Summary
Snelle herhalingssnelheid fluorometer (FRRf) is een nuttige methode voor het meten van fotosysteem II fotofysiologie en primaire productiviteit. Hier beschrijven we een protocol om PSII-fotofysiologie van epizoïsche alg, Colacium sp. op substraat zoöplankton te meten met behulp van cuvette-type FRRf.
Abstract
Snelle herhalingssnelheid fluorometer (FRRf) is een nuttige methode voor het meten van fotosysteem II (PSII) fotofysiologie en primaire productiviteit. Hoewel FRRf psii-absorptiedoorsnede (σ PSII), maximale fotochemische efficiëntie (Fv / Fm), effectieve fotochemische efficiëntie (Fq ′ / Fm ′) en niet-fotochemische blussen (NPQNSV) voor verschillende eukaryote algen en cyanobacteriën kan meten, hebben bijna alle FRRf-studies tot nu toe zich gericht op fytoplankton. Hier beschrijft het protocol hoe psii-fotofysiologie van een epizoïsche alg Colacium sp. Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), in zijn bijgevoegde fase (bevestigd aan zoöplankton), met behulp van cuvette-type FRRf. Eerst schatten we de effecten van substraat zoöplankton (Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776, Cladocera, Daphniidae) op baseline fluorescentie en σ PSII, Fv/Fm, Fq′/Fm′en NPQNSV van planktonic Colacium sp. Om deze methodologie te valideren, registreerden we fotofysiologische metingen van attached Colacium sp. op S. mucronata en vergeleken deze resultaten met het planktonstadium. Representatieve resultaten toonden aan hoe het protocol de effecten van calcium (Ca) en mangaan (Mn) op colacium sp. fotofysiologie kon bepalen en de verschillende effecten van Mn-verrijking tussen gehechte en planktonstadia kon identificeren. Tot slot bespreken we het aanpassingsvermogen van dit protocol aan andere perifytische algen.
Introduction
Chlorofyl variabele fluorescentie is een nuttig hulpmiddel voor het meten van algen fotosysteem II (PSII) fotofysiologie. Algen reageren op verschillende omgevingsstressen, zoals overtollig licht en tekort aan voedingsstoffen, door hun PSII-fotofysiologie te veranderen. Snelle herhalingssnelheid fluorometer (FRRf) is een veelgebruikte methode voor het meten van PSII-fotofysiologie1,2 en het schatten van de primaire productiviteit1,3,4, waarmee fytoplankton PSII-fotofysiologie kan worden gemonitord, evenals de primaire productiviteit op brede ruimtelijke en temporele schalen5,6,7. FRRf kan tegelijkertijd psii (σ PSII) absorptiedoorsnede, reactiecentrum ([RCII]) concentratie, maximale fotochemische efficiëntie (Fv /Fm), effectieve fotochemische efficiëntie (Fq ′ / Fm ′) en niet-fotochemische blussen (NPQNSV) meten (tabel 1). Over het algemeen worden Fv/Fm en Fq′/Fm′ gedefinieerd als PSII-activiteit8, terwijl NPQNSV wordt gedefinieerd als relatieve warmte-afgevoerde energie9.
Belangrijk is dat single turnover (ST) flitsen van FRRf de primaire chinonelektronacceptor, QA, volledig verminderen, maar niet de plastochinonpool. Omgekeerd kunnen meervoudige omzet (MT) flitsen van een pulsamplitudemodulatie (PAM) fluorometer beide verminderen. De ST-methode heeft een duidelijk voordeel ten opzichte van de MT-methode bij het identificeren van de mogelijke oorsprong van NPQNSV door gelijktijdig de herstelkinetiek van Fv/Fm, Fq′/Fm′, NPQNSV en σ PSII10 te meten. Tot op heden zijn verschillende soorten FRRf-instrumenten, zoals submersible-type, cuvette-type en flow-through-type, commercieel verkrijgbaar. Het submersible-type FRRf maakt in situ metingen in oceanen en meren mogelijk, terwijl de cuvette-type FRRf geschikt is voor het meten van kleine monstervolumes. Het doorstroomtype wordt vaak gebruikt om continu de fotofysiologie van fytoplankton in oppervlaktewateren te meten.
Gezien de ontwikkeling van PAM-fluorometers, inclusief het cuvette-type, voor een breed scala aan onderwerpen11, komen PAM-fluormeters nog steeds vaker voor dan FRRfs in algenfotofysiologisch onderzoek12. Hoewel de structuur van de monsterkamer en de cuvettecapaciteit tussen deze gereedschappen slechts enigszins verschillen, is het cuvette-type PAM bijvoorbeeld toegepast op fytoplankton13,14,15, benthische microalgen16,17,18, ijsalgen19 en epizoïsche algen20, terwijl de cuvette-type FRRf voornamelijk is toegepast op fytoplankton21,22,23 en een beperkt aantal ijsalgengemeenschappen24,25. Gezien de effectiviteit is cuvette-type FRRf evenzeer van toepassing op benthische als epizoïsche algen. Daarom zal het uitbreiden van de toepassing ervan veel inzicht geven in psii-fotofysiologie, met name voor minder bekende epizoïsche algenfotofysiologie.
Epizoïsche algen hebben weinig aandacht gekregen, met weinig studies die hun PSII-fotofysiologie onderzoeken20,26, hoogstwaarschijnlijk vanwege hun kleine rol in aquatische voedselwebben27,28. Epibionten, waaronder epizoïsche algen, kunnen echter een positieve invloed hebben op de dynamiek van de zoöplanktongemeenschap, zoals toenemende reproductie- en overlevingskansen29,30, evenals een negatieve invloed op processen, zoals een toenemende zinksnelheid29,31 en kwetsbaarheid voor visuele roofdieren32,33,34,35,36 . Daarom is het onderzoeken van de omgevings- en biologische factoren die de epibiontdynamiek in zoöplanktongemeenschappen beheersen, cruciaal.
Onder epizoïsche algen is Colacium Ehrenberg 1834 (Euglenophyta) een veel voorkomende zoetwater-, algengroep32,37,38,39 met verschillende levensfasen, waaronder gehecht (figuur 1A-D), niet-beweeglijke planktonische (figuur 1E, F) en beweeglijke planktonstadia40,41 . Tijdens het niet-beweeglijke planktonische stadium leven cellen als eencellig plankton, geaggregeerde kolonies of eenlaagse plaatkolonies, bedekt met slijm42. In het aangehechte stadium gebruikt Colacium sp. slijm dat wordt uitgescheiden uit het voorste uiteinde van de cel37,39,41 om zich te hechten aan substraatorganismen (basibionten), met name microschaaldieren41,43. Hun levenscyclus omvat ook het losmaken van het vermolmde exoskelet of dode basibiont en zwemmen met hun flagella om een ander substraatorganisme te vinden39. Zowel planktonische als aangehechte stadia kunnen hun populatiegrootte vergroten door mitose40. Hoewel hun bijgevoegde stadium wordt verondersteld een evolutionaire eigenschap te zijn voor het verzamelen van bronnen, zoals licht44 en sporenelementen41,45,46, of als een dispersiestrategie27, is er weinig experimenteel bewijs beschikbaar over deze aspecten37,41,44 en de belangrijkste hechtingsmechanismen zijn grotendeels onbekend. Rosowski en Kugrens verwachtten bijvoorbeeld dat Colacium mangaan (Mn) verkrijgt uit substraat roeipootkreeftjes41, geconcentreerd in het exoskelet47.
