Summary
Bu çalışma, 3D hücre invazyonu ve göçü gibi dinamik süreçler sırasında plazma zarı üzerindeki proteinlerin ekspresyonunu gerçek zamanlı olarak incelemek için yararlı olan, pediatrik diffüz orta hat glioma hücre hattına uygulanan bir canlı 3D hücre immünositokimyası protokolü sunmaktadır.
Abstract
Hücre göçü ve invazyonu, Diffüz Orta Hat Gliomu (DMG) H3K27M mutant tümörlerinin ayırt edici özellikleridir. Bu özellikleri, üç boyutlu (3D) hücre tabanlı invazyon ve migrasyon tahlilleri kullanarak zaten modelledik. Bu çalışmada, bu 3D tahlilleri canlı hücre immünositokimyası için optimize ettik. Bir DMG H3K27M primer hasta kaynaklı hücre hattının göç eden ve istilacı hücrelerinin plazma membranı üzerindeki adezyon molekülü CD44'ün ekspresyonunu gerçek zamanlı olarak tespit etmek için bir Antikor Etiketleme Reaktifi kullanıldı. CD44, kanser kök hücre fenotipi ve tümör hücresi göçü ve invazyonu ile ilişkilidir ve merkezi sinir sistemi (CNS) hücre dışı matrisi ile doğrudan etkileşimlerde rol oynar. DMG H3K27M hücre hattından nörosferler (NS), bazal membran matrisine (BMM) gömüldü veya antikor etiketleme reaktifi (ALR) ile birlikte bir anti-CD44 antikoru varlığında ince bir BMM kaplama tabakasına yerleştirildi. Canlı 3D hücre immünositokimya görüntü analizi, özellikle göç eden ve istilacı hücreler üzerinde genel CD44 ekspresyonunu kantitatif olarak ölçmek için bir canlı hücre analiz cihazında gerçekleştirildi. Yöntem ayrıca, göç eden ve istilacı hücrelerin plazma zarı üzerindeki CD44'ün aralıklı ekspresyonunun gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine izin verir. Ayrıca, test, CD44'ün DMG H3K27M hücrelerinde mezenkimal - amipoid geçişindeki potansiyel rolü hakkında yeni bilgiler sağladı.
Introduction
Tümör hücrelerinin çevre dokudan kaçma ve yayılma yeteneği, kanserin ayırt edici özelliğidir1. Özellikle, tümör hücresi motilitesi, meme2 veya kolorektal kanser3 gibi metastatik bir tümör tipi veya diffüz glioma4,5 gibi lokal olarak invaziv bir tip olsun, malign tümörlerin karakteristik bir özelliğidir.
Görüntüleme, tümör hücresi fenotiplerinin birçok yönünün araştırılmasında merkezi bir role sahiptir; Bununla birlikte, göç ve invazyon gibi dinamik hücresel süreçleri incelerken, morfoloji ve hücre-hücre etkileşiminde 6,7 değişiklikler meydana geldiğinde ve zaman içinde daha kolay incelenebildiğinde, canlı hücre görüntüleme kesinlikle tercih edilmelidir. Canlı hücre görüntüleme için, faz kontrastından konfokal floresan mikroskoplara kadar farklı optik mikroskopi sistemleri kullanılabilir ve sıcaklık veCO2 kontrolü için bir hazne ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskopta kısa veya uzun bir süre boyunca gerçekleştirilen görüntü elde etme veya yerleşik odalara sahip yüksek içerikli görüntü analiz sistemlerinde veya alternatif olarak tüm süre boyunca hücreleri rahatsız etmeye gerek kalmadan inkübatörde oturabilen görüntü sistemlerinde deneyin. Kullanılan sistemin seçimi genellikle ihtiyaç duyulan çözünürlük, genel alım süresinin uzunluğu ve zaman aralıkları, kullanılan kap tipi ve testin verimi (tek odacıklı veya çok kuyulu plaka), kullanılan hücrelerin duyarlılığı (değerli ve/veya nadir hücreler) ve floroforlar varsa hücrelerin fototoksisitesi gibi bir dizi faktör tarafından belirlenir.
Canlı modda floresan görüntüleme ile ilgili olarak, bu, floresan proteinlerin ekspresyonu için hücrelerin kararlı ekspresyon veya indüklenebilir bir sistem8 olarak, geçici hücre transfeksiyonu ile transdüksiyonu veya şu anda canlı hücre etiketlemesi7, canlı hücre takibi ve hücre altı organelleri etiketleme9 için mevcut olan hücre boyaları kullanılarak elde edilebilir.
