Summary
In dieser Studie wird ein Protokoll der Lebend-3D-Zell-Immunzytochemie vorgestellt, das auf eine pädiatrische diffuse Mittellinien-Gliomzelllinie angewendet wird, um die Expression von Proteinen auf der Plasmamembran während dynamischer Prozesse wie 3D-Zellinvasion und -migration in Echtzeit zu untersuchen.
Abstract
Zellmigration und Zellinvasion sind spezifische Kennzeichen von H3K27M-mutierten Tumoren des diffusen Mittellinienglioms (DMG). Wir haben diese Merkmale bereits mit dreidimensionalen (3D) zellbasierten Invasions- und Migrationsassays modelliert. In dieser Studie haben wir diese 3D-Assays für die Immunzytochemie lebender Zellen optimiert. Ein Antikörper-Markierungsreagenz wurde verwendet, um die Expression des Adhäsionsmoleküls CD44 auf der Plasmamembran von migrierenden und eindringenden Zellen einer DMG H3K27M primären Patientenzelllinie in Echtzeit zu detektieren. CD44 ist mit dem Phänotyp von Krebsstammzellen und der Migration und Invasion von Tumorzellen assoziiert und an den direkten Interaktionen mit der extrazellulären Matrix des Zentralnervensystems (ZNS) beteiligt. Neurosphären (NS) aus der DMG H3K27M-Zelllinie wurden in die Basalmembranmatrix (BMM) eingebettet oder in Gegenwart eines Anti-CD44-Antikörpers in Verbindung mit dem Antikörpermarkierungsreagenz (ALR) auf eine dünne Beschichtungsschicht aus BMM aufgebracht. Die immunzytochemische Live-3D-Zellanalyse wurde auf einem Lebendzellanalysegerät durchgeführt, um die gesamte CD44-Expression, insbesondere auf den migrierenden und eindringenden Zellen, quantitativ zu messen. Die Methode ermöglicht es auch, die intermittierende Expression von CD44 auf der Plasmamembran von migrierenden und eindringenden Zellen in Echtzeit zu visualisieren. Darüber hinaus lieferte der Assay auch neue Einblicke in die mögliche Rolle von CD44 beim Übergang von mesenchymal zu amöboid in DMG H3K27M-Zellen.
Introduction
Die Fähigkeit von Tumorzellen, sich dem umgebenden Gewebe zu entziehen und es zu verbreiten, ist ein Kennzeichen von Krebs1. Insbesondere die Tumorzellmotilität ist ein charakteristisches Merkmal maligner Tumoren, unabhängig davon, ob es sich um einen metastasierten Tumortyp wie Brust2 oder Darmkrebs3 oder einen lokal invasiven Typ wie das diffuse Gliomhandelt 4,5.
Die Bildgebung spielt eine zentrale Rolle bei der Untersuchung vieler Aspekte von Tumorzellphänotypen; Bei der Untersuchung dynamischer zellulärer Prozesse wie Migration und Invasion ist jedoch die Bildgebung lebender Zellen definitiv zu bevorzugen, wenn Veränderungen in der Morphologie und der Zell-Zell-Interaktion auftreten 6,7 und im Laufe der Zeit leichter untersucht werden können. Für die Bildgebung lebender Zellen können verschiedene optische Mikroskopiesysteme verwendet werden, vom Phasenkontrastmikroskop bis zum konfokalen Fluoreszenzmikroskop, und die Bildaufnahme über einen kurzen oder langen Zeitraum auf einem inversen Mikroskop, das mit einer Kammer zur Temperatur- und CO2 -Kontrolle ausgestattet ist, oder in High-Content-Bildanalysesystemen mit eingebauten Kammern oder alternativ in Bildsystemen, die im Inkubator sitzen können, ohne dass die Zellen während der gesamten Dauer gestört werden müssen des Experiments. Die Wahl des verwendeten Systems wird häufig von einer Reihe von Faktoren bestimmt, wie z. B. der erforderlichen Auflösung, der Länge der Gesamterfassungszeit und der Zeitintervalle, dem verwendeten Gefäßtyp und dem Durchsatz des Assays (Einkammer- oder Multi-Well-Platte), der Empfindlichkeit der verwendeten Zellen (Edel- und/oder seltene Zellen) und der Phototoxizität der Zellen, wenn Fluorophore vorhanden sind.
Im Hinblick auf die Fluoreszenzbildgebung im Live-Modus kann dies erreicht werden, indem Zellen für die Expression fluoreszierender Proteine entweder für eine stabile Expression oder als induzierbares System8 transduzierbar gemacht werden, durch transiente Zelltransfektion oder durch die Verwendung von Zellfarbstoffen, die jetzt für die Markierung lebender Zellen7, für die Verfolgung lebender Zellen sowie für die Markierung subzellulärer Organellen9 zur Verfügung stehen.
