.4). - Följ samma procedur som rapporterades i steg 2.5.
- Tillsätt försiktigt 50 μL BSR i varje brunn.
- Tillsätt försiktigt 50 μl ALR/antikropp i varje brunn. Vänta 2 eller 3 minuter för att låta reagenserna blandas och kontrollera visuellt med hjälp av ett inverterat mikroskop för att säkerställa att de flesta av replikatets NS är centralt placerade i brunnen.
- Undvik bildandet av bubblor och ta bort eventuella befintliga med hjälp av en nål. Överför försiktigt plattan i det levande cellanalysinstrumentet som placerats i inkubatorn vid 37 °C, 5%CO2, 95% luftfuktighet.
4. Inställning av instrument för analys av levande celler för bildinsamling
- Skanna plattorna med hjälp av analysinstrumentet för levande celler (för specifikationer, se Materialförteckning) med skanningsintervall som börjar från tidpunkt noll (t0) för invasions- respektive migrationsanalyserna efter steg 2.14. och 3.10. upp till 96 h.
OBS: Se till att kunna kassera analysinstrumentet för levande celler omedelbart efter starten av invasions- och migrationsanalysen. Beroende på tumörtyp kan celler börja invadera eller migrera från NS redan inom 1 h från analysinställningen. - I programvaran för live-cellanalysinstrument väljer du alternativet Schema för att förvärva. Klicka på fliken + och välj alternativet Skanna enligt schema.
- I programvarufönstret Skapa eller återställ fartyg klickar du på alternativet Ny.
- Välj den specifika applikationen i live-cellanalysinstrumentet för invasion och migrationsförvärv. Välj Spheroid-skanningstyp , 4x mål, fas + ljusfält och gröna bildkanaler för invasionsanalysen. Välj genomsökningstyp för utspädningskloning , 4x mål och fas och grönt för migreringsanalysen.
- Välj platttyp och definiera brunnarna som ska skannas genom att markera dem på plattkartan.
- Ställ in skanningsfrekvensen (för experimenten i detta protokoll var skanningsfrekvensen 15 minuter för invasion och 30 min för migrering).
- Klicka på Lägg till i schema och starta skanningen.
5. Inställning av instrument för analys av levande celler för bildanalys
- Välj fliken Skapa ny analysdefinition.
- Välj Spheroid Invasion eller Basic Analyzer-program för invasion respektive migrering på fliken.
- Välj lämpliga kanaler för invasion och migrering (för Invasion: Fas+Brightfield-Green; för Migration: Phase-Green) i bildkanalen.
- Välj några representativa bilder från 3–4 brunnar för förhandsgranskning och förfining av analysinställningen.
- För invasionsanalysen justerar du programinställningarna i kanalerna Brightfield och Green på fliken Analysdefinition med följande inställning för att generera en exakt segmentering mellan Whole Spheroid och Invading Cells (se figur 5; blå mask):
Brightfield-segmentering: Hel sfäroidkänslighet = 50; Invaderande cellkänslighet = 100; Städa upp = standard.
Hela sfäroidfilter: ställ in alla parametrar som standard.
Filter för invaderande celler: ställ in alla parametrar som standard.
Grön segmentering: Radie = 900. - För migreringsanalys justerar du programinställningarna i faskanalerna och gröna kanaler för att generera en exakt segmentering mellan sammanflödet och gröna celler (se bild 5, gula och rosa masker) med följande inställning:
Fas: ställ in alla parametrar som standard.
Grön segmentering: radie = 300; Tröskelvärde = 1000
Rengöring: Hålfyllning = 400; Filter = standard.
Hela brunnen: ställ in alla parametrar som standard. - Kontrollera att analysinställningarna är korrekta för NS genom att klicka slumpmässigt på flera brunnar. Segmenteringen måste beskriva sfäroiden. Om inte, justera inställningen därefter.
- Välj de brunnar och tidpunkter som ska analyseras.
- Spara analysdefinitionen och klicka på Slutför.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Live-3D-Cell Immunocytochemistry protokoll för invasion och migration sammanfattas i ett enkelt och reproducerbart arbetsflöde i figur 1. Genom att seeda DMG-cellerna i ULA 96-brunns rundbottenplattor erhålls reproducerbar storlek NS och används i de visade stegen. När NS har nått den ideala storleken på ~ 300 μm (ungefär 4 dagar efter sådd) initieras invasion12 och migration14 analyser. Tillägget av ALR / antikroppskomplexet tillsammans med bakgrundssuppressorn i mediet för den enskilda NS, gör det möjligt att följa det specifika marköruttrycket på cellmembranet, i live-avbildning och över tid. Ytmarköruttrycket under cellinvasionen och migrationen övervakas enkelt med intervaller från t = 0 upp till 96 timmar med hjälp av analysinstrumentet för levande celler. Detta bildsystem möjliggör en helautomatisk bildanalys.
