Summary
Cette étude présente un protocole d’immunocytochimie de cellules 3D vivantes appliqué à une lignée cellulaire de gliome diffus pédiatrique, utile pour étudier en temps réel l’expression des protéines sur la membrane plasmique au cours de processus dynamiques tels que l’invasion et la migration des cellules 3D.
Abstract
La migration et l’invasion cellulaires sont des caractéristiques spécifiques des tumeurs mutantes H3K27M du gliome médian diffus (DMG). Nous avons déjà modélisé ces caractéristiques à l’aide de tests tridimensionnels (3D) d’invasion et de migration cellulaires. Dans cette étude, nous avons optimisé ces tests 3D pour l’immunocytochimie des cellules vivantes. Un réactif de marquage des anticorps a été utilisé pour détecter en temps réel l’expression de la molécule d’adhésion CD44, sur la membrane plasmique des cellules migrantes et envahissantes d’une lignée cellulaire primaire dérivée du patient DMG H3K27M. CD44 est associé au phénotype des cellules souches cancéreuses et à la migration et à l’invasion des cellules tumorales et est impliqué dans les interactions directes avec la matrice extracellulaire du système nerveux central (SNC). Les neurosphères (NS) de la lignée cellulaire DMG H3K27M ont été intégrées dans la matrice de la membrane basale (BMM) ou placées sur une fine couche de revêtement de BMM, en présence d’un anticorps anti-CD44 en conjonction avec le réactif de marquage des anticorps (ALR). L’analyse d’images immunocytochimiques de cellules vivantes en 3D a été réalisée sur un instrument d’analyse de cellules vivantes pour mesurer quantitativement l’expression globale de CD44, en particulier sur les cellules migratrices et envahissantes. La méthode permet également de visualiser en temps réel l’expression intermittente de CD44 sur la membrane plasmique des cellules migrantes et envahissantes. De plus, le test a également fourni de nouvelles informations sur le rôle potentiel de CD44 dans la transition mésenchymateuse vers amiboïde dans les cellules DMG H3K27M.
Introduction
La capacité des cellules tumorales à s’échapper et à se disséminer à travers les tissus environnants est une caractéristique du cancer1. En particulier, la motilité des cellules tumorales est une caractéristique des tumeurs malignes, qu’il s’agisse d’un type de tumeur métastatique tel que le cancer du sein2 ou colorectal3 ou d’un type localement invasif tel que le gliome diffus 4,5.
L’imagerie joue un rôle central dans l’étude de nombreux aspects des phénotypes de cellules tumorales; Cependant, l’imagerie de cellules vivantes est certainement à privilégier lors de l’étude de processus cellulaires dynamiques tels que la migration et l’invasion, lorsque des changements de morphologie et d’interaction cellule-cellule 6,7 se produisent et peuvent être examinés plus facilement au fil du temps. Pour l’imagerie de cellules vivantes, différents systèmes de microscopie optique peuvent être utilisés, du contraste de phase aux microscopes confocaux fluorescents, et l’acquisition d’images effectuée sur une courte ou longue période de temps sur un microscope inversé équipé d’une chambre pour le contrôle de la température et du CO2, ou dans des systèmes d’analyse d’images à haut contenu qui ont des chambres intégrées, ou bien dans des systèmes d’image qui peuvent rester dans l’incubateur sans avoir besoin de déranger les cellules pendant toute la durée de l’expérience. Le choix du système utilisé est souvent dicté par un certain nombre de facteurs tels que la résolution nécessaire, la durée du temps global d’acquisition et les intervalles de temps, le type de récipient utilisé et le débit du test (chambre unique ou plaque multipuits), la sensibilité des cellules utilisées (cellules précieuses et/ou rares) et la phototoxicité des cellules en présence de fluorophores.
En ce qui concerne l’imagerie fluorescente en mode vivant, cela peut être réalisé en transduisant des cellules pour l’expression de protéines fluorescentes soit pour une expression stable, soit en tant que système inductible8, par transfection cellulaire transitoire, soit en utilisant des colorants cellulaires qui sont maintenant disponibles pour le marquage des cellules vivantes7, pour le suivi des cellules vivantes ainsi que pour le marquage des organites subcellulaires9.