Kürzlich wurde ein nützlicher Ansatz für die Immunzytochemie lebender Zellen entwickelt, bei dem ein Antikörper, der einen Oberflächenmarker der Wahl erkennt, an ein Markierungsreagenz gebunden werden kann, und nach Zugabe zu den Kulturmedien können Zellen, die den spezifischen Marker exprimieren, leicht in Echtzeit durch Lebendzell-Bildgebung abgebildet werden. Die Visualisierung und Quantifizierung der Markerexpression unter Verwendung eines solchen Systems kann leicht erreicht werden, wenn Zellen unter zweidimensionalen (2D) Kulturbedingungen gezüchtet werden10.
In dieser Studie haben wir Protokolle für die Invasion und Migration von pädiatrischen diffusen Mittelliniengliomen (DMG)-Patientenzellen optimiert11,12. DMG sind hochaggressive Hirntumoren, die Kinder betreffen und in der überwiegenden Mehrheit mit der Treibermutation K27M in Histon-H3-Varianten assoziiert sind. DMG entstehen im Hirnstamm und in den Mittellinienregionen des Zentralnervensystems (ZNS) und zeichnen sich durch eine stark infiltrative Natur aus. Es wurde gezeigt, dass diese invasive Fähigkeit zumindest teilweise durch die intratumorale Heterogenität und die krebsstammähnlichen Merkmale von DMG-Zellen vermittelt wird7.
Zur Veranschaulichung unserer Assays wurde ein Antikörpermarkierungsreagenz (ALR) in Kombination mit einem Antikörper gegen CD44 verwendet. CD44 ist ein Transmembran-Glykoprotein und Adhäsionsmolekül, das auf Stammzellen und anderen Zelltypen exprimiert wird und mit dem Phänotyp von Krebsstammzellen und der Migration und Invasion von Tumorzellen assoziiertist 13. Die Protokolle umfassen die Probenvorbereitung, die Bildaufnahme im Hellfeld- und Fluoreszenzmodus und die Analyse auf einem Lebendzellanalysegerät, das es ermöglichte, die gesamte CD44-Expression auf der DMG-Zellmembran während der 3D-Invasion und -Migration quantitativ in Echtzeit zu messen. Die Assays ermöglichten auch die Möglichkeit, das intermittierende Fluoreszenzsignal von CD44 auf einzelnen Zellen während der Migration und Invasion sichtbar zu machen. Interessanterweise wurde auch ein Effekt des Anti-CD44-Antikörpers beobachtet, der möglicherweise als blockierender Antikörper fungiert und auch die Zellmigration und -invasion zu reduzieren schien und einen Wechsel des Invasionsmusters von einem kollektiven mesenchymalartigen zu einem eher einzelligen amöbenartigen Phänotyp zu induzieren schien.
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Protocol
Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommissionen der Institutionen für die Humanforschung.
HINWEIS: Diese Studie wurde mit dem Incucyte S3 und/oder SX5 Lebendzellanalysegerät (als Lebendzellanalysegerät bezeichnet) durchgeführt.
1. Generierung von reproduzierbar großen Tumorsphäroiden
HINWEIS: Das von Vinci et al. 2015 7,12 beschriebene Protokoll (Abschnitt 1) wurde wie folgt verwendet, mit einigen Modifikationen:
- Die DMG H3K27M-mutierten Neurosphären (NS) werden gesammelt und bei 170 x g für 10 Minuten (min) bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert.
- Die NS werden mit 500 μl der Accutase-Lösung für 3 min bei 37 °C inkubiert, um sie aufzubrechen.
- Neutralisieren Sie die Accutase-Lösung mit Tumorstammzellmedium (TSM)7 und zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 355 x g für 5 min bei RT.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml TSM-Medium und zählen Sie dann die Zellen in einer Zellzählkammer.
- Verdünnen Sie die Zellsuspension, um 2,5-5 x 103Zellen/ml zu erhalten, und säen Sie 100 μl/Well in 96-Well-Platten mit rundem Boden (ULA) ein (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie eine geeignete Zelldichte, um 4 Tage nach der Zellaussaat eine individuelle NS von ~300 μm Durchmesser zu erhalten (250-500 Zellen/Well für hochaggressive Gliomzellen).
- Visuelle Bestätigung der NS-Bildung mit einem inversen Mikroskop 4 Tage nach der Zellaussaat.
2. Herstellung des ALR/Antikörper-Komplexes und Aufbau für den Invasionsassay
HINWEIS: Für das Antikörpermarkierungsverfahren wird das Antikörpermarkierungsfarbstoffprotokoll10 für die Immunzytochemie lebender Zellen mit einigen Modifikationen verwendet, wie unten beschrieben. Für den Invasionsassay wird das zuvor von Vinci et al. 201512 beschriebene Protokoll befolgt.
