Summary
מחקר זה מציג פרוטוקול של אימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים המיושמים על קו תאי גליומה מפוזר בקו האמצע בילדים, שימושי כדי לחקור בזמן אמת את ביטוי החלבונים על קרום הפלזמה במהלך תהליכים דינמיים כמו פלישה ונדידה של תאים תלת-ממדיים.
Abstract
נדידת תאים ופלישה הם סימני היכר ספציפיים של גידולים מוטנטיים מסוג Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M. כבר מידלנו תכונות אלה באמצעות מבחני פלישה והגירה תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) מבוססי תאים. במחקר זה, ביצענו אופטימיזציה של מבחני תלת-ממד אלה עבור אימונוציטוכימיה של תאים חיים. מגיב תיוג נוגדנים שימש כדי לזהות בזמן אמת את הביטוי של מולקולת ההידבקות CD44, על קרום הפלזמה של תאים נודדים ופולשים של קו תאים ראשוני שמקורו בחולה DMG H3K27M. CD44 קשור לפנוטיפ של תאי גזע סרטניים ולנדידה ופלישה של תאי גידול והוא מעורב באינטראקציות ישירות עם המטריצה החוץ תאית של מערכת העצבים המרכזית (CNS). נוירוספרות (NS) מקו התאים DMG H3K27M הוטמעו במטריצת קרום הבסיס (BMM) או הונחו על שכבת ציפוי דקה של BMM, בנוכחות נוגדן אנטי-CD44 בשילוב עם מגיב תיוג נוגדנים (ALR). ניתוח התמונה האימונוציטוכימית של תאים חיים בתלת-ממד בוצע על מכשיר ניתוח תאים חיים כדי למדוד כמותית את ביטוי CD44 הכולל, במיוחד על התאים הנודדים והפולשים. השיטה מאפשרת גם הדמיה בזמן אמת של ביטוי לסירוגין של CD44 על קרום הפלזמה של תאים נודדים ופולשים. יתר על כן, הבדיקה גם סיפקה תובנות חדשות לגבי התפקיד הפוטנציאלי של CD44 במעבר מזנכימלי לאמבואיד בתאי DMG H3K27M.
Introduction
היכולת של תאי הגידול להתחמק ולהתפשט דרך הרקמה שמסביב היא סימן ההיכר של סרטן1. בפרט, תנועתיות תאי הגידול היא מאפיין אופייני של גידולים ממאירים, בין אם מדובר בסוג גידול גרורתי כגון שד2 או סרטן המעי הגס3 או מסוג פולשני מקומי כגון גליומה מפושטת 4,5.
לדימות תפקיד מרכזי בחקירת היבטים רבים של פנוטיפים של תאי גידול; עם זאת, הדמיה של תאים חיים בהחלט עדיפה כאשר חוקרים תהליכים תאיים דינמיים כגון נדידה ופלישה, כאשר שינויים במורפולוגיה ובאינטראקציה בין תאים 6,7 מתרחשים וניתן לבחון אותם בקלות רבה יותר לאורך זמן. לצורך דימות תאים חיים ניתן להשתמש במערכות מיקרוסקופיה אופטיות שונות, החל מניגוד פאזה ועד מיקרוסקופים פלואורסצנטיים קונפוקליים, וקליטת תמונה המבוצעת על פני פרק זמן קצר או ארוך במיקרוסקופ הפוך המצויד בתא לבקרת טמפרטורהו-CO2, או במערכות ניתוח תמונה בעלות תוכן גבוה בעלות תאים מובנים, או לחילופין במערכות תמונה המסוגלות לשבת באינקובטור ללא צורך להפריע לתאים לאורך כל הזמן של הניסוי. בחירת המערכת בה נעשה שימוש מוכתבת לעיתים קרובות על ידי מספר גורמים כגון הרזולוציה הדרושה, אורך זמן הרכישה הכולל ומרווחי הזמן, סוג כלי הדם המשמש והתפוקה של הבדיקה (תא בודד או צלחת מרובת בארות), רגישות התאים המשמשים (תאים יקרים ו / או נדירים) ופוטוטוקסיות של התאים אם קיימים פלואורופורים.
באשר לדימות פלואורסצנטי במצב חי, ניתן להשיג זאת על ידי התמרת תאים לביטוי חלבונים פלואורסצנטיים או לביטוי יציב או כמערכת אינדוקציה8, על ידי התמרה של תאים חולפים, או על ידי שימוש בצבעי תאים הזמינים כעת לסימון תאים חיים7, למעקב אחר תאים חיים וכן לתיוג אברונים תת-תאיים9.
