Summary
Deze studie presenteert een protocol van live-3D-cel immunocytochemie toegepast op een pediatrische diffuse midline glioom cellijnlijn, nuttig om in real-time de expressie van eiwitten op het plasmamembraan te bestuderen tijdens dynamische processen zoals 3D-celinvasie en migratie.
Abstract
Celmigratie en invasie zijn specifieke kenmerken van Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutante tumoren. We hebben deze functies al gemodelleerd met behulp van driedimensionale (3D) celgebaseerde invasie- en migratietests. In deze studie hebben we deze 3D-assays geoptimaliseerd voor live-cell immunocytochemie. Een antilichaamlabelreagens werd gebruikt om in realtime de expressie van het adhesiemolecuul CD44 te detecteren, op het plasmamembraan van migrerende en binnendringende cellen van een DMG H3K27M primaire patiënt-afgeleide cellijn. CD44 is geassocieerd met kankerstamcelfenotype en tumorcelmigratie en -invasie en is betrokken bij de directe interacties met de extracellulaire matrix van het centrale zenuwstelsel (CZS). Neurosferen (NS) uit de DMG H3K27M-cellijn werden ingebed in de basale membraanmatrix (BMM) of geplaatst op een dunne coatinglaag van BMM, in aanwezigheid van een anti-CD44-antilichaam in combinatie met het antilichaametiketteringsreagens (ALR). De live-3D-cell immunocytochemische beeldanalyse werd uitgevoerd op een live-cell analyse-instrument om de totale CD44-expressie kwantitatief te meten, specifiek op de migrerende en binnendringende cellen. De methode maakt het ook mogelijk om in real-time de intermitterende expressie van CD44 op het plasmamembraan van migrerende en binnendringende cellen te visualiseren. Bovendien leverde de test ook nieuwe inzichten op in de potentiële rol van CD44 in de mesenchymale naar amoeboïde overgang in DMG H3K27M-cellen.
Introduction
Het vermogen van tumorcellen om te ontwijken en zich te verspreiden door het omliggende weefsel is een kenmerk van kanker1. In het bijzonder is tumorcelmotiliteit een kenmerkend kenmerk van kwaadaardige tumoren, of het nu gaat om een gemetastaseerd tumortype zoals borst2 of colorectale kanker3 of een lokaal invasief type zoals diffuus glioom 4,5.
Beeldvorming speelt een centrale rol in het onderzoek naar vele aspecten van tumorcelfenotypen; Live-cell imaging heeft echter zeker de voorkeur bij het bestuderen van dynamische cellulaire processen zoals migratie en invasie, wanneer veranderingen in morfologie en cel-celinteractie 6,7 optreden en in de loop van de tijd gemakkelijker kunnen worden onderzocht. Voor live-cell imaging kunnen verschillende optische microscopiesystemen worden gebruikt, van fasecontrast tot confocale fluorescerende microscopen, en beeldacquisitie uitgevoerd over een korte of lange periode op een omgekeerde microscoop uitgerust met een kamer voor temperatuur- en CO2-regeling, of in high-content beeldanalysesystemen met ingebouwde kamers, of als alternatief in beeldsystemen die in de incubator kunnen zitten zonder de cellen gedurende de hele duur te hoeven verstoren van het experiment. De keuze van het gebruikte systeem wordt vaak bepaald door een aantal factoren, zoals de benodigde resolutie, de lengte van de totale acquisitietijd en tijdsintervallen, het gebruikte vattype en de doorvoer van de test (enkele kamer of multi-well plaat), de gevoeligheid van de gebruikte cellen (kostbare en / of zeldzame cellen) en fototoxiciteit van de cellen als fluoroforen aanwezig zijn.
Met betrekking tot fluorescerende beeldvorming in live-modus kan dit worden bereikt door cellen te transduceren voor de expressie van fluorescerende eiwitten, hetzij voor stabiele expressie of als een induceerbaar systeem8, door transiënte celtransfectie, of door celkleurstoffen te gebruiken die nu beschikbaar zijn voor live-cell labeling7, voor live-cell tracking en voor het labelen van subcellulaire organellen9.
