Summary
Este estudio presenta un protocolo de inmunocitoquímica de células vivas en 3D aplicado a una línea celular de glioma difuso de línea media pediátrico, útil para estudiar en tiempo real la expresión de proteínas en la membrana plasmática durante procesos dinámicos como la invasión y migración de células 3D.
Abstract
La migración celular y la invasión son características distintivas específicas de los tumores con mutación H3K27M en glioma difuso de línea media (DMG). Ya hemos modelado estas características utilizando ensayos tridimensionales (3D) de invasión y migración basados en células. En este estudio, hemos optimizado estos ensayos 3D para la inmunocitoquímica de células vivas. Se utilizó un reactivo de marcaje de anticuerpos para detectar en tiempo real la expresión de la molécula de adhesión CD44, en la membrana plasmática de células migratorias e invasoras de una línea celular primaria derivada del paciente DMG H3K27M. CD44 se asocia con el fenotipo de las células madre cancerosas y la migración e invasión de células tumorales y está involucrado en las interacciones directas con la matriz extracelular del sistema nervioso central (SNC). Las neuroesferas (NS) de la línea celular DMG H3K27M se incrustaron en la matriz de la membrana basal (BMM) o se colocaron sobre una capa delgada de BMM, en presencia de un anticuerpo anti-CD44 junto con el reactivo de marcaje de anticuerpos (ALR). El análisis de imágenes de inmunocitoquímica de células vivas en 3D se realizó en un instrumento de análisis de células vivas para medir cuantitativamente la expresión general de CD44, específicamente en las células migratorias e invasoras. El método también permite visualizar en tiempo real la expresión intermitente de CD44 en la membrana plasmática de las células migratorias e invasoras. Además, el ensayo también proporcionó nuevos conocimientos sobre el papel potencial de CD44 en la transición mesenquimal a ameboide en células DMG H3K27M.
Introduction
La capacidad de las células tumorales para evadir y diseminarse a través del tejido circundante es un sello distintivodel cáncer. En particular, la motilidad de las células tumorales es un rasgo característico de los tumores malignos, ya sea un tipo de tumor metastásico como el cáncer de mama2 o colorrectal3 o un tipo localmente invasivo como el glioma difuso 4,5.
Las imágenes tienen un papel central en la investigación de muchos aspectos de los fenotipos de las células tumorales; Sin embargo, la obtención de imágenes de células vivas es definitivamente preferible cuando se estudian procesos celulares dinámicos como la migración y la invasión, cuando se producen cambios en la morfología y la interacción célula-célula 6,7 y pueden examinarse más fácilmente a lo largo del tiempo. Para la obtención de imágenes de células vivas, se pueden utilizar diferentes sistemas de microscopía óptica, desde el contraste de fase hasta los microscopios fluorescentes confocal, y la adquisición de imágenes realizada durante un corto o largo período de tiempo en un microscopio invertido equipado con una cámara para el control de la temperatura y elCO2, o en sistemas de análisis de imágenes de alto contenido que tienen cámaras incorporadas, o alternativamente en sistemas de imágenes que pueden permanecer en la incubadora sin necesidad de perturbar las células durante toda la duración del experimento. La elección del sistema utilizado suele estar dictada por una serie de factores, como la resolución necesaria, la duración del tiempo total de adquisición y los intervalos de tiempo, el tipo de recipiente utilizado y el rendimiento del ensayo (cámara única o placa de pocillos múltiples), la sensibilidad de las células utilizadas (células preciosas y/o raras) y la fototoxicidad de las células si hay fluoróforos presentes.
Con respecto a las imágenes fluorescentes en modo vivo, esto puede lograrse mediante la transducción de células para la expresión de proteínas fluorescentes, ya sea para una expresión estable o como un sistema inducible8, mediante la transfección celular transitoria o mediante el uso de colorantes celulares que ahora están disponibles para el marcaje de células vivas7, para el seguimiento de células vivas y para el etiquetado de orgánulos subcelulares9.