Son zamanlarda, seçilen bir yüzey markörünü tanıyan bir antikorun bir etiketleme reaktifine bağlanabildiği ve kültür ortamına eklendikten sonra, spesifik markörü eksprese eden hücrelerin canlı hücre görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak kolayca görüntülenebildiği canlı hücre immünositokimyası için yararlı bir yaklaşım geliştirilmiştir. Böyle bir sistem kullanılarak işaretleyici ekspresyonunun görselleştirilmesi ve miktarının belirlenmesi, hücreler iki boyutlu (2D) kültür koşullarında büyütüldüğünde kolayca elde edilebilir10.
Bu çalışmada, pediatrik diffüz orta hat glioma (DMG) hasta kaynaklı hücrelerin canlı 3D hücre immünositokimya invazyonu ve migrasyonu için protokolleri optimize ettik11,12. DMG, çocukları etkileyen oldukça agresif beyin tümörleridir ve büyük çoğunluğu histon H3 varyantlarındaki sürücü mutasyonu K27M ile ilişkilidir. DMG, beyin sapında ve merkezi sinir sisteminin (MSS) orta hat bölgelerinde ortaya çıkar ve oldukça infiltratif bir yapıya sahiptir. Bu invaziv kapasitenin en azından kısmen intratümör heterojenliği ve DMG hücrelerinin kanser kökü benzeri özellikleri tarafından aracılık edildiği gösterilmiştir7.
Testlerimizi örneklemek için, CD44 için bir antikor ile kombinasyon halinde bir antikor etiketleme reaktifi (ALR) kullanıldı. CD44, kanser kök hücre fenotipi ve tümör hücresi göçü ve invazyonu ile ilişkili, kök hücre ve diğer hücre tipleri üzerinde eksprese edilen bir transmembran glikoprotein ve adezyon molekülüdür13. Protokoller arasında numune hazırlama, parlak alan ve floresan modunda görüntü elde etme ve 3D invazyon ve göç sırasında DMG hücre zarı üzerindeki genel CD44 ekspresyonunun gerçek zamanlı olarak nicel olarak ölçülmesine izin veren bir canlı hücre analiz cihazında analiz yer alır. Tahliller ayrıca, göç ederken ve istila ederken CD44'ün aralıklı floresan sinyalini tek tek hücreler üzerinde görselleştirme olanağına da izin verdi. İlginç bir şekilde, potansiyel olarak bloke edici bir antikor olarak hareket eden anti-CD44 antikorunun bir etkisi de gözlendi, aynı zamanda hücre göçünü ve invazyonunu azalttığı ve ayrıca invazyon modelinin kolektif mezenkimal benzeri bir fenotipten daha tek hücreli amip benzeri bir fenotipe geçişini indüklediği görüldü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, kurumların insan araştırmaları etik kurullarının yönergelerini takip eder.
NOT: Bu çalışma, Incucyte S3 ve/veya SX5 Canlı Hücre Analiz Cihazı (canlı hücre analiz cihazı olarak referans alınmıştır) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
1. Tekrarlanabilir büyüklükte tümör sferoidlerinin üretilmesi
NOT: Vinci ve ark. 2015 7,12 tarafından açıklanan protokol (bölüm 1), bazı değişikliklerle aşağıda bildirildiği gibi kullanılmıştır:
- DMG H3K27M-mutant nörosferleri (NS) toplayın ve oda sıcaklığında (RT) 10 dakika (dk) boyunca 170 x g'da santrifüjleyin.
- NS'yi parçalamak için 500 μL akaktaz çözeltisi ile 37 ° C'de 3 dakika inkübe edin.
- Accutase solüsyonunu tümör kök hücre (TSM) ortamı7 ile nötralize edin ve hücre süspansiyonunu RT'de 5 dakika boyunca 355 x g'da santrifüjleyin.
- Hücre peletini 1 mL TSM ortamında yeniden süspanse edin ve ardından bir hücre sayma odası kullanarak hücreleri sayın.
- 2.5-5 x 103hücre / mL elde etmek için hücre süspansiyonunu seyreltin ve 100 μL / kuyuyu ultra düşük bağlantı (ULA) 96 oyuklu yuvarlak tabanlı plakalara tohumlayın (bkz. Hücre tohumlamasından 4 gün sonra ~ 300 μm çapında bireysel NS elde etmek için uygun bir hücre yoğunluğu kullanın (oldukça agresif glioma hücreleri için 250-500 hücre / kuyu).
- Hücre tohumlamasından 4 gün sonra ters mikroskop kullanarak NS oluşumunu görsel olarak doğrulayın.
2. ALR / antikor kompleksinin hazırlanması ve invazyon testi için kurulum
NOT: Antikor etiketleme prosedürü için, canlı hücre İmmünositokimyası için antikor etiketleme boyalarıprotokolü 10 , aşağıda bildirildiği gibi bazı modifikasyonlarla birlikte kullanılır. İstila tahlili için, daha önce Vinci ve ark. 201512 .