לאחרונה פותחה גישה שימושית לאימונוציטוכימיה של תאים חיים, שבה נוגדן המזהה סמן פני שטח נבחר יכול להיות קשור למגיב תיוג, ובתוספת מדיה תרבית, תאים המבטאים את הסמן הספציפי יכולים להיות מצולמים בקלות בזמן אמת על ידי הדמיה של תאים חיים. הדמיה וכימות של ביטוי סמן באמצעות מערכת כזו ניתן להשיג בקלות כאשר תאים גדלים בתנאי תרבית דו-ממדית (2D)10.
במחקר זה, ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקולים לפלישה אימונוציטוכימית של תאים חיים בתלת-ממד והגירה של תאים שמקורם בגליומה מפושטת בקו האמצע בילדים (DMG)11,12. DMG הם גידולי מוח אגרסיביים מאוד הפוגעים בילדים, עבור רובם המכריע הקשורים למוטציה המניע K27M בגרסאות היסטון H3. DMG מתעוררים בגזע המוח ובאזורי קו האמצע של מערכת העצבים המרכזית (CNS) ומאופיינים באופי חדיר מאוד. יכולת פולשנית זו הוכחה כמתווכת לפחות בחלקה על ידי ההטרוגניות התוך-סרטנית והתכונות דמויות-הגזע הסרטני של תאי DMG7.
כדי להדגים את הבדיקות שלנו, נעשה שימוש בריאגנט תיוג נוגדנים (ALR) בשילוב עם נוגדן עבור CD44. CD44 הוא גליקופרוטאין טרנסממברנה ומולקולת היצמדות המתבטאת בתאי גזע ובסוגי תאים אחרים, הקשורים לפנוטיפ של תאי גזע סרטניים ולנדידת תאי גידול ופלישה13. הפרוטוקולים כוללים את הכנת הדגימה, רכישת התמונה במצב שדה בהיר ופלואורסצנטי, והניתוח על מכשיר ניתוח תאים חיים שאיפשר למדוד כמותית בזמן אמת את ביטוי CD44 הכולל על קרום תא DMG במהלך פלישה והגירה תלת-ממדית. הבדיקות אפשרו גם את האפשרות לדמיין את האות הפלואורסצנטי לסירוגין של CD44 על תאים בודדים בזמן נדידה ופלישה. מעניין לציין כי נצפתה גם השפעה של נוגדן אנטי-CD44, אשר עשוי לפעול כנוגדן חוסם, נראה גם להפחית נדידת תאים ופלישה, כמו גם לגרום לשינוי של דפוס הפלישה מ mesenchymal קולקטיבי דמוי פנוטיפ דמוי amoeboid תא יחיד יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות ועדות האתיקה למחקר אנושי של המוסדות.
הערה: מחקר זה בוצע באמצעות Incucyte S3 ו/או SX5 Live-Cell Analysis Instrument (המכונה מכשיר ניתוח תאים חיים).
1. יצירת ספרואידים סרטניים בגודל שניתן לשכפל
הערה: הפרוטוקול (סעיף 1) שתואר על ידי Vinci et al. 2015 7,12, שימש כפי שדווח להלן, עם כמה שינויים:
- אסוף את הנוירוספרות המוטנטיות DMG H3K27M (NS) והצנטריפוגה במהירות של 170 x גרם למשך 10 דקות (דקות) בטמפרטורת החדר (RT).
- לדגור את NS עם 500 μL של תמיסת accutase במשך 3 דקות ב 37 ° C כדי לפרק אותם.
- נטרל את תמיסת האקוטאז עם תא גזע גידולי (TSM) בינוני7 וצנטריפוגה את תרחיף התא ב 355 x גרם למשך 5 דקות ב- RT.
- השהה מחדש את גלולת התא ב -1 מ"ל של מדיום TSM ולאחר מכן ספור את התאים באמצעות תא ספירת תאים.
- לדלל את תרחיף התא כדי לקבל 2.5-5 x 103תאים/מ"ל וזרע 100 μL / באר לתוך חיבור נמוך במיוחד (ULA) 96 באר לוחות עגולים למטה (ראה טבלה של חומרים). השתמש בצפיפות תאים נאותה כדי לקבל NS בודד בקוטר ~300 מיקרומטר, 4 ימים לאחר זריעת התאים (250-500 תאים / באר עבור תאי גליומה אגרסיביים מאוד).
- אשרו ויזואלית את היווצרות NS באמצעות מיקרוסקופ הפוך 4 ימים לאחר זריעת התא.
2. הכנת קומפלקס ALR/נוגדנים והכנה לבדיקת הפלישה
הערה: עבור הליך תיוג נוגדנים, פרוטוקול תיוג נוגדנים10 עבור אימונוציטוכימיה של תאים חיים משמש עם כמה שינויים, כפי שמדווח להלן. עבור מבחן הפלישה, הפרוטוקול שתואר בעבר על ידי וינצ'י ואחרים2015 12 הוא אחריו.
