Summary
Este estudo apresenta um protocolo de imunocitoquímica de células vivas 3D aplicado a uma linhagem celular pediátrica de glioma difuso da linha média, útil para estudar em tempo real a expressão de proteínas na membrana plasmática durante processos dinâmicos como invasão e migração de células 3D.
Abstract
A migração e invasão celular são características específicas dos tumores mutantes H3K27M de glioma difuso da linha média (DMG). Já modelamos essas características usando ensaios tridimensionais (3D) de invasão e migração baseados em células. Neste estudo, otimizamos esses ensaios 3D para imunocitoquímica de células vivas. Um Antibody Labeling Reagent foi usado para detectar em tempo real a expressão da molécula de adesão CD44, na membrana plasmática de células migratórias e invasoras de uma linhagem celular primária derivada de paciente DMG H3K27M. O CD44 está associado ao fenótipo de células-tronco cancerígenas e à migração e invasão de células tumorais e está envolvido nas interações diretas com a matriz extracelular do sistema nervoso central (SNC). As neuroesferas (NS) da linhagem celular DMG H3K27M foram embutidas na matriz de membrana basal (BMM) ou colocadas em uma fina camada de revestimento de BMM, na presença de um anticorpo anti-CD44 em conjunto com o reagente de marcação de anticorpos (ALR). A análise de imagens imunocitoquímicas de células vivas em 3D foi realizada em um instrumento de análise de células vivas para medir quantitativamente a expressão global de CD44, especificamente nas células migrantes e invasoras. O método também permite visualizar em tempo real a expressão intermitente de CD44 na membrana plasmática de células migratórias e invasoras. Além disso, o ensaio também forneceu novos conhecimentos sobre o papel potencial do CD44 na transição mesenquimal para ameboide em células DMG H3K27M.
Introduction
A capacidade das células tumorais de evadir e disseminar-se através do tecido circundante é uma característica do câncer1. Em particular, a motilidade das células tumorais é uma característica dos tumores malignos, seja um tipo de tumor metastático, comoo câncer de mama2 ou colorretal3, ou um tipo localmente invasivo, como o gliomadifuso4,5.
Os exames de imagem têm um papel central na investigação de muitos aspectos dos fenótipos de células tumorais; No entanto, a imagem de células vivas é definitivamente preferida quando se estudam processos celulares dinâmicos, como migração e invasão, quando ocorrem mudanças na morfologia e na interaçãocélula-célula6,7 e podem ser mais facilmente examinadas ao longo do tempo. Para imagens de células vivas, diferentes sistemas de microscopia óptica podem ser usados, desde contraste de fase até microscópios confocais fluorescentes, e aquisição de imagens realizadas por um curto ou longo período de tempo em um microscópio invertido equipado com uma câmara para controle de temperatura e CO2, ou em sistemas de análise de imagem de alto conteúdo que possuem câmaras embutidas, ou alternativamente em sistemas de imagem que podem ficar na incubadora sem a necessidade de perturbar as células durante toda a duração do experimento. A escolha do sistema utilizado é frequentemente ditada por uma série de fatores, tais como a resolução necessária, a duração do tempo total de aquisição e intervalos de tempo, o tipo de vaso utilizado e o rendimento do ensaio (câmara única ou placa de poço múltiplo), a sensibilidade das células utilizadas (células preciosas e/ou raras) e a fototoxicidade das células se fluoroforóricos estiverem presentes.
No que diz respeito à imagem fluorescente em modo vivo, isso pode ser obtido pela transdução de células para a expressão de proteínas fluorescentes para expressão estável ou como um sistema induzível8, por transfecção celular transitória ou pelo uso de corantes celulares que agora estão disponíveis para marcação de células vivas7, para rastreamento de células vivas e para marcação de organelas subcelulares9.
Uma abordagem útil foi recentemente desenvolvida para imunocitoquímica de células vivas, onde um anticorpo reconhecendo um marcador de superfície de escolha pode ser ligado a um reagente de marcação e, após adição ao meio de cultura, as células que expressam o marcador específico podem ser prontamente imageadas em tempo real por imagens de células vivas. A visualização e quantificação da expressão de marcadores por este sistema podem ser facilmente obtidas quando as células são cultivadas em condições de cultura bidimensional (2D)10.