- Her bir reaktif için gereken hacmi analiz etmek ve hesaplamak için kuyu sayısını (örneğin 60 kuyu) göz önünde bulundurun. Ayrıca negatif kontrol için kuyucukları da dahil edin (ALR'li ancak antikorsuz numuneler).
- Reaktifi yeniden sulandırmak için ALR'ye 100 μL steril su ekleyin (son konsantrasyon = 0.5 mg/mL). Çözeltiyi karıştırmak için pipetleyin.
NOT: Reaktif ışığa duyarlıdır; Bu nedenle, karanlıkta tutun. Kalan reaktifi ayırın ve -80 °C'de saklayın (donmaktan ve çözülmekten kaçının). - Antikoru TSM ortamında (veya tercih edilen hücre hattı için uygun hücre büyüme ortamında) ALR ile yuvarlak tabanlı çok kuyulu bir plakada veya kehribar bir tüpte karıştırın ve ışıktan koruyun.
- 3x son tahlil konsantrasyonunda 25 μL / kuyu dağıtmak için yeterli miktarda ortam hazırlayın. RT'de 15 dakika inkübe edin.
NOT: Test antikorunun son (1x) konsantrasyonu <1.5 μg/mL ile 1:3 molar antikor oranı önerilir. Bu protokoldeki deneyler için, 0.1 μg/mL'lik (3x konsantrasyon = 0.3 μg/mL) nihai konsantrasyonda bir anti-insan CD44 fare antikoru (başlangıç konsantrasyonu 86 μg/mL) kullanılır. Reaktifleri aşağıdaki sırayla ekleyin: i) antikor; ii) ALR; iii) TSM ortamı. Pipetleme ile karıştırın. - Testin sonunda 0.5 mM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için arka plan baskılayıcı reaktifini (BSR) TSM ortamında (veya tercih edilen hücre hattı için uygun hücre büyüme ortamında) 1.5 mM'de (3x) seyreltin.
- İnvazyon tahlilini doğrudan hücrelerin başlangıçta tohumlandığı ULA 96 oyuklu yuvarlak tabanlı plakada gerçekleştirin. Başlamadan önce ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak NS'yi görsel olarak kontrol edin.
- NS'nin oturduğu kuyunun dibine dokunmaktan kaçınarak ortamın 75 μL/kuyusunu nazikçe ve yavaşça çıkarın. NS'nin varlığını görsel olarak kontrol edin.
- Her bir oyuğa yavaşça 25 μL BSR ekleyin.
- Her bir oyuğa yavaşça 25 μL ALR / antikor kompleksi ekleyin. ALR / antikor kompleksinin ortamla karışmasına izin vermek için 2 veya 3 dakika bekleyin.
- Her NS'nin kuyunun dibinde merkezi olarak bulunduğundan emin olmak için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak görsel olarak kontrol edin. Kabarcık oluşumundan kaçının. Herhangi bir kabarcık varsa, bir iğne kullanarak çıkarın.
- Plakayı buzun üzerine yerleştirin ve tabağın tabanının soğuması için 5 dakika bekleyin.
- Önceden soğutulmuş bir p200 ucuyla, pipet ucunu kuyunun iç duvarına yerleştirerek ve kuyunun dibine dokunmaktan kaçınarak 75 μL/kuyucuk bazal membran matrisi (BMM) dağıtın. Kabarcık oluşumunu önleyin ve mevcut olanları steril bir iğne ile çıkarın.
NOT: BMM'yi bir gece önce 4 °C'de çözdürdüğünüzden emin olun. - BMM'nin ortamla karışmasını sağlamak için plakayı 5 dakika buz üzerinde bırakın. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak NS'nin varlığını ve kuyuda merkezi olarak bulunduğunu görsel olarak kontrol edin. Değilse, plakayı 4 °C'de 180 x g'de 5 dakika santrifüjleyin.
- Plakayı, inkübatöre yerleştirilmiş canlı hücre analiz cihazına (Malzeme Tablosu) 37 °C, %5CO2, %95 nemde aktarın.
3. ALR / antikor kompleksinin hazırlanması ve migrasyon testi için kurulum
NOT: Antikor etiketleme prosedürü için, Canlı Hücre İmmünositokimyası için Etiketleme Boyaları protokolü10 kullanılır.
- Her bir reaktif için gereken hacmi analiz etmek ve hesaplamak için kuyucuk sayısını göz önünde bulundurun. Negatif kontroller için gerekli kuyuları da dahil edin. Başlamadan önce ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak NS'yi görsel olarak kontrol edin.