Recientemente se ha desarrollado un enfoque útil para la inmunocitoquímica de células vivas, en el que un anticuerpo que reconoce un marcador de superficie de elección puede unirse a un reactivo de marcaje y, al agregarlo al medio de cultivo, las células que expresan el marcador específico pueden obtener imágenes fácilmente en tiempo real mediante imágenes de células vivas. La visualización y cuantificación de la expresión de marcadores utilizando un sistema de este tipo puede lograrse fácilmente cuando las células se cultivan en condiciones de cultivo bidimensionales (2D)10.
En este estudio, optimizamos los protocolos para la invasión inmunocitoquímica de células vivas en 3D y la migración de células derivadas de pacientes con glioma difuso difuso de línea media (DMG) pediátrico11,12. Los DMG son tumores cerebrales altamente agresivos que afectan a los niños, en su gran mayoría asociados con la mutación conductora K27M en las variantes de la histona H3. Los DMG surgen en el tronco encefálico y en las regiones de la línea media del sistema nervioso central (SNC) y se caracterizan por una naturaleza altamente infiltrativa. Se ha demostrado que esta capacidad invasiva está, al menos en parte, mediada por la heterogeneidad intratumoral y las características similares a las de las células madre cancerosas de las células DMG7.
Para ejemplificar nuestros ensayos, se utilizó un reactivo de marcado de anticuerpos (ALR) en combinación con un anticuerpo para CD44. CD44 es una glicoproteína transmembrana y una molécula de adhesión expresada en células madre y otros tipos de células, asociada con el fenotipo de células madre cancerosas y la migración e invasión de células tumorales13. Los protocolos incluyen la preparación de la muestra, la adquisición de imágenes en modo de campo claro y fluorescente, y el análisis en un instrumento de análisis de células vivas que permitió medir cuantitativamente en tiempo real la expresión global de CD44 en la membrana celular de DMG durante la invasión y migración 3D. Los ensayos también permitieron visualizar la señal fluorescente intermitente de CD44 en células individuales mientras migran e invaden. Curiosamente, también se observó un efecto del anticuerpo anti-CD44, que potencialmente actuando como un anticuerpo bloqueador, también pareció reducir la migración e invasión celular, así como inducir un cambio en el patrón de invasión de un fenotipo colectivo de tipo mesenquimal a un fenotipo más similar al amebo de una sola célula.
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Protocol
Este protocolo sigue las directrices de los comités de ética en investigación en humanos de las instituciones.
NOTA: Este estudio se realizó utilizando el instrumento de análisis de células vivas Incucyte S3 y/o SX5 (referenciado como instrumento de análisis de células vivas).
1. Generación de esferoides tumorales de tamaño reproducible
NOTA: Se utilizó el protocolo (sección 1) descrito por Vinci et al. 2015 7,12, como se informa a continuación, con algunas modificaciones:
- Recoja las neuroesferas (NS) mutantes DMG H3K27M y centrifugue a 170 x g durante 10 minutos (min) a temperatura ambiente (RT).
- Incubar los SN con 500 μL de la solución de accutasa durante 3 min a 37 °C para romperlos.
- Neutralizar la solución de acutasa con medio de células madre tumorales (TSM)7 y centrifugar la suspensión celular a 355 x g durante 5 min a RT.
- Vuelva a suspender el gránulo de células en 1 ml de medio TSM y luego cuente las células utilizando una cámara de recuento de células.
- Diluir la suspensión celular para obtener 2,5-5 x 103células/mL y sembrar 100 μL/pocillo en placas de fondo redondo de 96 pocillos de fijación ultrabaja (ULA) (ver Tabla de Materiales). Utilice una densidad celular adecuada para obtener un NS individual de ~300 μm de diámetro, 4 días después de la siembra celular (250-500 células/pocillo para células de glioma altamente agresivas).
- Confirmar visualmente la formación de NS utilizando un microscopio invertido 4 días después de la siembra celular.
