Summary
빠른 반복률 형광계 (FRRf)는 광계 II 광생리학 및 일차 생산성을 측정하는 유익한 방법입니다. 여기서 우리는 큐벳 타입 FRRf를 사용하여 기질 동물 플랑크톤에 대한 후생대 조류, Colacium sp.의 PSII 광생리학을 측정하는 프로토콜을 설명한다.
Abstract
빠른 반복률 형광계 (FRRf)는 광시스템 II (PSII) 광생리학 및 일차 생산성을 측정하는 유익한 방법입니다. FRRf는 다양한 진핵 조류 및 시아 노 박테리아에 대한 PSII 흡수 단면 (σ PSII), 최대 광화학 효율 (Fv / Fm), 효과적인 광화학 효율 (Fq '/ Fm') 및 비 광화학 담금질 (NPQNSV)을 측정 할 수 있지만 현재까지 거의 모든 FRRf 연구는 식물성 플랑크톤에 중점을 두었습니다. 여기서, 프로토콜은 후생대 알가 콜라시움 sp의 PSII 광생리학을 측정하는 방법을 기술한다. Ehrenberg 1834 (Euglenophyta)는 큐벳 형 FRRf를 사용하여 부착 된 단계 (동물 플랑크톤에 부착)에 있습니다. 먼저, 우리는 기질 동물 플랑크톤 (Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776, Cladocera, Daphniidae)이 기준선 형광에 미치는 영향과 플랑크톤 콜라시움 sp의 σ PSII, Fv / Fm, Fq '/ Fm'및 NPQNSV에 미치는 영향을 추정했습니다. 이 방법론을 검증하기 위해, 우리는 S. mucronata에 부착 된 Colacium sp.의 광생리학 측정을 기록하고 이러한 결과를 플랑크톤 단계와 비교했습니다. 대표적인 결과는 프로토콜이 Colacium sp. 광생리학에 대한 칼슘 (Ca) 및 망간 (Mn)의 효과를 결정하고 부착 단계와 플랑크톤 단계 사이의 Mn 농축의 다양한 효과를 확인하는 방법을 보여주었습니다. 마지막으로, 우리는이 프로토콜이 다른 periphytic 조류에 적응할 수 있는지에 대해 논의합니다.
Introduction
엽록소 가변 형광은 조류 광계 II (PSII) 광생리학을 측정하는 데 유용한 도구입니다. 조류는 PSII 광생리학을 변경함으로써 과도한 빛과 영양 결핍과 같은 다양한 환경 스트레스에 반응합니다. 빠른 반복률 형광계(FRRf)는 PSII 광생리학1,2을 측정하고 일차 생산성1,3,4를 추정하는 일반적인 방법으로, 식물성 플랑크톤 PSII 광생리학을 모니터링할 수 있을 뿐만 아니라 넓은 공간 및 시간적 척도5,6,7에서 1차 생산성을 모니터링할 수 있습니다. FRRf는 PSII (σ PSII) 흡수 단면, 반응 중심 ([RCII]) 농도, 최대 광화학 효율 (Fv / Fm), 효과적인 광화학 효율 (Fq ' / Fm') 및 비 광화학 담금질 (NPQNSV) (표 1)을 동시에 측정 할 수 있습니다. 일반적으로 Fv/Fm 및 Fq'/Fm'은 PSII 활성8로 정의되며, NPQNSV는 상대 방열 에너지9로 정의됩니다.
중요하게도, FRRf의 단일 턴오버(ST) 플래시는 일차 퀴논 전자 수용체인 QA를 완전히 감소시키지만, 플라스토퀴논 풀은 감소시키지 않는다. 반대로, 펄스 진폭 변조(PAM) 형광계로부터의 다중 턴오버(MT) 플래시는 둘 다 감소시킬 수 있다. ST 방법은 Fv/Fm, Fq'/Fm', NPQNSV 및 σ PSII10의 회복 동역학을 동시에 측정하여 NPQNSV의 가능한 기원을 식별할 때 MT 방법에 비해 분명한 이점이 있습니다. 현재까지 잠수할 수 있는 유형, 큐벳 유형 및 플로우 스루 타입과 같은 여러 유형의 FRRf 장비가 상용화되어 있습니다. 잠수할 수 있는 타입 FRRf는 바다와 호수에서 현장 측정을 가능하게 하며, 큐벳형 FRRf는 작은 시료 부피를 측정하는 데 적합합니다. 유동 스루 유형은 일반적으로 표층수에서 식물성 플랑크톤의 광생리학을 지속적으로 측정하는 데 사용됩니다.
광범위한 피험자에 대한 큐벳 타입을 포함한 PAM 형광계의 발달을 감안할 때11, PAM 형광계는 조류 광생리학 연구에서 FRRfs보다 여전히 더 일반적이다12. 예를 들어, 이들 툴 사이의 샘플 챔버 구조와 큐벳 용량은 약간만 다르지만, 큐벳형 PAM은 식물성 플랑크톤13,14,15, 벤딕 미세조류16,17,18, 얼음 조류19 및 상생대 조류20에 적용되었으며, 큐벳형 FRRf는 주로 식물성 플랑크톤21,22,23에 적용되었다. 그리고 제한된 수의 얼음 조류 공동체24,25. 그 효과를 감안할 때, 큐벳 형 FRRf는 벤딕 조류 및 후생대 조류에 똑같이 적용됩니다. 따라서 응용 프로그램을 확장하면 PSII 광생리학, 특히 덜 알려진 epizoic algal 광생리학에 대한 상당한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
후생대 조류는 PSII 광생리학20,26을 조사한 연구는 거의 없으며, 수생 식품 웹에서 사소한 역할 때문일 가능성이 큽니다.27,28. 그러나 후생대 조류를 포함한 epibionts는 번식 및 생존율 증가29,30과 같은 동물 플랑크톤 공동체 역학에 긍정적 인 영향을 미칠 수있을뿐만 아니라 침몰률 증가29,31 및 시각 포식자에 대한 취약성과 같은 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.32,33,34,35,36 . 따라서 동물 플랑크톤 공동체에서 epibiont 역학을 통제하는 환경 및 생물학적 요인을 탐구하는 것이 중요합니다.