Une approche utile a récemment été développée pour l’immunocytochimie des cellules vivantes, où un anticorps reconnaissant un marqueur de surface de choix peut être lié à un réactif de marquage et, lors de l’ajout au milieu de culture, les cellules exprimant le marqueur spécifique peuvent être facilement imagées en temps réel par imagerie de cellules vivantes. La visualisation et la quantification de l’expression des marqueurs à l’aide d’un tel système peuvent être facilement réalisées lorsque les cellules sont cultivées dans des conditions de culture bidimensionnelles (2D)10.
Dans cette étude, nous avons optimisé les protocoles pour l’invasion immunocytochimique des cellules 3D vivantes et la migration des cellules pédiatriques de gliome diffus à ligne médiane (DMG) dérivées de patients11,12. Les DMG sont des tumeurs cérébrales très agressives affectant les enfants, pour la grande majorité associées à la mutation conductrice K27M dans les variantes de l’histone H3. Les DMG apparaissent dans le tronc cérébral et les régions médianes du système nerveux central (SNC) et se caractérisent par une nature hautement infiltrante. Il a été démontré que cette capacité invasive est au moins en partie médiée par l’hétérogénéité intratumorale et les caractéristiques cancéreuses des cellules DMG7.
Pour illustrer nos essais, un réactif de marquage d’anticorps (ALR) a été utilisé en combinaison avec un anticorps contre CD44. CD44 est une glycoprotéine transmembranaire et une molécule d’adhésion exprimée sur les cellules souches et d’autres types de cellules, associée au phénotype des cellules souches cancéreuses et à la migration et à l’invasion des cellules tumorales13. Les protocoles comprennent la préparation de l’échantillon, l’acquisition d’images en mode fond clair et fluorescent, et l’analyse sur un instrument d’analyse de cellules vivantes qui a permis de mesurer quantitativement en temps réel l’expression globale de CD44 sur la membrane cellulaire DMG pendant l’invasion et la migration 3D. Les tests ont également permis de visualiser le signal fluorescent intermittent de CD44 sur des cellules individuelles lors de la migration et de l’invasion. Il est intéressant de noter qu’un effet de l’anticorps anti-CD44 a également été observé, qui potentiellement agissant comme un anticorps bloquant, semblait également réduire la migration et l’invasion cellulaires ainsi qu’induire un changement du modèle d’invasion d’un phénotype mésenchymateux collectif à un phénotype amiboïde plus unicellulaire.
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Protocol
Ce protocole suit les lignes directrices des comités d’éthique de la recherche sur des sujets humains des établissements.
REMARQUE : Cette étude a été réalisée à l’aide de l’instrument d’analyse de cellules vivantes Incucyte S3 et/ou SX5 (référencé comme instrument d’analyse de cellules vivantes).
1. Génération de sphéroïdes tumoraux de taille reproductible
NOTE: Le protocole (section 1) décrit par Vinci et al. 2015 7,12, a été utilisé comme indiqué ci-dessous, avec quelques modifications:
- Recueillir les neurosphères (NS) mutantes DMG H3K27M et centrifuger à 170 x g pendant 10 minutes (min) à température ambiante (RT).
- Incuber le NS avec 500 μL de la solution d’accutase pendant 3 min à 37 °C pour les briser.
- Neutraliser la solution d’accutase avec le milieu de cellules souches tumorales (TSM)7 et centrifuger la suspension cellulaire à 355 x g pendant 5 min à TA.
- Remettez en suspension la pastille de cellule dans 1 mL de milieu TSM, puis comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage de cellules.
- Diluer la suspension cellulaire pour obtenir 2,5-5 x 103cellules/mL et ensemencer 100 μL/puits dans des plaques à fond rond à 96 puits à très faible attache (ULA) (voir le tableau des matériaux). Utiliser une densité cellulaire appropriée pour obtenir une NS individuelle de ~300 μm de diamètre, 4 jours après l’ensemencement cellulaire (250-500 cellules/puits pour les cellules de gliome très agressives).
- Confirmer visuellement la formation de NS à l’aide d’un microscope inversé 4 jours après l’ensemencement cellulaire.