2. Preparación del complejo ALR/anticuerpo y configuración para el ensayo de invasión
NOTA: Para el procedimiento de marcaje de anticuerpos, se utiliza el protocolo10 de colorantes de marcaje de anticuerpos para inmunocitoquímica de células vivas con algunas modificaciones, como se informa a continuación. Para el ensayo de invasión, se sigue el protocolo previamente descrito por Vinci et al. 201512 .
- Considere el número de pocillos (por ejemplo, 60 pocillos) para analizar y calcular el volumen necesario para cada reactivo. Incluir también los pocillos para el control negativo (muestras con ALR pero sin anticuerpos).
- Añadir 100 μL de agua estéril al ALR para rehidratar el reactivo (concentración final = 0,5 mg/mL). Pipetear para mezclar la solución.
NOTA: El reactivo es sensible a la luz; por lo tanto, manténgase en la oscuridad. Alicuar el reactivo sobrante y almacenar a -80 °C (evitar la congelación y descongelación). - Mezcle el anticuerpo con el ALR en el medio TSM (o en el medio de crecimiento celular apropiado para la línea celular de elección) en una placa de pocillos múltiples de fondo redondo o en un tubo ámbar y protéjalo de la luz.
- Prepare una cantidad suficiente del medio para dispensar 25 μL/pocillo a una concentración final de ensayo de 3x. Incubar en RT durante 15 min.
NOTA: Se recomienda una relación molar de 1:3 entre el anticuerpo y la ALR, con una concentración final (1x) del anticuerpo de prueba <1,5 μg/ml. Para los experimentos de este protocolo se utiliza un anticuerpo de ratón CD44 antihumano (concentración inicial de 86 μg/mL) a una concentración final de 0,1 μg/mL (concentración 3x = 0,3 μg/mL). Agregue los reactivos en el siguiente orden: i) anticuerpo; ii) ALR; iii) Medio TSM. Mezclar por pipeteo. - Diluir el reactivo supresor de fondo (BSR) en medio TSM (o medio de crecimiento celular apropiado para la línea celular de elección) a 1,5 mM (3x) para obtener al final del ensayo una concentración final de 0,5 mM.
- Realice el ensayo de invasión directamente en la placa de fondo redondo ULA de 96 pocillos donde se sembraron inicialmente las células. Compruebe visualmente el SN con un microscopio invertido antes de empezar.
- Retire suave y lentamente 75 μL/pocillo del medio, evitando tocar el fondo del pocillo donde se asienta el SN. Compruebe visualmente la presencia del SN.
- Agregue suavemente 25 μL de BSR a cada pocillo.
- Agregue suavemente 25 μL del complejo ALR/anticuerpo a cada pocillo. Espere 2 o 3 minutos para que el complejo ALR/anticuerpo se mezcle con el medio.
- Verifique visualmente con un microscopio invertido para asegurarse de que cada NS esté ubicado en el centro del fondo del pozo. Evitar la formación de burbujas. Si hay alguna burbuja, retírela con una aguja.
- Coloque el plato sobre hielo y espere 5 minutos para que el fondo del plato se enfríe.
- Con una punta p200 preenfriada, dispense 75 μL/pocillo de matriz de membrana basal (BMM), colocando la punta de pipeta en la pared interna del pocillo y evitando tocar el fondo del pocillo. Evite la formación de burbujas y retire con una aguja estéril las existentes.
NOTA: Asegúrese de haber descongelado el BMM a 4 °C desde la noche anterior. - Deje la placa en hielo durante 5 minutos para que el BMM se mezcle con el medio. Compruebe visualmente con un microscopio invertido la presencia de los SN y que estén situados en el centro del pocillo. Si no es así, centrifugar la placa a 4 °C a 180 x g durante 5 min.
- Transfiera la placa en el instrumento de análisis de células vivas (Tabla de materiales) colocado dentro de la incubadora a 37 °C, 5% CO2, 95% de humedad.
3. Preparación del complejo ALR/anticuerpo y configuración para el ensayo de migración
NOTA: Para el procedimiento de marcaje de anticuerpos, se utiliza el protocolo10 de colorantes de marcaje para inmunocitoquímica de células vivas.