후생대 조류 중에서, Colacium Ehrenberg 1834 (Euglenophyta)는 공통의 담수, 조류 그룹32,37,38,39 (첨부 (그림 1A-D), 비 운동성 플랑크톤 (그림 1E, F) 및 운동성 플랑크톤 단계 40,41을 포함한 다양한 생명 단계를 포함합니다. . 비운동성 플랑크톤 단계 동안, 세포는 점액질42로 덮인 단세포 플랑크톤, 응집된 콜로니, 또는 일층 시트 콜로니로 산다. 부착 단계에서, Colacium sp.는 기질 유기체 (basibionts), 특히 미세 갑각류41,43에 부착하기 위해 세포의 전방 말단으로부터 배설 된 점액질37,39,41을 사용한다. 그들의 수명주기는 또한 탈피 된 외골격 또는 죽은 basibiont에서 분리하고 다른 기질 유기체를 찾기 위해 편모와 함께 수영하는 것을 포함합니다39. 플랑크톤과 부착 단계 모두 유사분열에 의해 개체군 크기를 증가시킬 수 있다40. 비록 그것들의 부착된 단계가 빛44 및 미량 원소41,45,46과 같은 자원을 수집하기 위한 진화적 특성이거나 분산 전략27로서 가설화되었지만, 이러한 측면들에 대한 실험적 증거는 거의 없다37,41,44 그리고 주요 부착 메커니즘은 대체로 알려져 있지 않다. 예를 들어, Rosowski와 Kugrens는 Colacium이 외골격47에 농축 된 기질 copepods41로부터 망간 (Mn)을 얻을 것으로 예상했다.
여기에서는 플랑크톤 조류의 PSII 광생리학을 측정하는 방법과 큐벳형 FRRf를 사용하여 Colacium sp. 세포로 부착된 조류(동물플랑크톤에 부착)를 표적화하는 관련 적용 방법을 설명한다. 우리는 444nm, 512nm 및 633nm48에 집중된 플래시 여기 에너지를 제공하는 세 개의 발광 다이오드(LED)가 장착된 Act2 시스템을 사용합니다. 여기서, 444 nm (파란색)는 크로필 a (Chl-a)의 흡수 피크에 해당하고, 512 nm (녹색) 및 633 nm (오렌지)는 각각 피코에리트린과 피코시아닌의 흡수 피크에 해당한다. 형광 신호 검출 피크는 682nm이며 30nm의 절반 대역폭을 갖는다. 자연 환경에서 Colacium sp.의 플랑크톤 단계를 찾기가 어렵기 때문에, 그들의 부착 단계를 실험을 위해 수집하였다. 수많은 기질 유기체 중에서,Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776 (Branchiopoda, Daphniidae; 그림 1A, B, G)는 느린 수영 속도, 큰 신체 크기 (400-650 μm) 및 독특한 행동 (물 표면에 거꾸로 매달려 있음)으로 인해 가장 간단한 처리 방법 중 하나입니다. 따라서, 이 프로토콜은 S. mucronata에 부착된 Colacium sp.를 Colacium-basibiont 시스템의 사례 연구로서 사용한다. 장 내용물에서 유래 된 형광을 피하기 위해 S. mucronata는 굶주렸다. 이전 연구에서는 장 내용물(섭취된 조류)의 형광 신호가 40분49 이후 다섯 배 감소를 나타냄을 보고한 바와 같이, 90분 기아가 영양 결핍과 같은 Colacium sp.에 대한 실험 스트레스의 최소 영향으로 FRRf 측정에 영향을 미치는 장내 함량 형광의 가능성을 최소화하기에 충분할 것으로 예상했습니다. 또한,이 프로토콜은 Colacium sp.의 부착 메커니즘을 명확히하고 두 금속, 칼슘 (Ca)과 망간 (Mn)이 플랑크톤 및 부착 단계 모두의 광생리학에 어떻게 영향을 미치는지를 결정하기 위해 적용되었습니다. 칼슘은 여러 가지 방법으로 광합성 경로50에서 중요한 역할을 하며, 두 금속 모두 PSII51의 산소-진화 복합체를 구성하는 데 필요합니다. 칼슘과 망간은 갑각류 동물 플랑크톤47의 캐러페이스에 고도로 집중되어 있기 때문에, 우리는 Colacium sp. 광생리학이 플랑크톤 단계에서 Ca 및 Mn 농축에 더 두드러지게 반응할 수 있다고 가정한다.
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Protocol
1. 샘플링
- 양동이로 표면에서 호수 물을 수집하십시오. S. mucronata (도 1A-C) 필터에 부착된 Colacium sp.를 표적으로 하기 위해 100 μm 나일론 메쉬 net52를 사용하여 0.5-10 L의 호수 물을 여과한다.
참고 : S. mucronata는 종종 갈대 (phragmites) 지역과 같이 얕고 부영양적이며 진흙 투성이의 물에 조밀하게 응집됩니다. - 농축된 샘플을 350mL의 호수 물과 함께 500mL 플라스틱 병에 보관하십시오. 어두운 환경에서 보관하십시오.
- 실험실에서 샘플 물을 500 mL 비이커에 붓고 몇 분 동안 정착시킵니다.
- 호수 물을 0.2 μm 공극 크기 필터를 통해 여과한다.
- S를 데리러 오십시오. mucronata 개인은 100x 배율로 광학 현미경으로 피펫을 사용합니다. Błędzki 및 Rybak53에 따라 종 식별을 수행하십시오.
- 이를 유리 슬라이드 위에 놓은 0.2-μm 여과된 호수수(FLW) 방울로 옮긴다.
참고: S. mucronata 는 표면으로 수영하거나 비커 벽에 부착 할 수 있습니다. - S를 확인하십시오. 가벼운 현미경 검사하에 mucronata.