Neste estudo, otimizamos protocolos para invasão imunocitoquímica de células vivas 3D e migração de células pediátricas derivadas de glioma difuso da linha média (DMG)do paciente 11,12. DMG são tumores cerebrais altamente agressivos que afetam crianças, para a grande maioria associados com a mutação condutora K27M em variantes de histona H3. As DMG surgem no tronco cerebral e nas regiões da linha média do sistema nervoso central (SNC) e são caracterizadas por uma natureza altamente infiltrativa. Demonstrou-se que essa capacidade invasiva é, pelo menos em parte, mediada pela heterogeneidade intratumoral e pelas características cancerígenas das células DMG7.
Para exemplificar nossos ensaios, um reagente de marcação de anticorpos (ALR) foi usado em combinação com um anticorpo para CD44. CD44 é uma glicoproteína transmembrana e molécula de adesão expressa em células-tronco e outros tipos celulares, associada ao fenótipo de células-tronco cancerígenas e à migração e invasão de célulastumorais13. Os protocolos incluem a preparação da amostra, a aquisição da imagem em modo de campo claro e fluorescente e a análise em um instrumento de análise de células vivas que permitiu medir quantitativamente em tempo real a expressão global de CD44 na membrana celular DMG durante a invasão e migração 3D. Os ensaios também permitiram visualizar o sinal fluorescente intermitente de CD44 em células individuais durante a migração e a invasão. Curiosamente, um efeito do anticorpo anti-CD44 também foi observado, que potencialmente agindo como um anticorpo bloqueador, também pareceu reduzir a migração e invasão celular, bem como induzir uma mudança do padrão de invasão de um mesenquimal coletivo para um fenótipo amebóide-like de célula única.
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Protocol
Este protocolo segue as diretrizes dos comitês de ética em pesquisa com seres humanos das instituições.
NOTA: Este estudo foi realizado utilizando o Incucyte S3 e/ou SX5 Live-Cell Analysis Instrument (referenciado como instrumento de análise de células vivas).
1. Geração de esferoides tumorais de tamanho reprodutível
NOTA: O protocolo (seção 1) descrito por Vinci et al., 2015 7,12, foi utilizado conforme relatado a seguir, com algumas modificações:
- Coletar as neuroesferas mutantes (NS) DMG H3K27M e centrifugar a 170 x g por 10 minutos (min) à temperatura ambiente (TR).
- Incubar o SN com 500 μL da solução de acutase durante 3 minutos a 37 °C para os quebrar.
- Neutralizar a solução de acutase com meio de células-tronco tumorais (TSM)7 e centrifugar a suspensão celular a 355 x g por 5 min na RT.
- Ressuspender o pellet de células em 1 mL de meio TSM e, em seguida, contar as células usando uma câmara de contagem de células.
- Diluir a suspensão celular para obter 2,5-5 x 103células/mL e semear 100 μL/poço em placas de fundo redondo de 96 poços de fixação ultrabaixa (ULA) (ver Tabela de Materiais). Use uma densidade celular adequada para obter NS individual de ~300 μm de diâmetro, 4 dias após a semeadura celular (250-500 células/poço para células de glioma altamente agressivas).
- Confirmar visualmente a formação de SN usando um microscópio invertido 4 dias após a semeadura celular.
2. Preparo do complexo ALR/anticorpo e configuração para o ensaio de invasão
NOTA: Para o procedimento de marcação de anticorpos, o protocolo de marcação de anticorpos10 para imunocitoquímica de células vivas é usado com algumas modificações, conforme relatado abaixo. Para o ensaio de invasão, é seguido o protocolo descrito anteriormente por Vinci etal.12 12 .
- Considere o número de poços (por exemplo, 60 poços) para analisar e calcular o volume necessário para cada reagente. Incluir também os poços para o controle negativo (amostras com ALR, mas sem anticorpo).
- Adicionar 100 μL de água estéril à ALR para reidratar o reagente (concentração final = 0,5 mg/mL). Pipetar para misturar a solução.
NOTA: O reagente é sensível à luz; portanto, mantenha-se no escuro. Aliquot as sobras de reagente e armazenar a -80 °C (evitar congelamento e descongelamento). - Misture o anticorpo com a ALR no meio TSM (ou meio de crescimento celular apropriado para a linha celular de escolha) em uma placa de fundo redondo de vários poços ou em um tubo âmbar e proteja da luz.
- Preparar quantidade suficiente do meio para dispensar 25 μL/poço na concentração final do ensaio de 3x. Incubar em TR por 15 min.