2. Préparation du complexe ALR/anticorps et configuration pour le test d’invasion
REMARQUE: Pour la procédure de marquage des anticorps, le protocole10 des colorants de marquage des anticorps pour l’immunocytochimie des cellules vivantes est utilisé avec quelques modifications, comme indiqué ci-dessous. Pour le test d’invasion, le protocole précédemment décrit par Vinci et al. 201512 est suivi.
- Considérez le nombre de puits (p. ex. 60 puits) pour analyser et calculer le volume nécessaire pour chaque réactif. Inclure également les puits pour le témoin négatif (échantillons avec ALR mais sans anticorps).
- Ajouter 100 μL d’eau stérile à l’ALR pour réhydrater le réactif (concentration finale = 0,5 mg/mL). Pipette pour mélanger la solution.
REMARQUE: Le réactif est sensible à la lumière; Par conséquent, restez dans l’obscurité. Aliquote du réactif restant et conserver à -80 °C (éviter la congélation et la décongélation). - Mélanger l’anticorps avec l’ALR dans le milieu VDMD (ou le milieu de croissance cellulaire approprié pour la lignée cellulaire de votre choix) dans une plaque multipuits à fond rond ou dans un tube ambré et protéger de la lumière.
- Préparer une quantité suffisante du milieu pour distribuer 25 μL/puits à 3 fois la concentration finale de l’essai. Incuber à TA pendant 15 min.
REMARQUE : Un rapport molaire de 1:3 entre les anticorps et l’ALR est recommandé, avec une concentration finale (1x) de l’anticorps d’essai <1,5 μg/mL. Pour les expériences de ce protocole, un anticorps anti-humain CD44 de souris est utilisé (concentration initiale de 86 μg/mL) à une concentration finale de 0,1 μg/mL (concentration 3x = 0,3 μg/mL). Ajouter les réactifs dans l’ordre suivant : i) anticorps ; ii) ALR; iii) Moyen VDMD. Mélanger par pipetage. - Diluer le réactif suppresseur de fond (BSR) dans le milieu VDMD (ou le milieu de croissance cellulaire approprié pour la lignée cellulaire de votre choix) à 1,5 mM (3x) pour obtenir à la fin de l’essai une concentration finale de 0,5 mM.
- Effectuer l’essai d’invasion directement dans la plaque à fond rond à 96 puits ULA où les cellules ont été initialement ensemencées. Vérifiez visuellement le NS à l’aide d’un microscope inversé avant de commencer.
- Retirer doucement et lentement 75 μL/puits du milieu, en évitant de toucher le fond du puits où se trouve le NS. Vérifiez visuellement la présence du NS.
- Ajouter délicatement 25 μL de BSR à chaque puits.
- Ajouter doucement 25 μL du complexe ALR/anticorps à chaque puits. Attendez 2 ou 3 minutes pour laisser le complexe ALR/anticorps se mélanger au milieu.
- Vérifiez visuellement à l’aide d’un microscope inversé pour vous assurer que chaque NS est situé au centre au fond du puits. Évitez la formation de bulles. Si une bulle est présente, retirez-la à l’aide d’une aiguille.
- Placez l’assiette sur de la glace et attendez 5 minutes pour que le fond de l’assiette refroidisse.
- Avec une pointe p200 pré-refroidie, distribuer 75 μL/puits de matrice membranaire basale (BMM), en plaçant la pointe de la pipette sur la paroi interne du puits et en évitant de toucher le fond du puits. Évitez la formation de bulles et retirez avec une aiguille stérile celles existantes.
REMARQUE: Assurez-vous d’avoir décongelé le BMM à 4 ° C de la veille. - Laisser l’assiette sur la glace pendant 5 minutes pour laisser le BMM se mélanger au milieu. Vérifiez visuellement à l’aide d’un microscope inversé la présence des NS et qu’ils sont situés au centre du puits. Sinon, centrifuger la plaque à 4 °C à 180 x g pendant 5 min.
- Transférer la plaque dans l’instrument d’analyse de cellules vivantes (Table des matériaux) placé dans l’incubateur à 37 °C, 5% CO2, 95% d’humidité.
3. Préparation du complexe ALR/anticorps et configuration pour le test de migration
REMARQUE: Pour la procédure de marquage des anticorps, le protocole de colorants de marquage10 pour l’immunocytochimie des cellules vivantes est utilisé.