- 세척 S. mucronata 개체는 다른 유기체의 오염을 방지하기 위해 FLW (3 방울 이상)를 사용합니다 (그림 2).
- S를 유지하십시오. 40 μmol 광자·m−2·s−1 미만의 성장 챔버 내의 현장 온도에서 뮤크로나타.
2. S의 효과 . 기준선 형광에 대한 뮤크로나타
-
S. 무크로나타 재배
- S. mucronata 개체를 100x 배율로 광학 현미경으로 피펫을 사용하여 픽업하고 1.8 단계와 같이 FLW를 사용하여 씻으십시오.
- 에어 스톤을 통해 전기 공기 펌프를 사용하여 수돗물을 적어도 1 주 동안 통기하십시오. 폭기 된 수돗물 300 mL를 350 mL 유리 병에 붓습니다.
- 클로렐라 (1 mg C·L-1)를 공급하고 성장 챔버에서 40 μmol 광자·m-2·s-1 하에 20°C에서 유지한다.
- 약 14 일 후, 100x 배율의 광학 현미경으로 피펫을 사용하여 5-30 명의 개인을 데리러 300 mL의 깨끗하고 폭기 된 수돗물에 접종하여 배지를 신선하게 유지하십시오.
- FRRf 설정
- Act2Run 소프트웨어를 시작합니다.
- 옵션 탭을 클릭하고 작동 모드에서 Act2 FLC(흰색 LED)를 선택하여 actinic LED 색상을 설정합니다.
- 주 창에서 형광-광 곡선 설정의 단계 1에서 Dark의 값을 클릭하고 30을 입력하여 어두운 기간의 지속 시간을 설정합니다(그림 3A).
- LED 조합 B, C 및 D를 클릭하여 녹색 및 주 황색 LED를 끕니다(그림 3C).
- Sat 아래의 Fets 및 Pitch 값을 클릭하고 각각 100과 2를 입력하여 포화 단계에서 플래시렛의 수와 피치를 설정합니다(그림 3D).
- Rel에서 Fets 및 Pitch 값을 클릭하고 각각 40과 60을 입력하여 이완 단계에서 플래시렛의 수와 피치를 설정합니다(그림 3E).
- FLC 동안(그림 3F)을 클릭하여 워터 재킷 펌프를 작동시켜 측정 중에 샘플 온도를 제어합니다.
- 자동 LED 및 자동 PMT를 클릭하여 활성화합니다(그림 3F).
- 동기화를 클릭하여 FRRf-Act2를 연결합니다.
- FRRf 측정
- 기준선 형광에 대한 동물 플랑크톤 개체의 효과를 조사하려면 성인 S를 준비 하십시오. mucronata (신체 크기 400-650 μm)로부터 어떠한 부착 유기체도 없이 단계 2.1.1-2.1.4에서 배양하였다.
- 장 내용물에서 형광을 피하려면 FLW의 개인을 20 ° C에서 적어도 90 분 동안 굶어 죽입니다.
- 1.5mL의 FLW를 큐벳에 붓습니다. 0, 1, 5 및 10 S. mucronata 개체를 100x 배율로 광학 현미경으로 피펫을 사용하여 픽업하십시오.
- 전송 S. mucronata 개인을 큐벳에 넣고 FLW를 추가하여 샘플을 최대 2mL까지 가져옵니다.
- FRRf 측정 전에 15분 동안 20°C에서 저조도(1-10μmol 광자·m−2·s-1) 하에서 적응시킨다.
- Act2 실행을 클릭하여 측정을 시작합니다. 샘플당 측정을 >3회 반복합니다.
- 결과 그림에서 Fo 값을 읽습니다(그림 4).
3. 기질 유기체 가 형광에 미치는 영향
-
콜라시움 sp. 재배
- 배양을 위해 FLW 및 AF-6 배지54 를 준비한다(표 2).
- 단계 1.1 및 1.2에서와 같이 S. mucronata에 부착된 Colacium sp.를 수집하고, 성장 챔버 내의 계내 온도에서 유지한다.
- 100x 배율에서 광학 현미경 하에서 피펫을 사용하여 용융된 카라페이스(그림 1D)로 Colacium sp.를 픽업합니다. 1.8 단계와 같이 FLW로 씻으십시오.
- 무균적으로 Colacium sp. 및 AF-6 배지를 깨끗한 벤치의 10 mL 유리 튜브에 접종하십시오.
- 배양물을 성장 챔버에서 200 μmol 광자·m-2·s-1 하에 계내 온도에서 유지한다. 세포 침전을 방지하기 위해 하루에 한 번 이상 손으로 유리 튜브를 부드럽게 흔든다.
참고: 응집된 콜로니의 감쇠 효과를 가능한 한 낮게 유지하려면 FRRf 측정 전에 현미경으로 콜로니를 확인하십시오. 세포 응집은 조밀 한 식민지를 일으키고 조류 광생리학에 영향을 줄 수 있습니다55.
- FRRf 측정
- Colacium sp.의 Chl-a 형광에 대한 동물 플랑크톤 개체의 영향을 조사하려면 성인 S를 준비하십시오. mucronata (신체 크기 400-650 μm)는 부착 된 유기체가 없습니다.
- 장 내용물에서 형광을 피하려면 FLW에서 적어도 90 분 동안 굶주 리십시오.
- 큐벳 타입 빠른 반복률 형광계(FRRf)를 설정합니다.
- 예비배양된 Colacium sp.의 1.5 mL 서브샘플을 큐벳에 붓는다. 0, 5, 10 및 15 S를 전송 합니다. mucronata 개인을이 큐벳에 넣고 2 μm의 여과 된 배지를 첨가하여 샘플을 2 mL까지 가져옵니다.
- FRRf 측정을 취하기 전에 20°C에서 15분 동안 저조도(1-10μmol 광자·m−2·s-1) 하에서 적응시킨다.