Een nuttige benadering is onlangs ontwikkeld voor live-cell immunocytochemie, waarbij een antilichaam dat een oppervlaktemarker naar keuze herkent, kan worden gebonden aan een etiketteringsreagens, en na toevoeging aan de kweekmedia kunnen cellen die de specifieke marker tot expressie brengen gemakkelijk in realtime worden afgebeeld door live-cell imaging. De visualisatie en kwantificering van markerexpressie met behulp van een dergelijk systeem kan gemakkelijk worden bereikt wanneer cellen worden gekweekt in tweedimensionale (2D) cultuuromstandigheden10.
In deze studie hebben we protocollen geoptimaliseerd voor live-3D-cel immunocytochemische invasie en migratie van pediatrische diffuse midline glioma (DMG) patiënt-afgeleide cellen11,12. DMG zijn zeer agressieve hersentumoren die kinderen treffen, voor de overgrote meerderheid geassocieerd met de drivermutatie K27M in histon H3-varianten. DMG ontstaat in de hersenstam en de middellijngebieden van het centrale zenuwstelsel (CZS) en wordt gekenmerkt door een zeer infiltratief karakter. Van deze invasieve capaciteit is aangetoond dat deze ten minste gedeeltelijk wordt gemedieerd door de intratumor heterogeniteit en de kankerstamachtige kenmerken van DMG-cellen7.
Om onze testen te illustreren, werd een antilichaamlabelreagens (ALR) gebruikt in combinatie met een antilichaam voor CD44. CD44 is een transmembraan glycoproteïne en adhesiemolecuul uitgedrukt op stamcel- en andere celtypen, geassocieerd met kankerstamcelfenotype en tumorcelmigratie en invasie13. De protocollen omvatten de monstervoorbereiding, de beeldacquisitie in brightfield- en fluorescerende modus en de analyse op een live-cell analyse-instrument dat het mogelijk maakte om kwantitatief in realtime de algehele CD44-expressie op het DMG-celmembraan te meten tijdens 3D-invasie en migratie. De testen maakten het ook mogelijk om het intermitterende fluorescerende signaal van CD44 op individuele cellen te visualiseren tijdens het migreren en binnendringen. Interessant is dat ook een effect van het anti-CD44-antilichaam werd waargenomen, dat mogelijk als een blokkerend antilichaam fungeerde, ook de celmigratie en invasie leek te verminderen en een omschakeling van het invasiepatroon van een collectief mesenchymaal-achtig naar een meer eencellig amoeboïde-achtig fenotype induceerde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissies voor menselijk onderzoek van de instellingen.
OPMERKING: Deze studie werd uitgevoerd met behulp van Incucyte S3 en/of SX5 Live-Cell Analysis Instrument (aangeduid als live cell analysis instrument).
1. Generatie van reproduceerbare tumorsferoïden
OPMERKING: Het protocol (sectie 1) beschreven door Vinci et al. 2015 7,12, werd gebruikt zoals hieronder vermeld, met enkele wijzigingen:
- Verzamel de DMG H3K27M-mutante neurosferen (NS) en centrifugeer op 170 x g gedurende 10 minuten (min) bij kamertemperatuur (RT).
- Incubeer de NS met 500 μL van de accutase-oplossing gedurende 3 minuten bij 37 °C om ze te breken.
- Neutraliseer de accutase-oplossing met tumorstamcel (TSM) medium7 en centrifugeer de celsuspensie op 355 x g gedurende 5 minuten bij RT.
- Resuspendie van de celkorrel in 1 ml TSM-medium en tel vervolgens de cellen met behulp van een celtelkamer.
- Verdun de celsuspensie om 2,5-5 x 103cellen/ml te verkrijgen en zaai 100 μL/goed in ultralage aanhechtingsplaten (ULA) 96-well rondbodemplaten (zie materiaaltabel). Gebruik een juiste celdichtheid om individuele NS van ~ 300 μm diameter te verkrijgen, 4 dagen na het zaaien van de cel (250-500 cellen / put voor zeer agressieve glioomcellen).
- Bevestig de NS-vorming visueel met behulp van een omgekeerde microscoop 4 dagen na het zaaien van de cel.
2. Voorbereiding van het ALR/antilichaamcomplex en opstelling voor de invasietest
OPMERKING: Voor de antilichaametiketteringsprocedure wordt het antilichaametiketteringskleurstoffenprotocol10 voor live-cell immunocytochemie gebruikt met enkele wijzigingen, zoals hieronder vermeld. Voor de invasietest wordt het eerder beschreven protocol gevolgd door Vinci et al.2015 12 .