- Considere el número de pocillos a analizar y calcule el volumen necesario para cada reactivo. Incluya también los pocillos necesarios para los controles negativos. Compruebe visualmente el SN con un microscopio invertido antes de empezar.
- Utilice placas de fondo plano de 96 pocillos. Realice el procedimiento de recubrimiento como lo describe Vinci et al., 201314. Para este estudio, el BMM se utiliza como una capa delgada.
- Una vez que el recubrimiento esté listo, retire el exceso de recubrimiento BMM con una punta p200 colocando la punta en el borde del pozo y evitando tocar el fondo. Si trabaja con varios pocillos, utilice una pipeta multicanal.
- Corte una punta p200, tome 50 μL del medio celular + NS de cada pocillo seleccionado y transfiéralo a un pocillo de fondo plano recubierto. Verifique visualmente la presencia y la posición del NS en cada pozo.
NOTA: Cada NS debe estar ubicado en el centro del pozo. Evite apoyarse en la punta en el borde del pozo durante la transferencia, pero deje caer el medio en el centro del pozo sin tocar el fondo. En el caso de las células altamente migratorias, considere un número mayor de réplicas que las tres réplicas estándar. Esto se debe a que cuando NS se encuentra demasiado cerca del borde del pocillo, las células migratorias pueden cubrir un área más pequeña del pocillo. - Rehidrate el ALR como se ha descrito anteriormente (pasos 2.2-2.3).
NOTA: El reactivo es sensible a la luz. Consulte más arriba para conocer los procedimientos de buena manipulación. - Mezcle el anticuerpo con ALR en el medio de crecimiento celular completo apropiado en una placa de pocillos múltiples de fondo redondo o en un tubo ámbar y protéjalo de la luz. Prepare una cantidad suficiente para dispensar 50 μL/pocillo a una concentración final de ensayo 3x. Incubar en RT durante 15 min.
NOTA: Agregue los reactivos en el orden indicado anteriormente (paso 2.4). - Siga el mismo procedimiento que se indica en el paso 2.5.
- Agregue suavemente 50 μL de BSR a cada pocillo.
- Agregue suavemente 50 μL de ALR/anticuerpo a cada pocillo. Espere 2 o 3 minutos para que los reactivos se mezclen y verifique visualmente con un microscopio invertido para asegurarse de que la mayoría de los SN replicados estén ubicados en el centro del pocillo.
- Evite la formación de burbujas y elimine las existentes con una aguja. Transfiera suavemente la placa en el instrumento de análisis de células vivas colocado dentro de la incubadora a 37 °C, 5% CO2, 95% de humedad.
4. Configuración del instrumento de análisis de células vivas para la adquisición de imágenes
- Escanee las placas utilizando el instrumento de análisis de células vivas (para ver las especificaciones, consulte la Tabla de materiales) con intervalos de escaneo a partir del punto de tiempo cero (t0) de los ensayos de invasión y migración establecidos, respectivamente, después del paso 2.14. y 3.10. hasta 96 h.
NOTA: Asegúrese de poder desechar el instrumento de análisis de células vivas inmediatamente después del inicio del ensayo de invasión y migración. Dependiendo del tipo de tumor, las células pueden comenzar a invadir o migrar desde el SN dentro de 1 h desde la configuración del ensayo. - En el software del instrumento de análisis de células vivas, seleccione la opción Programar para adquirir. Haga clic en la pestaña + y seleccione la opción Escanear en programación.
- En la ventana del software Crear o restaurar recipiente, haga clic en la opción Nuevo.
- Seleccione la aplicación específica en el instrumento de análisis de células vivas para la adquisición de invasión y migración. Seleccione el tipo de escaneo esferoide , el objetivo 4x, los canales de imagen de fase + campo claro y verde para el ensayo de invasión. Seleccione el tipo de escaneo de clonación por dilución , el objetivo 4x y la fase y el verde para el ensayo de migración.
- Seleccione el tipo de placa y defina los pozos que se van a escanear resaltándolos en el mapa de placas.