NOTA: Recomenda-se uma razão molar de 1:3 de anticorpo para ALR, com uma concentração final (1x) do anticorpo teste <1,5 μg/mL. Para os experimentos deste protocolo é utilizado um anticorpo anti-humano CD44 de camundongo (concentração inicial 86 μg/mL) na concentração final de 0,1 μg/mL (concentração 3x = 0,3 μg/mL). Adicionar os reagentes na seguinte ordem: i) anticorpo; ii) ALR; iii) Meio TSM. Misture por pipetagem. - Diluir o reagente supressor de fundo (BSR) em meio TSM (ou meio de crescimento celular apropriado para a linhagem celular de escolha) a 1,5 mM (3x) para obter no final do ensaio uma concentração final de 0,5 mM.
- Realizar o ensaio de invasão diretamente na placa de fundo redondo de 96 poços da ULA, onde as células foram inicialmente semeadas. Verifique visualmente o SN usando um microscópio invertido antes de iniciar.
- Remover suave e lentamente 75 μL/poço do meio, evitando tocar o fundo do poço onde se encontra o SN. Verifique visualmente a presença do SN.
- Adicione suavemente 25 μL da BSR a cada poço.
- Adicione suavemente 25 μL do complexo ALR/anticorpo a cada poço. Aguarde 2 ou 3 minutos para deixar o complexo ALR/anticorpo misturar-se com o meio.
- Verifique visualmente usando um microscópio invertido para garantir que cada NS esteja localizado centralmente na parte inferior do poço. Evite a formação de bolhas. Se houver alguma bolha, remova-a usando uma agulha.
- Coloque a placa no gelo e espere 5 min para deixar o fundo da placa esfriar.
- Com uma ponta p200 pré-resfriada, dispense 75 μL/poço de matriz de membrana basal (BMM), colocando a ponta da pipeta na parede interna do poço e evitando tocar o fundo do poço. Evite a formação de bolhas e remova com uma agulha estéril as existentes.
NOTA: Certifique-se de ter descongelado o BMM a 4 °C da noite anterior. - Deixe a placa no gelo por 5 min para deixar o BMM misturar com o meio. Verificar visualmente, por meio de microscópio invertido, a presença do SN e se eles estão localizados centralmente no poço. Caso contrário, centrifugar a placa a 4 °C a 180 x g durante 5 min.
- Transfira a placa no instrumento de análise de células vivas (Tabela de Materiais) colocado dentro da incubadora a 37 °C, 5% CO2, 95% de umidade.
3. Preparação do complexo ALR/anticorpo e configuração para o ensaio de migração
NOTA: Para o procedimento de marcação de anticorpos, o protocolo de Marcação de Corantes10 para Imunocitoquímica de Células Vivas é usado.
- Considere o número de poços para analisar e calcular o volume necessário para cada reagente. Inclua também os poços necessários para os controles negativos. Verifique visualmente o SN usando um microscópio invertido antes de iniciar.
- Use placas de fundo plano de 96 poços. Realizar o procedimento de revestimento conforme descrito por Vinci et al., 201314. Para este estudo, o BMM é usado como um revestimento fino.
- Assim que o revestimento estiver pronto, remova o excesso de revestimento BMM com uma ponta p200 colocando a ponta na borda do poço e evitando tocar no fundo. Se estiver trabalhando com vários poços, use uma pipeta multicanal.
- Corte uma ponta p200, pegue 50 μL do meio celular + NS de cada poço selecionado e transfira-o para um poço de fundo plano revestido. Verifique visualmente a presença e a posição do SN em cada poço.
NOTA: Cada NS deve estar localizado centralmente no poço. Evite apoiar-se na ponta na borda do poço durante a transferência, mas solte o meio centralmente no poço sem tocar no fundo. Para células altamente migratórias, considere um número maior de réplicas do que as três réplicas padrão. Isso ocorre porque quando o NS fica muito perto da borda do poço, as células migratórias podem cobrir uma área menor do poço. - Reidratar a ALR conforme descrito acima (passos 2.2-2.3).
NOTA: O reagente é sensível à luz. Veja acima os bons procedimentos de manuseio. - Misture o anticorpo com ALR no meio de crescimento celular completo apropriado em uma placa de fundo redondo de vários poços ou em um tubo âmbar e proteja da luz. Preparar quantidade suficiente para dispensar 50 μL/poço a 3x concentração final do ensaio. Incubar em TR por 15 min.
