Summary
تقدم هذه الدراسة بروتوكولا للكيمياء المناعية للخلايا الحية ثلاثية الأبعاد المطبقة على خط خلايا الورم الدبقي المنتشر في خط الوسط للأطفال ، وهو مفيد لدراسة التعبير عن البروتينات على غشاء البلازما في الوقت الفعلي أثناء العمليات الديناميكية مثل غزو الخلايا ثلاثية الأبعاد والهجرة.
Abstract
تعد هجرة الخلايا وغزوها من السمات المميزة للأورام الطافرة للورم الدبقي المنتشر في خط الوسط (DMG) H3K27M. لقد قمنا بالفعل بنمذجة هذه الميزات باستخدام فحوصات الغزو والهجرة ثلاثية الأبعاد (3D). في هذه الدراسة ، قمنا بتحسين هذه المقايسات 3D للكيمياء المناعية للخلايا الحية. تم استخدام كاشف وضع العلامات على الأجسام المضادة للكشف في الوقت الفعلي عن تعبير جزيء الالتصاق CD44 ، على غشاء البلازما للخلايا المهاجرة والغازية لخط الخلايا الأساسي المشتق من المريض DMG H3K27M. يرتبط CD44 بالنمط الظاهري للخلايا الجذعية السرطانية وهجرة الخلايا السرطانية وغزوها ويشارك في التفاعلات المباشرة مع مصفوفة الجهاز العصبي المركزي (CNS) خارج الخلية. تم تضمين المجالات العصبية (NS) من خط خلية DMG H3K27M في مصفوفة الغشاء القاعدي (BMM) أو وضعها على طبقة طلاء رقيقة من BMM ، في وجود جسم مضاد ل CD44 بالتزامن مع كاشف وسم الأجسام المضادة (ALR). تم إجراء تحليل صورة الكيمياء المناعية للخلايا الحية ثلاثية الأبعاد على أداة تحليل الخلايا الحية لقياس تعبير CD44 الكلي كميا ، وتحديدا على الخلايا المهاجرة والغازية. تسمح الطريقة أيضا بتصور التعبير المتقطع ل CD44 في الوقت الفعلي على غشاء البلازما للخلايا المهاجرة والغازية. علاوة على ذلك ، قدم الفحص أيضا رؤى جديدة حول الدور المحتمل ل CD44 في انتقال اللحمة المتوسطة إلى الأميبات في خلايا DMG H3K27M.
Introduction
تعد قدرة الخلايا السرطانية على التهرب والانتشار عبر الأنسجة المحيطة سمة مميزة للسرطان1. على وجه الخصوص ، تعد حركة الخلايا السرطانية سمة مميزة للأورام الخبيثة ، سواء كانت نوعا من الورم النقيلي مثل الثدي2 أو سرطان القولون والمستقيم3 أو نوعا غازيا محليا مثل الورم الدبقيالمنتشر 4,5.
التصوير له دور مركزي في التحقيق في العديد من جوانب الأنماط الظاهرية للخلايا السرطانية. ومع ذلك ، يفضل بالتأكيد تصوير الخلايا الحية عند دراسة العمليات الخلوية الديناميكية مثل الهجرة والغزو ، عندما تحدث تغييرات في التشكل والتفاعل بين الخليةوالخلية 6,7 ويمكن فحصها بسهولة أكبر بمرور الوقت. بالنسبة لتصوير الخلايا الحية ، يمكن استخدام أنظمة مجهرية ضوئية مختلفة ، من تباين الطور إلى المجاهر الفلورية متحدة البؤر ، والحصول على الصور على مدى فترة زمنية قصيرة أو طويلة على مجهر مقلوب مجهز بغرفة للتحكم في درجة الحرارة و CO2 ، أو في أنظمة تحليل الصور عالية المحتوى التي تحتوي على غرف مدمجة ، أو بدلا من ذلك في أنظمة الصور التي يمكن أن تجلس في الحاضنة دون الحاجة إلى إزعاج الخلايا طوال المدة من التجربة. غالبا ما يتم تحديد اختيار النظام المستخدم من خلال عدد من العوامل مثل الدقة المطلوبة ، وطول وقت الاستحواذ الإجمالي والفترات الزمنية ، ونوع الوعاء المستخدم وإنتاجية الفحص (غرفة واحدة أو لوحة متعددة الآبار) ، وحساسية الخلايا المستخدمة (الخلايا الثمينة و / أو النادرة) والسمية الضوئية للخلايا في حالة وجود الفلوروفورات.
فيما يتعلق بالتصوير الفلوري في الوضع المباشر ، يمكن تحقيق ذلك عن طريق تحويل الخلايا للتعبير عن البروتينات الفلورية إما للتعبير المستقر أو كنظام محفز8 ، عن طريق نقل الخلايا العابرة ، أو باستخدام أصباغ الخلايا المتاحة الآن لوضع العلامات على الخلاياالحية 7 ، لتتبع الخلايا الحية وكذلك لوضع العلامات على العضيات تحت الخلوية9.