- Considérez le nombre de puits à analyser et calculez le volume nécessaire pour chaque réactif. Inclure également les puits nécessaires pour les contrôles négatifs. Vérifiez visuellement le NS à l’aide d’un microscope inversé avant de commencer.
- Utilisez des plaques à fond plat à 96 puits. Effectuer la procédure de revêtement décrite par Vinci et al., 201314. Pour cette étude, le BMM est utilisé comme revêtement mince.
- Une fois que le revêtement est prêt, retirez l’excès de revêtement BMM avec une pointe p200 plaçant la pointe dans le bord du puits et évitant de toucher le fond. Si vous travaillez avec plusieurs puits, utilisez une pipette multicanal.
- Coupez une pointe p200, prenez 50 μL du milieu cellulaire + NS de chaque puits sélectionné et transférez-la dans un puits à fond plat revêtu. Vérifiez visuellement la présence et la position du NS dans chaque puits.
REMARQUE : Chaque NS doit être située au centre du puits. Évitez de vous appuyer sur la pointe sur le bord du puits pendant le transfert, mais laissez tomber le milieu au centre du puits sans toucher le fond. Pour les cellules hautement migratoires, envisager un nombre plus élevé de réplications que les trois réplicas standard. En effet, lorsque NS se trouve trop près du bord du puits, les cellules migrantes peuvent couvrir une plus petite zone du puits. - Réhydrater l’ALR comme décrit ci-dessus (étapes 2.2-2.3).
REMARQUE: Le réactif est sensible à la lumière. Voir ci-dessus pour de bonnes procédures de manipulation. - Mélanger l’anticorps avec l’ALR dans le milieu de croissance cellulaire complet approprié dans une plaque multipuits à fond rond ou dans un tube ambré et protéger de la lumière. Préparer une quantité suffisante pour distribuer 50 μL/puits à 3x la concentration finale de l’essai. Incuber à TA pendant 15 min.
REMARQUE : Ajoutez les réactifs dans l’ordre indiqué ci-dessus (étape 2.4). - Suivez la même procédure que celle décrite à l’étape 2.5.
- Ajouter délicatement 50 μL de BSR à chaque puits.
- Ajouter doucement 50 μL de l’ALR/anticorps à chaque puits. Attendez 2 ou 3 minutes pour laisser les réactifs se mélanger et vérifier visuellement à l’aide d’un microscope inversé pour vous assurer que la plupart des NS répliqués sont situés au centre du puits.
- Évitez la formation de bulles et enlevez celles existantes à l’aide d’une aiguille. Transférer délicatement la plaque dans l’instrument d’analyse des cellules vivantes placé dans l’incubateur à 37 °C, 5% CO2, 95% d’humidité.
4. Réglage de l’instrument d’analyse de cellules vivantes pour l’acquisition d’images
- Scanner les plaques à l’aide de l’instrument d’analyse de cellules vivantes (pour les spécifications, voir le tableau des matériaux) avec des intervalles de balayage à partir du point de temps zéro (t0) des essais d’invasion et de migration mis en place, respectivement, après l’étape 2.14. et 3.10. jusqu’à 96 h.
NOTA : S’assurer d’être en mesure d’éliminer l’instrument d’analyse des cellules vivantes immédiatement après le début de l’essai d’invasion et de migration. Selon le type de tumeur, les cellules peuvent commencer à envahir ou à migrer du NS déjà dans les 1 heure suivant la configuration du test. - Sur le logiciel de l’instrument d’analyse de cellules vivantes, sélectionnez l’option Planifier l’acquisition. Cliquez sur l’onglet + et sélectionnez l’option Analyser selon le calendrier.
- Dans la fenêtre du logiciel Créer ou restaurer un navire, cliquez sur l’option Nouveau.
- Sélectionnez l’application spécifique dans l’instrument d’analyse de cellules vivantes pour l’acquisition de l’invasion et de la migration. Sélectionnez le type de balayage sphéroïde , l’objectif 4x, les canaux d’image Phase + Brightfield et Green pour le test d’invasion. Sélectionnez le type d’analyse de clonage de dilution , objectif 4x et Phase et vert pour le test de migration.
- Sélectionnez le type de plaque et définissez les puits à scanner en les mettant en surbrillance sur la carte des plaques.