Hier beschrijven we hoe psii-fotofysiologie van planktonalgen en de bijbehorende toepassingsmethode voor het richten op aangehechte algen (hechting aan zoöplankton) met Colacium sp. cellen met behulp van de cuvette-type FRRf. We gebruiken het Act2-systeem uitgerust met drie light-emitting diodes (LED's) die zorgen voor flitsexcitatie-energie gecentreerd op 444 nm, 512 nm en 633 nm48. Hier komt 444 nm (blauw) overeen met de absorptiepiek van chrophyll a (Chl-a), terwijl 512 nm (groen) en 633 nm (oranje) overeenkomen met de absorptiepieken van respectievelijk fycoerythrin en phycocyanine. De fluorescentiesignaaldetectiepiek is 682 nm met 30 nm halve bandbreedte. Omdat het moeilijk is om het planktonische stadium van Colacium sp. in natuurlijke omgevingen te vinden, werd hun bijgevoegde stadium verzameld voor de experimenten. Onder de talrijke substraatorganismen,Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776 (Branchiopoda, Daphniidae; Figuur 1A, B, G) is een van de eenvoudigste om te hanteren vanwege hun langzame zwemsnelheid, grote lichaamsgrootte (400-650 μm) en uniek gedrag (ondersteboven hangen aan het wateroppervlak). Daarom gebruikt dit protocol Colacium sp. bevestigd op S. mucronata als een casestudy van het Colacium-basibiont-systeem. Om fluorescentie afgeleid van de darminhoud te voorkomen, werd S. mucronata uitgehongerd. Aangezien een eerdere studie meldde dat het fluorescentiesignaal van darminhoud (ingenomen algen) een vijfvoudige afname vertoont na 40 min49, verwachtten we dat 90 minuten uithongering voldoende zou zijn om de mogelijkheid van darminhoudfluorescentie die de FRRf-meting beïnvloedt te minimaliseren met minimale effecten van experimentele stress op Colacium sp., zoals tekort aan voedingsstoffen. Bovendien werd dit protocol toegepast om het hechtingsmechanisme van Colacium sp. te verduidelijken en te bepalen hoe twee metalen, calcium (Ca) en mangaan (Mn) de fotofysiologie van zowel planktonische als gehechte stadia beïnvloeden. Calcium speelt op meerdere manieren een sleutelrol in de fotosynthetische routes50, en beide metalen zijn nodig om de zuurstof-evoluerende complexen van de PSII51 te construeren. Aangezien calcium en mangaan sterk geconcentreerd zijn in het schild van schaaldier zoöplankton47, veronderstellen we dat Colacium sp. fotofysiologie prominenter zou kunnen reageren op Ca- en Mn-verrijking tijdens de planktonische fase als deze levensfase deze elementen van S. mucronata verkrijgt tijdens de bijgevoegde fase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Steekproeven
- Verzamel meerwater van het oppervlak door een emmer. Om Colacium sp. bevestigd aan S. mucronata (figuur 1A-C) te richten, filter 0,5-10 L meerwater met behulp van een nylon gaasnet van 100 μm52.
OPMERKING: S. mucronata vaak dicht aggregeren in ondiep, eutroof, modderig water, zoals tussen riet (phragmites) gebieden. - Bewaar de geconcentreerde monsters in plastic flessen van 500 ml met 350 ml meerwater. Bewaren in donkere omstandigheden.
- Giet in het laboratorium het monsterwater in een bekerglas van 500 ml en laat het een paar minuten bezinken.
- Filter het water van het meer door een poriegroot filter van 0,2 μm.
- Haal S. op. mucronata individuen met behulp van een pipet onder een optische microscoop bij 100x vergroting. Voer soortidentificatie uit volgens Błędzki en Rybak53.
- Breng ze over in een druppel van 0,2 μm gefilterd meerwater (FLW) geplaatst op een glazen glijbaan.
OPMERKING: S. mucronata kan naar de oppervlakte zwemmen of zich hechten aan de bekerwand. - Controleer S. mucronata onder lichtmicroscopie.
- Wassen S. mucronata-individuen die FLW (3 druppels of meer) gebruiken om besmetting door andere organismen te voorkomen (figuur 2).
- Houd S. mucronata bij een in situ temperatuur in een groeikamer onder 40 μmol foton·m−2·s−1.
2. Effecten van S . mucronata op baseline fluorescentie
-
S. mucronata teelt
- Pak S. mucronata-personen op met een pipet onder een optische microscoop met een vergroting van 100x en was met FLW, zoals in stap 1.8.
- Belucht kraanwater met behulp van een elektrische luchtpomp via een luchtsteen gedurende ten minste 1 week. Giet 300 ml belucht leidingwater in een glazen pot van 350 ml.
- Voer Chlorella (1 mg C·L−1) en houd op 20 °C onder 40 μmol foton·m−2·s−1 in een groeikamer.
- Na ongeveer 14 dagen, pak 5-30 personen op met behulp van een pipet onder een optische microscoop bij 100x vergroting en ent ze in 300 ml schoon, belucht kraanwater om het medium vers te houden.
- FRRf instellen
- Start de Act2Run software.
- Klik op het tabblad Opties en selecteer Act2 FLC (witte LED's) in Werkingsmodus om de kleur van de actinische LED's in te stellen.
- Klik op de waarde van Donker bij stap 1 van de instellingen van de fluorescerende lichtcurve in het hoofdvenster en typ 30 om de duur van de donkere periode in te stellen (figuur 3A).
- Klik op de LED-combinatie B, C en D om de groene en oranje LED's uit te schakelen (figuur 3C).
- Klik op de waarde van Fets en Pitch onder Sat en typ respectievelijk 100 en 2 om het aantal en de toonhoogte van de flashlet in de verzadigingsfase in te stellen (Figuur 3D).
- Klik op de waarde van Fets en Pitch onder Rel en typ respectievelijk 40 en 60 om het aantal en de toonhoogte van de flashlet in de ontspanningsfase in te stellen (figuur 3E).
- Activeer de watermantelpomp door op Tijdens FLC (figuur 3F) te klikken om de monstertemperatuur tijdens de meting te regelen.
- Activeer door op Auto-LED en Auto-PMT (Figuur 3F) te klikken.
- Klik op Synchroniseren om FRRf-Act2 te verbinden.
- FRRf metingen
- Om de effecten van zoöplankton individuen op baseline fluorescentie te onderzoeken, bereid volwassen S. voor. mucronata (lichaamsgrootte 400-650 μm) uit de kweek in stappen 2.1.1-2.1.4 zonder aangehechte organismen.
- Om fluorescentie van de darminhoud te voorkomen, verhongert u de personen in FLW bij 20 °C gedurende ten minste 90 minuten.
- Giet 1,5 ml FLW in een cuvette. Pak 0, 1, 5 en 10 S. mucronata individuen op met behulp van een pipet onder een optische microscoop bij 100x vergroting.
- Overdracht S. mucronata individuen in de cuvette en voeg FLW toe om het monster tot 2 ml te brengen.
- Acclimatiseren bij weinig licht (1-10 μmol foton·m−2·s−1) bij 20 °C gedurende 15 minuten vóór frRf-meting.
- Klik op Act2 Run om de meting te starten. Herhaal de metingen >3 keer per monster.
- Lees de Fo-waarde af van de resultatenplot (figuur 4).
3. Effecten van substraatorganisme op Chl-a fluorescentie
-
Colacium sp. teelt
- Bereid de FLW en AF-6 medium54 voor op de teelt (tabel 2).
- Verzamel Colacium sp. bevestigd aan S. mucronata zoals in stap 1.1 en 1.2 en houd op in situ temperatuur in een groeikamer.
- Pak Colacium sp. op met een verveld carapax (figuur 1D) met behulp van een pipet onder een optische microscoop bij een vergroting van 100x. Was ze met FLW, zoals in stap 1.8.
- Aseptisch ent Colacium sp. en AF-6 medium in een glazen buis van 10 ml op een schone bank.