تم تطوير نهج مفيد مؤخرا للكيمياء المناعية للخلايا الحية ، حيث يمكن ربط الجسم المضاد الذي يتعرف على علامة السطح المفضلة بكاشف وضع العلامات ، وعند إضافة وسائط الثقافة ، يمكن تصوير الخلايا التي تعبر عن العلامة المحددة بسهولة في الوقت الفعلي عن طريق تصوير الخلايا الحية. يمكن تحقيق التصور والقياس الكمي لتعبير العلامة باستخدام مثل هذا النظام بسهولة عندما تنمو الخلايا في ظروف ثقافة ثنائية الأبعاد (2D)10.
في هذه الدراسة ، قمنا بتحسين بروتوكولات غزو الكيمياء المناعية للخلايا الحية ثلاثية الأبعاد وهجرة الخلايا المشتقة من المريض للورم الدبقي المنتشر في خط الوسط (DMG)لدى الأطفال 11,12. DMG هي أورام دماغية شديدة العدوانية تؤثر على الأطفال ، بالنسبة للغالبية العظمى المرتبطة بطفرة المحرك K27M في متغيرات هيستون H3. تنشأ DMG في جذع الدماغ ومناطق خط الوسط في الجهاز العصبي المركزي (CNS) وتتميز بطبيعة تسلل للغاية. وقد ثبت أن هذه القدرة الغازية تتوسط جزئيا على الأقل عدم التجانس داخل الورم والسمات الشبيهة بجذع السرطان لخلايا DMG7.
لتوضيح مقايساتنا ، تم استخدام كاشف وضع العلامات على الأجسام المضادة (ALR) مع جسم مضاد ل CD44. CD44 هو بروتين سكري عبر الغشاء وجزيء الالتصاق يتم التعبير عنه على الخلايا الجذعية وأنواع الخلايا الأخرى ، المرتبطة بالنمط الظاهري للخلايا الجذعية السرطانية وهجرة الخلايا السرطانية وغزوها13. تشمل البروتوكولات إعداد العينة ، والحصول على الصور في وضع برايت فيلد وفلورسنت ، والتحليل على أداة تحليل الخلايا الحية التي سمحت بالقياس الكمي في الوقت الفعلي للتعبير الكلي CD44 على غشاء خلية DMG أثناء الغزو والهجرة ثلاثية الأبعاد. سمحت المقايسات أيضا بإمكانية تصور إشارة الفلورسنت المتقطعة ل CD44 على الخلايا الفردية أثناء الهجرة والغزو. ومن المثير للاهتمام أنه لوحظ أيضا تأثير الجسم المضاد ل CD44 ، والذي يحتمل أن يكون بمثابة جسم مضاد مانع ، ويبدو أيضا أنه يقلل من هجرة الخلايا وغزوها بالإضافة إلى إحداث تحول في نمط الغزو من نمط ظاهري جماعي يشبه اللحمة المتوسطة إلى نمط ظاهري شبيه بالأميبويد أحادي الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للجان أخلاقيات البحوث البشرية في المؤسسات.
ملاحظة: تم إجراء هذه الدراسة باستخدام أداة تحليل الخلايا الحية Incucyte S3 و / أو SX5 (المشار إليها كأداة تحليل الخلايا الحية).
1. توليد كرويات الورم ذات الحجم المستنسخ
ملاحظة: تم استخدام البروتوكول (القسم 1) الذي وصفه Vinci et al. 2015 7,12 ، كما هو مذكور أدناه ، مع بعض التعديلات:
- اجمع الكرات العصبية الطافرة DMG H3K27M (NS) وأجهزة الطرد المركزي عند 170 × جم لمدة 10 دقائق (دقيقة) في درجة حرارة الغرفة (RT).
- احتضان NS مع 500 ميكرولتر من محلول أكوتاز لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية لتفتيتها.
- تحييد محلول accutase باستخدام وسيط الخلايا الجذعية السرطانية (TSM)7 والطرد المركزي تعليق الخلية عند 355 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
- أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط TSM ثم عد الخلايا باستخدام غرفة عد الخلايا.
- قم بتخفيف تعليق الخلية للحصول على 2.5-5 × 103خلايا / مل والبذور 100 ميكرولتر / بئر في ألواح ذات قاع دائري منخفض للغاية (ULA) ذات 96 بئرا (انظر جدول المواد). استخدم كثافة خلية مناسبة للحصول على NS فردي بقطر ~ 300 ميكرومتر ، بعد 4 أيام من بذر الخلية (250-500 خلية / بئر لخلايا الورم الدبقي شديدة العدوانية).
- تأكد بصريا من تكوين NS باستخدام مجهر مقلوب بعد 4 أيام من بذر الخلية.
2. إعداد مجمع ALR / الأجسام المضادة والإعداد لفحص الغزو
ملاحظة: بالنسبة لإجراء وضع العلامات على الأجسام المضادة ، يتم استخدام بروتوكول أصباغ وسم الأجسامالمضادة 10 للكيمياء المناعية للخلايا الحية مع بعض التعديلات ، كما هو موضح أدناه. بالنسبة لفحص الغزو ، يتم اتباع البروتوكول الذي وصفه سابقا Vinci et al. 201512 .