- שקול את מספר הבארות (למשל, 60 בארות) כדי לנתח ולחשב את הנפח הדרוש לכל מגיב. כלול גם את הבארות עבור הבקרה השלילית (דגימות עם ALR אך ללא נוגדן).
- הוסף 100 μL של מים סטריליים ל- ALR כדי להחזיר לחות למגיב (ריכוז סופי = 0.5 מ"ג / מ"ל). פיפטה כדי לערבב את הפתרון.
הערה: המגיב רגיש לאור; לכן, לשמור בחושך. Aliquot מגיב שאריות ולאחסן ב -80 ° C (למנוע הקפאה והפשרה). - ערבבו את הנוגדן עם ה-ALR בתווך TSM (או אמצעי גידול תאים מתאים לקו התאים שבחרתם) בצלחת מרובת בארות תחתונה עגולה או בצינור ענבר והגנו מפני אור.
- הכינו כמות מספקת של המדיום כדי להוציא 25 μL/well בריכוז סופי פי 3. יש לדגור ב-RT למשך 15 דקות.
הערה: מומלץ יחס מולארי של 1:3 בין נוגדן ל-ALR, עם ריכוז סופי (1x) של נוגדן הבדיקה <1.5 מיקרוגרם/מ"ל. לצורך הניסויים בפרוטוקול זה נעשה שימוש בנוגדן עכבר CD44 אנטי-אנושי (ריכוז התחלתי 86 מק"ג/מ"ל) בריכוז סופי של 0.1 מק"ג/מ"ל (ריכוז פי 3 = 0.3 מק"ג/מ"ל). הוסף את הריאגנטים בסדר הבא: i) נוגדן; ב) אל"ר; iii) מדיום TSM. מערבבים על ידי pipetting. - לדלל את מגיב מדכא הרקע (BSR) בתווך TSM (או מדיה מתאימה לגידול תאים לקו תאים לפי בחירה) ב 1.5 mM (3x) כדי לקבל בסוף הבדיקה ריכוז סופי של 0.5 mM.
- בצע את בדיקת הפלישה ישירות בלוח התחתון העגול ULA 96 שבו נזרעו תאים בתחילה. בדוק את NS חזותית באמצעות מיקרוסקופ הפוך לפני שמתחילים.
- הסירו בעדינות ובאיטיות 75 מיקרוליטר/באר של המדיום, תוך הימנעות מלגעת בתחתית הבאר בה יושב ה-NS. בדוק את נוכחותו של NS באופן חזותי.
- הוסף בעדינות 25 μL של BSR לכל באר.
- הוסיפו בעדינות 25 μL של קומפלקס ALR/נוגדנים לכל באר. המתן 2 או 3 דקות כדי לתת לקומפלקס ALR/נוגדנים להתערבב עם המדיום.
- בדוק חזותית באמצעות מיקרוסקופ הפוך כדי לוודא שכל NS ממוקם במיקום מרכזי בתחתית הבאר. הימנע היווצרות של בועות. אם קיימת בועה כלשהי, הסר אותה באמצעות מחט.
- מניחים את הצלחת על קרח ומחכים 5 דקות כדי לתת לתחתית הצלחת להתקרר.
- עם קצה p200 מקורר מראש, מוציאים 75 μL/well של מטריצת קרום הבסיס (BMM), מניחים את קצה הפיפטה על הקיר הפנימי של הבאר ונמנעים מלגעת בתחתית הבאר. הימנע היווצרות של בועות ולהסיר עם מחט סטרילית את הקיימים.
הערה: הקפד להפשיר את BMM ב 4 °C מהלילה הקודם. - השאירו את הצלחת על קרח למשך 5 דקות כדי לתת ל-BMM להתערבב עם המדיום. בדוק חזותית באמצעות מיקרוסקופ הפוך את נוכחותם של NS וכי הם ממוקמים במרכז הבאר. אם לא, צנטריפוגר את הצלחת ב 4 ° C ב 180 x גרם במשך 5 דקות.
- מעבירים את הצלחת במכשיר ניתוח התא החי (טבלה של חומרים) הממוקם בתוך האינקובטור ב 37 ° C, 5% CO2, 95% לחות.
3. הכנת קומפלקס ALR/נוגדנים והכנה לבדיקת הנדידה
הערה: עבור הליך תיוג נוגדנים, פרוטוקול תוויותצבעים 10 עבור אימונוציטוכימיה של תאים חיים משמש.
- שקול את מספר הבארות לנתח ולחשב את הנפח הדרוש עבור כל מגיב. כלול גם את הבארות הדרושות לבקרות השליליות. בדוק את NS חזותית באמצעות מיקרוסקופ הפוך לפני שמתחילים.