- Berücksichtigen Sie die Anzahl der Wells (z. B. 60 Wells), um das für jedes Reagenz benötigte Volumen zu analysieren und zu berechnen. Beziehen Sie auch die Vertiefungen für die Negativkontrolle mit ein (Proben mit ALR, aber ohne Antikörper).
- Geben Sie 100 μl steriles Wasser in den ALR, um das Reagenz zu rehydrieren (Endkonzentration = 0,5 mg/ml). Pipetten, um die Lösung zu mischen.
HINWEIS: Das Reagenz ist lichtempfindlich; Halten Sie sich daher im Dunkeln. Aliquotieren Sie das übrig gebliebene Reagenz und lagern Sie es bei -80 °C (Einfrieren und Auftauen vermeiden). - Mischen Sie den Antikörper mit dem ALR im TSM-Medium (oder einem geeigneten Zellwachstumsmedium für die Zelllinie Ihrer Wahl) in einer Multiwell-Platte mit rundem Boden oder in einem bernsteinfarbenen Röhrchen und schützen Sie es vor Licht.
- Bereiten Sie eine ausreichende Menge des Mediums vor, um 25 μl/Well bei der 3-fachen Endkonzentration des Assays abzugeben. 15 Minuten bei RT inkubieren.
HINWEIS: Es wird ein molares Verhältnis von 1:3 von Antikörper zu ALR empfohlen, mit einer Endkonzentration (1x) des Testantikörpers <1,5 μg/ml. Für die Experimente in diesem Protokoll wird ein Anti-Human-CD44-Maus-Antikörper (Ausgangskonzentration 86 μg/ml) in einer Endkonzentration von 0,1 μg/ml (3-fache Konzentration = 0,3 μg/ml) verwendet. Fügen Sie die Reagenzien in der folgenden Reihenfolge hinzu: i) Antikörper; ii) ALR; iii) TSM-Medium. Durch Pipettieren mischen. - Verdünnen Sie das Hintergrundsuppressor-Reagenz (BSR) in TSM-Medium (oder geeignetem Zellwachstumsmedium für die Zelllinie Ihrer Wahl) bei 1,5 mM (3x), um am Ende des Assays eine Endkonzentration von 0,5 mM zu erhalten.
- Führen Sie den Invasionsassay direkt in der ULA 96-Well-Platte mit rundem Boden durch, auf der die Zellen ursprünglich ausgesät wurden. Überprüfen Sie den NS visuell mit einem inversen Mikroskop, bevor Sie beginnen.
- Entfernen Sie vorsichtig und langsam 75 μl/Vertiefung des Mediums und vermeiden Sie es, den Boden der Vertiefung zu berühren, in der sich der NS befindet. Prüfen Sie das Vorhandensein des NS visuell.
- Geben Sie vorsichtig 25 μl BSR in jede Vertiefung.
- Geben Sie vorsichtig 25 μl des ALR/Antikörper-Komplexes in jede Vertiefung. Warten Sie 2 oder 3 Minuten, damit sich der ALR/Antikörper-Komplex mit dem Medium vermischt.
- Überprüfen Sie visuell mit einem inversen Mikroskop, um sicherzustellen, dass sich jeder NS zentral am Boden des Brunnens befindet. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen. Wenn eine Blase vorhanden ist, entfernen Sie sie mit einer Nadel.
- Den Teller auf Eis legen und 5 Minuten warten, bis der Boden des Tellers kalt wird.
- Geben Sie mit einer vorgekühlten p200-Spitze 75 μl/Well Basalmembranmatrix (BMM) ab, indem Sie die Pipettenspitze auf die Innenwand des Wells setzen und den Boden des Wells nicht berühren. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen und entfernen Sie die vorhandenen mit einer sterilen Nadel.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie den BMM am Vorabend bei 4 °C aufgetaut haben. - Lassen Sie die Platte 5 Minuten lang auf Eis, damit sich das BMM mit dem Medium vermischen kann. Prüfen Sie visuell mit einem inversen Mikroskop, ob die NS vorhanden sind und ob sie sich zentral im Brunnen befinden. Ist dies nicht der Fall, zentrifugieren Sie die Platte bei 4 °C bei 180 x g für 5 min.
- Die Platte wird in das Lebendzellanalysegerät (Materialtabelle) im Inkubator bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit überführt.
3. Herstellung des ALR/Antikörper-Komplexes und Aufbau für den Migrationsassay
HINWEIS: Für die Antikörpermarkierung wird das Markierungsfarbstoffprotokoll10 für die Lebendzell-Immunzytochemie verwendet.