- ضع في اعتبارك عدد الآبار (على سبيل المثال ، 60 بئرا) لتحليل وحساب الحجم المطلوب لكل كاشف. قم أيضا بتضمين آبار التحكم السلبي (عينات مع ALR ولكن بدون أجسام مضادة).
- أضف 100 ميكرولتر من الماء المعقم إلى ALR لإعادة ترطيب الكاشف (التركيز النهائي = 0.5 مجم / مل). ماصة لخلط الحل.
ملاحظة: الكاشف حساس للضوء. لذلك ، ابق في الظلام. قم بقسمة الكاشف المتبقي وخزنه في درجة حرارة -80 درجة مئوية (تجنب التجميد والذوبان). - امزج الجسم المضاد مع ALR في وسط TSM (أو وسائط نمو الخلايا المناسبة لخط الخلية المفضل) في صفيحة مستديرة القاع متعددة الآبار أو في أنبوب كهرماني وحمايته من الضوء.
- قم بإعداد كمية كافية من الوسط لتوزيع 25 ميكرولتر / بئر بتركيز 3x للفحص النهائي. احتضان في RT لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: يوصى باستخدام نسبة مولية 1: 3 من الجسم المضاد إلى ALR ، مع تركيز نهائي (1x) للجسم المضاد للاختبار <1.5 ميكروغرام / مل. بالنسبة للتجارب في هذا البروتوكول ، يتم استخدام جسم مضاد للفأر CD44 مضاد للإنسان (تركيز ابتدائي 86 ميكروغرام / مل) بتركيز نهائي قدره 0.1 ميكروغرام / مل (تركيز 3x = 0.3 ميكروغرام / مل). أضف الكواشف بالترتيب التالي: ط) الأجسام المضادة. ب) ALR ؛ ج) TSM المتوسطة. تخلط عن طريق الماصة. - قم بتخفيف كاشف مثبط الخلفية (BSR) في وسط TSM (أو وسائط نمو الخلايا المناسبة لخط الخلية المختار) عند 1.5 mM (3x) للحصول في نهاية الفحص على تركيز نهائي قدره 0.5 mM.
- قم بإجراء مقايسة الغزو مباشرة في لوحة ULA 96-well مستديرة القاع حيث تم زرع الخلايا في البداية. تحقق من NS بصريا باستخدام مجهر مقلوب قبل البدء.
- قم بإزالة 75 ميكرولتر / بئر من الوسط برفق وببطء ، وتجنب لمس قاع البئر حيث يوجد NS. تحقق من وجود NS بصريا.
- أضف برفق 25 ميكرولتر من BSR إلى كل بئر.
- أضف برفق 25 ميكرولتر من مركب ALR / الأجسام المضادة إلى كل بئر. انتظر 2 أو 3 دقائق للسماح لمركب ALR / الأجسام المضادة بالاختلاط مع الوسيط.
- تحقق بصريا باستخدام مجهر مقلوب للتأكد من أن كل NS يقع في موقع مركزي في قاع البئر. تجنب تشكيل الفقاعات. في حالة وجود أي فقاعة ، قم بإزالتها باستخدام إبرة.
- ضع الطبق على الثلج وانتظر 5 دقائق حتى يصبح قاع الطبق باردا.
- باستخدام طرف p200 المبرد مسبقا ، قم بتوزيع 75 ميكرولتر / بئر من مصفوفة الغشاء القاعدي (BMM) ، ووضع طرف الماصة على الجدار الداخلي للبئر وتجنب لمس قاع البئر. تجنب تشكيل فقاعات وإزالة بإبرة معقمة تلك الموجودة.
ملاحظة: تأكد من إذابة BMM عند 4 درجات مئوية من الليلة السابقة. - اترك الطبق على الثلج لمدة 5 دقائق للسماح ل BMM بالاختلاط مع الوسط. تحقق بصريا باستخدام المجهر المقلوب من وجود NS وأنها تقع في موقع مركزي في البئر. إذا لم يكن كذلك ، قم بطرد اللوحة عند 4 درجات مئوية عند 180 × جم لمدة 5 دقائق.
- نقل اللوحة في أداة تحليل الخلايا الحية (جدول المواد) الموضوعة داخل الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، 95٪ رطوبة.
3. إعداد مركب ALR / الأجسام المضادة والإعداد لمقايسة الهجرة
ملاحظة: بالنسبة لإجراء وضع العلامات على الأجسام المضادة ، يتم استخدام بروتوكول Labeling Dyes10 للكيمياء المناعية للخلايا الحية.
- ضع في اعتبارك عدد الآبار لتحليل وحساب الحجم المطلوب لكل كاشف. قم أيضا بتضمين الآبار اللازمة للضوابط السلبية. تحقق من NS بصريا باستخدام مجهر مقلوب قبل البدء.