- Overweeg het aantal putten (bijvoorbeeld 60 putten) om het volume dat nodig is voor elk reagens te analyseren en te berekenen. Neem ook de putjes op voor de negatieve controle (monsters met ALR maar zonder antilichaam).
- Voeg 100 μL steriel water toe aan de ALR om het reagens te hydrateren (eindconcentratie = 0,5 mg/ml). Pipetteer om de oplossing te mengen.
OPMERKING: Het reagens is lichtgevoelig; Blijf daarom in het donker. Aliquot het overgebleven reagens en bewaar bij -80 °C (vermijd bevriezen en ontdooien). - Meng het antilichaam met de ALR in het TSM-medium (of geschikte celgroeimedia voor de cellijn van keuze) in een ronde bodem multi-well plaat of in een amberkleurige buis en bescherm tegen licht.
- Bereid voldoende hoeveelheid van het medium voor om 25 μL/put af te geven bij 3x de eindtestconcentratie. Incubeer bij RT gedurende 15 minuten.
OPMERKING: Een 1:3 molaire verhouding van antilichaam tot ALR wordt aanbevolen, met een uiteindelijke (1x) concentratie van het testantilichaam <1,5 μg/ml. Voor de experimenten in dit protocol wordt een anti-humaan CD44 muizenantilichaam gebruikt (startconcentratie 86 μg/ml) bij een eindconcentratie van 0,1 μg/ml (3x concentratie = 0,3 μg/ml). Voeg de reagentia in de volgende volgorde toe: i) antilichaam; ii) ALR; iii) TSM-medium. Meng door pipetteren. - Verdun het achtergrondsuppressorreagens (BSR) in TSM-medium (of geschikte celgroeimedia voor de cellijn naar keuze) tot 1,5 mM (3x) om aan het einde van de test een eindconcentratie van 0,5 mM te verkrijgen.
- Voer de invasietest rechtstreeks uit in de ULA 96-put ronde bodemplaat waar cellen aanvankelijk werden gezaaid. Controleer de NS visueel met een omgekeerde microscoop voordat u begint.
- Verwijder voorzichtig en langzaam 75 μL/put van het medium, vermijd het aanraken van de bodem van de put waar de NS zit. Controleer de aanwezigheid van de NS visueel.
- Voeg voorzichtig 25 μL van de BSR toe aan elk putje.
- Voeg voorzichtig 25 μL van het ALR/antilichaamcomplex toe aan elk putje. Wacht 2 of 3 minuten om het ALR/antilichaamcomplex te laten mengen met het medium.
- Controleer visueel met een omgekeerde microscoop om er zeker van te zijn dat elke NS zich centraal op de bodem van de put bevindt. Vermijd de vorming van bubbels. Als er een bubbel aanwezig is, verwijder deze dan met een naald.
- Leg de plaat op ijs en wacht 5 minuten om de bodem van de plaat koud te laten worden.
- Doseer met een voorgekoelde p200-tip 75 μL/put basale membraanmatrix (BMM), plaats de pipetpunt op de binnenwand van de put en vermijd het aanraken van de bodem van de put. Vermijd de vorming van bubbels en verwijder met een steriele naald de bestaande.
LET OP: Zorg ervoor dat je de BMM bij 4 °C van de avond ervoor hebt ontdooid. - Laat de plaat 5 minuten op het ijs staan om de BMM te laten mengen met het medium. Controleer visueel met een omgekeerde microscoop de aanwezigheid van de NS en of ze centraal in de put liggen. Zo niet, centrifugeer de plaat dan gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 180 x g .
- Breng de plaat over in het analyse-instrument voor levende cellen (materiaaltabel) dat in de incubator is geplaatst bij 37 °C, 5% CO2, 95% vochtigheid.
3. Voorbereiding van het ALR/antilichaamcomplex en opstelling voor de migratietest
OPMERKING: Voor de antilichaametiketteringsprocedure wordt het etiketteringskleurstoffenprotocol10 voor live-cell immunocytochemie gebruikt.
- Overweeg het aantal putten om het volume dat nodig is voor elk reagens te analyseren en te berekenen. Neem ook de putten op die nodig zijn voor de negatieve controles. Controleer de NS visueel met een omgekeerde microscoop voordat u begint.