- השתמשו בצלחות בעלות תחתית שטוחה של 96 בארות. בצע את הליך הציפוי כמתואר על ידי וינצ'י ואחרים, 201314. במחקר זה, ה-BMM משמש כציפוי דק.
- לאחר שהציפוי מוכן, הסירו את עודפי ציפוי ה-BMM עם קצה p200 תוך הנחת החוד בקצה הבאר והימנעות מנגיעה בתחתית. אם אתה עובד עם בארות מרובות, השתמש פיפטה רב ערוצית.
- חותכים קצה p200, לוקחים 50 μL של תווך התא + NS מכל באר שנבחרה, ומעבירים אותו לבאר תחתית שטוחה מצופה. בדוק את הנוכחות ואת המיקום של NS בכל באר חזותית.
הערה: כל NS חייב להיות ממוקם במיקום מרכזי בבאר. הימנעו מלהישען על קצה הבאר במהלך ההעברה, אך השליכו את המדיום למרכז הבאר מבלי לגעת בתחתית. עבור תאים נודדים מאוד, שקול מספר גבוה יותר של עותקים משוכפלים מאשר שלושת המשוכפלים הסטנדרטיים. הסיבה לכך היא שכאשר NS יושב קרוב מדי לקצה הבאר, התאים הנודדים עשויים לכסות שטח קטן יותר של הבאר. - יש לייבש מחדש את ה-ALR כמתואר לעיל (שלבים 2.2-2.3).
הערה: מגיב רגיש לאור. ראה לעיל נהלי טיפול טובים. - ערבבו את הנוגדן עם ALR במצע צמיחת התאים המלא המתאים בצלחת מרובת בארות תחתונה עגולה או בצינור ענבר והגנו מפני אור. הכינו כמות מספקת כדי להוציא 50 מיקרוליטר/באר בריכוז סופי פי 3. יש לדגור ב-RT למשך 15 דקות.
הערה: הוסף את הריאגנטים בסדר כפי שצוין לעיל (שלב 2.4). - בצע את אותו הליך כפי שדווח בשלב 2.5.
- מוסיפים בעדינות 50 μL של BSR לכל באר.
- הוסיפו בעדינות 50 μL של ALR/נוגדן לכל באר. המתינו 2 או 3 דקות כדי לאפשר לריאגנטים להתערבב ובדקו ויזואלית באמצעות מיקרוסקופ הפוך כדי לוודא שרוב ה-NS המשוכפלים ממוקמים במיקום מרכזי בבאר.
- הימנע היווצרות של בועות ולהסיר את כל הקיימים באמצעות מחט. העבר בעדינות את הצלחת במכשיר ניתוח התא החי הממוקם בתוך האינקובטור ב 37 ° C, 5% CO2, 95% לחות.
4. הגדרת מכשיר ניתוח תאים חיים לרכישת תמונה
- סרוק את הלוחות באמצעות מכשיר ניתוח תאים חיים (לקבלת מפרטים, ראה טבלת חומרים) עם מרווחי סריקה החל מנקודת זמן אפס (t0) של מבחני הפלישה והנדידה שהוגדרו, בהתאמה, לאחר שלב 2.14. ו-3.10. עד 96 שעות.
הערה: ודא שאתה מסוגל להיפטר ממכשיר ניתוח התאים החיים מיד לאחר תחילת הפלישה ומבחן ההגירה. בהתאם לסוג הגידול, תאים יכולים להתחיל לפלוש או לנדוד מה- NS כבר תוך שעה אחת מהגדרת הבדיקה. - בתוכנת המכשיר לניתוח תאים חיים, בחר באפשרות תזמון להשגה. לחץ על הכרטיסייה + ובחר באפשרות סרוק לפי תזמון.
- בחלון התוכנה צור או שחזר כלי, לחץ על האפשרות חדש.
- בחר את היישום הספציפי במכשיר ניתוח התא החי עבור הפלישה ורכישת ההגירה. בחר Type Spheroid Scan type, 4x objective, Phase+Brightfield וערוצי תמונה ירוקים לבדיקת הפלישה. בחר סוג סריקה של שכפול דילול, מטרה 4x ושלב וירוק עבור בדיקת ההעברה.
- בחר את סוג הלוח והגדר את הבארות לסריקה על-ידי הדגשתן במפת הלוחות.
- הגדר את תדירות הסריקה (עבור הניסויים בפרוטוקול זה תדירות הסריקה הייתה 15 דקות לפלישה ו -30 דקות להגירה).
- לחץ על הוסף ללוח זמנים והתחל בסריקה.
5. הגדרת מכשיר ניתוח תאים חיים לניתוח תמונה
- בחר בכרטיסיה צור הגדרת ניתוח חדשה.