- Berücksichtigen Sie die Anzahl der zu analysierenden Wells und berechnen Sie das Volumen, das für jedes Reagenz benötigt wird. Fügen Sie auch die Vertiefungen hinzu, die für die Negativkontrollen benötigt werden. Überprüfen Sie den NS visuell mit einem inversen Mikroskop, bevor Sie beginnen.
- Verwenden Sie 96-Well-Platten mit flachem Boden. Führen Sie das Beschichtungsverfahren durch, wie von Vinci et al., 201314 beschrieben. Für diese Studie wird das BMM als dünne Schicht verwendet.
- Sobald die Beschichtung fertig ist, entfernen Sie den Überschuss der BMM-Beschichtung mit einer p200-Spitze, indem Sie die Spitze in den Rand der Vertiefung stecken und den Boden nicht berühren. Wenn Sie mit mehreren Wells arbeiten, verwenden Sie eine Mehrkanalpipette.
- Schneiden Sie eine p200-Spitze ab, entnehmen Sie 50 μl des Zellmediums + NS aus jeder ausgewählten Vertiefung und geben Sie sie in eine beschichtete Vertiefung mit flachem Boden. Überprüfen Sie das Vorhandensein und die Position des NS in jeder Vertiefung visuell.
HINWEIS: Jeder NS muss sich zentral im Brunnen befinden. Vermeiden Sie es, sich während des Transfers auf die Spitze am Rand der Vertiefung zu stützen, sondern lassen Sie das Medium mittig in die Vertiefung fallen, ohne den Boden zu berühren. Für stark migrierende Zellen sollten Sie eine höhere Anzahl von Replikaten als die standardmäßigen drei Replikate in Betracht ziehen. Dies liegt daran, dass die migrierenden Zellen einen kleineren Bereich des Wells bedecken können, wenn NS zu nah am Rand des Wells sitzt. - Rehydrieren Sie den ALR wie oben beschrieben (Schritte 2.2-2.3).
HINWEIS: Das Reagenz ist lichtempfindlich. Siehe oben für gute Handhabungsverfahren. - Mischen Sie den Antikörper mit ALR in den entsprechenden vollständigen Zellwachstumsmedien in einer Multiwell-Platte mit rundem Boden oder in einem braunen Röhrchen und schützen Sie es vor Licht. Bereiten Sie eine ausreichende Menge vor, um 50 μl/Well bei 3-facher Endkonzentration des Assays abzugeben. 15 Minuten bei RT inkubieren.
HINWEIS: Fügen Sie die Reagenzien in der oben angegebenen Reihenfolge hinzu (Schritt 2.4). - Gehen Sie wie in Schritt 2.5 beschrieben vor.
- Geben Sie vorsichtig 50 μl BSR in jede Vertiefung.
- Geben Sie vorsichtig 50 μl des ALR/Antikörpers in jede Vertiefung. Warten Sie 2 oder 3 Minuten, bis sich die Reagenzien vermischen, und überprüfen Sie dies visuell mit einem inversen Mikroskop, um sicherzustellen, dass sich die meisten replizierten NS zentral in der Vertiefung befinden.
- Vermeiden Sie die Bildung von Blasen und entfernen Sie vorhandene Blasen mit einer Nadel. Die Platte wird vorsichtig in das Lebendzellanalysegerät im Inkubator bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit überführt.
4. Einstellung des Live-Cell-Analysegeräts für die Bildaufnahme
- Scannen Sie die Platten mit dem Lebendzellanalysegerät (Spezifikationen siehe Materialtabelle) mit Scanintervallen, beginnend mit dem Zeitpunkt Null (t0) der Invasions- bzw. Migrationsassays, die nach Schritt 2.14 eingerichtet wurden. und 3.10. bis zu 96 h.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Lebendzellanalysegerät sofort nach Beginn des Invasions- und Migrationstests entsorgt werden kann. Je nach Tumortyp können Zellen bereits innerhalb von 1 h nach dem Assay-Aufbau in den NS eindringen oder aus ihm migrieren. - Wählen Sie in der Software des Live-Cell-Analysegeräts die Option Schedule to Acquisition (Erfassen planen) aus. Klicken Sie auf die Registerkarte + und wählen Sie die Option Scan nach Zeitplan.
- Klicken Sie im Softwarefenster Vessel erstellen oder wiederherstellen auf die Option Neu.
- Wählen Sie die spezifische Anwendung im Lebendzellanalysegerät für die Invasions- und Migrationserfassung aus. Wählen Sie den Sphäroid-Scan-Typ , das 4x-Objektiv, Phase+Hellfeld und die grünen Bildkanäle für den Invasionsassay aus. Wählen Sie den Scantyp Verdünnungsklonierung , 4x-Objektiv und Phase und Grün für den Migrationsassay aus.
- Wählen Sie den Plattentyp aus und definieren Sie die zu scannenden Wells, indem Sie sie auf der Plattenkarte markieren.