- Gebruik platen met een vlakke bodem van 96 putten. Voer de coatingprocedure uit zoals beschreven door Vinci et al., 201314. Voor dit onderzoek wordt de BMM gebruikt als dunne coating.
- Zodra de coating klaar is, verwijdert u de overtollige BMM-coating met een p200-tip die de punt in de rand van de put plaatst en de bodem niet raakt. Als u met meerdere putten werkt, gebruikt u een pipet met meerdere kanalen.
- Snijd een p200-punt, neem 50 μL van het celmedium + NS uit elke geselecteerde put en breng deze over naar een gecoate platte bodemput. Controleer de aanwezigheid en de positie van de NS in elke put visueel.
LET OP: Elke NS moet centraal in de put liggen. Vermijd het leunen op de punt aan de rand van de put tijdens de overdracht, maar laat het medium centraal in de put vallen zonder de bodem aan te raken. Overweeg voor sterk migrerende cellen een hoger aantal replicaties dan de standaard drie replicaties. Dit komt omdat wanneer NS te dicht bij de rand van de put zit, de migrerende cellen een kleiner deel van de put kunnen bedekken. - Rehydrateer de ALR zoals hierboven beschreven (stappen 2.2-2.3).
OPMERKING: Reagens is lichtgevoelig. Zie hierboven voor goede behandelingsprocedures. - Meng het antilichaam met ALR in de juiste complete celgroeimedia in een multi-well plaat met ronde bodem of in een amberkleurige buis en bescherm tegen licht. Bereid voldoende hoeveelheid voor om 50 μL/put af te geven bij 3x de eindtestconcentratie. Incubeer bij RT gedurende 15 minuten.
OPMERKING: Voeg de reagentia toe in de volgorde zoals hierboven aangegeven (stap 2.4). - Volg dezelfde procedure als beschreven in stap 2.5.
- Voeg voorzichtig 50 μL van de BSR toe aan elk putje.
- Voeg voorzichtig 50 μL van het ALR/antilichaam toe aan elk putje. Wacht 2 of 3 minuten om de reagentia te laten mengen en controleer visueel met behulp van een omgekeerde microscoop om ervoor te zorgen dat de meeste replicerende NS zich centraal in de put bevinden.
- Vermijd de vorming van bubbels en verwijder bestaande bubbels met behulp van een naald. Breng de plaat voorzichtig over in het analyse-instrument voor levende cellen dat in de incubator is geplaatst bij 37 °C, 5% CO2, 95% vochtigheid.
4. Live-cell analyse instrument instelling voor beeldacquisitie
- Scan de platen met behulp van het live-cell analyse-instrument (voor specificaties, zie tabel met materialen) met scanintervallen vanaf tijdpunt nul (t0) van de invasie- en migratietests die respectievelijk na stap 2.14 zijn ingesteld. en 3.10. tot 96 uur.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u het analyse-instrument voor levende cellen onmiddellijk na het begin van de invasie- en migratietest kunt verwijderen. Afhankelijk van het tumortype kunnen cellen al binnen 1 uur na de testopstelling beginnen binnen te dringen of migreren van de NS. - Selecteer in de software van het live-celanalyse-instrument de optie Schedule to Acquire. Klik op het tabblad + en selecteer de optie Scannen op schema.
- Klik in het softwarevenster Vaartuig maken of herstellen op de optie Nieuw.
- Selecteer de specifieke toepassing in het live-cell analyse-instrument voor de invasie- en migratie-acquisitie. Selecteer Spheroid scan type, 4x objective, Phase+Brightfield en Green image kanalen voor de invasie assay. Selecteer Dilution Cloning scan type, 4x objective en Phase and Green voor de migratietest.
- Selecteer het plaattype en definieer de te scannen putten door ze te markeren op de plaatkaart.
- Stel de scanfrequentie in (voor de experimenten in dit protocol was de scanfrequentie 15 minuten voor invasie en 30 minuten voor migratie).
- Klik op Toevoegen aan schema en start de scan.
5. Live-cell analyse instrument instelling voor beeldanalyse
- Selecteer het tabblad Nieuwe analysedefinitie maken.
- Selecteer Spheroid Invasion of Basic Analyzer-toepassing voor respectievelijk invasie en migratie op het tabblad.