NOTA: Adicione os reagentes na ordem indicada acima (passo 2.4). - Siga o mesmo procedimento relatado na etapa 2.5.
- Adicione suavemente 50 μL da BSR a cada poço.
- Adicione suavemente 50 μL de ALR/anticorpo a cada poço. Aguarde 2 ou 3 min para deixar os reagentes se misturarem e verifique visualmente usando um microscópio invertido para garantir que a maioria dos NS replicados estejam localizados centralmente no poço.
- Evite a formação de bolhas e remova as existentes usando uma agulha. Transfira suavemente a placa no instrumento de análise de células vivas colocado dentro da incubadora a 37 °C, 5% CO2, 95% de umidade.
4. Configuração do instrumento de análise de células vivas para aquisição de imagens
- Digitalize as placas usando o instrumento de análise de células vivas (para especificações, consulte Tabela de Materiais) com intervalos de varredura a partir do ponto de tempo zero (t0) dos ensaios de invasão e migração configurados, respectivamente, após a etapa 2.14. e 3.10. até 96 h.
NOTA: Garantir a possibilidade de eliminar o instrumento de análise de células vivas imediatamente após o início do ensaio de invasão e migração. Dependendo do tipo de tumor, as células podem começar a invadir ou migrar da SN já dentro de 1 h da instalação do ensaio. - No software de instrumento de análise de células vivas, selecione a opção Programar para Adquirir. Clique na guia + e selecione a opção Digitalizar no agendamento.
- Na janela do software Create or Restore Vessel, clique na opção New.
- Selecione a aplicação específica no instrumento de análise de células vivas para a aquisição de invasão e migração. Selecione Tipo de varredura esferoide , objetiva 4x, Phase+Brightfield e canais de imagem verde para o ensaio de invasão. Selecione Tipo de varredura de clonagem de diluição , Objetivo 4x e Fase e Verde para o ensaio de migração.
- Selecione o tipo de placa e defina os poços a serem escaneados, destacando-os no mapa da placa.
- Definir a frequência de varredura (para os experimentos neste protocolo, a frequência de varredura foi de 15 min para invasão e 30 min para migração).
- Clique em Adicionar à programação e inicie a verificação.
5. Configuração do instrumento de análise de células vivas para análise de imagens
- Selecione a guia Criar Nova Definição de Análise.
- Selecione o aplicativo Spheroid Invasion ou Basic Analyzer para invasão e migração, respectivamente, na guia.
- Selecione os canais apropriados de invasão e migração (para Invasão: Fase+Brightfield-Green; para Migração: Fase-Verde) no canal de imagem.
- Selecione algumas imagens representativas de 3-4 poços para visualizar e refinar a configuração de análise.
- Para o ensaio de invasão, na guia Definição de análise , ajuste as configurações do aplicativo nos canais Brightfield e Green com a seguinte configuração para gerar uma segmentação precisa entre as células esferoides inteiras e invasoras (consulte a Figura 5; máscara azul):
Segmentação de Campo Brilhante: Sensibilidade Esferoide Inteira = 50; Sensibilidade de Células Invasoras = 100; Limpar = padrão.
Filtros Esferoides Inteiros: defina todos os parâmetros como padrão.
Filtros de células invasoras: defina todos os parâmetros como padrão.
Segmentação Verde: Raio = 900. - Para o ensaio de migração, ajuste as configurações do aplicativo nos canais Phase e Green para gerar uma segmentação precisa entre as células Confluence e Green (consulte a Figura 5, máscaras amarelas e rosas) com a seguinte configuração:
Fase: defina todos os parâmetros como padrão.
Segmentação Verde: Raio = 300; Limiar = 1000
Limpeza: Preenchimento de furo = 400; Filtros = padrão.
Whole Well: defina todos os parâmetros como padrão. - Verifique se as configurações de análise estão corretas para o SN clicando aleatoriamente em vários poços. A segmentação deve delinear o esferoide. Caso contrário, ajuste a configuração de acordo.
- Selecione os poços e os pontos de tempo a serem analisados.
- Salve a Definição de Análise e clique em Concluir.