- בחר Spheroid Invasion או יישום Basic Analyzer עבור פלישה והגירה, בהתאמה, בכרטיסייה.
- בחרו בערוצים המתאימים לפלישה ולהעברה (לפלישה: פאזה+שדה בהיר-ירוק; להעברה: פאזה-ירוק) בערוץ התמונה.
- בחר כמה תמונות מייצגות מ- 3-4 בארות לתצוגה מקדימה ולליטוש הגדרת הניתוח.
- עבור מבחן הפלישה, בכרטיסייה Analysis Definition , התאם את הגדרות היישום בערוצים Brightfield ו - Green עם ההגדרה הבאה כדי ליצור פילוח מדויק בין התאים הספרואידיים השלמים והתאים הפולשים (ראה איור 5; מסיכה כחולה):
סגמנטציה של שדה בהיר: רגישות כדורית שלמה = 50; רגישות התא הפולש = 100; ניקוי = ברירת מחדל.
מסנני ספרואידים שלמים: הגדר את כל הפרמטרים כברירת מחדל.
מסנני תאים פולשים: הגדר את כל הפרמטרים כברירת מחדל.
פילוח ירוק: רדיוס = 900. - עבור בדיקת העברה, התאם את הגדרות היישום בערוצים פאזה וירוק כדי ליצור פילוח מדויק בין המפגש והתאים הירוקים (ראה איור 5, מסיכות צהובות וורודות) עם ההגדרה הבאה:
שלב: הגדר את כל הפרמטרים כברירת מחדל.
פילוח ירוק: רדיוס = 300; סף = 1000
ניקוי: מילוי חור = 400; מסננים = ברירת מחדל.
Whole Well: הגדר את כל הפרמטרים כברירת מחדל. - בדוק שהגדרות הניתוח נכונות עבור NS על ידי לחיצה אקראית על מספר בארות. הפילוח חייב לשרטט את הספרואידים. אם לא, התאם את ההגדרה בהתאם.
- בחר את הבארות ונקודות הזמן לניתוח.
- שמור את הגדרת הניתוח ולחץ על סיום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול אימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים עבור פלישה והגירה מסוכם בתהליך עבודה פשוט וניתן לשחזור באיור 1. על ידי זריעת תאי DMG בלוחות תחתונים עגולים ULA 96, NS בגודל הניתן לשחזור מתקבלים ומשמשים בשלבים המוצגים. כאשר NS הגיעו לגודל האידיאלי של ~ 300 מיקרומטר (כ -4 ימים לאחר הזריעה) הפלישה12 והגירה14 בדיקות מתחילות. הוספת קומפלקס ALR/נוגדנים יחד עם מדכא הרקע בתווך של NS הבודד, מאפשרת לעקוב אחר ביטוי הסמן הספציפי על קרום התא, בהדמיה חיה ולאורך זמן. ביטוי סמן פני השטח במהלך הפלישה והנדידה של התא מנוטר בקלות במרווחי זמן החל מ- t = 0 ועד 96 שעות באמצעות מכשיר ניתוח התא החי. מערכת הדמיה זו מאפשרת ניתוח תמונה אוטומטי לחלוטין.
קו תאים עיקרי שמקורו בחולה, QCTB-R059, שימש כדי להדגים את הפלישה וההגירה של הפצת גידולי DMG בילדים. QCTB-R059 צוין במקור כקו תאי גליובלסטומה תלמית לילדים (GBM)15. מאוחר יותר, הוא צוין כקו תאי גליומה תלמית H3-K27M 16 או קו תאי גליומה מפוזר בקו האמצע (DMG) H3-K27M קו תא 11, בעקבות סיווג ארגון הבריאות העולמי משנת 2016 של גידולי מוח עם הצגת מוטנט DMG H3F3A K27M כישות חדשה 17.
CD44, מולקולת הדבקה הידועה כמעורבת בנדידת תאים ופלישה, נחקרה. CD44 מבוטא על-ידי תאי QCTB-R059 כפי שמודגם על-ידי תמונות קונפוקליות של צביעה אימונופלואורסצנטית (IF) על נדידת תאים תלת-ממדית אל (איור 2), ופלישה לתוך (איור 3) BMM.
בהתחשב בכך שפלישה תלת-ממדית והגירה הן תהליכים לא סטטיים, חשבנו לחקור את הביטוי של CD44 לאורך זמן כאשר תאים נמצאים בתנועה. לשם כך השתמשנו בבדיקת אימונוציטוכימיה של תאים חיים והתאמנו את הפרוטוקול לבדיקות תלת-ממדיות. על ידי שימוש ב- ALR בקומפלקס עם נוגדן אנטי CD44, אנו מסוגלים לעקוב בזמן אמת אחר הביטוי של CD44 כאשר החלבון מבוטא על קרום התא בעוד התאים חומקים מהנוירוספרות ומתפשטים לתוך ולתוך BMM.
האימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים מאפשרת הדמיה של ביטוי CD44 (וידאו משלים 1 ווידאו משלים 2). המסגרות המייצגות של הילוך הזמן, הן עבור הגירה והן עבור פלישה (איור 4A,B), מראות בפירוט רב יותר את הביטוי לסירוגין של CD44 על קרום התא. בפרט, ניתן לראות את האות הפלואורסצנטי הירוק דולק (עיגול ירוק) ואז כבוי (עיגול שחור) על אותו תא שנצפה לאורך זמן, מה שמרמז על כך שהביטוי של CD44 מופעל ונכבה בזמן שתאים נודדים ופולשים.
תהליכי ההגירה והפלישה נמצאים במעקב במשך 96 שעות, וכפי שמוצג באיור 5, תאי QCTB-R059 מראים רמה גבוהה של CD44, מה שמוכיח שבסך הכל הביטוי שנצפה באימונוציטוכימיה של תאים חיים עולה בקנה אחד עם הביטוי של CD44 שהתקבל על-ידי IF שמוצג בתמונות קונפוקליות באיור 2 ובאיור 3. עם זאת, שמנו לב גם שכאשר משתמשים בנוגדן נגד CD44 על תאים חיים, הוא משפיע על המורפולוגיה של התא, וגורם למעבר מפלישה דמוית מזנכימלית לפלישה דמוית אמבואידים. הוא גורם לירידה ביכולת הפולשנית והנדידה של התאים האלה (איור משלים 1). עם זאת, איננו יכולים להוציא מכלל אפשרות שהירידה בנדידת התאים ובפלישה שנצפתה נובעת בחלקה גם מעיכוב של התפשטות תאים.
ניתוח התמונה האוטומטי שבוצע במכשיר ניתוח התאים החיים מראה את כימות ביטוי CD44 וגידולו לאורך זמן, שנמדד על-ידי האות הפלואורסצנטי הירוק הכולל הקשור ל-ALR (איור 5B,C) הן עבור הגירה והן עבור פלישה. הכימות מושג כפי שמודגם באיור 5B ובאיור 5C, כאשר ניתוח התמונה האוטומטי מוגדר לפלח את כל השטח המכוסה על ידי התאים הירוקים של CD44 (איור 4B) ואת כל אזור ההתפשטות המכוסה על ידי התאים שפלשו לירוק CD44, אך למעט ליבת הנוירוספירה (איור 5C).
איור 1: זרימת עבודה סכמטית של בדיקות אימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים. זרימת העבודה מציגה את השלבים הכרוכים בפלישה תלת-ממדית ובשיטות הדמיה חיה של הגירה, כולל תמונות מייצגות של תאים ראשוניים שמקורם בחולה DMG בילדים (QCTB-R059) לאחר פלישה לתוך (פאנל עליון; t = 96 שעות) והעברה אל (לוח תחתון; t = 96 שעות) BMM. ברים = 800 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ביטוי CD44 בנדידת תאי גידול תלת-ממדיים. תמונות קונפוקליות אימונופלואורסצנטיות מייצגות של ביטוי CD44 בתאים ראשוניים שמקורם בחולה DMG (QCTB-R059) עם המעבר ל- BMM. נקודת זמן = 96 שעות (אדום: CD44; כחול: גרעינים). פסי קנה מידה: 500 מיקרומטר (פנל עליון) ו-200 מיקרומטר (פנל תחתון). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ביטוי CD44 בפלישה תלת-ממדית של תאי גידול. תמונות קונפוקליות אימונופלואורסצנטיות מייצגות של ביטוי CD44 בתאים ראשוניים שמקורם בחולה DMG (QCTB-R059) עם הפלישה ל- BMM. נקודת זמן = 96 שעות (אדום: CD44; כחול: גרעינים). פסי קנה מידה: 250 מיקרומטר (פנל עליון) ו-100 מיקרומטר (פנל תחתון). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ביטוי CD44 לאורך זמן. מסגרות נבחרות של העברת QCTB-R059 (A) ופלישה (B) בהילוך מהיר. התמונות התקבלו במכשיר ההדמיה של התא החי. עיגול ירוק מציין את הביטוי של CD44, עיגול שחור מציין שאין ביטוי CD44 על קרום התא של אותו תא שנצפה לאורך זמן. פסי קנה מידה: 200 מיקרומטר (A) ו- 100 מיקרומטר (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: בדיקות אימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים עבור CD44: הגירה ופלישה. (A) מוצגים שדה בהיר מייצג, פלואורסצנטי (ALR עם נוגדן נגד CD44), ותמונות מיזוג של נדידת אימונוציטוכימיה של תאים QCTB-R059 ופלישה (96 שעות). פסי קנה מידה: 400 מיקרומטר. (B) כימות הביטוי הכולל של CD44 יחסית להגירה (B) ולפלישה (C), שנקבע על ידי ניתוח תמונה ALR-anti-CD44 במכשיר הדמיה של תאים חיים. העקומות מציגות את העוצמה הממוצעת הירוקה של ביטוי CD44 לאורך זמן. הערכים הם ממוצעים ± SD. שתי הדמויות הקטנות בחלקות מציגות את הפילוח שהוחל לניתוח ההגירה (B) שבה נלקח בחשבון כל השטח והפלישה (C) שלגביה לא נכלל החלק המרכזי של NS. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: השפעת נוגדנים נגד CD44 על המורפולוגיה של התא ועל מידת תנועתיות התא. תמונות מייצגות של בדיקת הפלישה וההגירה של QCTB-R059 מראות את ההשפעה של נוגדן אנטי-CD44 המשמש לאימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים. תאים מציגים יכולת פלישה והגירה מופחתת, כמו גם את המעבר מדפוס פלישה דמוי מזנכימלית יותר לדפוס פלישה דמוי אמבוידים בין הבקרה השלילית (ללא נוגדן נגד CD44) לבין CD44 (בתוספת נוגדן נגד CD44). לוח תחתון מציג הגדלת הספק גבוהה יותר, ומציג תצוגה ברורה יותר על המראה המורפולוגי של התאים בהיעדר ונוכחות נוגדן נגד CD44 (חצים לבנים). פסי קנה מידה: פנל עליון של 800 מיקרומטר ופנל תחתון של 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
סרטון משלים 1: סרטון קיטועי זמן של נדידת תאים תלת-ממדית QCTB-R059 ב-BMM בנוכחות נוגדן אנטי-CD44. אות ירוק פלואורסצנטי, המייצג את הביטוי של CD44 על קרום התא, הוא דמיינו לאורך זמן על ידי הצמידות של נוגדן אנטי CD44 עם ALR. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
סרטון משלים 2: סרטון קיטועי זמן של פלישת תאים תלת-ממדיים QCTB-R059 ב-BMM בנוכחות נוגדן אנטי-CD44. אות ירוק פלואורסצנטי, המייצג את הביטוי של CD44 על קרום התא, הוא דמיינו לאורך זמן על ידי הצמידות של נוגדן אנטי CD44 עם ALR. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
האימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים שאימצנו כאן לפלישה והגירה של DMG בילדים יכולה להיות מותאמת בקלות גם לסוגים אחרים של תאי גידול פולשניים מאוד, כולל שורות תאים של סרטן השד והמעי הגס.
בשונה מבדיקות אימונוציטוכימיה של תאים דו-ממדיים חייםשבוצעו בעבר 10, כאשר עובדים בתלת-ממד, מומלץ לשים לב לכמה שלבים קריטיים. בפרט, עבור בדיקת הפלישה שאנו מתארים, מומלץ להוסיף את תערובת ה- ALR/נוגדנים ישירות למדיום עם NS בכל באר, לפני הוספת ה- BMM, ולא ב- BMM או על גבי ה- BMM לאחר הג'ל. זאת כדי לאפשר שילוב טוב של הריאגנטים עם המדיום ולהבטיח גישה ישירה יותר של הריאגנטים לפני השטח של התא. יתר על כן, כדי להבטיח איכות טובה יותר של ההדמיה, למרות שהפרוטוקול כולל את השימוש ב- BSR, אנו ממליצים להשתמש במדיום ללא פנול אדום ו- BMM.
נקודה נוספת שיש לקחת בחשבון עבור אימונוציטוכימיה של תאים חיים היא שכל נוגדן הקושר חלבון קרום חוץ-תאי על תאים חיים עשוי להשפיע על תפקוד החלבון על ידי שינוי הקונפורמציה שלו או על ידי תפיסת אתר הקישור של ליגנד או של חלבון בתא סמוך, ולכן פועל כ"סוכן חוסם"18,19. בעוד שגישה זו עשויה להיות שימושית כאסטרטגיה טיפולית19, ייתכן שהיא אינה המטרה העיקרית של מערך ניסויי כלשהו. לכן, לפני ביצוע סדרה גדולה של ניסויים, נוגדנים שונים הקושרים אפיטופים שונים של אותו חלבון צריכים להיבדק כדי לאמת גם כל אפקט "חוסם" פוטנציאלי. במחקר זה, השתמשנו בנוגדן ספציפי כדי לעקוב בזמן אמת אחר הביטוי של CD44 על קרום התא של קו תאי DMG אגרסיבי מאוד בילדים בפלישה והגירה תלת-ממדית. הפרוטוקול שבו נעשה שימוש אפשר לנו למדוד כמותית את הביטוי של CD44 לאורך זמן על תאים פולשים ונודדים. באופן מעניין, בנוכחות נוגדן נגד CD44, ציינו גם ירידה בתנועתיות התאים בהשוואה לתאים עם ALR אך בהיעדר הנוגדן. איננו יכולים לשלול גם השפעה מעכבת על התפשטות תאים. רכישת דפוס פלישה שונה עם מעבר ממורפולוגיה של תאים דמויי מזנכימלית למורפולוגיה של תאים דמויי אמבואידים20 נצפתה גם בנוכחות נוגדנים נגד CD44. תוצאות בלתי צפויות אלה מצביעות על כך שחסימת CD44 עשויה לתרום למעבר מזנכימלי לאמבואיד ב- DMG ילדים.