참고: 측정 중에 샘플을 인큐베이션 온도에서 유지하십시오. - Act2 실행을 클릭하여 측정을 시작합니다. 샘플당 측정을 >3회 반복합니다.
- 결과 그림에서 FO 및 Fm 값을 읽습니다(그림 4).
참고: LED 전원이 PSII 파라미터를 올바르게 추정하기 위한 최적 범위 내에 있는지 여부를 보여주는 RσPSII 값(표 1)을 확인하십시오. 자동 LED가 활성화되면 Act2run 시스템은 LED 전원을 제어하여 최적의 RσPSII 범위(0.042-0.064)를 달성합니다. 실험적 RσPSII 컷오프 값은 이전 연구48에서 0.03 및 0.08로 정의되었다. - 기준선 형광22를 보정하기 위해, 배양액을 0.2-μm 공극 크기 필터를 사용하여 여과하고 형광을 측정하였다. Colacium sp.의 FO 및 Fm에서 기준선 샘플의 FO를 빼거나 옵션 탭의 설정에서 빈 보정 값을 수정합니다.
4. Colacium sp.의 광생리학 (부착 단계)
- 피펫을 사용하여 Colacium sp.를 가진 S. mucronata 개인을 광학 현미경으로 분리하십시오.
- 세척 S. 1.8 단계에서와 같이 FLW를 사용하는 mucronata .
- 전송 S. 뮤크로나타 를 FLW 100 mL에 넣습니다. 굶주림의 경우 어두운 조건에서 90 분 동안 현장 온도에서 보관하십시오.
- 1.5mL의 FLW를 큐벳에 붓습니다.
- 전송 ~ 10 S. Colacium sp.를 큐벳으로 가진 mucronata 개인. 측정을 위해서는 2mL당 100개 이상의 콜라시움 세포가 필요합니다. FLW를 첨가하여 샘플을 최대 2mL까지 가져옵니다.
- 저조도(1-10μmol 광자·m-2·s-1) 하에서 15분 동안 현장 온도에서 적응합니다. 단계 3.2.6-3.2.8에서와 같이 Chl-a 형광을 측정합니다 .
- 부착된 세포의 수를 열거하기 위해, FRRf 측정을 취한 후 글루타르알데히드(2% 최종 부피)로 샘플을 고정시킨다. S의 여러 초점 깊이와 위치에서 사진을 찍습니다. 광학 현미경으로 mucronata .
5. Colacium sp.의 광생리학 (플랑크톤 단계)
- 샘플링된 Colacium sp.를 단계 3.1.1-3.1.5에서와 같이 계내 온도에서 AF-6 배지에서 배양한다.
- 고정상의 경우, 배양된 Colacium sp. 2 mL를 취하여 큐벳에 부어줍니다.
- 저조도(1-10μmol 광자·m-2·s-1) 하에서 15분 동안 현장 온도에서 적응합니다. 단계 3.2.6-3.2.8에서와 같이 Chl-a 형광을 측정합니다 .
6. Colacium sp의 광생리학에 대한 Ca 및 Mn 첨가의 효과.
- 첨부된 스테이지에 대한 효과
- 피펫을 사용하여 Colacium sp.를 가진 S. mucronata 개인을 광학 현미경으로 분리하십시오. 단계 1.8에서와 같이 FLW를 사용하여 세척한다.
- 여섯 명을 각각 30mL의 FLW가 있는 12개의 유리 비커로 옮깁니다. 각 비커에 >100 Colacium sp. 세포가 포함되어 있는지 확인하십시오.
- 200 μmol· L−1 CaCl2· H2O (Ca 처리), 40 μmol· L-1 MnCl4 (Mn 처리) 또는 초순수 (대조군)를 각 비이커에 적용한다. 샘플을 성장 챔버 내의 계내 온도에서 200 μmol 광자·m-2·s-1 하에 인큐베이션한다.
- 3 시간 및 21 시간에, 모든 개인과 털갈이 된 피부를 2 mL의 배지가있는 큐벳으로 옮깁니다.
- 증가하는 빛에 대한 빠른 반응을 조사하려면 8개의 actinic light 단계의 기간 중 Up 을 클릭하고 20을 입력(그림 3A)하여 각 단계의 지속 시간을 20초로 설정합니다. 단계적 화학광을 0, 11, 25, 44, 68, 101, 144 및 200 μmol 광자·m-2·s-1로 설정하려면 High E 및 Step Up을 클릭하고 값을 각각 200 및 34로 변경합니다(그림 3B).
- 15분의 다크 순응 후에, Chl-a 단계 3.2.6-3.2.8과 유사한 각 샘플의 형광을 측정하였다.
참고: RσPSII 및 RσPSII의 값이 최적 범위(0.03-0.08)48 내에 있는지 확인하십시오.
- 플랑크톤 단계에 미치는 영향
- 샘플링된 Colacium sp.를 단계 3.1.1-3.1.5에서와 같이 계내 온도에서 AF-6 배지에서 배양한다.
- 배양된 Colacium sp.를 FLW 내로 옮기고, 200 μmol 광자·m-2·s-1 미만의 계내 온도에서 3일 동안 적응시킨다.
- 적응된 샘플 1mL를 FLW 10mL가 있는 세 개의 유리 바이알에 옮깁니다.
- 200 μmol· L−1 CaCl2· H2O (Ca 처리), 40 μmol· L-1 MnCl3 (Mn 처리) 또는 바이알에 초순수 (대조군). 샘플을 성장 챔버 내의 계내 온도에서 200 μmol 광자·m-2·s-1 하에 인큐베이션한다.
- 3 h 및 21 h에서, 단계 3.2.6-3.2.8에서와 같이 각 샘플의 Chl-a 형광을 측정하였다 .