En primär patient-härledd cellinje, QCTB-R059, användes för att exemplifiera invasions- och migrationsegenskaperna för pediatrisk DMG-tumörspridning. QCTB-R059 indikerades ursprungligen som en pediatrisk talamisk glioblastom (GBM) cellinje15. Senare har det indikerats som H3-K27M thalamic gliomcellinje 16 eller diffust mittlinjegliom (DMG) H3-K27M cellinje11, efter Världshälsoorganisationens klassificering av hjärntumörer 2016 med introduktionen av DMG H3F3A K27M-mutant som en ny enhet17.
CD44, en adhesionsmolekyl som är känd för att vara involverad i cellmigration och invasion, undersöktes. CD44 uttrycks av QCTB-R059-celler, vilket demonstreras av konfokala bilder av immunofluorescerande (IF) färgning på 3D-cellmigration till (figur 2) och invasion i (figur 3) BMM.
Med tanke på att 3D-invasion och migration båda är icke-statiska processer, tänkte vi undersöka uttrycket av CD44 över tid när celler är i rörelse. För att göra detta använde vi live-cell immunocytochemistry analys och anpassade protokollet för 3D-analyser. Genom att använda ALR i komplex med en anti-CD44-antikropp kan vi i realtid följa uttrycket av CD44 när proteinet uttrycks på cellmembranet medan cellerna undviker neurosfärerna och sprider sig till och in i BMM.
Live-3D-cellimmunocytokemin gör det möjligt att visualisera CD44-uttryck (kompletterande video 1 och kompletterande video 2). De representativa ramarna för tidsfördröjningen, för både migration och invasion (figur 4A,B), visar mer i detalj det intermittenta uttrycket av CD44 på cellmembranet. I synnerhet är det möjligt att se den gröna fluorescerande signalen vara på (grön cirkel) och sedan av (svart cirkel) på samma cell observerad över tiden, vilket tyder på att uttrycket av CD44 är på och av medan celler migrerar och invaderar.
Migrations- och invasionsprocesserna följs under 96 timmar, och som visas i figur 5 visar QCTB-R059-celler en hög nivå av CD44, vilket visar att det uttryck som observerats med levande cellimmunocytokemi överlag är i linje med uttrycket av CD44 erhållet av IF som visas på konfokala bilder i figur 2 och figur 3. Intressant nog märkte vi också att när anti-CD44-antikroppen används på levande celler påverkar den cellmorfologin och inducerar en övergång från mesenkymalliknande till amoeboidliknande invasion. Det inducerar en minskning av dessa cellers invasiva och migrerande kapacitet (kompletterande figur 1). Vi kan dock inte utesluta att minskningen av cellmigration och invasion som observerats också delvis beror på en hämning av cellproliferation.
Den automatiserade bildanalysen som utförs på live-cellanalysinstrumentet visar kvantifieringen av CD44-uttryck och dess ökning över tid, mätt med den totala gröna fluorescerande signalen associerad med ALR (figur 5B, C) för både migration och invasion. Kvantifieringarna uppnås som exemplifieras i figur 5B och figur 5C, med den automatiserade bildanalysen inställd på att segmentera hela området som täcks av CD44-grönmigrerade celler (figur 4B) och hela spridningsområdet som täcks av CD44-gröninvaderade celler men exklusive neurosfärkärnan (figur 5C).