באשר למגבלות של פרוטוקול זה, בהתחשב ברזולוציה של מצלמת CCD של מכשיר ניתוח התא החי Incucyte ויכולת מחסנית z המוגבלת שלה, ההתקנה שאנו מציגים עבור בדיקות אימונוציטוכימיה של תאים חיים בתלת-ממד עשויה לשמש כגישה ראשונית, בפורמט רב-באר בקנה מידה גדול, לפני המעבר לניתוח מעמיק יותר באמצעות מערכות הדמיה פלואורסצנטיות חזקות יותר (למשל, מיקרוסקופים קונפוקליים ומערכת הדמיה בעלת תוכן גבוה עם מודאליות קונפוקלית כגון אופרטה CLS או אופרה פוניקס) או גישה מעודנת יותר לחקר בזמן אמת ביטוי של חלבון פני השטח באמצעות בדיקת כתב21.
יישום רחב יותר של האימונוציטוכימיה של התא החי-תלת-ממדי המוצג כאן כמונוקולטורה, יכול להיות מבחן תרבית משותפת תלת-ממדית שהוקם כדי לצלם ולנתח באינטראקציות ישירות בזמן אמת בין תאים לתאים. במקרה זה, ניתן להשתמש בשני ALR שונים עם פלואורופורים שונים כדי לקשור חלבונים המבוטאים באופן ספציפי על קרום התא על סוגי תאים שונים (למשל, תאי גידול ותאי מערכת החיסון). במקרה זה, ניתן לנתח מגע ישיר בין התא לתא באמצעות הדמיה חיה על ידי לוקליזציה משותפת של שני מתחמי ALR / נוגדנים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין קשרים רלוונטיים או מעורבות כספית עם ארגון או ישות כלשהם בעלי עניין כספי או סכסוך כספי עם הנושא או החומרים הנדונים בכתב היד.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לד"ר סילביה סודו ולד"ר ג'וליה פדריצ'י (היחידה לרשתות סלולריות ומטרות טיפוליות מולקולריות, המכון הלאומי לסרטן IRCCS-Regina Elena, רומא, איטליה) על הגישה למערכת IncuCyte S3 Live Cell Imaging System בהגדרה הראשונית של פרוטוקול ההדמיה. יתר על כן, אנו מודים לברנדט קולוזווארי על הייעוץ הטכני. המחקר נתמך על ידי מענק ילדים חולי סרטן בבריטניה (16-234) ומשרד הבריאות האיטלקי Ricerca Corrente. M וינצ'י הוא עמית ילדים חולי סרטן בבריטניה. R Ferretti הוא חתן מלגת Fondazione Veronesi (2018 ו 2019). המחברים מודים ל-Fondazione Heal על תמיכתם ולקרן בית החולים לילדים על מימון בנק גידולי הילדים של קווינסלנד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well TC-Treated Microplates | Corning | 3595 | size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution for neurosphere dissociation |
| Burker chamber | Mv medical | FFL16034 | cell counting chamber |
| CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
| Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye | Incucyte | 4743 | Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry |
| Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | - | The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays. |
| Inverted Microscope | - | any inverted microscope | |
| Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
| Tumor stem cell (TSM) medium | - | - | growth cell medium (see reference in the text for details) |
| Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, round bottom clear |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
- Magrì, A., Bardelli, A. Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).
- Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
- Caretti, V., et al. Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma. Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).
- Pericoli, G., et al. Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763 (2020).
- Vinci, M., et al. Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells. Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).
- Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies. Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).
- Huang, C. C., et al. Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells. PLoS One. 10 (6), 0128045 (2015).
- Prudner, B. C., et al. Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors. Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).
- Ferretti, R., et al. Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction. Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
- Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 64 (2018).
- Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).
- Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).
- Mount, C. W., et al. Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M. Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Czabanka, M., et al. Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209 (2020).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Panková, K., Rösel, D., Novotný, M., Brábek, J. The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