- Düz tabanlı 96 oyuklu plakalar kullanın. Kaplama prosedürünü Vinci ve diğerleri, 201314 tarafından açıklandığı gibi gerçekleştirin. Bu çalışma için BMM ince bir kaplama olarak kullanılmıştır.
- Kaplama hazır olduğunda, ucu kuyunun kenarına yerleştirerek ve tabana dokunmaktan kaçınarak bir p200 ucu ile BMM kaplamasının fazlalığını çıkarın. Birden fazla kuyucukla çalışıyorsanız, çok kanallı bir pipet kullanın.
- Bir p200 ucu kesin, seçilen her kuyucuktan 50 μL hücre ortamı + NS alın ve kaplanmış düz tabanlı bir kuyuya aktarın. Her bir kuyucuktaki NS'nin varlığını ve konumunu görsel olarak kontrol edin.
NOT: Her NS, kuyuda merkezi olarak bulunmalıdır. Transfer sırasında kuyu kenarındaki uca yaslanmaktan kaçının, ancak ortamı dibe dokunmadan kuyunun ortasına bırakın. Yüksek oranda göç eden hücreler için, standart üç kopyadan daha fazla sayıda kopya düşünün. Bunun nedeni, NS kuyunun kenarına çok yakın oturduğunda, göç eden hücrelerin kuyunun daha küçük bir alanını kaplayabilmesidir. - ALR'yi yukarıda açıklandığı gibi yeniden sulandırın (adım 2.2-2.3).
NOT: Reaktif ışığa duyarlıdır. İyi kullanım prosedürleri için yukarıya bakın. - Antikoru ALR ile uygun tam hücre büyüme ortamında, yuvarlak tabanlı çok kuyulu bir plakada veya kehribar bir tüpte karıştırın ve ışıktan koruyun. 3x son tahlil konsantrasyonunda 50 μL/kuyu dağıtmak için yeterli miktarda hazırlayın. RT'de 15 dakika inkübe edin.
NOT: Reaktifleri yukarıda belirtildiği sırayla ekleyin (adım 2.4). - Adım 2.5'te bildirilen prosedürün aynısını izleyin.
- Her bir oyuğa yavaşça 50 μL BSR ekleyin.
- Her oyuğa yavaşça 50 μL ALR / antikor ekleyin. Reaktiflerin karışmasına izin vermek için 2 veya 3 dakika bekleyin ve replikasyon NS'lerinin çoğunun kuyuda merkezi olarak bulunduğundan emin olmak için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak görsel olarak kontrol edin.
- Kabarcık oluşumunu önleyin ve bir iğne kullanarak mevcut olanları çıkarın. Plakayı 37 °C, %5CO2, %95 nemde inkübatöre yerleştirilmiş canlı hücre analiz cihazına yavaşça aktarın.
4. Görüntü elde etmek için canlı hücre analiz cihazı ayarı
- Plakaları, canlı hücre analiz cihazını kullanarak (spesifikasyonlar için, Malzeme Tablosuna bakın), adım 2.14'ten sonra ayarlanan invazyon ve migrasyon tahlillerinin sırasıyla sıfır zaman noktasından (t0) başlayan tarama aralıklarıyla tarayın. ve 3.10. 96 saate kadar.
NOT: Canlı hücre analiz cihazını, istila ve migrasyon tahlilinin başlamasından hemen sonra imha edebildiğinizden emin olun. Tümör tipine bağlı olarak, hücreler test kurulumundan itibaren 1 saat içinde NS'yi istila etmeye veya göç etmeye başlayabilir. - Canlı hücre analiz cihazı yazılımında, Alınacak Zamanlama seçeneğini seçin. + sekmesine tıklayın ve Programa Göre Tara seçeneğini seçin.
- Gemi Oluştur veya Geri Yükle yazılım penceresinde, Yeni seçeneğine tıklayın.
- İstila ve geçiş alımı için canlı hücre analiz aracında belirli bir uygulamayı seçin. İnvazyon testi için Spheroid tarama tipi, 4x objektif, Faz+Parlak Alan ve Yeşil görüntü kanallarını seçin. Geçiş testi için Seyreltme Klonlama tarama tipini, 4x hedefi ve Faz ve Yeşil'i seçin.
- Plaka tipini seçin ve taranacak kuyucukları plaka haritası üzerinde vurgulayarak tanımlayın.
- Tarama sıklığını ayarlayın (bu protokoldeki deneyler için tarama frekansı invazyon için 15 dakika ve geçiş için 30 dakika idi).
- Programa Ekle'ye tıklayın ve taramayı başlatın.
5. Görüntü analizi için canlı hücre analiz cihazı ayarı
- Yeni Analiz Tanımı Oluştur sekmesini seçin.