Figur 1: Schematiskt arbetsflöde för Live-3D-cell immunocytokemiska analyser. Arbetsflödet visar stegen som är involverade i 3D-invasionen och migreringsmetoderna för live-bildbehandling, inklusive representativa bilder av pediatriska primära DMG-patienthärledda celler (QCTB-R059) efter invasion i (övre panelen; t = 96 timmar) och migrering till (nedre panelen; t = 96 timmar) BMM. Staplar = 800 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: CD44-uttryck i 3D-tumörcellmigration. Representativa immunofluorescerande konfokala bilder av CD44-uttryck i primära DMG-patient-härledda celler (QCTB-R059) vid migrering till BMM. Tidpunkt = 96 h (röd: CD44; blå: kärnor). Skalstänger: 500 μm (övre panel) och 200 μm (nedre panel). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: CD44-uttryck i 3D-tumörcellsinvasion. Representativa immunofluorescerande konfokala bilder av CD44-uttryck i primära DMG-patient-härledda celler (QCTB-R059) vid invasion i BMM. Tidpunkt = 96 h (röd: CD44; blå: kärnor). Skalstänger: 250 μm (övre panel) och 100 μm (nedre panel). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 4: CD44-uttryck över tid. Valda bildrutor för QCTB-R059-migrering (A) och invasion (B) tidsfördröjning. Bilder erhölls på live-cell imaging instrumentet. Grön cirkel indikerar uttrycket av CD44, svart cirkel indikerar inget CD44-uttryck på cellmembranet i samma cell observerat över tiden. Skalstänger: 200 μm (A) och 100 μm (B). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Live-3D-cell immunocytochemistry Assays för CD44: migration och invasion. (A) Representativa ljusfält, fluorescerande (ALR med anti-CD44-antikropp) och sammanslagningsbilder av QCTB-R059-cellimmunocytokemimigration och invasion (96 timmar) visas. Skalstapeler: 400 μm. (B) Kvantifiering av CD44 övergripande uttryck i förhållande till migration (B) och invasion (C), bestämd av ALR-anti-CD44 bildanalys på live-cell imaging instrument. Kurvorna visar den gröna medelintensiteten för CD44-uttryck över tid. Värdena är medelvärde ± SD. De två små siffrorna i diagrammen visar den segmentering som tillämpades för analysen av migrationen (B) där hela området beaktades och invasionen (C) för vilken NS-kärndelen uteslöts. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Effekt av anti-CD44-antikroppar på cellmorfologi och grad av cellmotilitet. Representativa bilder av QCTB-R059 invasion och migrationsanalys visar effekten av anti-CD44-antikroppar som används för levande 3D-cell immunocytokemi. Celler uppvisar en minskad invasions- och migrationskapacitet samt övergången från ett mer mesenkymalt till amoeboidliknande invasionsmönster mellan den negativa kontrollen (utan anti-CD44-antikropp) och CD44 (plus anti-CD44-antikropp). Nedre panelen visar högre effektförstoring som visar en tydligare bild av cellernas morfologiska utseende i frånvaro och närvaro av anti-CD44-antikroppen (vita pilar). Skalstänger: 800 μm övre panel och 100 μm nedre panel. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande video 1: Time-lapse-video av QCTB-R059 3D-cellmigrering på BMM i närvaro av anti-CD44-antikropp. Fluorescerande grön signal, som representerar uttrycket av CD44 på cellmembranet, visualiseras över tid genom konjugering av anti-CD44-antikroppen med ALR. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande video 2: Time-lapse video av QCTB-R059 3D-cell invasion i BMM i närvaro av anti-CD44 antikropp. Fluorescerande grön signal, som representerar uttrycket av CD44 på cellmembranet, visualiseras över tid genom konjugering av anti-CD44-antikroppen med ALR. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den levande 3D-cellimmunocytokemin som vi har antagit här för pediatrisk DMG-invasion och migration kan enkelt anpassas även för andra mycket invasiva tumörcelltyper, inklusive bröst- och tjocktarmscancercellinjer.
Till skillnad från tidigare utförda live-2D-cell immunocytokemianalyser10, när man arbetar i 3D, föreslås att man uppmärksammar några kritiska steg. I synnerhet, för invasionsanalysen som vi beskriver, rekommenderas det att tillsätta ALR / antikroppsblandningen direkt till mediet med NS i varje brunn, före tillsatsen av BMM, och inte i BMM eller ovanpå BMM en gång gelad. Detta för att möjliggöra en bra blandning av reagenserna med mediet och säkerställa mer direkt åtkomst av reagenserna till cellytan. För att säkerställa en bättre kvalitet på avbildningen, även om protokollet inkluderar användning av BSR, rekommenderar vi att du använder fenolrött medium och BMM.