- Houd de cultuur op in situ temperatuur onder 200 μmol foton·m−2·s−1 in een groeikamer. Schud de glazen buis minstens één keer per dag voorzichtig met de hand om celafzetting te voorkomen.
OPMERKING: Om het dempende effect van geaggregeerde kolonies zo laag mogelijk te houden, controleert u de kolonies onder een microscoop voorafgaand aan de FRRf-meting. Celaggregatie kan dichte kolonies veroorzaken en de fotofysiologie van algen beïnvloeden55.
- FRRf metingen
- Om de effecten van zoöplankton individuen op Chl-a fluorescentie van Colacium sp. te onderzoeken, bereid volwassen S. voor. mucronata (lichaamsgrootte 400-650 μm) zonder aangehechte organismen.
- Om fluorescentie van de darminhoud te voorkomen, verhongert u de personen in FLW gedurende ten minste 90 minuten.
- Stel een cuvette-type snelle herhalingssnelheid fluorometer (FRRf) in.
- Giet een substeekproef van 1,5 ml voorgekweekt Colacium sp. in een cuvette. 0, 5, 10 en 15 S overbrengen. mucronata individuen in deze cuvetten en voeg 2 μm gefilterd medium toe om het monster tot 2 ml te brengen.
- Acclimatiseer bij weinig licht (1-10 μmol foton·m−2·s−1) bij 20 °C gedurende 15 minuten voordat de FRRf-meting wordt uitgevoerd.
OPMERKING: Houd de monsters op incubatietemperatuur tijdens metingen - Klik op Act2 Run om de meting te starten. Herhaal de metingen >3 keer per monster.
- Lees de FO- en Fm-waarden uit de resultatenplot (figuur 4).
OPMERKING: Controleer de RσPSII-waarde (tabel 1), die laat zien of het LED-vermogen binnen het optimale bereik ligt om de PSII-parameters correct te schatten. Wanneer de Auto-LED wordt geactiveerd, regelt het Act2run-systeem het LED-vermogen om een optimaal RσPSII-bereik (0.042-0.064) te bereiken. De experimentele RσPSII-afkapwaarde werd in een eerdere studie gedefinieerd op 0,03 en 0,0848. - Om de basisfluorescentie22 te corrigeren, filtert u het kweekmedium met behulp van een poriegroot filter van 0,2 μm en meet u de fluorescentie. Trek FO van het basislijnvoorbeeld af van FO en Fm van Colacium sp., of wijzig de waarde voor blancocorrectie in de instellingen op het tabblad Opties.
4. Fotofysiologie van Colacium sp. (bijgevoegd stadium)
- Isoleer S. mucronata-individuen met Colacium sp. met behulp van een pipet onder een optische microscoop.
- Wassen S. mucronata met FLW, zoals in stap 1.8.
- Overdracht S. mucronata in een 100 ml FLW. Voor uithongering, onder donkere omstandigheden op in situ temperatuur gedurende 90 minuten bewaren.
- Giet 1,5 ml FLW in een cuvette.
- Overdracht ~10 S. mucronata individuen met Colacium sp. in een cuvette. Voor metingen zijn meer dan 100 Colaciumcellen per 2 ml nodig. Voeg FLW toe om het monster tot 2 ml te brengen.
- Acclimatiseren bij weinig licht (1-10 μmol foton·m−2·s−1) bij in situ temperatuur gedurende 15 min. Meet Chl-a fluorescentie zoals in stap 3.2.6-3.2.8.
- Om het aantal aangehechte cellen te inventariseren, fixeert u het monster met glutaaraldehyde (2% eindvolume) na het nemen van de FRRf-meting. Maak foto's op verschillende scherptedieptes en posities van S. mucronata onder een lichtmicroscoop.
5. Fotofysiologie van Colacium sp. (planktonische fase)
- Kweek bemonsterd Colacium sp. in AF-6 medium bij in situ temperatuur zoals in stap 3.1.1-3.1.5.
- Neem voor de stationaire fase 2 ml gekweekt Colacium sp. en giet in een cuvette.
- Acclimatiseren bij weinig licht (1-10 μmol foton·m−2·s−1) bij in situ temperatuur gedurende 15 min. Meet Chl-a fluorescentie zoals in stap 3.2.6-3.2.8.
6. Effecten van Ca en Mn toevoeging op de fotofysiologie van Colacium sp.
- Effecten op het bijgevoegde podium
- Isoleer S. mucronata-individuen met Colacium sp. met behulp van een pipet onder een optische microscoop. Wassen met FLW, zoals in stap 1.8.
- Breng elk zes personen over in 12 glazen bekers met 30 ml FLW. Zorg ervoor dat elk bekerglas >100 Colacium sp. cellen bevat.
- 200 μmol bijtellen· L−1 CaCl2· H2O (Ca behandeling), 40 μmol· L−1 MnCl4 (Mn-behandeling) of ultrapuur water (controle) voor elk bekerglas. Incubeer de monsters onder 200 μmol foton·m−2 ·s−1 bij in situ temperatuur in een groeikamer.
- Breng na 3 uur en 21 uur alle individuen en vervelde huiden over in een cuvette met 2 ml van het medium.
- Om de snelle reactie op toenemend licht te onderzoeken, klikt u op Omhoog van de perioden van 8 actinische lichtstappen en typt u 20 (figuur 3A) om de duur van elke stap in 20 s in te stellen. Om het stapsgewijze actinische licht in te stellen als 0, 11, 25, 44, 68, 101, 144 en 200 μmol foton·m−2·s−1, klikt u op Hoge E en Stap omhoog en wijzigt u de waarden in respectievelijk 200 en 34 (figuur 3B).
- Meet na 15 minuten donkere acclimatisatie de Chl-a-fluorescentie van elk monster vergelijkbaar met stap 3.2.6-3.2.8.
OPMERKING: Controleer of de waarden van RσPSII en RσPSII zich binnen het optimale bereik (0,03-0,08)48 bevinden.
- Effecten op het planktonstadium
- Kweek bemonsterd Colacium sp. in AF-6 medium bij in situ temperatuur zoals in stap 3.1.1-3.1.5.
- Breng het gekweekte Colacium sp. over in FLW en acclimatiseer bij een in situ temperatuur van minder dan 200 μmol foton·m−2·s−1 gedurende 3 dagen.
- Breng 1 ml van de geacclimatiseerde monsters over in drie glazen injectieflacons met 10 ml FLW.
- 200 μmol bijtellen· L−1 CaCl2· H2O (Ca behandeling), 40 μmol· L−1 MnCl3 (Mn-behandeling), of ultrapuur water (controle) naar injectieflacons. Incubeer de monsters onder 200 μmol foton·m−2·s−1 bij in situ temperatuur in een groeikamer.
- Meet na 3 uur en 21 uur de Chl-a-fluorescentie van elk monster zoals in de stappen 3.2.6-3.2.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Er was geen significant effect van baseline fluorescentie (figuur 5) of Chl-a fluorescentie (figuur 6) door S. mucronata tot 5 individuen (inds.) ml−1. Fv/Fm en NPQNSV werden echter significant beïnvloed wanneer S. mucronata 7,5 inds·mL−1 was. Daarom hebben we voor het meten van de fotofysiologie van Colacium sp. tijdens de bijgevoegde fase gekozen voor S. mucronata met de hogere belasting van Colacium sp. om voldoende Colacium sp. abundantie (>50 cellen·ml−1) en een laag aantal S. mucronata (≤5 inds·mL−1) in de cuvette te bereiken.