- Sekmede sırasıyla istila ve geçiş için Spheroid Invasion veya Basic Analyzer uygulamasını seçin.
- Görüntü kanalında invasion ve migration için uygun kanalları (Invasion için: Phase+Brightfield-Green; Migration için: Phase-Green) seçin.
- Analiz ayarını önizlemek ve iyileştirmek için 3-4 kuyudan birkaç temsili görüntü seçin.
- İstila testi için, Analiz Tanımı sekmesinde, Tüm Küresel ve İstilacı Hücreler arasında kesin bir segmentasyon oluşturmak için Parlak Alan ve Yeşil kanallardaki uygulama ayarlarını aşağıdaki ayarla ayarlayın (bkz. Şekil 5; mavi maske):
Brightfield Segmentasyonu: Tüm Küresel duyarlılık = 50; İstilacı Hücre duyarlılığı = 100; Temizle = varsayılan.
Tüm Küresel Filtreler: tüm parametreleri varsayılan olarak ayarlayın.
İstilacı Hücre Filtreleri: tüm parametreleri varsayılan olarak ayarlayın.
Yeşil Segmentasyon: Yarıçap = 900. - Migrasyon tahlili için, aşağıdaki ayarla Confluence ve Green Cells (bkz. Şekil 5, sarı ve pembe maskeler) arasında kesin bir segmentasyon oluşturmak için Faz ve Yeşil kanallardaki uygulama ayarlarını ayarlayın:
Aşama: tüm parametreleri varsayılan olarak ayarlayın.
Yeşil Segmentasyon: Yarıçap = 300; Eşik = 1000
Temizleme: Delik Doldurma = 400; Filtreler = varsayılan.
Whole Well: tüm parametreleri varsayılan olarak ayarlayın. - Birkaç kuyucuğa rastgele tıklayarak NS için analiz ayarlarının doğru olup olmadığını kontrol edin. Segmentasyon, sferoidin ana hatlarını çizmelidir. Değilse, ayarı buna göre ayarlayın.
- Analiz edilecek kuyuları ve zaman noktalarını seçin.
- Analiz Tanımını kaydedin ve Son'a tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İnvazyon ve migrasyon için Live-3D-Cell İmmünositokimya protokolü, Şekil 1'de basit ve tekrarlanabilir bir iş akışında özetlenmiştir. DMG hücrelerinin ULA 96 oyuklu yuvarlak tabanlı plakalara tohumlanmasıyla, tekrarlanabilir boyutta NS elde edilir ve görüntülenen adımlarda kullanılır. NS ~300 μm'lik ideal boyuta ulaştığında (tohumlamadan yaklaşık 4 gün sonra) invazyon12 ve göç14 tahlilleri başlatılır. ALR/antikor kompleksinin arka plan baskılayıcı ile birlikte bireysel NS ortamına eklenmesi, canlı görüntülemede ve zaman içinde hücre zarı üzerindeki spesifik belirteç ekspresyonunun izlenmesine izin verir. Hücre istilası ve göçü sırasındaki yüzey işaretleyici ekspresyonu, canlı hücre analiz cihazı kullanılarak t = 0'dan 96 saate kadar aralıklarla kolayca izlenir. Bu görüntüleme sistemi, tam otomatik bir görüntü analizine izin verir.
Pediatrik DMG tümör yayılımının invazyon ve göç özelliklerini örneklemek için birincil hasta kaynaklı hücre hattı olan QCTB-R059 kullanıldı. QCTB-R059 başlangıçta pediatrik talamik glioblastoma (GBM) hücre hattı15 olarak endike edildi. Daha sonra, 2016 Dünya Sağlık Örgütü'nün DMG H3F3A K27M-mutantının yeni bir antite 17 olarak tanıtılmasıyla beyin tümörlerinin sınıflandırılmasını takiben H3-K27M talamik glioma hücre hattı16 veya diffüz orta hat glioma (DMG) H3-K27M hücre hattı11 olarak endike edilmiştir.
Hücre göçü ve invazyonunda rol oynadığı bilinen bir adezyon molekülü olan CD44 araştırıldı. CD44, 3D hücre göçü (Şekil 2) ve (Şekil 3) BMM'ye invazyon üzerinde immünofloresan (IF) boyamanın konfokal görüntüleri ile gösterildiği gibi QCTB-R059 hücreleri tarafından eksprese edilir.
3D invazyon ve göçün her ikisinin de statik olmayan süreçler olduğunu göz önünde bulundurarak, hücreler hareket halindeyken CD44'ün zaman içindeki ekspresyonunu araştırmayı düşündük. Bunu yapmak için canlı hücre immünositokimya testini kullandık ve protokolü 3D testler için uyarladık. ALR'yi bir anti-CD44 antikoru ile kompleks halinde kullanarak, hücreler nörosferlerden kaçarken ve BMM'ye yayılırken, protein hücre zarında eksprese edildiğinde CD44'ün ekspresyonunu gerçek zamanlı olarak takip edebiliyoruz.