- Selecteer de juiste invasie- en migratiekanalen (voor Invasie: Fase +Brightfield-Groen; voor Migratie: Fasegroen) in het afbeeldingskanaal.
- Selecteer enkele representatieve afbeeldingen uit 3-4 putten om een voorbeeld te bekijken en de analyse-instelling te verfijnen.
- Voor de invasietest past u op het tabblad Analysedefinitie de toepassingsinstellingen in de Brightfield - en Green-kanalen aan met de volgende instelling om een nauwkeurige segmentatie te genereren tussen de Whole Spheroid en Invading Cells (zie Figuur 5; blauw masker):
Brightfield Segmentatie: Hele Sferoïde gevoeligheid = 50; Binnendringende celgevoeligheid = 100; Opschonen = standaard.
Hele sferoïde filters: stel alle parameters in als standaard.
Invading Cells Filters: stel alle parameters in als standaard.
Groene segmentatie: straal = 900. - Voor migratietest past u de toepassingsinstellingen in de kanalen Fase en Groen aan om een nauwkeurige segmentatie tussen de samenvloeiings- en groene cellen te genereren (zie Figuur 5, gele en roze maskers) met de volgende instelling:
Fase: stel alle parameters als standaard in.
Groene segmentatie: straal = 300; Drempel = 1000
Opruimen: Gaten vullen = 400; Filters = standaard.
Whole Well: stel alle parameters als standaard in. - Controleer of de analyse-instellingen correct zijn voor de NS door willekeurig op meerdere putten te klikken. De segmentatie moet de sferoïde omlijnen. Zo niet, pas dan de instelling dienovereenkomstig aan.
- Selecteer de putten en tijdpunten die u wilt analyseren.
- Sla de analysedefinitie op en klik op Voltooien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Live-3D-Cell Immunocytochemistry protocol voor invasie en migratie is samengevat in een eenvoudige en reproduceerbare workflow in figuur 1. Door de DMG-cellen in ULA 96-well rondebodemplaten te zaaien, worden reproduceerbare NS-groottes verkregen en gebruikt in de weergegeven stappen. Wanneer de NS de ideale grootte van ~300 μm hebben bereikt (ongeveer 4 dagen na het zaaien) worden de invasie12 en migratie14 testen gestart. De toevoeging van het ALR/antilichaamcomplex samen met de achtergrondsuppressor in het medium van de individuele NS, maakt het mogelijk om de specifieke markerexpressie op het celmembraan te volgen, in live beeldvorming en in de loop van de tijd. De oppervlaktemarkerexpressie tijdens de celinvasie en migratie kan eenvoudig worden bewaakt met intervallen van t = 0 tot 96 uur met behulp van het live-cell analyse-instrument. Dit beeldvormingssysteem maakt een volledig geautomatiseerde beeldanalyse mogelijk.
Een primaire patiënt-afgeleide cellijn, QCTB-R059, werd gebruikt om de invasie en migratie van pediatrische DMG-tumorverspreiding te illustreren. QCTB-R059 was oorspronkelijk geïndiceerd als een pediatrisch thalamisch glioblastoom (GBM) cellijn15. Later is het geïndiceerd als H3-K27M thalamisch glioomcellijn 16 of diffuus midline glioom (DMG) H3-K27M cellijn 11, volgens de 2016 World Health Organization classificatie van hersentumoren met de introductie van DMG H3F3A K27M-mutant als een nieuwe entiteit17.
CD44, een adhesiemolecuul waarvan bekend is dat het betrokken is bij celmigratie en invasie, werd onderzocht. CD44 wordt uitgedrukt door QCTB-R059-cellen, zoals aangetoond door confocale beelden van immunofluorescente (IF) kleuring bij 3D-celmigratie naar (figuur 2) en invasie in (figuur 3) BMM.
Rekening houdend met het feit dat 3D-invasie en migratie beide niet-statische processen zijn, dachten we de expressie van CD44 in de loop van de tijd te onderzoeken wanneer cellen in beweging zijn. Om dit te doen, gebruikten we de live-cell immunocytochemietest en pasten we het protocol voor 3D-assays aan. Door de ALR in complex met een anti-CD44-antilichaam te gebruiken, kunnen we in realtime de expressie van CD44 volgen wanneer het eiwit tot expressie komt op het celmembraan terwijl de cellen de neurosferen ontwijken en zich verspreiden op en in de BMM.