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Representative Results
O protocolo de imunocitoquímica de células vivas 3D para invasão e migração é resumido em um fluxo de trabalho simples e reprodutível na Figura 1. Ao semear as células DMG em placas de fundo redondo ULA 96 poços, NS de tamanho reprodutível são obtidos e usados nas etapas exibidas. Quando o SN atinge o tamanho ideal de ~300 μm (aproximadamente 4 dias pós-semeadura), iniciam-se os ensaios de invasão12 e migração14 . A adição do complexo ALR/anticorpo, juntamente com o supressor de fundo no meio da SN individual, permite seguir a expressão específica do marcador na membrana celular, em imagens ao vivo e ao longo do tempo. A expressão de marcadores de superfície durante a invasão e migração celular é facilmente monitorada em intervalos que vão de t = 0 até 96 h usando o instrumento de análise de células vivas. Este sistema de imagem permite uma análise de imagem totalmente automatizada.
Uma linhagem celular primária derivada do paciente, QCTB-R059, foi usada para exemplificar as propriedades de invasão e migração da disseminação tumoral pediátrica de DMG. QCTB-R059 foi originalmente indicado como uma linhagem celular pediátrica de glioblastoma talâmico (GBM)15. Posteriormente, foi indicada como linhagem celular de glioma talâmico H3-K27M 16 ou glioma de linha média difusa (DMG) H3-K27M linhagemcelular 11, seguindo a classificação de tumores cerebrais da Organização Mundial da Saúde de 2016 com a introdução do mutante DMG H3F3A K27M como uma nova entidade17.
CD44, uma molécula de adesão conhecida por estar envolvida na migração e invasão celular, foi investigada. O CD44 é expresso por células QCTB-R059, como demonstrado por imagens confocais de coloração de imunofluorescência (IF) na migração de células 3D para (Figura 2) e invasão em (Figura 3) BMM.
Levando em consideração que a invasão e migração 3D são ambos processos não estáticos, pensamos em investigar a expressão de CD44 ao longo do tempo quando as células estão em movimento. Para tanto, empregamos o ensaio de imunocitoquímica de células vivas e adaptamos o protocolo para ensaios 3D. Usando a ALR em complexo com um anticorpo anti-CD44, somos capazes de acompanhar em tempo real a expressão de CD44 quando a proteína é expressa na membrana celular enquanto as células escapam das neuroesferas e se espalham para dentro e para o BMM.
A imunocitoquímica de células vivas 3D permite visualizar a expressão de CD44 (Vídeo Suplementar 1 e Vídeo Suplementar 2). Os quadros representativos do time-lapse, tanto para migração quanto para invasão (Figura 4A,B), mostram mais detalhadamente a expressão intermitente de CD44 na membrana celular. Em particular, é possível ver o sinal fluorescente verde ligado (círculo verde) e depois desligado (círculo preto) na mesma célula observada ao longo do tempo, sugerindo que a expressão de CD44 está ligada e desligada enquanto as células estão migrando e invadindo.
Os processos de migração e invasão são acompanhados ao longo de 96 h, e como mostrado na Figura 5, as células QCTB-R059 apresentam um alto nível de CD44, demonstrando que, no geral, a expressão observada com a imunocitoquímica de células vivas está de acordo com a expressão de CD44 obtida pelo FI mostrado nas imagens confocais da Figura 2 e Figura 3. Curiosamente, porém, também notamos que, quando o anticorpo anti-CD44 é usado em células vivas, ele afeta a morfologia celular, induzindo uma transição de invasão mesenquimal para ameboide. Induz à redução da capacidade invasiva e migratória dessas células (Figura 1 Suplementar). Não podemos excluir, porém, que a redução da migração e invasão celular observada também se deva, em parte, a uma inibição da proliferação celular.
A análise automatizada de imagens realizada no instrumento de análise de células vivas mostra a quantificação da expressão de CD44 e seu aumento ao longo do tempo, medido pelo sinal verde fluorescente global associado à ALR (Figura 5B,C) tanto para migração quanto para invasão. As quantificações são obtidas conforme exemplificado nas Figuras 5B e Figura 5C, com a análise automatizada das imagens definida para segmentar toda a área coberta pelas células CD44 verde-migradas (Figura 4B) e toda a área de dispersão coberta pelas células CD44 verde-invadidas, mas excluindo o núcleo da neuroesfera (Figura 5C).