Tabel 3 toont de seizoensvariatie in de fotofysiologie van Colacium sp. tijdens de bijgevoegde fase. Hoewel de bemonsteringstemperatuur varieerde, bleef hun fotofysiologie relatief constant. σ PSII varieerde van 3,42 nm2 tot 3,76 nm2 (gemiddeld 3,60 nm2), Fv/Fm varieerde van 0,52 tot 0,60 (gemiddeld 0,55) en NPQNSV varieerde van 0,66 tot 0,85 (gemiddeld 0,82). Om deze resultaten te valideren, onderzochten we verder variaties in Colacium sp. fotofysiologie tijdens de planktonische fase voor de stationaire fase in het AF-6 medium (tabel 4). De gemiddelde Fv/Fm en NPQNSV voor de bijgevoegde fase waren vergelijkbaar met die van de planktonische fase wanneer geïncubeerd in AF-6 medium.
Om het effect van Ca en Mn op Colacium sp. fotofysiologie in zowel de aangehechte als planktonische stadia te bepalen, voerden we Ca- en Mn-verrijkingsexperimenten uit. Op 7 mei 2021 zijn monsters genomen uit het rietgebied van Lake Biwa. Voor het bijgevoegde stadium van Colacium sp. onder donkere omstandigheden was er geen significant verschil in fotofysiologische parameters tussen behandelingen, behalve voor NPQNSV tussen Mn- en Ca-behandelingen na 3 uur, waarbij Ca < Mn (figuur 7A,C,E). Verder vertoonden σ PSII′,Fq′/Fm′en NPQNSV-responsen op toenemend licht tijdens de bijgevoegde fase geen duidelijke verschillen tussen behandelingen (figuur 8A,C,E en figuur 9A,C,E). Npqnsv was echter meestal lager in de Ca-behandeling dan de controle bij een lage lichtintensiteit bij 21 uur (11 en 25 μmol foton·m−2·s−1, figuur 9E). Voor het planktonische stadium was σ PSII significant lager in de Mn dan Ca-behandeling na 3 uur (figuur 7B). Fq′/Fm′ was significant hoger, maar NPQNSV was lager in de Mn-behandeling dan controle na 21 h (figuur 7D,F). Onder toenemend licht had Mn de neiging om σ PSII te verlagen en Fq′/Fm′ te verhogen tijdens de planktonische fase, vergeleken met de controle bij 3 h (figuur 8D). Evenzo verminderde Mn de NPQNSV significant tijdens het planktonische stadium in vergelijking met de controle bij 21 uur (figuur 9F). Net als in het bijgevoegde stadium verbeterde calcium de NPQNSV voor het planktonstadium licht bij toenemend licht (figuur 9F). Ca verlaagde echter Fq′/Fm′ en verhoogde NPQNSV voor het planktonische stadium in vergelijking met Mn-behandeling onder 44-200 μmol foton·m−2·s−1 na 3 uur (figuur 8D,F).
Figuur 1: Colacium sp. en stoforganisme Scapholeberis mucronata. (A) Geïnfecteerde S. mucronata. (B) Geïnfecteerde S. mucronata gefixeerd met glutaaraldehyde. (C) Bevestigde colaciumcellen op levende S. mucronata. (D) Bevestigde colaciumcellen op het vermolmde schild. (E, F) Colacium sp. van planktonische (palmella) stadium. (G) Niet-geïnfecteerde S. mucronata. Pijlen geven Colacium-cellen aan. Schaalstaven: 200 μm (A, B en G), 10 μm (C, E en F) en 100 μm (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Zoöplankton wassen door pipetteren onder gefilterd meerwater (FLW). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Gebruikersinterface van de Act2Run-software. (A) Blootstellingstijd aan elke actinische lichtstap; B) aantal stappen en fotonenflux van actinezuur licht; (C) Combinatie van excitatiegolflengte; D) verzadigings- en relaxatieflitsersequentie; E) frequenties en intensiteiten van de watermantel en monstermengpompen; (F) Foton flux van excitatieflits bij 444 (hier aangeduid als 450), 512 (530) en 633 nm (624), fotomultiplicatorbuis (PMT) spanning, en repliceert en interval van sequentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Fluorescentiemeting van het algenmonster op Act2Run-software. De rode en blauwe lijnen geven het ruwe fluorescentiesignaal aan door een opeenvolging van flashlet en curve die passen in respectievelijk zowel verzadigings- als relaxatiefasen. Zie Kolber et al.2 voor meer details. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Het effect van S. mucronata dichtheid op baseline fluorescentie. De kleine stippen staan voor replicaties (n = 3). Ook de resultaten van de ANOVA-test worden getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: De effecten van S. mucronata dichtheden op (A) FO (B) σ PSII, (C) Fv/Fm, en (D) NPQNSV voor Colacium sp. tijdens de planktonische fase. De kleine stippen staan voor replicaties (n = 3). Colacium sp. werd gekweekt in AF-6 medium. De resultaten van ANOVA en Tukey post-hoc test worden ook gepresenteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Reacties van (A,B) absorptiedoorsnede, (C,D) PSII-fotochemie en (E,F) niet-fotochemische doven van (A,C,E) bevestigd stadium en (B,D,F) planktonstadium van Colacium sp. na 3 h en 21 h na ca- en mn-toevoeging. De kleine stippen staan voor replicaties (n = 4). De resultaten van ANOVA en Tukey post-hoc test worden ook gepresenteerd. * p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Snelle lichtresponsen van (A, B) absorptiedoorsnede, (C,D) PSII-fotochemie en (E,F) niet-fotochemische doven van Colacium sp. in aangehechte en planktonische stadia tot stapsgewijs lichtprotocol na ca- en Mn-toevoeging. C, controle; Ca, 200 μM Ca; Mn, 40 μM Mn. Significante verschillen tussen (a) C en Ca, (b) C en Mn, en (c) Ca en Mn bij elke PAR-flux, met een significantieniveau van p < 0,05 weergegeven in elk paneel. Foutbalk, Gemiddelde SD (n = 4). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Snelle lichtreacties van (A,B) absorptiedoorsnede, (C,D) PSII-fotochemie en (E,F) niet-fotochemische doven van Colacium sp. in aangehechte en planktonische stadia tot stapsgewijze lichtprotocol na ca- en Mn-toevoeging. C, controle; Ca, 200 μM Ca; Mn, 40 μM Mn. Significante verschillen tussen (a) C en Ca, (b) C en Mn, en (c) Ca en Mn bij elke PAR-flux, met een significantieniveau van p < 0,05 weergegeven in elk paneel. Foutbalk, Gemiddelde SD (n = 4). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Term | Definitie | Eenheden | |
| Baseline fluorescentie | Fo-waarde zonder Chl-a fluorescentie | ||
| F' | Fluorescentie bij nulde flits van een enkele omzetmeting bij C>0 | ||
| Fo (ʹ) | Minimale PSII-fluorescentieopbrengst (onder achtergrondlicht) bij nulde flits | ||
| Fv (ʹ) | Fm(ʹ) − Fo(ʹ) | ||
| Fm (ʹ) | Maximale PSII-fluorescentieopbrengst (onder achtergrondlicht) | ||
| Fv/Fm | Maximale PSII fotochemische efficiëntie in het donker | ||
| Fqʹ/Fmʹ | Maximale PSII fotochemische efficiëntie onder achtergrondlicht, (Fmʹ− F)/(Fmʹ) | ||
| Npqnsv | Genormaliseerde Stern-Volmer blussing, FOʹ/(Fmʹ − FOʹ) | ||
| [RCII] | Concentratie van het reactiecentrum | ||
| RσPSII (ʹ) | Waarschijnlijkheid dat een RCII wordt gesloten tijdens de eerste flits van een enkele omzetverzadigingsfase (onder achtergrondlicht) | ||
| σ PSII (ʹ) | Functionele absorptiedoorsnede van PSII voor excitatieflitsers (onder achtergrondlicht) | Nm2 | |
Tabel 1: Termen die in dit protocol worden gebruikt.