- Configurez la fréquence d’analyse (pour les expériences de ce protocole, la fréquence de balayage était de 15 min pour l’invasion et de 30 min pour la migration).
- Cliquez sur Ajouter à la planification et lancez l’analyse.
5. Réglage de l’instrument d’analyse de cellules vivantes pour l’analyse d’images
- Sélectionnez l’onglet Créer une nouvelle définition d’analyse.
- Sélectionnez Spheroid Invasion ou Basic Analyzer application pour l’invasion et la migration, respectivement, dans l’onglet.
- Sélectionnez les canaux d’invasion et de migration appropriés (pour Invasion : Phase+Brightfield-Green ; pour Migration : Phase-Green) dans le canal d’image.
- Sélectionnez quelques images représentatives de 3-4 puits pour prévisualiser et affiner le paramètre d’analyse.
- Pour le test d’invasion, dans l’onglet Définition de l’analyse , ajustez les paramètres de l’application dans les canaux Brightfield et Green avec le paramètre suivant pour générer une segmentation précise entre les cellules sphéroïdes entières et envahissantes (voir Figure 5 ; masque bleu) :
Segmentation en fond clair: sensibilité sphéroïde entière = 50; Sensibilité des cellules envahissantes = 100; Nettoyage = valeur par défaut.
Filtres sphéroïdes entiers : définissez tous les paramètres par défaut.
Filtres de cellules envahissantes : définissez tous les paramètres par défaut.
Segmentation verte : rayon = 900. - Pour le test de migration, ajustez les paramètres d’application dans les canaux Phase et Vert pour générer une segmentation précise entre la confluence et les cellules vertes (voir Figure 5, masques jaune et rose) avec le paramètre suivant :
Phase : définissez tous les paramètres par défaut.
Segmentation verte : rayon = 300; Seuil = 1000
Nettoyage: Remplissage des trous = 400; Filtres = valeur par défaut.
Whole Well : définissez tous les paramètres par défaut. - Vérifiez que les paramètres d’analyse sont corrects pour le NS en cliquant au hasard sur plusieurs puits. La segmentation doit délimiter le sphéroïde. Si ce n’est pas le cas, ajustez le paramètre en conséquence.
- Sélectionnez les puits et les points temporels à analyser.
- Enregistrez la définition de l’analyse et cliquez sur Terminer.
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Representative Results
Le protocole d’immunocytochimie des cellules vivantes 3D pour l’invasion et la migration est résumé dans un flux de travail simple et reproductible à la figure 1. En ensemençant les cellules DMG dans des plaques à fond rond ULA 96 puits, des NS de taille reproductible sont obtenues et utilisées dans les étapes affichées. Lorsque les NS ont atteint la taille idéale de ~300 μm (environ 4 jours après l’ensemencement), les tests d’invasion12 et de migration14 sont lancés. L’ajout du complexe ALR/anticorps avec le suppresseur de fond dans le milieu de la NS individuelle, permet de suivre l’expression du marqueur spécifique sur la membrane cellulaire, en imagerie en direct et dans le temps. L’expression du marqueur de surface pendant l’invasion et la migration des cellules est facilement surveillée à intervalles allant de t = 0 à 96 h à l’aide de l’instrument d’analyse des cellules vivantes. Ce système d’imagerie permet une analyse d’image entièrement automatisée.
Une lignée cellulaire primaire dérivée du patient, QCTB-R059, a été utilisée pour illustrer les propriétés d’invasion et de migration de la dissémination tumorale DMG pédiatrique. QCTB-R059 était initialement indiqué comme lignée cellulaire de glioblastome thalamique (GBM)pédiatrique 15. Plus tard, il a été indiqué comme lignée cellulaire de gliome thalamique H3-K27M 16 ou gliome diffus à ligne médiane (DMG) H3-K27M lignée cellulaire11, suivant la classification 2016 de l’Organisation mondiale de la santé des tumeurs cérébrales avec l’introduction du mutant DMG H3F3A K27M en tant que nouvelle entité17.
CD44, une molécule d’adhésion connue pour être impliquée dans la migration et l’invasion cellulaire, a été étudiée. CD44 est exprimé par les cellules QCTB-R059, comme le démontrent les images confocales de coloration immunofluorescente (IF) lors de la migration des cellules 3D sur (Figure 2) et de l’invasion dans (Figure 3) BMM.