- Configure la frecuencia de escaneo (para los experimentos en este protocolo, la frecuencia de escaneo fue de 15 min para la invasión y 30 min para la migración).
- Haga clic en Agregar a la programación e inicie el escaneo.
5. Configuración del instrumento de análisis de células vivas para el análisis de imágenes
- Seleccione la pestaña Crear nueva definición de análisis.
- Seleccione Spheroid Invasion o Basic Analyzer application for invasion and migration, respectivamente, en la pestaña.
- Seleccione los canales apropiados para la invasión y la migración (para Invasión: Fase+Campo claro-Verde; para Migración: Fase-Verde) en el canal de imagen.
- Seleccione algunas imágenes representativas de 3-4 pocillos para obtener una vista previa y refinar la configuración del análisis.
- Para el ensayo de invasión, en la pestaña Definición de análisis , ajuste la configuración de la aplicación en los canales Campo claro y Verde con la siguiente configuración para generar una segmentación precisa entre el esferoide completo y las células invasoras (consulte la Figura 5; máscara azul):
Segmentación de campo claro: Sensibilidad del esferoide completo = 50; Sensibilidad de las células invasoras = 100; Limpiar = predeterminado.
Filtros esferoides completos: establezca todos los parámetros como predeterminados.
Filtros de celdas invasoras: establece todos los parámetros como predeterminados.
Segmentación verde: Radio = 900. - Para el ensayo de migración, ajuste la configuración de la aplicación en los canales Fase y Verde para generar una segmentación precisa entre las celdas de confluencia y verde (consulte la Figura 5, máscaras amarillas y rosas) con la siguiente configuración:
Fase: establece todos los parámetros como predeterminados.
Segmentación verde: Radio = 300; Umbral = 1000
Limpieza: Relleno de agujeros = 400; Filtros = predeterminado.
Pozo entero: establece todos los parámetros como predeterminados. - Compruebe que la configuración del análisis es correcta para el NS haciendo clic aleatoriamente en varios pozos. La segmentación debe delinear el esferoide. De lo contrario, ajuste la configuración en consecuencia.
- Seleccione los pozos y los puntos de tiempo que desea analizar.
- Guarde la definición de análisis y haga clic en Finalizar.
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Representative Results
El protocolo de inmunocitoquímica de células vivas en 3D para la invasión y la migración se resume en un flujo de trabajo sencillo y reproducible en la Figura 1. Al sembrar las células DMG en placas de fondo redondo ULA de 96 pocillos, se obtienen NS de tamaño reproducible y se utilizan en los pasos que se muestran. Cuando los SN han alcanzado el tamaño ideal de ~300 μm (aproximadamente 4 días después de la siembra) se inician los ensayos de invasión12 y migración14 . La adición del complejo ALR/anticuerpo junto con el supresor de fondo en el medio del SN individual, permite seguir la expresión del marcador específico en la membrana celular, en imágenes en vivo y a lo largo del tiempo. La expresión del marcador de superficie durante la invasión y migración celular se monitoriza fácilmente a intervalos desde t = 0 hasta 96 h utilizando el instrumento de análisis de células vivas. Este sistema de imágenes permite un análisis de imágenes totalmente automatizado.
Se utilizó una línea celular primaria derivada del paciente, QCTB-R059, para ejemplificar las propiedades de invasión y migración de la diseminación tumoral de DMG pediátrica. QCTB-R059 se indicó originalmente como una línea celular de glioblastoma talámico (GBM) pediátrico15. Posteriormente, se ha indicado como línea celular 16 de glioma talámico H3-K27M o línea celular11 de glioma difuso de línea media (DMG) H3-K27M, siguiendo la clasificación de tumores cerebrales de la Organización Mundial de la Salud de2016 con la introducción de la mutación DMG H3F3A K27M como nueva entidad17.
Se investigó CD44, una molécula de adhesión que se sabe que está involucrada en la migración e invasión celular. CD44 es expresado por las células QCTB-R059, como lo demuestran las imágenes confocales de tinción inmunofluorescente (IF) en la migración celular 3D hacia (Figura 2) y la invasión en (Figura 3) BMM.