- استخدم ألواح مسطحة القاع ذات 96 بئرا. قم بإجراء الطلاء كما هو موضح من قبل Vinci et al. ، 201314. لهذه الدراسة ، يتم استخدام BMM كطلاء رقيق.
- بمجرد أن يصبح الطلاء جاهزا ، قم بإزالة الفائض من طلاء BMM بطرف p200 مع وضع الطرف في حافة البئر وتجنب لمس القاع. إذا كنت تعمل مع آبار متعددة ، فاستخدم ماصة متعددة القنوات.
- اقطع طرف p200 ، خذ 50 ميكرولتر من وسط الخلية + NS من كل بئر محدد ، وانقله إلى بئر قاع مسطح مطلي. تحقق من وجود وموضع NS في كل بئر بصريا.
ملاحظة: يجب أن يكون كل NS في موقع مركزي في البئر. تجنب الاتكاء على الطرف الموجود على حافة البئر أثناء النقل ولكن قم بإسقاط الوسط مركزيا في البئر دون لمس القاع. بالنسبة للخلايا شديدة الارتحال ، ضع في اعتبارك عددا أكبر من النسخ المتماثلة من النسخ المتماثلة الثلاثة القياسية. هذا لأنه عندما يجلس NS قريبا جدا من حافة البئر ، قد تغطي الخلايا المهاجرة مساحة أصغر من البئر. - أعد ترطيب ALR كما هو موضح أعلاه (الخطوات 2.2-2.3).
ملاحظة: الكاشف حساس للضوء. انظر أعلاه للحصول على إجراءات التعامل الجيدة. - امزج الجسم المضاد مع ALR في وسائط نمو الخلايا الكاملة المناسبة في صفيحة مستديرة القاع متعددة الآبار أو في أنبوب كهرماني وحمايته من الضوء. تحضير كمية كافية لتوزيع 50 ميكرولتر / بئر عند تركيز الفحص النهائي 3x. احتضان في RT لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: أضف الكواشف بالترتيب كما هو موضح أعلاه (الخطوة 2.4). - اتبع نفس الإجراء كما ورد في الخطوة 2.5.
- أضف برفق 50 ميكرولتر من BSR إلى كل بئر.
- أضف برفق 50 ميكرولتر من ALR / الجسم المضاد إلى كل بئر. انتظر 2 أو 3 دقائق للسماح للكواشف بالاختلاط والتحقق بصريا باستخدام مجهر مقلوب للتأكد من أن معظم NS المكررة تقع في موقع مركزي في البئر.
- تجنب تكوين الفقاعات وإزالة أي فقاعات موجودة باستخدام إبرة. انقل اللوحة برفق في أداة تحليل الخلايا الحية الموضوعة داخل الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، 95٪ رطوبة.
4. إعداد أداة تحليل الخلايا الحية للحصول على الصور
- امسح اللوحات ضوئيا باستخدام أداة تحليل الخلايا الحية (للاطلاع على المواصفات ، انظر جدول المواد) مع فترات مسح تبدأ من النقطة الزمنية صفر (t0) لفحوصات الغزو والهجرة التي تم إعدادها ، على التوالي ، بعد الخطوة 2.14. و 3.10. حتى 96 ساعة.
ملاحظة: تأكد من القدرة على التخلص من أداة تحليل الخلايا الحية فور بدء فحص الغزو والهجرة. اعتمادا على نوع الورم ، يمكن أن تبدأ الخلايا في الغزو أو الهجرة من NS بالفعل في غضون 1 ساعة من إعداد الفحص. - في برنامج أداة تحليل الخلايا الحية ، حدد الخيار جدولة للحصول عليها. انقر فوق علامة التبويب + وحدد الخيار مسح ضوئي في الجدول الزمني.
- في نافذة البرنامج إنشاء أو استعادة السفينة ، انقر فوق الخيار جديد.
- حدد التطبيق المحدد في أداة تحليل الخلايا الحية لاكتساب الغزو والهجرة. حدد نوع المسح الكروي ، والهدف 4x ، وقنوات الصورة Phase + Brightfield والخضراء لفحص الغزو. حدد نوع مسح استنساخ التخفيف وهدف 4x والمرحلة والأخضر لفحص الترحيل.
- حدد نوع اللوحة وحدد الآبار المراد مسحها ضوئيا من خلال تمييزها على خريطة اللوحة.
- قم بإعداد تردد المسح (بالنسبة للتجارب في هذا البروتوكول ، كان تردد المسح 15 دقيقة للغزو و 30 دقيقة للترحيل).
- انقر فوق إضافة إلى الجدول الزمني وابدأ الفحص.
5. إعداد أداة تحليل الخلايا الحية لتحليل الصور
- حدد علامة التبويب إنشاء تعريف تحليل جديد.
- حدد تطبيق Spheroid Invasion أو Basic Analyzer للغزو والترحيل ، على التوالي ، في علامة التبويب.