Figura 1: Fluxo de trabalho esquemático dos ensaios de imunocitoquímica de células vivas 3D. O fluxo de trabalho mostra as etapas envolvidas nos métodos de imagem ao vivo de invasão e migração 3D, incluindo imagens representativas de células pediátricas primárias derivadas de pacientes com DMG (QCTB-R059) após invasão em (painel superior; t = 96 h) e migração para (painel inferior; t = 96 h) BMM. Barras = 800 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Expressão de CD44 na migração de células tumorais 3D. Imagens confocais de imunofluorescência representativa da expressão de CD44 em células primárias derivadas de pacientes com DMG (QCTB-R059) após a migração para BMM. Ponto de tempo = 96 h (vermelho:CD44; azul: núcleos). Barras de escala: 500 μm (painel superior) e 200 μm (painel inferior). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Expressão de CD44 na invasão de células tumorais 3D. Imagens confocais imunofluorescentes representativas da expressão de CD44 em células primárias derivadas de pacientes com DMG (QCTB-R059) após invasão ao BMM. Ponto de tempo = 96 h (vermelho:CD44; azul: núcleos). Barras de escala: 250 μm (painel superior) e 100 μm (painel inferior). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Expressão de CD44 ao longo do tempo. Quadros selecionados de time-lapse de migração (A) e invasão (B) do QCTB-R059. As imagens foram obtidas no instrumento de imagem de células vivas. Círculo verde indica a expressão de CD44, círculo preto indica nenhuma expressão de CD44 na membrana celular da mesma célula observada ao longo do tempo. Barras de escala: 200 μm (A) e 100 μm (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Ensaios de imunocitoquímica de células vivas 3D para CD44: migração e invasão. (A) Campo claro representativo, fluorescente (ALR com anticorpo anti-CD44) e imagens de fusão da migração e invasão imunocitoquímica de células QCTB-R059 (96 h) são mostradas. Barras de escala: 400 μm. (B) Quantificação da expressão global de CD44 em relação à migração (B) e invasão (C), determinada pela análise de imagens ALR-anti-CD44 no instrumento de imagem de células vivas. As curvas mostram a Intensidade Média Verde da expressão de CD44 ao longo do tempo. Os valores são médios ± DP. As duas figuras pequenas nos gráficos mostram a segmentação aplicada para a análise da migração (B) onde toda a área foi considerada e a invasão (C) para a qual a parte central do SN foi excluída. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Efeito do anticorpo anti-CD44 na morfologia celular e no grau de motilidade celular. Imagens representativas do ensaio de invasão e migração do QCTB-R059 mostram o efeito do anticorpo anti-CD44 usado para a imunocitoquímica de células vivas 3D. As células exibem uma reduzida capacidade de invasão e migração, bem como a transição de um padrão de invasão mais mesenquimal para amebóide-like entre o controle negativo (sem anticorpo anti-CD44) e CD44 (mais anticorpo anti-CD44). O painel inferior mostra maior ampliação de potência, mostrando uma visão mais clara sobre a aparência morfológica das células na ausência e a presença do anticorpo anti-CD44 (setas brancas). Barras de escala: painel superior de 800 μm e painel inferior de 100 μm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Vídeo Suplementar 1: Vídeo time-lapse da migração de células 3D QCTB-R059 em BMM na presença de anticorpo anti-CD44. O sinal verde fluorescente, que representa a expressão de CD44 na membrana celular, é visualizado ao longo do tempo pela conjugação do anticorpo anti-CD44 com a ALR. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo Suplementar 2: Vídeo time-lapse da invasão celular 3D QCTB-R059 em BMM na presença de anticorpo anti-CD44. O sinal verde fluorescente, que representa a expressão de CD44 na membrana celular, é visualizado ao longo do tempo pela conjugação do anticorpo anti-CD44 com a ALR. Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
A imunocitoquímica de células vivas 3D que adotamos aqui para invasão e migração de DMG pediátrica pode ser facilmente adaptada também para outros tipos de células tumorais altamente invasivas, incluindo linhagens de células de câncer de mama e cólon.
Diferentemente dos ensaios de imunocitoquímica de células vivas2D previamente realizados 10, quando se trabalha em 3D, sugere-se atentar para algumas etapas críticas. Em particular, para o ensaio de invasão que descrevemos, é aconselhável adicionar a mistura ALR/anticorpo diretamente ao meio com SN em cada poço, antes da adição do BMM, e não no BMM ou em cima do BMM uma vez gelificado. Isso é para permitir uma boa mistura dos reagentes com o meio e garantir um acesso mais direto dos reagentes à superfície celular. Além disso, para garantir uma melhor qualidade da imagem, embora o protocolo inclua o uso da BSR, aconselhamos o uso de meio livre de fenol vermelho e BMM.