- Richten Sie die Scanfrequenz ein (für die Experimente in diesem Protokoll betrug die Scanfrequenz 15 Minuten für die Invasion und 30 Minuten für die Migration).
- Klicken Sie auf Zum Zeitplan hinzufügen und starten Sie den Scan.
5. Einstellung des Live-Cell-Analysegeräts für die Bildanalyse
- Wählen Sie den Reiter Neue Analysedefinition anlegen.
- Wählen Sie auf der Registerkarte Spheroid Invasion oder Basic Analyzer für die Invasion bzw. Migration aus.
- Wählen Sie die für die Invasion und Migration geeigneten Kanäle (für Invasion: Phase+Hellfeld-Grün; für Migration: Phase-Grün) im Bildkanal aus.
- Wählen Sie einige repräsentative Bilder aus 3-4 Vertiefungen aus, um eine Vorschau anzuzeigen und die Analyseeinstellung zu verfeinern.
- Passen Sie für den Invasionsassay auf der Registerkarte Analysedefinition die Anwendungseinstellungen in den Kanälen Hellfeld und Grün mit der folgenden Einstellung an, um eine präzise Segmentierung zwischen dem gesamten Sphäroid und den eindringenden Zellen zu erzeugen (siehe Abbildung 5; blaue Maske):
Hellfeld-Segmentierung: Empfindlichkeit des gesamten Sphäroids = 50; Empfindlichkeit für eindringende Zellen = 100; Bereinigen = Standard.
Ganze Sphäroidfilter: Setzt alle Parameter als Standard.
Filter für eindringende Zellen: Setzen Sie alle Parameter als Standard.
Grüne Segmentierung: Radius = 900. - Passen Sie für den Migrationsassay die Anwendungseinstellungen in den Kanälen Phase und Grün an, um eine präzise Segmentierung zwischen den Confluence- und Green Cells (siehe Abbildung 5, gelbe und rosa Masken) mit der folgenden Einstellung zu erzeugen:
Phase: Setzen Sie alle Parameter als Standard.
Grüne Segmentierung: Radius = 300; Schwellenwert = 1000
Bereinigung: Lochfüllung = 400; Filter = Standard.
Whole Well: Setzen Sie alle Parameter als Standard. - Überprüfen Sie, ob die Analyseeinstellungen für den NS korrekt sind, indem Sie zufällig auf mehrere Vertiefungen klicken. Die Segmentierung muss das Sphäroid umreißen. Ist dies nicht der Fall, passen Sie die Einstellung entsprechend an.
- Wählen Sie die zu analysierenden Vertiefungen und Zeitpunkte aus.
- Speichern Sie die Analysedefinition und klicken Sie auf Fertig stellen.
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Representative Results
Das Live-3D-Zell-Immunzytochemie-Protokoll für Invasion und Migration ist in einem einfachen und reproduzierbaren Arbeitsablauf in Abbildung 1 zusammengefasst. Durch die Aussaat der DMG-Zellen in ULA 96-Well-Rundbodenplatten werden reproduzierbare NS erhalten und in den gezeigten Schritten verwendet. Wenn die NS die ideale Größe von ~300 μm erreicht haben (ca. 4 Tage nach der Aussaat), werden die Assays für Invasion12 und Migration14 eingeleitet. Die Zugabe des ALR/Antikörper-Komplexes zusammen mit dem Hintergrundsuppressor im Medium des individuellen NS ermöglicht es, die spezifische Markerexpression auf der Zellmembran in der Live-Bildgebung und über die Zeit zu verfolgen. Die Expression von Oberflächenmarkern während der Zellinvasion und -migration kann in Intervallen von t = 0 bis zu 96 h mit dem Lebendzellanalysegerät leicht überwacht werden. Dieses bildgebende System ermöglicht eine vollautomatische Bildanalyse.
Eine primäre, von Patienten stammende Zelllinie, QCTB-R059, wurde verwendet, um die Invasions- und Migrationseigenschaften der pädiatrischen DMG-Tumorausbreitung zu veranschaulichen. QCTB-R059 wurde ursprünglich als pädiatrische Thalamus-Glioblastom-Zelllinie (GBM) indiziert15. Später wurde es als H3-K27M-Thalamusgliom-Zelllinie 16 oder diffuses Mittelliniengliom (DMG) H3-K27M-Zelllinie11 indiziert, nachdem die Weltgesundheitsorganisation 2016 Hirntumoren mit der Einführung der DMG H3F3A K27M-Mutante als neue Entität17 klassifiziert hatte.
CD44, ein Adhäsionsmolekül, von dem bekannt ist, dass es an der Zellmigration und -invasion beteiligt ist, wurde untersucht. CD44 wird von QCTB-R059-Zellen exprimiert, wie konfokale Bilder der Immunfluoreszenzfärbung (IF) bei der 3D-Zellmigration auf (Abbildung 2) und der Invasion in (Abbildung 3) BMM zeigen.
Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass 3D-Invasion und Migration beides nicht-statische Prozesse sind, wollten wir die Expression von CD44 im Laufe der Zeit untersuchen, wenn Zellen in Bewegung sind. Zu diesem Zweck haben wir den Immunzytochemie-Assay für lebende Zellen verwendet und das Protokoll für 3D-Assays angepasst. Durch die Verwendung des ALR im Komplex mit einem Anti-CD44-Antikörper sind wir in der Lage, die Expression von CD44 in Echtzeit zu verfolgen, wenn das Protein auf der Zellmembran exprimiert wird, während die Zellen den Neurosphären entgehen und sich auf und in das BMM ausbreiten.
Die Live-3D-Zell-Immunzytochemie ermöglicht die Visualisierung der CD44-Expression (Supplementary Video 1 und Supplementary Video 2). Die repräsentativen Bilder des Zeitraffers, sowohl für die Migration als auch für die Invasion (Abbildung 4A,B), zeigen detaillierter die intermittierende Expression von CD44 auf der Zellmembran. Insbesondere ist es möglich, zu sehen, dass das grüne Fluoreszenzsignal auf derselben Zelle im Laufe der Zeit eingeschaltet (grüner Kreis) und dann ausgeschaltet (schwarzer Kreis) ist, was darauf hindeutet, dass die Expression von CD44 ein- und ausgeschaltet ist, während die Zellen wandern und eindringen.
Die Migrations- und Invasionsprozesse werden über einen Zeitraum von 96 Stunden verfolgt, und wie in Abbildung 5 gezeigt, zeigen QCTB-R059-Zellen einen hohen Gehalt an CD44, was zeigt, dass die mit der Immunzytochemie der lebenden Zellen beobachtete Expression von CD44 insgesamt mit der Expression von CD44 übereinstimmt, die durch IF erhalten wurde, die auf konfokalen Bildern in Abbildung 2 und Abbildung 3 gezeigt wird. Interessanterweise haben wir jedoch auch festgestellt, dass der Anti-CD44-Antikörper, wenn er auf lebende Zellen angewendet wird, die Zellmorphologie beeinflusst und einen Übergang von mesenchymalähnlicher zu amöboidähnlicher Invasion induziert. Es induziert eine Verringerung der invasiven und migrierenden Kapazität dieser Zellen (ergänzende Abbildung 1). Wir können jedoch nicht ausschließen, dass die beobachtete Verringerung der Zellmigration und -invasion zum Teil auch auf eine Hemmung der Zellproliferation zurückzuführen ist.
Die automatisierte Bildanalyse, die mit dem Lebendzellanalysegerät durchgeführt wurde, zeigt die Quantifizierung der CD44-Expression und ihren Anstieg im Laufe der Zeit, gemessen am gesamten grünen Fluoreszenzsignal, das mit dem ALR assoziiert ist (Abbildung 5B,C) sowohl für die Migration als auch für die Invasion. Die Quantifizierungen werden wie in Abbildung 5B und Abbildung 5C dargestellt erreicht, wobei die automatisierte Bildanalyse so eingestellt ist, dass sie den gesamten Bereich, der von den grün migrierten CD44-Zellen (Abbildung 4B) abgedeckt wird, und den gesamten Ausbreitungsbereich, der von den grün eingedrungenen CD44-Zellen bedeckt ist, jedoch mit Ausnahme des Neurosphärenkerns (Abbildung 5C), segmentiert.