Canlı 3D hücre immünositokimyası, CD44 ekspresyonunun görselleştirilmesine izin verir (Ek Video 1 ve Ek Video 2). Hem göç hem de invazyon için hızlandırılmış çizginin temsili çerçeveleri (Şekil 4A,B), CD44'ün hücre zarı üzerindeki aralıklı ekspresyonunu daha ayrıntılı olarak göstermektedir. Özellikle, yeşil floresan sinyalinin zaman içinde gözlemlenen aynı hücrede açık (yeşil daire) ve sonra kapalı (siyah daire) olduğunu görmek mümkündür, bu da hücreler göç ederken ve istila ederken CD44 ekspresyonunun açık ve kapalı olduğunu düşündürür.
Migrasyon ve invazyon süreçleri 96 saat boyunca takip edilir ve Şekil 5'te gösterildiği gibi, QCTB-R059 hücreleri yüksek düzeyde CD44 gösterir, bu da genel olarak canlı hücre immünositokimyası ile gözlenen ekspresyonun Şekil 2 ve Şekil 3'teki konfokal görüntülerde gösterilen IF ile elde edilen CD44 ekspresyonu ile uyumlu olduğunu gösterir. İlginç bir şekilde, anti-CD44 antikoru canlı hücrelerde kullanıldığında, hücre morfolojisini etkileyerek mezenkimal benzeri istiladan amip benzeri istilaya geçişi indüklediğini de fark ettik. Bu hücrelerin invaziv ve göç kapasitesinin azalmasına neden olur (Ek Şekil 1). Bununla birlikte, gözlenen hücre göçü ve istilasındaki azalmanın da kısmen hücre proliferasyonunun inhibisyonundan kaynaklandığını göz ardı edemeyiz.
Canlı hücre analiz cihazında gerçekleştirilen otomatik görüntü analizi, hem göç hem de invazyon için ALR (Şekil 5B, C) ile ilişkili genel yeşil floresan sinyali ile ölçülen CD44 ekspresyonunun nicelleştirilmesini ve zaman içindeki artışını gösterir. Nicelemeler, Şekil 5B ve Şekil 5C'de örneklendiği gibi, CD44 yeşil göçlü hücrelerin kapsadığı tüm alanı (Şekil 4B) ve CD44 yeşil istila edilmiş hücrelerin kapsadığı tüm yayılma alanını segmentlere ayıracak şekilde ayarlanmış, ancak nörosfer çekirdeği hariç (Şekil 5C) ile elde edilir.
Şekil 1: Canlı 3D Hücre İmmünositokimya Testlerinin şematik iş akışı. İş akışı, pediatrik primer DMG hastadan türetilen hücrelerin (QCTB-R059) (üst panel; t = 96 saat) invazyondan ve (alt panel; t = 96 saat) BMM'ye geçişten sonra temsili görüntüleri de dahil olmak üzere 3D invazyon ve migrasyon canlı görüntüleme yöntemlerinde yer alan adımları gösterir. Barlar = 800 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: 3D tümör hücresi göçünde CD44 ekspresyonu. BMM'ye göç ettikten sonra primer DMG hasta kaynaklı hücrelerde (QCTB-R059) CD44 ekspresyonunun temsili immünofloresan konfokal görüntüleri. Zaman noktası = 96 saat (kırmızı: CD44; mavi: çekirdekler). Ölçek çubukları: 500 μm (üst panel) ve 200 μm (alt panel). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: 3D tümör hücresi invazyonunda CD44 ekspresyonu. BMM'ye invazyon üzerine primer DMG hasta kaynaklı hücrelerde (QCTB-R059) CD44 ekspresyonunun temsili immünofloresan konfokal görüntüleri. Zaman noktası = 96 saat (kırmızı: CD44; mavi: çekirdekler). Ölçek çubukları: 250 μm (üst panel) ve 100 μm (alt panel). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Zaman içinde CD44 ifadesi. QCTB-R059 migrasyon (A) ve invazyon (B) zaman atlamalı seçilmiş kareler. Görüntüler canlı hücre görüntüleme cihazında elde edildi. Yeşil daire CD44 ekspresyonunu, siyah daire ise aynı hücrenin hücre zarında zamanla gözlenen CD44 ekspresyonunun olmadığını gösterir. Ölçek çubukları: 200 μm (A) ve 100 μm (B). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: CD44 için Canlı 3D Hücre İmmünositokimya Testleri: göç ve invazyon. (A) Temsili parlak alan, floresan (anti-CD44 antikorlu ALR) ve QCTB-R059 hücre immünositokimyası, migrasyon ve invazyonun (96 saat) birleştirme görüntüleri gösterilmiştir. Ölçek çubukları: 400 μm. (B) Canlı hücre görüntüleme cihazında ALR-anti-CD44 görüntü analizi ile belirlenen, migrasyon (B) ve invazyona (C) göre CD44 genel ekspresyonunun miktarı. Eğriler, CD44 ifadesinin zaman içindeki Yeşil Ortalama Yoğunluğunu gösterir. Değerler ortalama ± SD'dir. Grafiklerdeki iki küçük şekil, tüm alanın dikkate alındığı göçün (B) ve NS