Outro ponto a ser considerado para a imunocitoquímica de células vivas é que qualquer anticorpo que se ligue a uma proteína de membrana extracelular em células vivas pode afetar a função da proteína alterando sua conformação ou ocupando o sítio de ligação de um ligante ou de uma proteína em uma célula adjacente, agindo assim como um "agente bloqueador"18,19. Embora essa abordagem possa ser útil como estratégia terapêutica19, ela pode não ser o objetivo primário de qualquer configuração experimental. Portanto, antes de realizar um grande conjunto de experimentos, diferentes anticorpos ligando epítopos distintos da mesma proteína devem ser testados para também verificar qualquer potencial efeito "bloqueador". Neste estudo, usamos um anticorpo específico para acompanhar em tempo real a expressão de CD44 na membrana celular de uma linhagem celular DMG pediátrica altamente agressiva na invasão e migração 3D. O protocolo utilizado permitiu medir quantitativamente a expressão de CD44 ao longo do tempo em células invasoras e migrantes. Curiosamente, na presença do anticorpo anti-CD44, também observamos uma redução na motilidade celular em comparação com as células com ALR, mas na ausência do anticorpo. Não podemos excluir, porém, também um efeito inibitório sobre a proliferação celular. A aquisição de um padrão de invasão diferente com a mudança da morfologia de células mesenquimais para ameboides20 também foi observada na presença de anticorpos anti-CD44. Esses resultados inesperados sugerem que o bloqueio de CD44 pode contribuir para a transição mesenquimal para ameboide na DMG pediátrica.
Com relação às limitações deste protocolo, levando em consideração a resolução da câmera CCD do Incucyte Live-Cell Analysis Instrument e sua capacidade limitada de z-stack, a configuração que apresentamos para os ensaios de imunocitoquímica de células vivas 3D pode ser usada como uma abordagem preliminar, em um formato multipoço em larga escala, antes de passar para uma análise mais aprofundada usando sistemas de imagem fluorescente mais poderosos (por exemplo, microscópios confocais e sistema de imagem de alto conteúdo com modalidade confocal como o Operetta CLS ou o Opera Phoneix) ou uma abordagem mais refinada para estudar em tempo real a expressão de uma proteína de superfície através de um ensaio de repórter21.
Uma aplicação mais ampla da imunocitoquímica de células vivas 3D, apresentada aqui como uma monocultura, poderia ser um ensaio de co-cultura 3D estabelecido para obter imagens e analisar em tempo real interações diretas célula-célula. Nesse caso, duas ALR diferentes poderiam ser usadas com fluoróforos diferentes para ligar proteínas especificamente expressas na membrana celular em diferentes tipos celulares (por exemplo, células tumorais e células imunes). Neste caso, o contato direto célula-célula pode ser analisado com imagens ao vivo pela co-localização dos dois diferentes complexos ALR/anticorpos.
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Disclosures
Os autores não têm afiliações relevantes ou envolvimento financeiro com qualquer organização ou entidade com interesse financeiro ou conflito financeiro com o assunto ou materiais discutidos no manuscrito.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer à Dra. Silvia Soddu e à Dra. Giulia Federici (Unidade de Redes Celulares e Alvos Terapêuticos Moleculares, IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute, Roma, Itália) pelo acesso ao IncuCyte S3 Live Cell Imaging System na configuração preliminar do protocolo de imagem. Além disso, agradecemos a Bernadett Kolozsvari pela assessoria técnica. O estudo foi apoiado pela bolsa Children with Cancer UK (16-234) e pelo Ministério da Saúde italiano Ricerca Corrente. M Vinci é bolsista da Children with Cancer UK. R Ferretti recebeu a bolsa Fondazione Veronesi (2018 e 2019). Os autores agradecem à Fondazione Heal por seu apoio e à Children's Hospital Foundation pelo financiamento do Queensland Children's Tumor Bank.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well TC-Treated Microplates | Corning | 3595 | size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution for neurosphere dissociation |
| Burker chamber | Mv medical | FFL16034 | cell counting chamber |
| CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
| Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye | Incucyte | 4743 | Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry |
| Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | - | The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays. |
| Inverted Microscope | - | any inverted microscope | |
| Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
| Tumor stem cell (TSM) medium | - | - | growth cell medium (see reference in the text for details) |
| Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, round bottom clear |
References
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