| Bestanddeel | Hoeveelheid |
| NaNO3 | 140 mg· L−1 |
| Nh4No3 | 22 mg· L−1 |
| MgSO4·7H2O | 30 mg· L−1 |
| Kh2PO4 | 10 mg· L−1 |
| K2HPO4 | 5 mg· L−1 |
| CaCl2·2H2O | 10 mg· L−1 |
| CaCO3 | 10 mg· L−1 |
| Fe-citraat* | 2 mg· L−1 |
| Citroenzuur* | 2 mg· L−1 |
| Biotine | 0,002 mg· L−1 |
| Vit.B 1 | 0,01 mg· L−1 |
| Vit.B 6 | 0,001 mg· L−1 |
| Vit.B 12 | 0,001 mg· L−1 |
| Sporenmetalen | 1 ml L−1 |
| (FeCl3·6H2O) | (1,0 mg ml−1) |
| (MnCl3·4H2O) | (0,4 mg ml−1) |
| (ZnSO4·7H2O) | (0,005 mg ml−1) |
| (CoCl2·6H2O) | (0,002 mg ml−1) |
| (Na2MoO4) | (0,004 mg ml−1) |
| (Na2-EDTA) | (7,5 mg ml−1) |
Tabel 2: Recept voor AF-6 medium. Stel de pH in op 6,6. Los Fe-citraat en citroenzuur afzonderlijk op in warm H2O en voeg HCl (1 ml L−1) toe na het mengen van beide reagentia. De inhoud van sporenmetalen staat tussen haakjes.
| Datum van bemonstering | Voorbeeldnr. |
Watertemperatuur. (°C) |
S. mucronata dichtheid (inds.· ml−1) |
Colacium sp. celdichtheid (inds.· ml−1) |
σ PSII (nm2) | Fv/Fm | Npqnsv |
| april 27/2020 | Nr. 1 | 14.2 | 4.5 | 77 | 3.42 | 0.60 | 0.66 |
| SE | 0.22 | 0.01 | 0.04 | ||||
| mei 21/2020 | Nr. 2 | 19.4 | 2 | 282.5 | 3.62 | 0.54 | 0.85 |
| SE | 0.16 | 0.02 | 0.06 | ||||
| Nr.3 | 19.4 | 2 | 250.5 | 3.55 | 0.56 | 0.77 | |
| SE | 0.09 | 0.01 | 0.02 | ||||
| Nr.4 | 19.4 | 5 | 204.5 | 3.76 | 0.52 | 0.94 | |
| SE | 0.12 | 0.00 | 0.02 | ||||
| augustus 18/2020 | Nr.5 | 22.4 | 2.5 | 474 | 3.62 | 0.54 | 0.85 |
| SE | 0.16 | 0.02 | 0.06 | ||||
| Nr.6 | 22.4 | 2 | 410 | 3.55 | 0.56 | 0.77 | |
| SE | 0.09 | 0.01 | 0.02 | ||||
| Nr.7 | 22.4 | 2.5 | 441 | 3.76 | 0.52 | 0.94 | |
| SE | 0.12 | 0.00 | 0.02 | ||||
| augustus 20/2020 | Nr. 8 | 27.5 | 5 | 109 | 3.49 | 0.58 | 0.74 |
| SE | 0.10 | 0.00 | 0.00 | ||||
| Bedoelen | 3.60 | 0.55 | 0.82 | ||||
| S.D. | 0.120349 | 0.03 | 0.10 |
Tabel 3: Fotofysiologie van Colacium sp. bevestigd op S. mucronata.
| Datum van bemonstering | Voorbeeldnr. | Gemiddeld | Groeitemperatuur (°C) | σ PSII (nm2) | Fv/Fm | Npqnsv |
| mei 21/2020 | Nr. 1 | AF-6 | 19.4 | 2.72 | 0.65 | 0.53 |
| SE | 0.03 | 0.00 | 0.01 | |||
| augustus 18/2020 | Nr. 2 | AF-6 | 22.4 | 3.07 | 0.55 | 0.84 |
| SE | 0.08 | 0.02 | 0.07 | |||
| augustus 20/2020 | Nr.3 | AF-6 | 27.5 | 2.90 | 0.58 | 0.73 |
| SE | 0.06 | 0.01 | 0.02 | |||
| Bedoelen | 2.90 | 0.59 | 0.70 | |||
| S.D. | 0.18 | 0.05 | 0.16 |
Tabel 4: Fotofysiologie van Colacium sp. planktonische fase. Elk monster werd gemeten tijdens de stationaire fase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol toonde voor het eerst aan dat de fotofysiologie van Colacium sp. tijdens de bijgevoegde fase in een natuurlijke omgeving vergelijkbaar is met de planktonische fase in AF-6 medium. Bovendien had de darminhoud van uitgehongerde S. mucronata geen invloed op baseline en Chl-a fluorescentie wanneer de dichtheid ≤5 inds·mL−1 was (figuur 5 en figuur 6). Deze resultaten suggereren dat dit protocol de fotofysiologie van Colacium sp. tijdens de bijgevoegde fase kan meten zonder correctie onder een lage overvloed aan substraatorganismen. Resultaten van stap 3.2.1-3.2.8 toonden echter aan dat de hoogste S. mucronata-abundantie Fv/Fm en NPQNSV significant beïnvloedde, maar niet FO en σ PSII (figuur 4). Hier is het mogelijk dat een hogere organismedichtheid de fysieke stress op Colacium sp. individuen verergerde en vervolgens de fotosynthetische activiteit verminderde. Voor metingen onder een hoge abundantie van substraatorganismen of andere soorten vereisen de effecten van substraatorganismedichtheid op de basislijn en Chl-a fluorescentie verdere aandacht.
FRRfs zijn gebruikt om de impact van nutriëntenmanipulatie op de lineaire elektronenstroom en niet-fotochemische doven van fytoplankton22,56,57 te onderzoeken. De primaire resultaten laten zien dat Ca- en Mn-verrijking significant verschilden tussen de levensfasen van Colacium sp. (figuur 7, figuur 8 en figuur 9). In het bijzonder verbeterde mangaan duidelijk de (maximale) fotochemische opbrengst van PSII (Fv/Fm en Fq′/Fm′) en verminderde de warmteafvoer (NPQNSV)50 van planktonstadia in het donker (figuur 7D,F) en lichtomstandigheden (figuur 8D,F en figuur 9D,F). Deze uitkomsten kunnen voortkomen uit een kleinere antennegrootte op PSII, σ PSII en σ PSII′ (figuur 7B en figuur 8B), waardoor overmatige lichtabsorptie wordt verminderd58,59. Het meten van de antennegrootte naast de energiestroom tussen PSII-complexen zou nauwkeurigere metingen van de algenrespons mogelijk maken10. Dit protocol maakt het ook mogelijk om fotosynthesebeperkingen door andere bronnen te onderzoeken. Stikstof- en fosforbeperkingen zijn bijvoorbeeld onderzocht in verschillende fytoplanktongemeenschappen, maar niet in epizoïsche algen, ondanks voorspelde effecten op Colacium41 en mariene epizoïsche diatomeeën60,61. Naast voedingsstoffen kan de lichte omgeving de verspreiding van epizoïsche algen verder beïnvloeden44.