- حدد القنوات المناسبة للغزو والترحيل (للغزو: المرحلة + برايتفيلد جرين ؛ للترحيل: المرحلة الخضراء) في قناة الصورة.
- حدد بعض الصور التمثيلية من 3-4 آبار لمعاينة إعداد التحليل وتحسينه.
- بالنسبة لفحص الغزو ، في علامة التبويب تعريف التحليل ، اضبط إعدادات التطبيق في قنوات Brightfield و Green باستخدام الإعداد التالي لإنشاء تجزئة دقيقة بين الخلايا الكروية الكاملة والخلايا الغازية (انظر الشكل 5 ؛ القناع الأزرق):
تجزئة برايتفيلد: حساسية كروية كاملة = 50 ؛ حساسية الخلية الغازية = 100 ؛ تنظيف = افتراضي.
مرشحات كروية كاملة: قم بتعيين جميع المعلمات كإعداد افتراضي.
عوامل تصفية الخلايا الغازية: قم بتعيين جميع المعلمات كافتراضي.
التجزئة الخضراء: نصف القطر = 900. - بالنسبة لمقايسة الترحيل ، اضبط إعدادات التطبيق في قنوات الطور والأخضر لإنشاء تجزئة دقيقة بين التقاء الخلايا الخضراء (انظر الشكل 5 ، الأقنعة الصفراء والوردية) مع الإعداد التالي:
المرحلة: تعيين جميع المعلمات كإعداد افتراضي.
التجزئة الخضراء: نصف القطر = 300 ؛ العتبة = 1000
التنظيف: ملء حفرة = 400 ؛ الفلاتر = افتراضي.
حسنا كله: قم بتعيين جميع المعلمات كإعداد افتراضي. - تحقق من صحة إعدادات التحليل ل NS بالنقر بشكل عشوائي على عدة آبار. يجب أن يحدد التجزئة الكروية. إذا لم يكن كذلك ، فاضبط الإعداد وفقا لذلك.
- حدد الآبار والنقاط الزمنية لتحليلها.
- احفظ تعريف التحليل وانقر فوق إنهاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم تلخيص بروتوكول الكيمياء المناعية للخلايا الحية 3D للغزو والهجرة في سير عمل مباشر وقابل للتكرار في الشكل 1. من خلال زرع خلايا DMG في ألواح ULA 96-well ذات القاع المستدير ، يتم الحصول على NS ذات الحجم القابل للتكرار واستخدامها في الخطوات المعروضة. عندما تصل NS إلى الحجم المثالي ~ 300 ميكرومتر (حوالي 4 أيام بعد البذر) ، يبدأ فحصالغزو 12 والهجرة14 . تسمح إضافة مركب ALR / الأجسام المضادة مع مثبط الخلفية في وسط NS الفردي باتباع تعبير العلامة المحدد على غشاء الخلية ، في التصوير المباشر وبمرور الوقت. يمكن مراقبة تعبير علامة السطح أثناء غزو الخلية وهجرتها بسهولة على فترات تبدأ من t = 0 حتى 96 h باستخدام أداة تحليل الخلية الحية. يسمح نظام التصوير هذا بتحليل تلقائي كامل للصور.
تم استخدام خط الخلايا الأساسي المشتق من المريض ، QCTB-R059 ، لتجسيد خصائص الغزو والهجرة لنشر ورم DMG لدى الأطفال. تمت الإشارة إلى QCTB-R059 في الأصل على أنه خط خلية الورم الأرومي الدبقي المهادي للأطفال (GBM)15. في وقت لاحق ، تمت الإشارة إليه على أنه خط خلايا الورم الدبقي المهادي H3-K27M 16 أو خط خلية الورم الدبقي المنتشر في خط الوسط (DMG) H3-K27M11 ، بعد تصنيف منظمة الصحة العالمية لعام2016 لأورام المخ مع إدخال DMG H3F3A K27M-mutant ككيان جديد17.
تم التحقيق في CD44 ، وهو جزيء التصاق معروف بمشاركته في هجرة الخلايا وغزوها. يتم التعبير عن CD44 بواسطة خلايا QCTB-R059 كما هو موضح من خلال الصور متحدة البؤر للتلطيخ المناعي (IF) على هجرة الخلايا ثلاثية الأبعاد إلى (الشكل 2) ، والغزو إلى (الشكل 3) BMM.
مع الأخذ في الاعتبار أن الغزو ثلاثي الأبعاد والهجرة كلاهما عمليتان غير ثابتتين ، فكرنا في التحقيق في التعبير عن CD44 بمرور الوقت عندما تكون الخلايا في حالة حركة. للقيام بذلك ، استخدمنا مقايسة الكيمياء المناعية للخلايا الحية وقمنا بتكييف بروتوكول فحوصات 3D. باستخدام ALR في مجمع مع جسم مضاد ل CD44 ، يمكننا متابعة التعبير عن CD44 في الوقت الفعلي عندما يتم التعبير عن البروتين على غشاء الخلية بينما تتهرب الخلايا من المجالات العصبية وتنتشر داخل وإلى BMM.