En tenant compte du fait que l’invasion et la migration 3D sont toutes deux des processus non statiques, nous avons pensé étudier l’expression de CD44 au fil du temps lorsque les cellules sont en mouvement. Pour ce faire, nous avons utilisé le test d’immunocytochimie sur cellules vivantes et adapté le protocole pour les tests 3D. En utilisant l’ALR en complexe avec un anticorps anti-CD44, nous sommes en mesure de suivre en temps réel l’expression de CD44 lorsque la protéine est exprimée sur la membrane cellulaire tandis que les cellules échappent aux neurosphères et se propagent sur et dans le BMM.
L’immunocytochimie des cellules 3D vivantes permet de visualiser l’expression de CD44 (vidéo supplémentaire 1 et vidéo supplémentaire 2). Les images représentatives du time-lapse, tant pour la migration que pour l’invasion (Figure 4A,B), montrent plus en détail l’expression intermittente de CD44 sur la membrane cellulaire. En particulier, il est possible de voir le signal fluorescent vert être activé (cercle vert) puis éteint (cercle noir) sur la même cellule observée au fil du temps, ce qui suggère que l’expression de CD44 est activée et désactivée pendant que les cellules migrent et envahissent.
Les processus de migration et d’invasion sont suivis sur 96 h, et comme le montre la figure 5, les cellules QCTB-R059 présentent un taux élevé de CD44, démontrant que globalement l’expression observée avec l’immunocytochimie des cellules vivantes est conforme à l’expression de CD44 obtenue par IF montrée sur les images confocales de la figure 2 et de la figure 3. Fait intéressant cependant, nous avons également remarqué que lorsque l’anticorps anti-CD44 est utilisé sur des cellules vivantes, il affecte la morphologie cellulaire, induisant une transition de l’invasion mésenchymateuse à l’invasion amiboïde. Il induit une réduction de la capacité invasive et migratoire de ces cellules (Figure supplémentaire 1). Nous ne pouvons cependant pas exclure que la réduction de la migration et de l’invasion cellulaire observée soit également due en partie à une inhibition de la prolifération cellulaire.
L’analyse automatisée des images effectuée sur l’instrument d’analyse de cellules vivantes montre la quantification de l’expression de CD44 et son augmentation au fil du temps, mesurée par le signal fluorescent vert global associé à l’ALR (Figure 5B,C) pour la migration et l’invasion. Les quantifications sont obtenues comme illustré à la figure 5B et à la figure 5C, l’analyse automatisée de l’image étant définie pour segmenter toute la zone couverte par les cellules CD44 vertes migrées (Figure 4B) et toute la zone de propagation couverte par les cellules CD44 envahies en vert, mais à l’exclusion du noyau de la neurosphère (Figure 5C).
Figure 1 : Flux de travail schématique des tests d’immunocytochimie sur cellules 3D vivantes. Le flux de travail montre les étapes impliquées dans les méthodes d’imagerie en direct d’invasion et de migration 3D, y compris des images représentatives de cellules pédiatriques primaires dérivées de patients DMG (QCTB-R059) après invasion dans (panneau supérieur; t = 96 h) et migration vers (panneau inférieur; t = 96 h) BMM. Barres = 800 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Expression de CD44 dans la migration 3D des cellules tumorales. Images confocales immunofluorescentes représentatives de l’expression de CD44 dans des cellules primaires dérivées de patients atteints de DMG (QCTB-R059) lors de la migration vers BMM. Point temporel = 96 h (rouge:CD44; bleu: noyaux). Barres d’échelle : 500 μm (panneau supérieur) et 200 μm (panneau inférieur). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Expression de CD44 dans l’invasion cellulaire tumorale 3D. Images confocales immunofluorescentes représentatives de l’expression de CD44 dans des cellules primaires dérivées de patients DMG (QCTB-R059) lors de l’invasion dans la BMM. Point temporel = 96 h (rouge:CD44; bleu: noyaux). Barres d’échelle : 250 μm (panneau supérieur) et 100 μm (panneau inférieur). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Expression de CD44 au fil du temps. Images sélectionnées du time-lapse de migration (A) et d’invasion (B) QCTB-R059. Des images ont été obtenues sur l’instrument d’imagerie de cellules vivantes. Le cercle vert indique l’expression de CD44, le cercle noir indique aucune expression de CD44 sur la membrane cellulaire de la même cellule observée au fil du temps. Barres d’échelle : 200 μm (A) et 100 μm (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Tests d’immunocytochimie sur cellules 3D vivantes pour CD44 : migration et invasion. (A) Des images représentatives en fond clair, fluorescentes (ALR avec anticorps anti-CD44) et fusionnées de la migration et de l’invasion de l’immunocytochimie cellulaire QCTB-R059 (96 h) sont montrées. Barres d’échelle : 400 μm. (B) Quantification de l’expression globale de CD44 par rapport à la migration (B) et à l’invasion (C), déterminée par analyse d’image ALR-anti-CD44 sur l’instrument d’imagerie de cellules vivantes. Les courbes montrent l’intensité moyenne verte de l’expression de CD44 au fil du temps. Les valeurs sont moyennes ± écart-type. Les deux petites figures des graphiques montrent la segmentation appliquée pour l’analyse de la migration (B) où toute la zone a été considérée et l’invasion (C) pour laquelle la partie centrale NS a été exclue. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Effet de l’anticorps anti-CD44 sur la morphologie cellulaire et le degré de motilité cellulaire. Des images représentatives du test d’invasion et de migration QCTB-R059 montrent l’effet de l’anticorps anti-CD44 utilisé pour l’immunocytochimie des cellules 3D vivantes. Les cellules présentent une capacité d’invasion et de migration réduite ainsi que la transition d’un profil d’invasion plus mésenchymateux à un profil d’invasion amiboïde entre le témoin négatif (sans anticorps anti-CD44) et CD44 (plus anticorps anti-CD44). Le panneau inférieur montre un grossissement de puissance plus élevé affichant une vue plus claire de l’aspect morphologique des cellules en l’absence et la présence de l’anticorps anti-CD44 (flèches blanches). Barres d’échelle : panneau supérieur de 800 μm et panneau inférieur de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Vidéo supplémentaire 1 : Vidéo time-lapse de la migration cellulaire 3D QCTB-R059 sur BMM en présence d’anticorps anti-CD44. Le signal vert fluorescent, représentant l’expression de CD44 sur la membrane cellulaire, est visualisé au fil du temps par la conjugaison de l’anticorps anti-CD44 avec ALR. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo supplémentaire 2 : Vidéo accélérée de l’invasion cellulaire 3D QCTB-R059 dans BMM en présence d’anticorps anti-CD44. Le signal vert fluorescent, représentant l’expression de CD44 sur la membrane cellulaire, est visualisé au fil du temps par la conjugaison de l’anticorps anti-CD44 avec ALR. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
L’immunocytochimie des cellules 3D vivantes que nous avons adoptée ici pour l’invasion et la migration pédiatriques de DMG pourrait être facilement adaptée également à d’autres types de cellules tumorales hautement invasives, y compris les lignées cellulaires cancéreuses du sein et du côlon.
Contrairement aux tests d’immunocytochimie sur cellules 2D vivantes10 précédemment réalisés, lorsque vous travaillez en 3D, il est suggéré de prêter attention à certaines étapes critiques. En particulier, pour le test d’invasion que nous décrivons, il est conseillé d’ajouter le mélange ALR/anticorps directement au milieu avec NS dans chaque puits, avant l’ajout du BMM, et non dans le BMM ou au-dessus du BMM une fois gélifié. Il s’agit de permettre un bon mélange des réactifs avec le milieu et d’assurer un accès plus direct des réactifs à la surface cellulaire. De plus, pour assurer une meilleure qualité de l’imagerie, bien que le protocole comprenne l’utilisation du BSR, nous conseillons d’utiliser un milieu sans rouge de phénol et BMM.