Zoals te zien is in figuur 7, figuur 8 en figuur 9, stelt cuvette-type FRRf ons in staat om tegelijkertijd voedings- en lichteffecten te onderzoeken zonder lange incubatietijden en meetinspanning. Dit stapsgewijze lichtprotocol (stap 6.1.5) kan ook snellichtcurven van relatieve elektronentransportsnelheden (rETR = Fq′/Fm′× licht) versus licht tekenen als analoog voor productie versus lichtcurven62. Hoewel de lineaire elektronenstroom in PSII kan worden geschat aan de hand van fotofysiologische parameters door de FRRf, is deze niet noodzakelijkerwijs analoog aan de koolstoffixatiesnelheid63,64. Voor het schatten van op koolstof gebaseerde primaire productie moet de elektronenbehoefte per CO2-fixatie (Фe, C), die temporeel en ruimtelijk kan variëren5,48, worden onderzocht bij de beoordeling van subjectgemeenschappen.
Als het planktonnet verstopt is door puin, scherm dan voor met een groter gaas, zoals een gaasnet van 5 mm, of pluk zoöplankton rechtstreeks uit het water van het meer met behulp van een pipet zonder filtratie. Opgemerkt moet worden dat er enige schade kan optreden aan de aangehechte algen, zelfs wanneer de filtratie voorzichtig wordt uitgevoerd met behulp van een relatief grote (200 μm) maaswijdte. Hoewel de resultaten aantonen dat de standaarddeviatie van de PSII-parameters klein was (tabel 3) en de gemiddelde waarden van de parameters sterk leken op die van het gekweekte planktonstadium (tabel 4), zou bemonstering zonder filtratie ideaal kunnen zijn.
Een andere beperking van deze studie was het afleiden σ PSII. Actinisch licht en Chl-a fluorescentieverzwakking kunnen een grote invloed/vervorming uitoefenen op de FRRfs, die afhankelijk is van optisch dunne monsters voor de nauwkeurige σ PSII-bepaling65. Hoewel we aantoonden dat S. mucronata geen invloed had op de σ PSII van planktonische colaciumcellen, moet dat worden onderzocht in verband met de σ PSII van de aangehechte colaciumcellen. Bovendien zou een spectrale correctiefactor (SCF) nodig zijn voor de σ PSII in situ66 schatting, aangezien de excitatiegolflengte van het ACT2-systeem (444 nm) verschilt van de spectrale verdeling van de in situ lichtomgeving. Over het algemeen wordt de filterpadtechniek gebruikt om het Chl-a specifieke absorptiespectrum te meten om het SCF te berekenen. Deze procedure is nodig om de primaire productiviteit van algen door de FRRfs te schatten. Omdat we tijdens de onderzoeksperiode niet genoeg aangehechte Colacium-cellen konden oogsten, moet het Chl-a-specifieke absorptiespectrum in toekomstige studies worden onderzocht.
Het implementeren van cuvette-type FRRf moet afhankelijk zijn van de substraatgrootte, omdat perifytische algen een substraataanhechting vereisen. Bijvoorbeeld, studies van algen op onverwoestbare stoffen, zoals rotsen67, grotere organismen26,68, of symbiotische algen, waaronder Symbiodinium geassocieerd met harde koralen10,69,70, kunnen het onderdompelbare type FRRf69 vereisen. Omgekeerd, als de basibiont klein genoeg is om zichzelf in een cuvette op te hangen, kan een cuvette-type FRRf voldoende zijn naast een cuvette-type PAM, zoals benthische algen16,17,18. Inderdaad, recente studies hebben een cuvette-type FRRf onderzocht voor het meten van de fotofysiologie van ijsalgen24,25. Bovendien maakt het inschakelen van de excitatieflits bij 512 en 633 nm de toepassing op cyanobacteriën met verschillende PSII-antennepigmenten, fycoerythrinen en fycocyaninen mogelijk, en dus verschillende absorptiepieken met Chl-a71. Aangezien de huidige FRRf-modellen met multi-excitatiegolflengten nuttige hulpmiddelen zijn voor het onderzoeken van de fotofysiologie en productiviteit van cyanobacteriën7,66,72, zouden deze nuttige methoden moeten zijn voor het beoordelen van benthische cyanobacteriën, als de effecten van de monsterdikte op fotofysiologische parameters zouden worden verbeterd65 . In toekomstige studies moet FRRfs gericht zijn op een breder scala aan subjectorganismen om meer inzicht te krijgen in de complexe mechanismen van algenfotofysiologie in verschillende habitats.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen onthullingen te verklaren.
Acknowledgments
Het werk werd ondersteund door het Collaborative Research Fund van de prefectuur Shiga getiteld "Study on water quality and lake-bottom environment for the protection of the soundness of water environment" onder de Japanse grant for regional revitalization and the Environment Research and Technology Development Fund (No. 5-1607) van het ministerie van Milieu, Japan. https://www.kantei.go.jp/jp/singi/tiiki/tiikisaisei/souseikoufukin.html. De auteurs willen Enago (www.enago.jp) bedanken voor de Engelstalige review.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrodisc syringe filter | Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA | 0.2 μm pore size | |
| Act2Run | CTG Ltd., West Molesey, UK | ||
| Biotin | Wako | 023-08711 | AF-6 medium |
| CaCl2·2H2O | Wako | 031-25031 | AF-6 medium |
| CaCO3 | Wako | 036-00382 | AF-6 medium |
| Citric acid | Wako | 036-05522 | AF-6 medium |
| CoCl2·6H2O | Wako | 036-03682 | AF-6 medium |
| Concentrated Chlorella | Recenttec, Tokyo, Japan | 20 mg C·mL−1 ; store at 4 °C | |
| FastOcean Act2 | CTG Ltd., West Molesey, UK | ||
| Fe-citrate | Wako | 093-00952 | AF-6 medium |
| FeCl3·6H2O | Wako | 091-00872 | AF-6 medium |
| HCLP-880PF | Nippon Medical and Chemical Instruments Co., Ltd., Osaka, Japan |
With LED light bulbs | |
| K2HPO4 | Wako | 160-04292 | AF-6 medium |
| KH2PO4 | Wako | 167-04241 | AF-6 medium |
| MgSO4·7H2O | Wako | 137-00402 | AF-6 medium |
| MnCl3·4H2O | Wako | 139-00722 | AF-6 medium |
| Na2EDTA | Wako | 343-01861 | AF-6 medium |
| Na2MoO4 | Wako | 196-02472 | AF-6 medium |
| NaNO3 | Wako | 191-02542 | AF-6 medium |
| NH4NO3 | Wako | 015-03231 | AF-6 medium |
| Plankton Counter | Matsunami Glass, Osaka, Japan | S6300 | |
| Pylex test tube | CTG Ltd., West Molesey, UK | With rim, 16 x 100 mm | |
| Vit. B1 | Wako | 203-00851 | AF-6 medium |
| Vit. B12 | Wako | 226-00343 | AF-6 medium |
| Vit. B6 | Wako | 165-05401 | AF-6 medium |
| ZnSO4·7H2O | Wako | 264-00402 | AF-6 medium |
References
- Kolber, Z., Falkowski, P. G. Use of active fluorescence to estimate phytoplankton photosynthesis in situ. Limnology and Oceanography. 38 (8), 1646-1665 (1993).
- Kolber, Z. S., Prášil, O., Falkowski, P. G. Measurements of variable chlorophyll fluorescence using fast repetition rate techniques: defining methodology and experimental protocols. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1367 (1), 88-106 (1998).
- Oxborough, K., Moore, C. M., Suggett, D. J., Lawson, T., Chan, H. G., Geider, R. J. Direct estimation of functional PSII reaction center concentration and PSII electron flux on a volume basis: a new approach to the analysis of Fast Repetition Rate fluorometry (FRRf) data. Limnology and Oceanography: Methods. 10 (3), 142-154 (2012).