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Representative Results
S. mucronata에 의한 기준선 형광 (도 5) 또는 Chl-a 형광 (도 6)의 유의한 효과는 최대 5 명 (inds.) mL-1까지 없었다. 그러나 Fv / Fm 및 NPQNSV는 S. mucronata가 7.5 inds·mL-1 일 때 크게 영향을 받았다. 따라서 부착 단계에서 Colacium sp.의 광생리학을 측정하기 위해 우리는 충분한 Colacium sp. 풍부 (>50 cells·mL-1)와 큐벳의 S. mucronata (≤5 inds·mL-1)의 수가 적기 위해 Colacium sp.의 부담이 높은 S. mucronata를 선택했습니다.
표 3은 부착 단계 동안 Colacium sp.의 광생리학의 계절적 변화를 보여준다. 샘플링 온도는 다양했지만 광생리학은 비교적 일정하게 유지되었습니다. σ PSII는 3.42 nm2에서 3.76 nm2 (평균 3.60 nm2)로 다양했으며 Fv / Fm은 0.52에서 0.60 (평균 0.55)으로 다양했으며 NPQNSV는 0.66에서 0.85 (평균 0.82)로 다양했습니다. 이러한 결과를 검증하기 위해, AF-6 배지에서 고정상에 대한 플랑크톤 단계 동안 Colacium sp. 광생리학의 변이를 추가로 조사하였다(표 4). 부착된 단계에 대한 평균 Fv/Fm 및 NPQNSV는 AF-6 배지에서 인큐베이션되었을 때 플랑크톤 단계의 것과 유사하였다.
부착 및 플랑크톤 단계 모두에서 Colacium sp. 광생리학에 대한 Ca 및 Mn의 효과를 결정하기 위해, 우리는 Ca 및 Mn 농축 실험을 수행했다. 샘플은 2021 년 5 월 7 일 Biwa 호수의 갈대 지역에서 채취되었습니다. 암흑 조건하에서의 Colacium sp.의 부착 단계의 경우, 3 h에서의 Mn 및 Ca 처리 사이의 NPQNSV를 제외하고, 여기서 Ca는 Mn < Mn 사이의 광생리학적 파라미터에 유의한 차이가 없었다 (도 7A, C, E). 또한, 부착 단계 동안 빛의 증가에 대한 σ PSII', Fq'/Fm' 및 NPQNSV 반응은 치료 간에 명확한 차이를 보이지 않았다(도 8A, C, E 및 도 9A, C, E). 그러나, NPQNSV는 21 h에서 낮은 광 강도에서 대조군보다 Ca 처리에서 더 낮은 경향이 있었다 (11 및 25 μmol 광자·m-2·s-1, 도 9E). 플랑크톤 단계의 경우, σ PSII는 3h에서 Ca 처리보다 Mn에서 유의하게 낮았다(도 7B). Fq'/Fm'은 상당히 높았지만, NPQNSV는 21h에서 대조군보다 Mn 처리에서 더 낮았다(그림 7D,F). 빛이 증가함에 따라 Mn은 플랑크톤 단계에서 σ PSII를 감소시키고 Fq'/Fm'을 증가시키는 경향이 있었으며, 이는 3h의 대조군과 비교했을 때 (그림 8D). 유사하게, Mn은 21h에서 대조군에 비해 플랑크톤 단계 동안 NPQNSV를 유의하게 감소시켰다(도 9F). 부착 단계와 유사하게, 칼슘은 증가하는 빛 하에서 플랑크톤 단계에 대해 NPQNSV를 약간 개선시켰다(그림 9F). 그러나, Ca는 3h에서 44-200 μmol 광자·m-2·s-1 하에서 Mn 처리와 비교하여 플랑크톤 단계에 대해 Fq'/Fm'을 감소시키고 NPQNSV를 증가시켰다(도 8D, F).
그림 1: Colacium sp. 및 물질 유기체 Scapholeberis mucronata. (A) 감염된 S. mucronata. (B) 글루타르알데히드로 고정된 감염된 S. mucronata. (C) 살아있는 S. mucronata 에 부착 된 Colacium 세포. (d) 탈피된 카라페이스에 부착된 콜라시움 세포. (E,F) 플랑크톤(팔멜라) 단계의 콜라시움 sp. (G) 감염되지 않은 S. mucronata. 화살표는 콜라시움 세포를 나타냅니다. 스케일 바: 200 μm (A, B 및 G), 10 μm (C, E 및 F) 및 100 μm (D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 여과된 호수 물(FLW)에서 피펫팅하여 동물플랑크톤을 세척합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: Act2Run 소프트웨어 사용자 인터페이스. (A) 각 화학광 단계에 대한 노출 시간; (b) 화학광의 수 단계 및 광자 플럭스; (c) 여기 파장의 조합; (d) 포화 및 이완 플래쉬릿 시퀀스; (e) 물 재킷 및 샘플 혼합 펌프의 주파수 및 강도; (f) 444 (여기서 450으로 표시됨), 512 (530), 및 633 nm (624), 광승수 튜브 (PMT) 전압에서의 여기 플래시의 광자 플럭스, 및 반복실험 및 시퀀스 간격. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: Act2Run 소프트웨어에서 조류 샘플의 형광 판독. 빨간색과 파란색 선은 각각 포화 및 이완 단계 모두에서 플래시렛과 곡선 피팅의 시퀀스에 의해 원시 형광 신호를 나타냅니다. 자세한 내용은 Kolber et al.2를 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: S. mucronata 밀도가 기준선 형광에 미치는 영향. 작은 점은 반복실험(n = 3)을 나타냅니다. ANOVA 테스트의 결과도 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 플랑크톤 단계 동안 Colacium sp.에 대한 (A) FO (B) σ PSII, (C) Fv/Fm 및 (D) NPQNSV에 대한 S. mucronata 밀도의 영향. 작은 점은 반복실험(n = 3)을 나타냅니다. Colacium sp.를 AF-6 배지에서 배양하였다. ANOVA 및 Tukey 사후 테스트의 결과도 제시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7: Ca 및 Mn 첨가 후 3 h 및 21 h에서 Colacium sp.