تسمح الكيمياء المناعية للخلايا الحية ثلاثية الأبعاد بتصور تعبير CD44 (الفيديو التكميلي 1 والفيديو التكميلي 2). تظهر الإطارات التمثيلية للفاصل الزمني ، لكل من الهجرة والغزو (الشكل 4 أ ، ب) ، بمزيد من التفصيل التعبير المتقطع ل CD44 على غشاء الخلية. على وجه الخصوص ، من الممكن رؤية إشارة الفلورسنت الخضراء على (الدائرة الخضراء) ثم إيقاف تشغيلها (الدائرة السوداء) على نفس الخلية التي لوحظت بمرور الوقت ، مما يشير إلى أن تعبير CD44 يتم تشغيله وإيقافه أثناء هجرة الخلايا وغزوها.
تتم متابعة عمليات الهجرة والغزو على مدار 96 ساعة ، وكما هو موضح في الشكل 5 ، تظهر خلايا QCTB-R059 مستوى عال من CD44 ، مما يدل على أن التعبير الذي لوحظ بشكل عام مع الكيمياء المناعية للخلايا الحية يتماشى مع تعبير CD44 الذي تم الحصول عليه بواسطة IF الموضح في الصور متحدة البؤر في الشكل 2 والشكل 3. ومن المثير للاهتمام أننا لاحظنا أيضا أنه عند استخدام الجسم المضاد ل CD44 على الخلايا الحية ، فإنه يؤثر على مورفولوجيا الخلية ، مما يؤدي إلى الانتقال من غزو يشبه اللحمة المتوسطة إلى غزو يشبه الأميبويد. إنه يؤدي إلى تقليل القدرة الغازية والمهاجرة لهذه الخلايا (الشكل التكميلي 1). ومع ذلك ، لا يمكننا استبعاد أن الانخفاض في هجرة الخلايا والغزو الذي لوحظ يرجع جزئيا أيضا إلى تثبيط تكاثر الخلايا.
يظهر تحليل الصور الآلي الذي يتم إجراؤه على أداة تحليل الخلايا الحية القياس الكمي لتعبير CD44 وزيادته بمرور الوقت ، مقاسا بإشارة الفلورسنت الخضراء الإجمالية المرتبطة ب ALR (الشكل 5B ، C) لكل من الهجرة والغزو. يتم تحقيق الكميات كما هو موضح في الشكل 5B والشكل 5C ، مع تعيين تحليل الصور الآلي لتقسيم جميع المنطقة التي تغطيها خلايا CD44 الخضراء المهاجرة (الشكل 4B) وجميع منطقة الانتشار التي تغطيها الخلايا الخضراء CD44 ولكن باستثناء قلب الغلاف العصبي (الشكل 5C).
الشكل 1: سير العمل التخطيطي لمقايسات الكيمياء المناعية للخلايا الحية ثلاثية الأبعاد. يوضح سير العمل الخطوات المتضمنة في طرق التصوير الحي للغزو والترحيل ثلاثية الأبعاد ، بما في ذلك الصور التمثيلية للخلايا الأولية المشتقة من المريض DMG للأطفال (QCTB-R059) بعد الغزو إلى (اللوحة العلوية ؛ t = 96 h) والهجرة إلى (اللوحة السفلية ؛ t = 96 h) BMM. القضبان = 800 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تعبير CD44 في هجرة الخلايا السرطانية ثلاثية الأبعاد. صور متحدة البؤر مناعية تمثيلية لتعبير CD44 في الخلايا الأولية المشتقة من المريض DMG (QCTB-R059) عند الهجرة إلى BMM. النقطة الزمنية = 96 ساعة (الأحمر: CD44 ؛ الأزرق: النوى). قضبان المقياس: 500 ميكرومتر (اللوحة العلوية) و 200 ميكرومتر (اللوحة السفلية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تعبير CD44 في غزو الخلايا السرطانية ثلاثية الأبعاد. صور متحدة البؤر مناعية تمثيلية لتعبير CD44 في الخلايا الأولية المشتقة من مريض DMG (QCTB-R059) عند غزو BMM. النقطة الزمنية = 96 ساعة (الأحمر: CD44 ؛ الأزرق: النوى). قضبان المقياس: 250 ميكرومتر (اللوحة العلوية) و 100 ميكرومتر (اللوحة السفلية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تعبير CD44 بمرور الوقت. إطارات مختارة من الفاصل الزمني للترحيل QCTB-R059 (A) والغزو (B). تم الحصول على الصور على أداة التصوير بالخلايا الحية. تشير الدائرة الخضراء إلى تعبير CD44 ، وتشير الدائرة السوداء إلى عدم وجود تعبير CD44 على غشاء الخلية لنفس الخلية التي تمت ملاحظتها بمرور الوقت. قضبان المقياس: 200 ميكرومتر (أ) و 100 ميكرومتر (ب). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مقايسات الكيمياء المناعية للخلايا الحية ثلاثية الأبعاد ل CD44: الهجرة والغزو. (أ) يتم عرض برايت فيلد التمثيلي ، والفلورسنت (ALR مع الجسم المضاد ل CD44) ، ودمج صور هجرة الكيمياء المناعية للخلية QCTB-R059 ، والغزو (96 ساعة). قضبان المقياس: 400 ميكرومتر. (ب) القياس الكمي للتعبير الكلي CD44 بالنسبة للهجرة (B) والغزو (C) ، الذي يحدده تحليل الصور ALR-anti-CD44 على أداة تصوير الخلايا الحية. توضح المنحنيات المتوسط الأخضر لشدة تعبير CD44 بمرور الوقت. القيم تعني ± SD. يعرض الشكلان الصغيران في المؤامرات التجزئة المطبقة لتحليل الهجرة (B) حيث تم النظر في كل المنطقة والغزو (C) الذي تم استبعاد الجزء الأساسي من NS له. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: تأثير الجسم المضاد ل CD44 على مورفولوجيا الخلية ودرجة حركتها. تظهر الصور التمثيلية لمقايسة الغزو والهجرة QCTB-R059 تأثير الجسم المضاد ل CD44 المستخدم في الكيمياء المناعية للخلايا الحية ثلاثية الأبعاد. تظهر الخلايا قدرة غزو وهجرة منخفضة بالإضافة إلى الانتقال من نمط غزو يشبه اللحمة المتوسطة إلى نمط غزو يشبه الأميبويد بين التحكم السلبي (بدون جسم مضاد ل CD44) و CD44 (بالإضافة إلى الجسم المضاد ل CD44). تظهر اللوحة السفلية تكبيرا أعلى للطاقة تعرض رؤية أكثر وضوحا للمظهر المورفولوجي للخلايا في غياب ووجود الجسم المضاد ل CD44 (الأسهم البيضاء). قضبان المقياس: لوحة علوية 800 ميكرومتر ولوحة سفلية 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
فيديو تكميلي 1: فيديو الفاصل الزمني لهجرة الخلايا ثلاثية الأبعاد QCTB-R059 على BMM في وجود جسم مضاد ل CD44. يتم تصور الإشارة الخضراء الفلورية ، التي تمثل تعبير CD44 على غشاء الخلية ، بمرور الوقت من خلال اقتران الجسم المضاد ل CD44 مع ALR. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.
الفيديو التكميلي 2: فيديو الفاصل الزمني لغزو الخلايا ثلاثية الأبعاد QCTB-R059 في BMM في وجود جسم مضاد ل CD44. يتم تصور الإشارة الخضراء الفلورية ، التي تمثل تعبير CD44 على غشاء الخلية ، بمرور الوقت من خلال اقتران الجسم المضاد ل CD44 مع ALR. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن تكييف الكيمياء المناعية للخلايا الحية 3D التي اعتمدناها هنا لغزو DMG للأطفال والهجرة بسهولة أيضا لأنواع الخلايا السرطانية الأخرى شديدة التوغل ، بما في ذلك خطوط خلايا سرطان الثدي والقولون.
تختلف عن فحوصات الكيمياء المناعية للخلايا الحية2D التي تم إجراؤها سابقا 10 ، عند العمل في 3D ، يقترح الانتباه إلى بعض الخطوات الحاسمة. على وجه الخصوص ، بالنسبة لفحص الغزو الذي وصفناه ، ينصح بإضافة مزيج ALR / الأجسام المضادة مباشرة إلى الوسط مع NS في كل بئر ، قبل إضافة BMM ، وليس في BMM أو أعلى BMM بمجرد التبلور. هذا للسماح بمزيج جيد من الكواشف مع الوسط وضمان وصول مباشر أكثر للكواشف إلى سطح الخلية. علاوة على ذلك ، لضمان جودة أفضل للتصوير ، على الرغم من أن البروتوكول يتضمن استخدام BSR ، فإننا ننصح باستخدام وسيط خال من الفينول الأحمر و BMM.
هناك نقطة أخرى يجب مراعاتها في الكيمياء المناعية للخلايا الحية وهي أن أي جسم مضاد يربط بروتين غشاء خارج الخلية على الخلايا الحية قد يؤثر على وظيفة البروتين عن طريق تغيير شكله أو عن طريق احتلال موقع ربط ليجند أو بروتين على خلية مجاورة ، وبالتالي يعمل ك "عامل مانع"18,19. في حين أن هذا النهج قد يكون مفيدا كاستراتيجية علاجية19 ، فقد لا يكون الهدف الأساسي لأي إعداد تجريبي. لذلك ، قبل إجراء مجموعة كبيرة من التجارب ، يجب اختبار الأجسام المضادة المختلفة التي تربط حوامل مميزة من نفس البروتين للتحقق أيضا من أي تأثير "حظر" محتمل. في هذه الدراسة ، استخدمنا جسما مضادا محددا لمتابعة التعبير عن CD44 في الوقت الفعلي على غشاء الخلية لخط خلايا DMG للأطفال شديد العدوانية في غزو وهجرة 3D. سمح لنا البروتوكول المستخدم بقياس تعبير CD44 كميا بمرور الوقت على الخلايا الغازية والمهاجرة. ومن المثير للاهتمام ، في وجود الجسم المضاد ل CD44 ، لاحظنا أيضا انخفاضا في حركة الخلية مقارنة بالخلايا التي تحتوي على ALR ولكن في غياب الجسم المضاد. لا يمكننا استبعاد التأثير المثبط على تكاثر الخلايا. كما لوحظ اكتساب نمط غزو مختلف مع التحول من مورفولوجيا الخلايا الشبيهة باللحمة المتوسطة إلى مورفولوجيا الخلايا الشبيهة بالأميبويد20 في وجود الأجسام المضادة المضادة ل CD44. تشير هذه النتائج غير المتوقعة إلى أن حجب CD44 قد يساهم في انتقال اللحمة المتوسطة إلى الأميبية في DMG للأطفال.