Abbildung 1: Schematischer Ablauf von Live-3D-Zell-Immunzytochemie-Assays. Der Workflow zeigt die Schritte der 3D-Invasions- und Migrations-Live-Bildgebungsmethoden, einschließlich repräsentativer Bilder von pädiatrischen primären DMG-Patientenzellen (QCTB-R059) nach der Invasion in (oberes Bild; t = 96 h) und der Migration auf (unteres Bild; t = 96 h) BMM. Balken = 800 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: CD44-Expression in der 3D-Tumorzellmigration. Repräsentative immunfluoreszierende konfokale Bilder der CD44-Expression in primären DMG-Patientenzellen (QCTB-R059) nach Migration auf BMM. Zeitpunkt = 96 h (rot: CD44; blau: Kerne). Maßstabsleisten: 500 μm (oberes Bild) und 200 μm (unteres Bild). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: CD44-Expression bei der Invasion von 3D-Tumorzellen. Repräsentative immunfluoreszierende konfokale Bilder der CD44-Expression in primären DMG-Patientenzellen (QCTB-R059) nach Invasion in BMM. Zeitpunkt = 96 h (rot: CD44; blau: Kerne). Maßstabsleisten: 250 μm (oberes Bild) und 100 μm (unteres Bild). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: CD44-Expression im Zeitverlauf. Ausgewählte Bilder der QCTB-R059-Migration (A) und Invasion (B) im Zeitraffer. Die Bilder wurden mit dem Live-Cell-Imaging-Instrument aufgenommen. Der grüne Kreis zeigt die Expression von CD44 an, der schwarze Kreis zeigt an, dass im Laufe der Zeit keine CD44-Expression auf der Zellmembran derselben Zelle beobachtet wurde. Maßstabsleisten: 200 μm (A) und 100 μm (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Lebend-3D-Zell-Immunzytochemie-Assays für CD44: Migration und Invasion. (A) Repräsentative Hellfeld-, Fluoreszenz- (ALR mit Anti-CD44-Antikörpern) und Merge-Bilder der immunzytochemischen Migration und Invasion von QCTB-R059-Zellen (96 h) werden gezeigt. Maßstabsbalken: 400 μm. (B) Quantifizierung der CD44-Gesamtexpression in Abhängigkeit von Migration (B) und Invasion (C), bestimmt durch ALR-anti-CD44-Bildanalyse auf dem Lebendzell-Bildgebungsinstrument. Die Kurven zeigen die grüne mittlere Intensität der CD44-Expression über die Zeit. Die Werte sind Mittelwerte ± SD. Die beiden kleinen Abbildungen in den Diagrammen zeigen die Segmentierung, die für die Analyse der Migration (B) angewendet wurde, bei der die gesamte Fläche berücksichtigt wurde, und der Invasion (C), für die der NS-Kernteil ausgeschlossen wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Wirkung von Anti-CD44-Antikörpern auf die Zellmorphologie und den Grad der Zellmotilität. Repräsentative Bilder des QCTB-R059-Invasions- und Migrationsassays zeigen die Wirkung von Anti-CD44-Antikörpern, die für die Immunzytochemie lebender 3D-Zellen verwendet werden. Die Zellen zeigen eine reduzierte Invasions- und Migrationskapazität sowie den Übergang von einem eher mesenchymalartigen zu einem amöbenartigen Invasionsmuster zwischen der Negativkontrolle (ohne Anti-CD44-Antikörper) und CD44 (plus Anti-CD44-Antikörper). Das untere Bild zeigt eine stärkere Vergrößerung, die eine klarere Sicht auf das morphologische Erscheinungsbild der Zellen in Abwesenheit und das Vorhandensein des Anti-CD44-Antikörpers (weiße Pfeile) zeigt. Maßstabsleisten: 800 μm obere Platte und 100 μm untere Platte. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzendes Video 1: Zeitraffervideo der 3D-Zellmigration von QCTB-R059 auf BMM in Gegenwart von Anti-CD44-Antikörpern. Das fluoreszierende grüne Signal, das die Expression von CD44 auf der Zellmembran darstellt, wird im Laufe der Zeit durch die Konjugation des Anti-CD44-Antikörpers mit ALR visualisiert. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Ergänzendes Video 2: Zeitraffervideo der 3D-Zellinvasion von QCTB-R059 in BMM in Gegenwart von Anti-CD44-Antikörpern. Das fluoreszierende grüne Signal, das die Expression von CD44 auf der Zellmembran darstellt, wird im Laufe der Zeit durch die Konjugation des Anti-CD44-Antikörpers mit ALR visualisiert. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Die Lebend-3D-Zell-Immunzytochemie, die wir hier für die pädiatrische DMG-Invasion und -Migration übernommen haben, könnte auch für andere hochinvasive Tumorzelltypen, einschließlich Brust- und Darmkrebszelllinien, leicht angepasst werden.
Anders als bei zuvor durchgeführten Live-2D-Zell-Immunzytochemie-Assays10 wird bei der Arbeit in 3D empfohlen, auf einige kritische Schritte zu achten. Insbesondere für den von uns beschriebenen Invasionsassay wird empfohlen, die ALR/Antikörper-Mischung direkt in das Medium mit NS in jeder Vertiefung vor der Zugabe des BMM und nicht in das BMM oder auf das BMM nach dem Gelieren zu geben. Dies soll eine gute Durchmischung der Reagenzien mit dem Medium ermöglichen und einen direkteren Zugang der Reagenzien zur Zelloberfläche gewährleisten. Um eine bessere Qualität der Bildgebung zu gewährleisten, empfehlen wir die Verwendung von phenolrotfreiem Medium und BMM, obwohl das Protokoll die Verwendung des BSR vorsieht.