의 (A,C,E) 부착 단계 및 (B,D,F) 플랑크톤 단계의 (A,C,E) 흡수 단면, (C,D) PSII 광화학, 및 (E,F) 비광화학적 담금질의 반응. 작은 점은 반복실험(n = 4)을 나타냅니다. ANOVA 및 Tukey 사후 테스트의 결과도 제시됩니다. * p < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 8: (A,B) 흡수 단면, (C,D) PSII 광화학, 및 (E,F) Ca 및 Mn 첨가 후 3 h에서 단계적 광 프로토콜에 대한 부착 및 플랑크톤 단계에서 Colacium sp.의 비광화학적 담금질의 급속 광 반응. C, 대조군; Ca, 200 μM Ca; Mn, 40 μM Mn. 각 PAR 플럭스에서 (a) C 및 Ca, (b) C 및 Mn, 및 (c) Ca 및 Mn 사이의 유의한 차이는 p < 0.05의 유의 수준을 갖는 각 패널에 나타내었다. 오류 막대, 평균 SD(n = 4). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 9: (A,B) 흡수 단면, (C,D) PSII 광화학, 및 (E,F) Ca 및 Mn 첨가 후 21h에서 단계적 광 프로토콜에 대한 부착 및 플랑크톤 단계에서 Colacium sp.의 비광화학적 담금질의 급속광 반응. C, 대조군; Ca, 200 μM Ca; Mn, 40 μM Mn. 각 PAR 플럭스에서 (a) C 및 Ca, (b) C 및 Mn, 및 (c) Ca 및 Mn 사이의 유의한 차이는 p < 0.05의 유의 수준을 갖는 각 패널에 나타내었다. 오류 막대, 평균 SD(n = 4). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 학기 | 정의 | 단위 | |
| 기준선 형광 | Chl-a 형광이 없는 Fo 값 | ||
| F' | 단일 턴오버 측정시 C>0의 영점 플래시렛에서의 형광 | ||
| 포 (ʹ) | 제로 플래시렛에서 최소 PSII 형광 수율(배경광 아래) | ||
| Fv (ʹ) | Fm(ʹ) - 포(ʹ) | ||
| FM (ʹ) | 최대 PSII 형광 수율 (배경광 하에서) | ||
| Fv / FM | 어둠 속에서 최대 PSII 광화학 효율 | ||
| Fqʹ/Fmʹ | 배경광 하에서 최대 PSII 광화학 효율, (Fmʹ− F)/(Fmʹ) | ||
| NPQNSV | 정규화된 스턴-볼머 담금질, FOʹ/(Fmʹ - FOʹ) | ||
| [RCII] | 반응 센터의 농도 | ||
| RσPSII (ʹ) | 단일 턴오버 포화 단계의 첫 번째 플래시렛 동안 RCII가 닫힐 확률(배경광 아래) | ||
| σ PSII (ʹ) | 여기 플래시렛에 대한 PSII의 기능적 흡수 단면 (배경 조명 아래) | nm2 | |
표 1: 이 프로토콜에 사용된 용어.
| 구성 요소 | 양 |
| 나NO3 | 140 밀리그램· L−1 |
| NH4NO3 | 22 밀리그램· L−1 |
| MgSO4·7H2O | 30 밀리그램· L−1 |
| KH2PO4 | 10 밀리그램· L−1 |
| K2HPO4 | 5 밀리그램· L−1 |
| CaCl2·2H2O | 10 밀리그램· L−1 |
| CaCO3 | 10 밀리그램· L−1 |
| Fe-시트레이트* | 2 밀리그램· L−1 |
| 구연산* | 2 밀리그램· L−1 |
| 비오 틴 | 0.002 밀리그램· L−1 |
| 비트.B 1 | 0.01 밀리그램· L−1 |
| 비트.B 6 | 0.001 밀리그램· L−1 |
| 비트.B 12 | 0.001 밀리그램· L−1 |
| 미량 금속 | 1 mL·L−1 |
| (FeCl3·6H2O) | (1.0 밀리그램·mL−1) |
| (MnCl3·4H2O) | (0.4 밀리그램·mL−1) |
| (ZnSO4·7H2O) | (0.005 밀리그램·mL−1) |
| (CoCl2·6H2O) | (0.002 밀리그램·mL−1) |
| (Na2MoO4) | (0.004 밀리그램·mL−1) |
| (Na2-EDTA) | (7.5 밀리그램·mL−1) |
표 2: AF-6 배지에 대한 레시피. pH를 6.6으로 조정한다. 따뜻한 H2O에 Fe-시트르산과 구연산을 별도로 녹이고 두 시약을 혼합 한 후 HCl (1 mL·L-1)을 첨가하십시오. 미량 금속의 내용은 괄호 안에 표시되어 있습니다.
| 샘플링 날짜 | 샘플 번호 |
물 임시 직원. (°C) |
S. 무크로나타 밀도 (inds.· mL−1) |
콜라시움 sp. 세포 밀도 (inds.· mL−1) |
σ PSII (nm2) | Fv / FM | NPQNSV |
| 월 27/2020 | 1위 | 14.2 | 4.5 | 77 | 3.42 | 0.60 | 0.66 |
| SE | 0.22 | 0.01 | 0.04 | ||||
| , 21을 2020 수 있습니다 | 2위 | 19.4 | 2 | 282.5 | 3.62 | 0.54 | 0.85 |
| SE | 0.16 | 0.02 | 0.06 | ||||
| 3위 | 19.4 | 2 | 250.5 | 3.55 | 0.56 | 0.77 | |
| SE | 0.09 | 0.01 | 0.02 | ||||
| 4위 | 19.4 | 5 | 204.5 | 3.76 | 0.52 | 0.94 | |
| SE | 0.12 | 0.00 | 0.02 | ||||
| 6월 18/2020 | 5위 | 22.4 | 2.5 | 474 | 3.62 | 0.54 | 0.85 |
| SE | 0.16 | 0.02 | 0.06 | ||||
| 6위 | 22.4 | 2 | 410 | 3.55 | 0.56 | 0.77 | |
| SE | 0.09 | 0.01 | 0.02 | ||||
| 7위 | 22.4 | 2.5 | 441 | 3.76 | 0.52 | 0.94 | |
| SE | 0.12 | 0.00 | 0.02 | ||||
| 칠월 20/2020 | 8위 | 27.5 | 5 | 109 | 3.49 | 0.58 | 0.74 |
| SE | 0.10 | 0.00 | 0.00 | ||||
| 의미하다 | 3.60 | 0.55 | 0.82 | ||||
| 증권 시세 표시기 | 0.120349 | 0.03 | 0.10 |
표 3: S. mucronata에 부착된 Colacium sp.의 광생리학.