فيما يتعلق بقيود هذا البروتوكول ، مع الأخذ في الاعتبار دقة كاميرا CCD لأداة تحليل الخلايا الحية Incucyte وقدرتها المحدودة على z-stack ، يمكن استخدام الإعداد الذي نقدمه لمقايسات الكيمياء المناعية للخلايا الحية 3D كنهج أولي ، على شكل متعدد الآبار على نطاق واسع ، قبل الانتقال إلى تحليل أكثر تعمقا باستخدام أنظمة تصوير فلورية أكثر قوة (على سبيل المثال ، المجاهر متحدة البؤر ونظام التصوير عالي المحتوى مع طريقة متحدة البؤر مثل أوبريت CLS أو Opera Phoneix) أو نهج أكثر دقة لدراسة التعبير عن البروتين السطحي في الوقت الفعلي عبر فحص المراسل21.
يمكن أن يكون التطبيق الأوسع للكيمياء المناعية للخلايا الحية ثلاثية الأبعاد المقدمة هنا كزراعة أحادية ، مقايسة ثقافة مشتركة ثلاثية الأبعاد تم إنشاؤها للتصوير والتحليل في تفاعلات الخلايا الخلوية المباشرة في الوقت الفعلي. في هذه الحالة ، يمكن استخدام اثنين من ALR مختلفين مع فلوروفورات مختلفة لربط البروتينات المعبر عنها على وجه التحديد على غشاء الخلية على أنواع مختلفة من الخلايا (على سبيل المثال ، الخلايا السرطانية والخلايا المناعية). في هذه الحالة ، يمكن تحليل الاتصال المباشر بين الخلايا والخلايا بالتصوير الحي عن طريق التوطين المشترك لمركبي ALR / الأجسام المضادة المختلفين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس للمؤلفين أي انتماءات ذات صلة أو مشاركة مالية مع أي منظمة أو كيان له مصلحة مالية أو تعارض مالي مع الموضوع أو المواد التي تمت مناقشتها في المخطوطة.
Acknowledgments
نود أن نشكر الدكتورة سيلفيا سودو والدكتورة جوليا فيديريتشي (وحدة الشبكات الخلوية والأهداف العلاجية الجزيئية ، معهد IRCCS-Regina Elena الوطني للسرطان ، روما ، إيطاليا) للوصول إلى نظام تصوير الخلايا الحية IncuCyte S3 في الإعداد الأولي لبروتوكول التصوير. علاوة على ذلك ، نشكر برناديت كولوزفاري على المشورة الفنية. تم دعم الدراسة من قبل منحة الأطفال المصابين بالسرطان في المملكة المتحدة (16-234) ووزارة الصحة الإيطالية Ricerca Corrente. إم فينشي هو زميل الأطفال المصابين بالسرطان في المملكة المتحدة. حصل R Ferretti على زمالة Fondazione Veronesi (2018 و 2019). يعترف المؤلفون بمؤسسة الشفاء لدعمها ومؤسسة مستشفى الأطفال لتمويل بنك أورام الأطفال في كوينزلاند.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well TC-Treated Microplates | Corning | 3595 | size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution for neurosphere dissociation |
| Burker chamber | Mv medical | FFL16034 | cell counting chamber |
| CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
| Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye | Incucyte | 4743 | Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry |
| Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | - | The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays. |
| Inverted Microscope | - | any inverted microscope | |
| Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
| Tumor stem cell (TSM) medium | - | - | growth cell medium (see reference in the text for details) |
| Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, round bottom clear |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
- Magrì, A., Bardelli, A. Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).
- Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
- Caretti, V., et al. Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma. Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).
- Pericoli, G., et al. Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763 (2020).
- Vinci, M., et al. Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells. Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).
- Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies. Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).
- Huang, C. C., et al. Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells. PLoS One. 10 (6), 0128045 (2015).
- Prudner, B. C., et al. Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors. Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).
- Ferretti, R., et al. Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction. Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
- Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 64 (2018).
- Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).
- Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).
- Mount, C. W., et al. Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M. Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Czabanka, M., et al. Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209 (2020).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Panková, K., Rösel, D., Novotný, M., Brábek, J. The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