çekirdek kısmının hariç tutulduğu istilanın (C) analizi için uygulanan segmentasyonu göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Anti-CD44 antikorunun hücre morfolojisi ve hücre motilitesi derecesi üzerine etkisi. QCTB-R059 invazyonu ve migrasyon testinin temsili görüntüleri, canlı 3D hücre immünositokimyası için kullanılan anti-CD44 antikorunun etkisini göstermektedir. Hücreler, negatif kontrol (anti-CD44 antikoru olmadan) ve CD44 (artı anti-CD44 antikoru) arasında daha mezenkimal benzeri bir invazyon benzeri invazyon paternine geçişin yanı sıra azalmış bir invazyon ve migrasyon kapasitesi gösterir. Alt panel, anti-CD44 antikorunun (beyaz oklar) yokluğunda ve varlığında hücrelerin morfolojik görünümü hakkında daha net bir görünüm gösteren daha yüksek güç büyütme gösterir. Ölçek çubukları: 800 μm üst panel ve 100 μm alt panel. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Video 1: Anti-CD44 antikoru varlığında BMM'de QCTB-R059 3D hücre göçünün hızlandırılmış videosu. CD44'ün hücre zarı üzerindeki ekspresyonunu temsil eden floresan yeşil sinyal, anti-CD44 antikorunun ALR ile konjugasyonu ile zaman içinde görselleştirilir. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Video 2: Anti-CD44 antikoru varlığında BMM'de QCTB-R059 3D hücre invazyonunun hızlandırılmış videosu. CD44'ün hücre zarı üzerindeki ekspresyonunu temsil eden floresan yeşil sinyal, anti-CD44 antikorunun ALR ile konjugasyonu ile zaman içinde görselleştirilir. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada pediatrik DMG invazyonu ve göçü için benimsediğimiz canlı 3D hücre immünositokimyası, meme ve kolon kanseri hücre hatları dahil olmak üzere diğer yüksek invaziv tümör hücre tipleri için de kolayca uyarlanabilir.
Daha önce gerçekleştirilen canlı 2D hücre immünositokimya testlerinden farklı olarak,3D olarak çalışırken, bazı kritik adımlara dikkat edilmesi önerilir. Özellikle, tarif ettiğimiz invazyon testi için, ALR/antikor karışımının, BMM'nin eklenmesinden önce, BMM'de veya jelleştikten sonra BMM'nin üstüne değil, her bir oyukta NS ile doğrudan ortama eklenmesi tavsiye edilir. Bu, reaktiflerin ortamla iyi bir karışımına izin vermek ve reaktiflerin hücre yüzeyine daha doğrudan erişimini sağlamak içindir. Ayrıca, görüntülemenin daha kaliteli olmasını sağlamak için, protokol BSR'nin kullanımını içermesine rağmen, fenol kırmızısı içermeyen ortam ve BMM kullanmanızı öneririz.
Canlı hücre immünositokimyası için göz önünde bulundurulması gereken bir diğer nokta, bir hücre dışı zar proteinini canlı hücrelere bağlayan herhangi bir antikorun, konformasyonunu değiştirerek veya bir ligandın veya bir proteinin bitişik bir hücre üzerindeki bağlanma bölgesini işgal ederek protein fonksiyonunu etkileyebileceğidir, bu nedenle bir "bloke edici ajan"18,19. Bu yaklaşım terapötik bir strateji olarak yararlı olsa da19, herhangi bir deney düzeneğinin birincil amacı olmayabilir. Bu nedenle, çok sayıda deney yapmadan önce, herhangi bir potansiyel "bloke etme" etkisini doğrulamak için aynı proteinin farklı epitoplarını bağlayan farklı antikorlar test edilmelidir. Bu çalışmada, 3D invazyon ve migrasyonda oldukça agresif bir pediatrik DMG hücre hattının hücre zarı üzerindeki CD44 ekspresyonunu gerçek zamanlı olarak takip etmek için spesifik bir antikor kullandık. Kullanılan protokol, CD44'ün zaman içinde istila eden ve göç eden hücreler üzerindeki ekspresyonunu nicel olarak ölçmemize izin verdi. İlginç bir şekilde, anti-CD44 antikorunun varlığında, ALR'li hücrelere kıyasla, ancak antikorun yokluğunda hücre motilitesinde bir azalma kaydettik. Hücre proliferasyonu üzerindeki inhibe edici bir etkiyi de göz ardı edemeyiz. Anti-CD44 antikorlarının varlığında mezenkimal benzerden amip benzeri hücre morfolojisine20 geçiş ile farklı bir invazyon paterni elde edilmesi de gözlenmiştir. Bu beklenmeyen sonuçlar, CD44'ün bloke edilmesinin pediatrik DMG'de mezenkimal ila amipoid geçişine katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir.