Teniendo en cuenta que la invasión y la migración 3D son procesos no estáticos, pensamos en investigar la expresión de CD44 a lo largo del tiempo cuando las células están en movimiento. Para ello, empleamos el ensayo de inmunocitoquímica de células vivas y adaptamos el protocolo para ensayos 3D. Al utilizar el ALR en complejo con un anticuerpo anti-CD44, podemos seguir en tiempo real la expresión de CD44 cuando la proteína se expresa en la membrana celular mientras las células evaden las neuroesferas y se propagan hacia y hacia el BMM.
La inmunocitoquímica de células vivas en 3D permite visualizar la expresión de CD44 (Video Suplementario 1 y Video Suplementario 2). Los marcos representativos del time-lapse, tanto para la migración como para la invasión (Figura 4A,B), muestran con más detalle la expresión intermitente de CD44 en la membrana celular. En particular, es posible ver que la señal fluorescente verde está encendida (círculo verde) y luego apagada (círculo negro) en la misma célula observada a lo largo del tiempo, lo que sugiere que la expresión de CD44 está encendida y desactivada mientras las células migran e invaden.
Los procesos de migración e invasión se siguen durante 96 h, y como se muestra en la Figura 5, las células QCTB-R059 muestran un alto nivel de CD44, lo que demuestra que en general la expresión observada con la inmunocitoquímica de células vivas está en línea con la expresión de CD44 obtenida por FI que se muestra en las imágenes confocales de la Figura 2 y la Figura 3. Sin embargo, curiosamente, también notamos que cuando el anticuerpo anti-CD44 se usa en células vivas, afecta la morfología celular, induciendo una transición de una invasión similar a la mesénquima a una invasión similar a la ameboide. Induce una reducción de la capacidad invasiva y migratoria de estas células (Figura 1 suplementaria). Sin embargo, no podemos excluir que la reducción de la migración e invasión celular observada también se deba en parte a una inhibición de la proliferación celular.
El análisis automatizado de imágenes realizado en el instrumento de análisis de células vivas muestra la cuantificación de la expresión de CD44 y su aumento a lo largo del tiempo, medido por la señal fluorescente verde general asociada con el ALR (Figura 5B,C) tanto para la migración como para la invasión. Las cuantificaciones se logran como se ejemplifica en la Figura 5B y la Figura 5C, con el análisis de imagen automatizado configurado para segmentar toda el área cubierta por las células CD44 migradas por verde (Figura 4B) y toda el área de propagación cubierta por las células CD44 invadidas por verde, pero excluyendo el núcleo de la neurosfera (Figura 5C).
Figura 1: Flujo de trabajo esquemático de los ensayos de inmunocitoquímica de células vivas en 3D. El flujo de trabajo muestra los pasos involucrados en los métodos de imágenes en vivo de invasión y migración en 3D, incluidas imágenes representativas de células pediátricas primarias derivadas de pacientes con DMG (QCTB-R059) después de la invasión (panel superior; t = 96 h) y la migración a (panel inferior; t = 96 h) BMM. Barras = 800 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Expresión de CD44 en la migración de células tumorales 3D. Imágenes confocales inmunofluorescentes representativas de la expresión de CD44 en células primarias derivadas de pacientes con DMG (QCTB-R059) tras la migración a BMM. Punto de tiempo = 96 h (rojo: CD44; azul: núcleos). Barras de escala: 500 μm (panel superior) y 200 μm (panel inferior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Expresión de CD44 en invasión de células tumorales 3D. Imágenes confocales inmunofluorescentes representativas de la expresión de CD44 en células primarias derivadas de pacientes con DMG (QCTB-R059) tras la invasión en BMM. Punto de tiempo = 96 h (rojo: CD44; azul: núcleos). Barras de escala: 250 μm (panel superior) y 100 μm (panel