Un autre point à considérer pour l’immunocytochimie des cellules vivantes est que tout anticorps liant une protéine membranaire extracellulaire sur des cellules vivantes peut affecter la fonction protéique en modifiant sa conformation ou en occupant le site de liaison d’un ligand ou d’une protéine sur une cellule adjacente, agissant ainsi comme un « agent bloquant»18,19. Bien que cette approche puisse être utile en tant que stratégie thérapeutique19, elle peut ne pas être l’objectif principal d’une installation expérimentale. Par conséquent, avant d’effectuer un grand nombre d’expériences, différents anticorps liant des épitopes distincts de la même protéine doivent être testés pour vérifier également tout effet « bloquant » potentiel. Dans cette étude, nous avons utilisé un anticorps spécifique pour suivre en temps réel l’expression de CD44 sur la membrane cellulaire d’une lignée cellulaire pédiatrique DMG très agressive en invasion et migration 3D. Le protocole utilisé nous a permis de mesurer quantitativement l’expression de CD44 au fil du temps sur les cellules envahissantes et migrantes. Fait intéressant, en présence de l’anticorps anti-CD44, nous avons également noté une réduction de la motilité cellulaire par rapport aux cellules avec l’ALR mais en l’absence de l’anticorps. Nous ne pouvons pas exclure mais aussi un effet inhibiteur sur la prolifération cellulaire. L’acquisition d’un schéma d’invasion différent avec un passage de la morphologie cellulaire mésenchymateuse à la morphologie cellulaire amiboïde20 a également été observée en présence d’anticorps anti-CD44. Ces résultats inattendus suggèrent que le blocage de CD44 peut contribuer à la transition mésenchymateuse vers amiboïde chez les enfants atteints de DMG.
En ce qui concerne les limites de ce protocole, compte tenu de la résolution de la caméra CCD de l’instrument d’analyse de cellules vivantes d’incucytes et de sa capacité limitée de pile z, la configuration que nous présentons pour les tests d’immunocytochimie de cellules vivantes 3D peut être utilisée comme approche préliminaire, sur un format multipuits à grande échelle, avant de passer à une analyse plus approfondie utilisant soit des systèmes d’imagerie fluorescente plus puissants (par exemple, microscopes confocaux et système d’imagerie à haut contenu avec une modalité confocale comme l’Operetta CLS ou l’Opera Phoneix) ou une approche plus raffinée pour étudier en temps réel l’expression d’une protéine de surface via un test rapporteur21.
Une application plus large de l’immunocytochimie des cellules vivantes 3D, présentée ici sous forme de monoculture, pourrait être un test de co-culture 3D établi pour imager et analyser en temps réel les interactions directes cellule-cellule. Dans ce cas, deux ALR différents pourraient être utilisés avec différents fluorophores pour lier les protéines spécifiquement exprimées sur la membrane cellulaire sur différents types de cellules (par exemple, les cellules tumorales et les cellules immunitaires). Dans ce cas, le contact direct cellule-cellule peut être analysé avec l’imagerie en direct par la co-localisation des deux différents complexes ALR/anticorps.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucune affiliation ou implication financière pertinente avec une organisation ou une entité ayant un intérêt financier ou un conflit financier avec le sujet ou les documents discutés dans le manuscrit.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier la Dre Silvia Soddu et la Dre Giulia Federici (Unité des réseaux cellulaires et des cibles thérapeutiques moléculaires, IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute, Rome, Italie) pour leur accès au système d’imagerie des cellules vivantes IncuCyte S3 dans la mise en place préliminaire du protocole d’imagerie. De plus, nous remercions Bernadett Kolozsvari pour ses conseils techniques. L’étude a été financée par la subvention Children with Cancer UK (16-234) et le ministère italien de la Santé, Ricerca Corrente. M Vinci est membre de Children with Cancer UK. R Ferretti est récipiendaire de la bourse de la Fondazione Veronesi (2018 et 2019). Les auteurs remercient la Fondazione Heal pour son soutien et la Children’s Hospital Foundation pour le financement de la Queensland Children’s Tumor Bank.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well TC-Treated Microplates | Corning | 3595 | size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution for neurosphere dissociation |
| Burker chamber | Mv medical | FFL16034 | cell counting chamber |
| CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
| Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye | Incucyte | 4743 | Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry |
| Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | - | The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays. |
| Inverted Microscope | - | any inverted microscope | |
| Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
| Tumor stem cell (TSM) medium | - | - | growth cell medium (see reference in the text for details) |
| Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, round bottom clear |
References
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