De live-3D-cel immunocytochemie maakt het mogelijk om CD44-expressie te visualiseren (Supplementary Video 1 en Supplementary Video 2). De representatieve frames van de time-lapse, voor zowel migratie als invasie (figuur 4A,B), tonen meer in detail de intermitterende expressie van CD44 op het celmembraan. In het bijzonder is het mogelijk om het groene fluorescerende signaal aan (groene cirkel) en vervolgens uit (zwarte cirkel) op dezelfde cel te zien die in de loop van de tijd wordt waargenomen, wat suggereert dat de expressie van CD44 aan en uit is terwijl cellen migreren en binnendringen.
De migratie- en invasieprocessen worden gedurende 96 uur gevolgd en zoals weergegeven in figuur 5, vertonen QCTB-R059-cellen een hoog niveau van CD44, wat aantoont dat de algehele expressie waargenomen met de live-cell immunocytochemie in overeenstemming is met de expressie van CD44 verkregen door IF weergegeven op confocale beelden in figuur 2 en figuur 3. Interessant is echter dat we ook opmerkten dat wanneer het anti-CD44-antilichaam op levende cellen wordt gebruikt, het de celmorfologie beïnvloedt en een overgang induceert van mesenchymale-achtige naar amoeboïde-achtige invasie. Het induceert een vermindering van de invasieve en migrerende capaciteit van deze cellen (aanvullende figuur 1). We kunnen echter niet uitsluiten dat de waargenomen vermindering van celmigratie en invasie ook gedeeltelijk te wijten is aan een remming van celproliferatie.
De geautomatiseerde beeldanalyse uitgevoerd op het live-cell analyse-instrument toont de kwantificering van CD44-expressie en de toename ervan in de loop van de tijd, gemeten door het totale groene fluorescerende signaal geassocieerd met de ALR (figuur 5B, C) voor zowel migratie als invasie. De kwantificeringen worden bereikt zoals geïllustreerd in figuur 5B en figuur 5C, waarbij de geautomatiseerde beeldanalyse is ingesteld om al het gebied te segmenteren dat wordt bestreken door de CD44 groen gemigreerde cellen (figuur 4B) en al het verspreidingsgebied dat wordt bestreken door de CD44 groen binnengedrongen cellen, maar exclusief de neurosfeerkern (figuur 5C).
Figuur 1: Schematische workflow van Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays. De workflow toont de stappen die betrokken zijn bij de 3D-invasie- en migratie-live beeldvormingsmethoden, inclusief representatieve beelden van pediatrische primaire DMG-patiënt-afgeleide cellen (QCTB-R059) na invasie in (bovenpaneel; t = 96 uur) en migratie naar (onderste paneel; t = 96 uur) BMM. Staven = 800 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: CD44-expressie in 3D-tumorcelmigratie. Representatieve immunofluorescente confocale beelden van CD44-expressie in primaire DMG-patiënt-afgeleide cellen (QCTB-R059) bij migratie naar BMM. Tijdspunt = 96 uur (rood:CD44; blauw: kernen). Schaalstaven: 500 μm (bovenpaneel) en 200 μm (onderpaneel). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: CD44-expressie in 3D-tumorcelinvasie. Representatieve immunofluorescente confocale beelden van CD44-expressie in primaire DMG-patiënt-afgeleide cellen (QCTB-R059) bij invasie in BMM. Tijdspunt = 96 uur (rood:CD44; blauw: kernen). Schaalstaven: 250 μm (bovenpaneel) en 100 μm (onderpaneel). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: CD44-expressie in de loop van de tijd. Geselecteerde frames van QCTB-R059-migratie (A) en invasie (B) time-lapse . Beelden werden verkregen op het live-cell imaging instrument. Groene cirkel geeft de expressie van CD44 aan, zwarte cirkel geeft geen CD44-expressie aan op het celmembraan van dezelfde cel die in de loop van de tijd is waargenomen. Schaalstaven: 200 μm (A) en 100 μm (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays voor CD44: migratie en invasie. (A) Representatieve brightfield, fluorescerend (ALR met anti-CD44-antilichaam) en samenvoegbeelden van QCTB-R059-celimmunocytochemiemigratie en invasie (96 h) worden getoond. Schaalbalken: 400 μm. (B) Kwantificering van de totale expressie van CD44 ten opzichte van migratie (B) en invasie (C), bepaald door ALR-anti-CD44-beeldanalyse op het live-cell imaging-instrument. De curven tonen de groene gemiddelde intensiteit van CD44-expressie in de loop van de tijd. Waarden zijn gemiddeld ± SD. De twee kleine figuren in de percelen tonen de segmentatie die is toegepast voor de analyse van de migratie (B) waarbij alle gebieden zijn overwogen en de invasie (C) waarvoor het NS-kerndeel is uitgesloten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Effect van anti-CD44-antilichaam op celmorfologie en mate van celmotiliteit. Representatieve beelden van QCTB-R059 invasie en migratietest tonen het effect van anti-CD44 antilichaam gebruikt voor de live-3D-cel immunocytochemie. Cellen vertonen een verminderde invasie- en migratiecapaciteit, evenals de overgang van een meer mesenchymaal-achtig naar amoeboïde-achtig invasiepatroon tussen de negatieve controle (zonder anti-CD44-antilichaam) en CD44 (plus anti-CD44-antilichaam). Het onderste paneel toont een hogere vermogensvergroting die een duidelijker beeld geeft van het morfologische uiterlijk van de cellen in afwezigheid en de aanwezigheid van het anti-CD44-antilichaam (witte pijlen). Schaalstaven: 800 μm bovenpaneel en 100 μm onderpaneel. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende video 1: Time-lapse video van QCTB-R059 3D celmigratie op BMM in aanwezigheid van anti-CD44 antilichaam. Fluorescerend groen signaal, dat de expressie van CD44 op het celmembraan vertegenwoordigt, wordt in de loop van de tijd gevisualiseerd door de conjugatie van het anti-CD44-antilichaam met ALR. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende video 2: Time-lapse video van QCTB-R059 3D cel invasie in BMM in de aanwezigheid van anti-CD44 antilichaam. Fluorescerend groen signaal, dat de expressie van CD44 op het celmembraan vertegenwoordigt, wordt in de loop van de tijd gevisualiseerd door de conjugatie van het anti-CD44-antilichaam met ALR. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De live-3D-cel immunocytochemie die we hier hebben aangenomen voor pediatrische DMG-invasie en migratie kan gemakkelijk worden aangepast, ook voor andere zeer invasieve tumorceltypen, waaronder borst- en darmkankercellijnen.
Anders dan eerder uitgevoerde live-2D-cel immunocytochemie assays10, wordt bij het werken in 3D voorgesteld om aandacht te besteden aan enkele kritieke stappen. In het bijzonder wordt voor de invasietest die we beschrijven, geadviseerd om de ALR / antilichaammix rechtstreeks aan het medium toe te voegen met NS in elke put, voorafgaand aan de toevoeging van de BMM, en niet in de BMM of bovenop de BMM zodra gelled. Dit is om een goede mix van de reagentia met het medium mogelijk te maken en te zorgen voor een directere toegang van de reagentia tot het celoppervlak. Bovendien, om een betere kwaliteit van de beeldvorming te garanderen, hoewel het protocol het gebruik van de BSR omvat, adviseren we het gebruik van fenolroodvrij medium en BMM.
Een ander punt om te overwegen voor de live-cell immunocytochemie is dat elk antilichaam dat een extracellulair membraaneiwit op levende cellen bindt, de eiwitfunctie kan beïnvloeden door de conformatie ervan te veranderen of door de bindingsplaats van een ligand of van een eiwit op een aangrenzende cel te bezetten, en daarom als een "blokkerend middel" fungeert18,19. Hoewel deze aanpak nuttig kan zijn als een therapeutische strategie19, is het misschien niet het primaire doel van een experimentele opstelling. Daarom moeten, voorafgaand aan het uitvoeren van een grote reeks experimenten, verschillende antilichamen die verschillende epitopen van hetzelfde eiwit binden, worden getest om ook een mogelijk "blokkerend" effect te verifiëren. In deze studie gebruikten we een specifiek antilichaam om in realtime de expressie van CD44 op het celmembraan van een zeer agressieve pediatrische DMG-cellijn in 3D-invasie en migratie te volgen. Het gebruikte protocol stelde ons in staat om de expressie van CD44 in de loop van de tijd kwantitatief te meten op cellen die binnendringen en migreren. Interessant is dat we in aanwezigheid van het anti-CD44-antilichaam ook een vermindering van de celmotiliteit opmerkten in vergelijking met de cellen met de ALR, maar in afwezigheid van het antilichaam. We kunnen echter ook een remmend effect op celproliferatie niet uitsluiten. De verwerving van een ander invasiepatroon met een overstap van mesenchymale-achtige naar amoeboïde-achtige celmorfologie20 werd ook waargenomen in de aanwezigheid van anti-CD44-antilichamen. Deze onverwachte resultaten suggereren dat het blokkeren van CD44 kan bijdragen aan mesenchymale naar amoeboïde overgang bij pediatrische DMG.