En annan punkt att tänka på för levande cellimmunocytokemi är att varje antikropp som binder ett extracellulärt membranprotein på levande celler kan påverka proteinfunktionen genom att ändra dess konformation eller genom att ockupera bindningsstället för en ligand eller ett protein på en intilliggande cell, och därför fungera som ett "blockerande medel"18,19. Även om detta tillvägagångssätt kan vara användbart som en terapeutisk strategi19, kan det inte vara det primära målet för någon experimentell inställning. Innan man utför en stor uppsättning experiment bör därför olika antikroppar som binder distinkta epitoper av samma protein testas för att också verifiera eventuell "blockerande" effekt. I denna studie använde vi en specifik antikropp för att i realtid följa uttrycket av CD44 på cellmembranet i en mycket aggressiv pediatrisk DMG-cellinje vid 3D-invasion och migration. Protokollet som användes gjorde det möjligt för oss att kvantitativt mäta uttrycket av CD44 över tid på celler som invaderar och migrerar. Intressant, i närvaro av anti-CD44-antikroppen, noterade vi också en minskning av cellmotiliteten jämfört med cellerna med ALR men i frånvaro av antikroppen. Vi kan dock inte utesluta en hämmande effekt på cellproliferation. Förvärvet av ett annat invasionsmönster med en övergång från mesenkymalliknande till amoeboidliknande cellmorfologi20 observerades också i närvaro av anti-CD44-antikroppar. Dessa oväntade resultat tyder på att blockering av CD44 kan bidra till mesenkymal till amoeboid övergång vid pediatrisk DMG.
När det gäller begränsningarna i detta protokoll, med hänsyn till upplösningen av CCD-kameran i Incucyte Live-Cell Analysis Instrument och dess begränsade z-stack-kapacitet, kan den inställning vi presenterar för live-3D-cellimmunocytokemianalyserna användas som ett preliminärt tillvägagångssätt, i ett storskaligt flerbrunnsformat, innan vi går vidare till en mer djupgående analys med antingen kraftfullare fluorescerande bildsystem (t.ex. konfokalmikroskop och höginnehållsavbildningssystem med en konfokalmodalitet som Operetta CLS eller Opera Phoneix) eller ett mer förfinat tillvägagångssätt för att i realtid studera uttrycket av ett ytprotein via en reporteranalys21.
En bredare tillämpning av live-3d-cell immunocytokemi presenteras här som en monokultur, kan vara en 3D-samodlingsanalys etablerad för att avbilda och analysera i realtid direkta cell-cellinteraktioner. I detta fall kan två olika ALR användas med olika fluoroforer för att binda proteiner som specifikt uttrycks på cellmembranet på olika celltyper (t.ex. tumörceller och immunceller). I detta fall kan direkt cell-cellkontakt analyseras med levande avbildning genom samlokalisering av de två olika ALR / antikroppskomplexen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga relevanta anknytningar eller ekonomiska engagemang med någon organisation eller enhet med ett ekonomiskt intresse i eller ekonomisk konflikt med ämnet eller materialet som diskuteras i manuskriptet.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr. Silvia Soddu och Dr. Giulia Federici (Enheten för cellulära nätverk och molekylära terapeutiska mål, IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute, Rom, Italien) för tillgång till IncuCyte S3 Live Cell Imaging System i den preliminära uppsättningen av bildprotokollet. Dessutom tackar vi Bernadett Kolozsvari för den tekniska rådgivningen. Studien stöddes av Children with Cancer UK-bidraget (16-234) och det italienska hälsoministeriet Ricerca Corrente. M Vinci är en Barn med Cancer UK Fellow. R Ferretti är mottagare av Fondazione Veronesi Fellowship (2018 och 2019). Författarna erkänner Fondazione Heal för deras stöd och Children's Hospital Foundation för finansiering av Queensland Children's Tumor Bank.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well TC-Treated Microplates | Corning | 3595 | size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution for neurosphere dissociation |
| Burker chamber | Mv medical | FFL16034 | cell counting chamber |
| CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
| Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye | Incucyte | 4743 | Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry |
| Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | - | The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays. |
| Inverted Microscope | - | any inverted microscope | |
| Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
| Tumor stem cell (TSM) medium | - | - | growth cell medium (see reference in the text for details) |
| Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, round bottom clear |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
- Magrì, A., Bardelli, A. Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).
- Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
- Caretti, V., et al. Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma. Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).
- Pericoli, G., et al. Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763 (2020).
- Vinci, M., et al. Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells. Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).
- Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies. Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).
- Huang, C. C., et al. Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells. PLoS One. 10 (6), 0128045 (2015).
- Prudner, B. C., et al. Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors. Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).
- Ferretti, R., et al. Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction. Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
- Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 64 (2018).
- Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).
- Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).
- Mount, C. W., et al. Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M. Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Czabanka, M., et al. Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209 (2020).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Panková, K., Rösel, D., Novotný, M., Brábek, J. The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