- Smyth, T. J., Pemberton, K. L., Aiken, J., Geider, R. J. A methodology to determine primary production and phytoplankton photosynthetic parameters from fast repetition rate fluorometry. Journal of Plankton Research. 26 (11), 1337-1350 (2004).
- Lawrenz, E., et al. Predicting the electron requirement for carbon fixation in seas and oceans. PLoS ONE. 8 (3), 58137 (2013).
- Zhu, Y., et al. Relationship between light, community composition and the electron requirement for carbon fixation in natural phytoplankton. Marine Ecology Progress Series. 580, 83-100 (2017).
- Schuback, N., Tortell, P. D. Diurnal regulation of photosynthetic light absorption, electron transport and carbon fixation in two contrasting oceanic environments. Biogeosciences. 16 (7), 1381-1399 (2019).
- Cosgrove, J., Borowitzka, M. A. Chlorophyll fluorescence terminology: an introduction. Chlorophyll a Fluorescence in Aquatic Sciences: Methods and Applications. , Springer. Dordrecht. 1-17 (2010).
- McKew, B. A., et al. The trade-off between the light-harvesting and photoprotective functions of fucoxanthin-chlorophyll proteins dominates light acclimation in Emiliania huxleyi (clone CCMP 1516). New Phytologist. 200 (1), 74-85 (2013).
- Warner, M. E., Lesser, M. P., Ralph, P. J. Chlorophyll fluorescence in reef building corals. Chlorophyll a Fluorescence in Aquatic Sciences: Methods and Applications. , Springer. Dordrecht. 209-222 (2010).
- Bhagooli, R., et al. Chlorophyll fluorescence - A tool to assess photosynthetic performance and stress photophysiology in symbiotic marine invertebrates and seaplants. Marine Pollution Bulletin. 165, 112059 (2021).
- Zavafer, A., Labeeuw, L., Mancilla, C. Global trends of usage of chlorophyll fluorescence and projections for the next decade. Plant Phenomics. 2020, 6293145 (2020).
- Goto, N., Tanaka, Y., Mitamura, O. Relationships between carbon flow through freshwater phytoplankton and environmental factors in Lake Biwa, Japan. Fundamental and Applied Limnology/Archiv für Hydrobiologie. 184 (4), 261-275 (2014).
- Napoléon, C., Raimbault, V., Claquin, P. Influence of nutrient stress on the relationships between PAM measurements and carbon incorporation in four phytoplankton species. PLOS ONE. 8 (6), 66423 (2013).
- Morris, E. P., Kromkamp, J. C. Influence of temperature on the relationship between oxygen- and fluorescence-based estimates of photosynthetic parameters in a marine benthic diatom (Cylindrotheca closterium). European Journal of Phycology. 38 (2), 133-142 (2003).
- Fraga, S., Rodríguez, F., Bravo, I., Zapata, M., Marañón, E. Review of the main ecological features affecting benthic dinoflagellate blooms. Cryptogamie, Algologie. 33 (2), 171-179 (2012).
- McMinn, A., et al. Quantum yield of the marine benthic microflora of near-shore coastal Penang, Malaysia. Marine and Freshwater Research. 56 (7), 1047-1053 (2005).
- Salleh, S., McMinn, A. The effects of temperature on the photosynthetic parameters and recovery of two temperate benthic microalgae, Amphora cf. coffeaeformis and Cocconeis cf. sublittoralis (Bacillariophyceae). Journal of Phycology. 47 (6), 1413-1424 (2011).
- McMinn, A., Pankowskii, A., Ashworth, C., Bhagooli, R., Ralph, P., Ryan, K. In situ net primary productivity and photosynthesis of Antarctic sea ice algal, phytoplankton and benthic algal communities. Marine Biology. 157 (6), 1345-1356 (2010).
- Garbary, D. J., Bird, C. J., Kim, K. Y. Sporocladopsis jackii, sp. nov. (Chroolepidaceae, chlorophyta): a new species from eastern Canada and Maine symbiotic with the mud snail, Ilyanassa obsoleta (Gastropoda). Rhodora. 107 (929), 52-68 (2005).
- Suggett, D. J., Oxborough, K., Baker, N. R., MacIntyre, H. L., Kana, T. M., Geider, R. J. Fast repetition rate and pulse amplitude modulation chlorophyll a fluorescence measurements for assessment of photosynthetic electron transport in marine phytoplankton. European Journal of Phycology. 38 (4), 371-384 (2003).
- Hughes, D. J., et al. Impact of nitrogen availability upon the electron requirement for carbon fixation in Australian coastal phytoplankton communities. Limnology and Oceanography. 63 (5), 1891-1910 (2018).
- Melrose, D. C., Oviatt, C. A., O'Reilly, J. E., Berman, M. S. Comparisons of fast repetition rate fluorescence estimated primary production and 14C uptake by phytoplankton. Marine Ecology Progress Series. 311, 37-46 (2006).
- Yoshida, K., Seger, A., Kennedy, F., McMinn, A., Suzuki, K. Freezing, melting, and light stress on the photophysiology of ice algae: ex situ incubation of the ice algal diatom Fragilariopsis cylindrus (Bacillariophyceae) using an ice tank. Journal of Phycology. 56 (5), 1323-1338 (2020).
- Selz, V., et al. Ice algal communities in the Chukchi and Beaufort Seas in spring and early summer: composition, distribution, and coupling with phytoplankton assemblages. Limnology and Oceanography. 63 (3), 1109-1133 (2018).
- Falasco, E., Bo, T., Ghia, D., Gruppuso, L., Bona, F., Fenoglio, S. Diatoms prefer strangers: non-indigenous crayfish host completely different epizoic algal diatom communities from sympatric native species. Biological Invasions. 20 (10), 2767-2776 (2018).
- Møhlenberg, F., Kaas, H. Colacium vesiculosum Ehrenberg (Euglenophyceae), infestation of planktonic copepods in the Western Baltic. Ophelia. 31 (2), 125-132 (1990).
- Zalocar, Y., Frutos, S. M., Casco, S. L., Forastier, M. E., Vallejos, S. V. Prevalence of Colacium vesiculosum (Colaciales: Euglenophyceae) on planktonic crustaceans in a subtropical shallow lake of Argentina. Revista De Biologia Tropical. 59 (3), 1295-1306 (2011).
- Barea-Arco, J., Pérez-Martínez, C., Morales-Baquero, R. Evidence of a mutualistic relationship between an algal epibiont and its host, Daphnia pulicaria. Limnology and Oceanography. 46 (4), 871-881 (2001).
- Decaestecker, E., Declerck, S., De Meester, L., Ebert, D. Ecological implications of parasites in natural Daphnia populations. Oecologia. 144 (3), 382-390 (2005).
- Allen, Y. C., Stasio, B. T. D., Ramcharan, C. W. Individual and population level consequences of an algal epibiont on Daphnia. Limnology and Oceanography. 38 (3), 592-601 (1993).
- Willey, R. L., Cantrell, P. A., Threlkeld, S. T. Epibiotic euglenoid flagellates increase the susceptibility of some zooplankton to fish predation. Limnology and Oceanography. 35 (4), 952-959 (1990).
- Green, J.
- Evans, M. S., Sicko-Goad, L. M., Omair, M. Seasonal occurrence of Tokophrya quadripartita (Suctoria) as epibionts on adult Limnocalanus macrurus (Copepoda: Calanoida) in southeastern Lake Michigan. Transactions of the American Microscopical Society. 98 (1), 102-109 (1979).
- Chiavelli, D. A., Mills, E. L., Threlkeld, S. T. Host preference, seasonality, and community interactions of zooplankton epibionts. Limnology and Oceanography. 38 (3), 574-583 (1993).