| 샘플링 날짜 | 샘플 번호 | 보통 | 성장 온도(°C) | σ PSII (nm2) | Fv / FM | NPQNSV |
| , 21을 2020 수 있습니다 | 1위 | AF-6 | 19.4 | 2.72 | 0.65 | 0.53 |
| SE | 0.03 | 0.00 | 0.01 | |||
| 6월 18/2020 | 2위 | AF-6 | 22.4 | 3.07 | 0.55 | 0.84 |
| SE | 0.08 | 0.02 | 0.07 | |||
| 칠월 20/2020 | 3위 | AF-6 | 27.5 | 2.90 | 0.58 | 0.73 |
| SE | 0.06 | 0.01 | 0.02 | |||
| 의미하다 | 2.90 | 0.59 | 0.70 | |||
| 증권 시세 표시기 | 0.18 | 0.05 | 0.16 |
표 4: Colacium sp. 플랑크톤 단계 의 광생리학. 각 샘플은 정지상 동안 측정되었다.
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Discussion
이 프로토콜은 자연 환경에서 부착 된 단계 동안 Colacium sp.의 광생리학이 AF-6 배지의 플랑크톤 단계와 비교할 수 있음을 처음으로 입증했습니다. 추가적으로, 굶주린 S. mucronata의 장 내용물은 기준선에 영향을 미치지 않았고 밀도가 ≤5 inds·mL-1일 때 Chl-a 형광에 영향을 미치지 않았다(도 5 및 도 6). 이러한 결과는 이 프로토콜이 낮은 기질 유기체 풍부도 하에서 보정 없이 부착된 단계 동안 Colacium sp.의 광생리학을 측정할 수 있음을 시사한다. 그러나 3.2.1-3.2.8 단계의 결과는 가장 높은 S. mucronata 풍부도가 Fv/Fm 및 NPQNSV에 유의하게 영향을 미쳤지만 FO 및 σ PSII에는 영향을 미치지 않음을 보여주었습니다(그림 4). 여기서, 더 높은 유기체 밀도는 Colacium sp. 개인에 대한 신체적 스트레스를 악화시키고 이어서 광합성 활성을 감소시킬 수 있다. 기질 유기체 또는 다른 종의 높은 풍부하에서의 측정을 위해, 기질 유기체 밀도가 기준선 및 Chl-a 형광에 미치는 영향은 더 많은 주의가 필요하다.
FRRfs는 식물성 플랑크톤22,56,57의 선형 전자 흐름 및 비광화학적 담금질에 대한 영양소 조작의 영향을 조사하는데 사용되어 왔다. 주요 결과는 Ca 및 Mn 농축이 Colacium sp. 수명 단계 간에 유의하게 다르다는 것을 보여준다(도 7, 도 8 및 도 9). 특히, 망간은 PSII (Fv / Fm 및 Fq '/ Fm')의 (최대) 광화학 수율을 분명히 향상시키고 어두운 (그림 7D, F) 및 조명 조건 (그림 8D, F 및 그림 9D, F)에서 플랑크톤 단계의 열 발산 (NPQNSV)50을 감소시켰다. 이러한 결과는 PSII, σ PSII σ 및 PSII'(그림 7B 및 그림 8B)의 안테나 크기 감소로 인해 과도한 광 흡수가 감소58,59 될 수 있습니다. PSII 복합체 사이의 에너지 흐름 외에도 안테나 크기를 측정하면 조류 응답을보다 정확하게 측정 할 수 있습니다10. 이 프로토콜은 또한 다른 자원에 의한 광합성 한계의 검사를 허용합니다. 예를 들어, 질소 및 인 한계는 다양한 식물성 플랑크톤 군집에서는 조사되었지만 Colacium41 및 해양 후생대 규조류60,61에 대한 예측 된 영향에도 불구하고 epizoic 조류에서는 그렇지 않습니다. 영양소 이외에, 광 환경은 epizoic 조류 분포에 더 영향을 미칠 수 있다44.
그림 7, 그림 8 및 그림 9에서 볼 수 있듯이 큐벳형 FRRf를 사용하면 긴 배양 시간과 측정 노력 없이 영양소와 빛의 효과를 동시에 검사할 수 있습니다. 이 단계적 광 프로토콜(단계 6.1.5)은 또한 상대적 전자 수송 속도(rETR = Fq'/Fm'× 광) 대 생산을 위한 아날로그로서의 광과 광 곡선62의 빠른 광 곡선을 그릴 수 있다. 그러나, PSII에서의 선형 전자 흐름이 FRRf에 의한 광생리학적 파라미터로부터 추정될 수 있지만, 반드시 탄소 고정 속도63,64와 유사하지는 않다. 탄소 기반 일차 생산을 추정하기 위해, 시간적으로나 공간적으로 변할 수 있는 CO2 고정(Фe, C)당 전자 요구량(Фe, C)은 피험자 공동체를 평가할 때 검토되어야 한다.
플랑크톤 그물이 파편에 의해 막히면 5mm 메쉬 그물과 같은 더 큰 메쉬로 사전 스크린하거나 여과없이 피펫을 사용하여 호수 물에서 직접 동물 플랑크톤을 선택하십시오. 부착된 조류에 약간의 손상이 발생할 수 있다는 점에 유의해야 하며, 여과가 비교적 큰 (200 μm) 메쉬 크기를 사용하여 부드럽게 수행되는 경우에도 발생한다. 결과는 PSII 파라미터의 표준 편차가 작았음을 보여 주지만(표 3), 파라미터의 평균값은 배양된 플랑크톤 단계의 평균값과 매우 유사하였다(표 4), 여과 없이 샘플링하는 것이 이상적일 수 있다.