Bu protokolün sınırlamaları ile ilgili olarak, Incucyte Canlı Hücre Analiz Cihazının CCD kamerasının çözünürlüğü ve sınırlı z-yığını kapasitesi göz önüne alındığında, canlı 3D hücre immünositokimya testleri için sunduğumuz kurulum, daha güçlü floresan görüntüleme sistemleri (örn. konfokal mikroskoplar ve Operetta CLS veya Opera Phoneix gibi konfokal bir modaliteye sahip yüksek içerikli görüntüleme sistemi) veya bir raportör tahlili yoluyla bir yüzey proteininin ekspresyonunu gerçek zamanlı olarak incelemek için daha rafine bir yaklaşım21.
Burada bir monokültür olarak sunulan canlı 3 boyutlu hücre immünositokimyasının daha geniş bir uygulaması, gerçek zamanlı doğrudan hücre-hücre etkileşimlerini görüntülemek ve analiz etmek için kurulmuş bir 3 boyutlu ko-kültür testi olabilir. Bu durumda, farklı hücre tiplerinde (örneğin, tümör hücresi ve bağışıklık hücreleri) hücre zarında spesifik olarak eksprese edilen proteinleri bağlamak için farklı floroforlarla iki farklı ALR kullanılabilir. Bu durumda, iki farklı ALR/antikor kompleksinin birlikte lokalizasyonu ile doğrudan hücre-hücre teması canlı görüntüleme ile analiz edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların, makalede tartışılan konu veya materyallerle ilgili herhangi bir finansal çıkarı veya finansal çatışması olan herhangi bir kuruluş veya kuruluşla ilgili hiçbir bağlantısı veya finansal katılımı yoktur.
Acknowledgments
Dr. Silvia Soddu ve Dr. Giulia Federici'ye (Hücresel Ağlar ve Moleküler Terapötik Hedefler Birimi, IRCCS-Regina Elena Ulusal Kanser Enstitüsü, Roma, İtalya) görüntüleme protokolünün ön kurulumunda IncuCyte S3 Canlı Hücre Görüntüleme Sistemine erişim için teşekkür ederiz. Ayrıca, teknik tavsiyeleri için Bernadett Kolozsvari'ye teşekkür ederiz. Çalışma, Kanserli Çocuklar İngiltere hibesi (16-234) ve İtalya Sağlık Bakanlığı Ricerca Corrente tarafından desteklenmiştir. M Vinci, Kanserli Çocuklar İngiltere Üyesidir. R Ferretti, Fondazione Veronesi Bursu (2018 ve 2019) sahibidir. Yazarlar, destekleri için Fondazione Heal'e ve Queensland Çocuk Tümör Bankası'nı finanse ettiği için Çocuk Hastanesi Vakfı'na teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well TC-Treated Microplates | Corning | 3595 | size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution for neurosphere dissociation |
| Burker chamber | Mv medical | FFL16034 | cell counting chamber |
| CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
| Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye | Incucyte | 4743 | Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry |
| Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | - | The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays. |
| Inverted Microscope | - | any inverted microscope | |
| Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
| Tumor stem cell (TSM) medium | - | - | growth cell medium (see reference in the text for details) |
| Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, round bottom clear |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
- Magrì, A., Bardelli, A. Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).
- Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
- Caretti, V., et al. Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma. Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).
- Pericoli, G., et al. Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763 (2020).
- Vinci, M., et al. Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells. Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).
- Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies. Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).
- Huang, C. C., et al. Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells. PLoS One. 10 (6), 0128045 (2015).
- Prudner, B. C., et al. Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors. Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).
- Ferretti, R., et al. Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction. Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
- Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 64 (2018).
- Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).
- Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).
- Mount, C. W., et al. Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M. Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Czabanka, M., et al. Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209 (2020).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Panková, K., Rösel, D., Novotný, M., Brábek, J. The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