- Willey, R. L., Willey, R. B., Threlkeld, S. T. Planktivore effects on zooplankton epibiont communities: epibiont pigmentation effects. Limnology and Oceanography. 38 (8), 1818-1822 (1993).
- Rosowski, J. R., Willey, R. L. Colacium libellae sp. nov. (euglenophyceae), a photosynthetic inhabitant of the larval damselfly rectum. Journal of Phycology. 11 (3), 310-315 (1975).
- Willey, R. L., Threlkeld, S. T. Organization of crustacean epizoan communities in a chain of subalpine ponds. Limnology and Oceanography. 38 (3), 623-627 (1993).
- Al-Dhaheri, R. S., Willey, R. L. Colonization and reproduction of the epibiotic flagellate Colacium vesiculosum (euglenophyceae) on Daphnia pulex. Journal of Phycology. 32 (5), 770-774 (1996).
- Rosowski, J. R. Photosynthetic euglenoids. Freshwater Algae of North America. , Elsevier Science. USA. 383-422 (2003).
- Rosowski, J. R., Kugrens, P. Observations on the euglenoid Colacium with special reference to the formation and morphology of attachment material. Journal of Phycology. 9 (4), 370-383 (1973).
- Salmaso, N., Tolotti, M. Other phytoflagellates and groups of lesser importance. Encyclopedia of Inland Waters. , Academic Press. 174-183 (2009).
- Threlkeld, S. T., Chiavelli, D. A., Willey, R. L. The organization of zooplankton epibiont communities. Trends in Ecology & Evolution. 8 (9), 317-321 (1993).
- Bertolo, A., Rodríguez, M. A., Lacroix, G. Control mechanisms of photosynthetic epibionts on zooplankton: an experimental approach. Ecosphere. 6 (11), (2015).
- Pringsheim, E. G.
- Wołowski, K., Duangjan, K., Peerapornpisal, Y. Colacium minimum (Euglenophyta), a new epiphytic species for Asia. Polish Botanical Journal. 60 (2), 179-185 (2015).
- Martin, J. H., Knauer, G. A.
- Kazama, T., Hayakawa, K., Kuwahara, V. S., Shimotori, K., Imai, A., Komatsu, K. Development of photosynthetic carbon fixation model using multi-excitation wavelength fast repetition rate fluorometry in Lake Biwa. PLOS ONE. 16 (2), 0238013 (2021).
- Chesney, T., Sastri, A. R., Beisner, B. E., Nandini, S., Sarma, S. S. S., Juneau, P. Application of fluorometry (Phyto-PAM) for assessing food selection by cladocerans. Hydrobiologia. 829 (1), 133-142 (2019).
- Wang, Q., Yang, S., Wan, S., Li, X.
- Dau, H., Haumann, M. Eight steps preceding O-O bond formation in oxygenic photosynthesis-A basic reaction cycle of the photosystem II manganese complex. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1767 (6), 472-483 (2007).
- Suthers, I., Bowling, L., Kobayashi, T., Rissik, D. Sampling methods for plankton. Plankton: A guide to their ecology and monitoring for water quality. , CSIRO Publishing. Melbourne. 63-90 (2019).
- Błędzki, L. A., Rybak, J. I. Freshwater Crustacean Zooplankton of Europe: Cladocera & Copepoda (Calanoida, Cyclopoida) Key to species identification, with notes on ecology, distribution, methods and introduction to data analysis. , Springer. Switzerland. (2016).
- Kato, S. Laboratory culture and morphology of Colacium vesiculosum Ehrb. (Euglenophyceae). Japanese Journal of Phycology (Sorui). 30, 63-67 (1982).
- Serôdio, J., Campbell, D. A. Photoinhibition in optically thick samples: Effects of light attenuation on chlorophyll fluorescence-based parameters. Journal of Theoretical Biology. 513, 110580 (2021).
- Sylvan, J. B., Quigg, A., Tozzi, S., Ammerman, J. W. Eutrophication-induced phosphorus limitation in the Mississippi River plume: evidence from fast repetition rate fluorometry. Limnology and Oceanography. 52 (6), 2679-2685 (2007).
- Browning, T. J., et al. P. Nutrient regulation of late spring phytoplankton blooms in the midlatitude North Atlantic. Limnology and Oceanography. 65 (6), 1136-1148 (2020).
- Pausch, F., Bischof, K., Trimborn, S. Iron and manganese co-limit growth of the Southern Ocean diatom Chaetoceros debilis. PLOS ONE. 14 (9), 0221959 (2019).
- Ferroni, L., Baldisserotto, C., Fasulo, M. P., Pagnoni, A., Pancaldi, S. Adaptive modifications of the photosynthetic apparatus in Euglena gracilis Klebs exposed to manganese excess. Protoplasma. 224 (3), 167-177 (2004).
- Gaiser, E. E., Bachmann, R. W. Seasonality, substrate pereference and attachment sites of epizoic diatoms on cladoceran zooplankton. Journal of Plankton Research. 16 (1), 53-68 (1994).
- Totti, C., et al. The diversity of epizoic diatoms: relationships between diatoms and marine invertebrates. The Diversity of Epizoic Diatoms. 16, 323-343 (2011).
- Perkins, M., Effler, S. W., Strait, C. M. Phytoplankton absorption and the chlorophyll a-specific absorption coefficient in dynamic Onondaga Lake. Inland Waters. 4 (2), 133-146 (2014).
- Kromkamp, J., Capuzzo, E., Philippart, C. J. M. Measuring phytoplankton primary production: review of existing methodologies and suggestions for a common approach. EcApRHA Deliverable WP 3.2. 28, (2017).
- Hughes, D., et al. Roadmaps and detours: active chlorophyll-a assessments of primary productivity across marine and freshwater systems. Environmental Science & Technology. 52 (21), 12039-12054 (2018).
- Perkins, R. G., et al. The application of variable chlorophyll fluorescence to microphytobenthic biofilms. Chlorophyll a Fluorescence in Aquatic Sciences: Methods and Applications. 4, Springer. Dordrecht. 237-275 (2010).
- Schuback, N., Flecken, M., Maldonado, M. T., Tortell, P. D. Diurnal variation in the coupling of photosynthetic electron transport and carbon fixation in iron-limited phytoplankton in the NE subarctic Pacific. Biogeosciences. 13 (4), 1019-1035 (2016).
- Schreiber, U., Gademann, R., Ralph, P. J., Larkum, A. W. D. Assessment of photosynthetic performance of Prochloron in Lissoclinum patella in hospite by chlorophyll fluorescence measurements. Plant and Cell Physiology. 38 (8), 945-951 (1997).
- Garbary, D. J., Miller, A. G., Scrosati, R. A. Ascophyllum nodosum and its symbionts: XI. The epiphyte Vertebrata lanosa performs better photosynthetically when attached to Ascophyllum than when alone. Algae. 29 (4), 321-331 (2014).
- Gorbunov, M. Y., Kolber, Z. S., Lesser, M. P., Falkowski, P. G. Photosynthesis and photoprotection in symbiotic corals. Limnology and Oceanography. 46 (1), 75-85 (2001).
- Yellowlees, D., Warner, M. Photosynthesis in symbiotic algae. Photosynthesis in Algae. 14, Springer. Dordrecht. 437-455 (2003).
- Wojtasiewicz, B., Stoń-Egiert, J. Bio-optical characterization of selected cyanobacteria strains present in marine and freshwater ecosystems. Journal of Applied Phycology. 28 (4), 2299-2314 (2016).
- Aardema, H. M., Rijkeboer, M., Lefebvre, A., Veen, A., Kromkamp, J. C. High-resolution underway measurements of phytoplankton photosynthesis and abundance as an innovative addition to water quality monitoring programs. Ocean Science. 15 (5), 1267-1285 (2019).