inferior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Expresión de CD44 a lo largo del tiempo. Fotogramas seleccionados del lapso de tiempo de migración (A) e invasión (B) de QCTB-R059. Las imágenes se obtuvieron en el instrumento de imágenes de células vivas. El círculo verde indica la expresión de CD44, el círculo negro indica que no se observa la expresión de CD44 en la membrana celular de la misma célula a lo largo del tiempo. Barras de escala: 200 μm (A) y 100 μm (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ensayos de inmunocitoquímica de células vivas en 3D para CD44: migración e invasión. (A) Se muestran imágenes representativas de campo claro, fluorescentes (ALR con anticuerpo anti-CD44) e imágenes de fusión de la migración e invasión de la inmunocitoquímica celular QCTB-R059 (96 h). Barras de escala: 400 μm. (B) Cuantificación de la expresión global de CD44 en relación con la migración (B) y la invasión (C), determinada por el análisis de imágenes ALR-anti-CD44 en el instrumento de imagen de células vivas. Las curvas muestran la intensidad media verde de la expresión de CD44 a lo largo del tiempo. Los valores son la media ± DE. Las dos pequeñas figuras de los gráficos muestran la segmentación aplicada para el análisis de la migración (B) donde se consideró toda el área y la invasión (C) para la cual se excluyó la parte núcleo del NS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Efecto del anticuerpo anti-CD44 sobre la morfología celular y el grado de motilidad celular. Las imágenes representativas del ensayo de invasión y migración QCTB-R059 muestran el efecto del anticuerpo anti-CD44 utilizado para la inmunocitoquímica de células vivas en 3D. Las células muestran una capacidad reducida de invasión y migración, así como la transición de un patrón de invasión más mesenquimal a un patrón de invasión ameboide entre el control negativo (sin anticuerpo anti-CD44) y CD44 (más anticuerpo anti-CD44). El panel inferior muestra un aumento de mayor potencia, mostrando una visión más clara de la apariencia morfológica de las células en ausencia y la presencia del anticuerpo anti-CD44 (flechas blancas). Barras de escala: panel superior de 800 μm y panel inferior de 100 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Video complementario 1: Vídeo time-lapse de la migración celular 3D QCTB-R059 en BMM en presencia de anticuerpo anti-CD44. La señal verde fluorescente, que representa la expresión de CD44 en la membrana celular, se visualiza a lo largo del tiempo mediante la conjugación del anticuerpo anti-CD44 con ALR. Haga clic aquí para descargar este video.
Video complementario 2: Vídeo time-lapse de la invasión celular 3D QCTB-R059 en BMM en presencia de anticuerpo anti-CD44. La señal verde fluorescente, que representa la expresión de CD44 en la membrana celular, se visualiza a lo largo del tiempo mediante la conjugación del anticuerpo anti-CD44 con ALR. Haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
La inmunocitoquímica de células vivas en 3D que hemos adoptado aquí para la invasión y migración pediátrica de DMG podría adaptarse fácilmente también a otros tipos de células tumorales altamente invasivas, incluidas las líneas celulares de cáncer de mama y colon.
A diferencia de los ensayos de inmunocitoquímica de células vivas 2D realizados anteriormente10, cuando se trabaja en 3D, se sugiere prestar atención a algunos pasos críticos. En particular, para el ensayo de invasión que describimos, se aconseja añadir la mezcla ALR/anticuerpo directamente al medio con NS en cada pocillo, antes de la adición del BMM, y no en el BMM o encima del BMM una vez gelificado. Esto es para permitir una buena mezcla de los reactivos con el medio y garantizar un acceso más directo de los reactivos a la superficie de la célula. Además, para garantizar una mejor calidad de las imágenes, aunque el protocolo incluye el uso del BSR, se aconseja el uso de medio libre de rojo de fenol y BMM.