Ein weiterer Punkt, der für die Immunzytochemie lebender Zellen zu berücksichtigen ist, ist, dass jeder Antikörper, der ein extrazelluläres Membranprotein an lebende Zellen bindet, die Proteinfunktion beeinflussen kann, indem er seine Konformation ändert oder die Bindungsstelle eines Liganden oder eines Proteins auf einer benachbarten Zelle besetzt und somit als "Blockierer" wirkt18,19. Während dieser Ansatz als therapeutische Strategie nützlich sein kann19, ist er möglicherweise nicht das primäre Ziel eines Versuchsaufbaus. Daher sollten vor der Durchführung einer großen Anzahl von Experimenten verschiedene Antikörper getestet werden, die unterschiedliche Epitope desselben Proteins binden, um auch eine mögliche "blockierende" Wirkung zu verifizieren. In dieser Studie haben wir einen spezifischen Antikörper verwendet, um die Expression von CD44 auf der Zellmembran einer hochaggressiven pädiatrischen DMG-Zelllinie in 3D-Invasion und -Migration in Echtzeit zu verfolgen. Das verwendete Protokoll ermöglichte es uns, die Expression von CD44 im Laufe der Zeit auf eindringenden und wandernden Zellen quantitativ zu messen. Interessanterweise stellten wir in Gegenwart des Anti-CD44-Antikörpers auch eine Verringerung der Zellmotilität im Vergleich zu den Zellen mit dem ALR fest, aber in Abwesenheit des Antikörpers. Wir können aber auch eine hemmende Wirkung auf die Zellproliferation nicht ausschließen. Der Erwerb eines anderen Invasionsmusters mit einem Wechsel von mesenchymaler zu amöboider Zellmorphologie20 wurde auch in Gegenwart von Anti-CD44-Antikörpern beobachtet. Diese unerwarteten Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Blockierung von CD44 zum Übergang von mesenchymal zu amöboidem DMG bei Kindern beitragen kann.
Im Hinblick auf die Einschränkungen dieses Protokolls kann unter Berücksichtigung der Auflösung der CCD-Kamera des Incucyte-Live-Cell-Analyseinstruments und seiner begrenzten Z-Stack-Fähigkeit der von uns vorgestellte Aufbau für die Lebend-3D-Zell-Immunzytochemie-Assays als vorläufiger Ansatz in einem groß angelegten Multi-Well-Format verwendet werden, bevor zu einer eingehenderen Analyse übergegangen wird, wobei entweder leistungsfähigere Fluoreszenz-Bildgebungssysteme (z. B. konfokale Mikroskope und High-Content-Bildgebungssysteme mit einer konfokalen Modalität wie das Operetta CLS oder das Opera Phoneix) oder ein verfeinerter Ansatz zur Untersuchung der Expression eines Oberflächenproteins in Echtzeit über einen Reporterassay21.
Eine breitere Anwendung der hier als Monokultur vorgestellten Lebend-3D-Zell-Immunzytochemie könnte ein 3D-Co-Kultur-Assay sein, der etabliert wurde, um direkte Zell-Zell-Interaktionen in Echtzeit abzubilden und zu analysieren. In diesem Fall könnten zwei verschiedene ALR mit unterschiedlichen Fluorophoren verwendet werden, um Proteine, die spezifisch auf der Zellmembran exprimiert werden, an verschiedene Zelltypen (z. B. Tumorzellen und Immunzellen) zu binden. In diesem Fall kann der direkte Zell-Zell-Kontakt mit Live-Bildgebung durch die Kolokalisation der beiden verschiedenen ALR/Antikörper-Komplexe analysiert werden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine relevanten Verbindungen oder finanziellen Beteiligungen an Organisationen oder Organisationen, die ein finanzielles Interesse an dem Thema oder den Materialien haben, die im Manuskript besprochen werden.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Silvia Soddu und Dr. Giulia Federici (Unit of Cellular Networks and Molecular Therapeutic Targets, IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute, Rom, Italien) für den Zugang zum IncuCyte S3 Live Cell Imaging System bei der vorläufigen Erstellung des Bildgebungsprotokolls. Ausserdem danken wir Bernadett Kolozsvari für die technische Beratung. Die Studie wurde durch das Stipendium von Children with Cancer UK (16-234) und das italienische Gesundheitsministerium Ricerca Corrente unterstützt. M Vinci ist Stipendiatin von Children with Cancer UK. R Ferretti ist Stipendiat der Fondazione Veronesi (2018 und 2019). Die Autoren danken der Fondazione Heal für ihre Unterstützung und der Children's Hospital Foundation für die Finanzierung der Queensland Children's Tumor Bank.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well TC-Treated Microplates | Corning | 3595 | size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution for neurosphere dissociation |
| Burker chamber | Mv medical | FFL16034 | cell counting chamber |
| CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
| Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye | Incucyte | 4743 | Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry |
| Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | - | The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays. |
| Inverted Microscope | - | any inverted microscope | |
| Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
| Tumor stem cell (TSM) medium | - | - | growth cell medium (see reference in the text for details) |
| Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, round bottom clear |
References
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