Met betrekking tot de beperkingen van dit protocol, rekening houdend met de resolutie van de CCD-camera van het Incucyte Live-Cell Analysis Instrument en zijn beperkte z-stack-capaciteit, kan de opstelling die we presenteren voor de live-3D-cel immunocytochemische assays worden gebruikt als een voorlopige benadering, op een grootschalig multi-well-formaat, voordat wordt overgegaan tot een meer diepgaande analyse met behulp van krachtigere fluorescerende beeldvormingssystemen (bijv. confocale microscopen en high-content beeldvormingssysteem met een confocale modaliteit zoals de Operette CLS of de Opera Phoneix) of een meer verfijnde benadering voor het in real-time bestuderen van de expressie van een oppervlakte-eiwit via een reporter assay21.
Een bredere toepassing van de live-3d-cel immunocytochemie die hier als monocultuur wordt gepresenteerd, zou een 3D-cocultuurtest kunnen zijn die is opgezet om in realtime directe cel-celinteracties in beeld te brengen en te analyseren. In dit geval kunnen twee verschillende ALR worden gebruikt met verschillende fluoroforen om eiwitten te binden die specifiek tot expressie komen op het celmembraan op verschillende celtypen (bijv. Tumorcel en immuuncellen). In dit geval kan direct cel-celcontact worden geanalyseerd met live beeldvorming door de co-lokalisatie van de twee verschillende ALR / antilichaamcomplexen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen relevante banden of financiële betrokkenheid bij een organisatie of entiteit met een financieel belang in of financieel conflict met het onderwerp of de materialen die in het manuscript worden besproken.
Acknowledgments
We willen Dr. Silvia Soddu en Dr. Giulia Federici (Unit of Cellular Networks and Molecular Therapeutic Targets, IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute, Rome, Italië) bedanken voor de toegang tot het IncuCyte S3 Live Cell Imaging System in de voorlopige opzet van het beeldvormingsprotocol. Bovendien danken we Bernadett Kolozsvari voor het technische advies. De studie werd ondersteund door de Children with Cancer UK-beurs (16-234) en het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid Ricerca Corrente. M Vinci is een Children with Cancer UK Fellow. R Ferretti is een ontvanger van de Fondazione Veronesi Fellowship (2018 en 2019). De auteurs erkennen Fondazione Heal voor hun steun en de Children's Hospital Foundation voor het financieren van de Queensland Children's Tumor Bank.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well TC-Treated Microplates | Corning | 3595 | size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution for neurosphere dissociation |
| Burker chamber | Mv medical | FFL16034 | cell counting chamber |
| CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
| Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye | Incucyte | 4743 | Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry |
| Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | - | The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays. |
| Inverted Microscope | - | any inverted microscope | |
| Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
| Tumor stem cell (TSM) medium | - | - | growth cell medium (see reference in the text for details) |
| Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, round bottom clear |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
- Magrì, A., Bardelli, A. Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).
- Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
- Caretti, V., et al. Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma. Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).
- Pericoli, G., et al. Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763 (2020).
- Vinci, M., et al. Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells. Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).
- Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies. Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).
- Huang, C. C., et al. Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells. PLoS One. 10 (6), 0128045 (2015).
- Prudner, B. C., et al. Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors. Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).
- Ferretti, R., et al. Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction. Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
- Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 64 (2018).
- Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).
- Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).
- Mount, C. W., et al. Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M. Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Czabanka, M., et al. Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209 (2020).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Panková, K., Rösel, D., Novotný, M., Brábek, J. The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