Otro punto a considerar para la inmunocitoquímica de células vivas es que cualquier anticuerpo que se una a una proteína de membrana extracelular en células vivas puede afectar la función de la proteína alterando su conformación u ocupando el sitio de unión de un ligando o de una proteína en una célula adyacente, actuando así como un "agente bloqueante"18,19. Si bien este enfoque puede ser útil como estrategia terapéutica19, puede no ser el objetivo principal de ningún sistema experimental. Por lo tanto, antes de realizar un gran conjunto de experimentos, se deben probar diferentes anticuerpos que se unen a distintos epítopos de la misma proteína para verificar también cualquier posible efecto de "bloqueo". En este estudio, utilizamos un anticuerpo específico para seguir en tiempo real la expresión de CD44 en la membrana celular de una línea celular DMG pediátrica altamente agresiva en invasión y migración 3D. El protocolo utilizado nos permitió medir cuantitativamente la expresión de CD44 a lo largo del tiempo en células invasoras y migratorias. Curiosamente, en presencia del anticuerpo anti-CD44, también observamos una reducción de la motilidad celular en comparación con las células con el ALR, pero en ausencia del anticuerpo. Sin embargo, no podemos excluir también un efecto inhibidor sobre la proliferación celular. También se observó la adquisición de un patrón de invasión diferente con un cambio de morfología celular de tipo mesenquimal a similar a ameboide20 en presencia de anticuerpos anti-CD44. Estos resultados inesperados sugieren que el bloqueo de CD44 puede contribuir a la transición mesenquimal a ameboide en la DMG pediátrica.
Con respecto a las limitaciones de este protocolo, teniendo en cuenta la resolución de la cámara CCD del instrumento de análisis de células vivas Incucyte y su limitada capacidad de pila z, la configuración que presentamos para los ensayos de inmunocitoquímica de células vivas en 3D puede utilizarse como un enfoque preliminar, en un formato multipocillo a gran escala, antes de pasar a un análisis más profundo utilizando sistemas de imágenes fluorescentes más potentes (p. ej., microscopios confocales y sistemas de imagen de alto contenido con una modalidad confocal como el Operetta CLS o el Opera Phoneix) o un enfoque más refinado para estudiar en tiempo real la expresión de una proteína de superficie a través de un ensayo reportero21.
Una aplicación más amplia de la inmunocitoquímica de células vivas en 3D, presentada aquí como un monocultivo, podría ser un ensayo de cocultivo en 3D establecido para obtener imágenes y analizar en tiempo real las interacciones directas célula-célula. En este caso, se podrían usar dos ALR diferentes con diferentes fluoróforos para unirse a proteínas expresadas específicamente en la membrana celular en diferentes tipos de células (por ejemplo, células tumorales y células inmunitarias). En este caso, el contacto directo célula-célula puede analizarse con imágenes en vivo mediante la colocalización de los dos complejos ALR/anticuerpo diferentes.
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Disclosures
Los autores no tienen afiliaciones relevantes o participación financiera con ninguna organización o entidad con un interés financiero o conflicto financiero con el tema o los materiales discutidos en el manuscrito.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a la Dra. Silvia Soddu y a la Dra. Giulia Federici (Unidad de Redes Celulares y Dianas Terapéuticas Moleculares, IRCCS-Instituto Nacional del Cáncer Regina Elena, Roma, Italia) por el acceso al sistema de imágenes de células vivas IncuCyte S3 en la configuración preliminar del protocolo de imágenes. Además, agradecemos a Bernadett Kolozsvari por el asesoramiento técnico. El estudio contó con el apoyo de la beca Children with Cancer UK (16-234) y el Ministerio de Salud italiano Ricerca Corrente. M Vinci es becaria de Children with Cancer UK. R Ferretti ha recibido la beca de la Fondazione Veronesi (2018 y 2019). Los autores agradecen a la Fondazione Heal por su apoyo y a la Fundación del Hospital Infantil por financiar el Banco de Tumores Infantiles de Queensland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well TC-Treated Microplates | Corning | 3595 | size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution for neurosphere dissociation |
| Burker chamber | Mv medical | FFL16034 | cell counting chamber |
| CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
| Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye | Incucyte | 4743 | Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry |
| Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | - | The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays. |
| Inverted Microscope | - | any inverted microscope | |
| Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
| Tumor stem cell (TSM) medium | - | - | growth cell medium (see reference in the text for details) |
| Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, round bottom clear |
References
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