이 연구의 또 다른 한계는 σ PSII를 도출하는 것이 었습니다. Actinic light 및 Chl-a 형광 감쇠는 FRRfs에 큰 영향/왜곡을 가할 수 있으며, 이는 정확한 σ PSII 결정을 위해 광학적으로 얇은 샘플에 의존합니다65). 우리는 S. mucronata가 플랑크톤 콜라시움 세포의 σ PSII에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여 주었지만, 그것은 부착 된 Colacium 세포의 σ PSII와 관련하여 조사되어야합니다. 또한, ACT2 시스템(444nm)의 여기 파장이 계내 광 환경의 스펙트럼 분포와 다르기 때문에 σ PSII in situ66 추정에 스펙트럼 보정 계수(SCF)가 필요할 것이다. 일반적으로, 필터 패드 기술은 SCF를 계산하기 위해 Chl-a 특이적 흡수 스펙트럼을 측정하는데 사용된다. 이 절차는 FRRfs에 의한 조류 일차 생산성을 추정하는 데 필요합니다. 연구 기간 동안 충분히 부착 된 Colacium 세포를 수확 할 수 없었기 때문에 Chl-a 특이적 흡수 스펙트럼을 향후 연구에서 조사해야합니다.
큐벳 타입 FRRf를 구현하는 것은 주변 조류가 기질 부착을 필요로 하기 때문에 기질 크기에 의존해야 한다. 예를 들어, 암석67, 더 큰 유기체26,68, 또는 경질 산호10,69,70과 관련된 Symbiodinium을 포함한 공생 조류와 같은 파괴 불가능한 물질에 대한 조류에 대한 연구는 잠수정형 FRRf69를 필요로 할 수 있다. 반대로, basibiont가 큐벳에서 스스로를 현탁시킬 정도로 충분히 작다면, 큐벳 타입 FRRf는 벤딕 조류 16,17,18과 같은 큐벳 타입 PAM 이외에 충분할 수 있다. 실제로, 최근의 연구들은 얼음 조류의 광생리학을 측정하기 위한 큐벳형 FRRf를 탐구하였다24,25. 또한, 512 및 633 nm에서 여기 플래시를 켜면 PSII 안테나 안료, 피코에리트린 및 피코시아닌이 다른 시아노박테리아에 적용할 수 있으며, 따라서 Chl-a71로 흡수 피크가 다릅니다. 다중 여기 파장을 통합하는 현재의 FRRf 모델은 시아 노박테리아 광생리학 및 생산성7,66,72를 검사하는 데 유용한 도구이므로, 샘플 두께가 광생리학적 파라미터에 미치는 영향이 개선된다면 벤딕 시아노박테리아를 평가하는 데 유용한 방법이 되어야 한다65 . 앞으로의 연구에서, FRRfs는 다양한 서식지에 걸친 조류 광생리학의 복잡한 메커니즘에 대한 더 많은 통찰력을 얻기 위해 더 넓은 범위의 피험자 유기체를 겨냥해야합니다.
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Disclosures
저자는 선언 할 공개가 없습니다.
Acknowledgments
이 사업은 일본 지역 활성화 보조금과 일본 환경부 환경 연구 기술 개발 기금 (제 5-1607 호)에 따라 "수질 및 수질 환경 보호를위한 수질 및 호수 바닥 환경에 관한 연구"라는 제목의 시가 현 공동 연구 기금의 지원을 받았다. https://www.kantei.go.jp/jp/singi/tiiki/tiikisaisei/souseikoufukin.html. 저자는 영어 리뷰에 대해 Enago (www.enago.jp)에게 감사하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrodisc syringe filter | Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA | 0.2 μm pore size | |
| Act2Run | CTG Ltd., West Molesey, UK | ||
| Biotin | Wako | 023-08711 | AF-6 medium |
| CaCl2·2H2O | Wako | 031-25031 | AF-6 medium |
| CaCO3 | Wako | 036-00382 | AF-6 medium |
| Citric acid | Wako | 036-05522 | AF-6 medium |
| CoCl2·6H2O | Wako | 036-03682 | AF-6 medium |
| Concentrated Chlorella | Recenttec, Tokyo, Japan | 20 mg C·mL−1 ; store at 4 °C | |
| FastOcean Act2 | CTG Ltd., West Molesey, UK | ||
| Fe-citrate | Wako | 093-00952 | AF-6 medium |
| FeCl3·6H2O | Wako | 091-00872 | AF-6 medium |
| HCLP-880PF | Nippon Medical and Chemical Instruments Co., Ltd., Osaka, Japan |
With LED light bulbs | |
| K2HPO4 | Wako | 160-04292 | AF-6 medium |
| KH2PO4 | Wako | 167-04241 | AF-6 medium |
| MgSO4·7H2O | Wako | 137-00402 | AF-6 medium |
| MnCl3·4H2O | Wako | 139-00722 | AF-6 medium |
| Na2EDTA | Wako | 343-01861 | AF-6 medium |
| Na2MoO4 | Wako | 196-02472 | AF-6 medium |
| NaNO3 | Wako | 191-02542 | AF-6 medium |
| NH4NO3 | Wako | 015-03231 | AF-6 medium |
| Plankton Counter | Matsunami Glass, Osaka, Japan | S6300 | |
| Pylex test tube | CTG Ltd., West Molesey, UK | With rim, 16 x 100 mm | |
| Vit. B1 | Wako | 203-00851 | AF-6 medium |
| Vit. B12 | Wako | 226-00343 | AF-6 medium |
| Vit. B6 | Wako | 165-05401 | AF-6 medium |
| ZnSO4·7H2O | Wako | 264-00402 | AF-6 medium |
References
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