Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Mätning av fotofysiologi av bifogat stadium av Colacium sp. med en Cuvette-typ snabb repetitionshastighet fluorometer

Published: November 12, 2021 doi: 10.3791/63108
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2, 1
1Lake Biwa Branch Office, National Institute for Environmental Studies, 2Center for Regional Environmental Research, National Institute for Environmental Studies, 3Graduate School of Human Development and Environment, Kobe University, 4Lake Biwa Environmental Research Institute

Summary

Snabb repetitionshastighet fluorometer (FRRf) är en fördelaktig metod för att mäta fotosystem II fotofysiologi och primär produktivitet. Här beskriver vi ett protokoll för att mäta PSII fotofysiologi av epizoic alga, Colacium sp. på substrat zooplankton med cuvette-typ FRRf.

Abstract

Snabb repetitionshastighet fluorometer (FRRf) är en fördelaktig metod för att mäta fotosystem II (PSII) fotofysiologi och primär produktivitet. Även om FRRf kan mäta PSII absorption tvärsnitt (σ PSII), maximal fotokemisk effektivitet (Fv/Fm), effektiv fotokemisk effektivitet (Fq′/Fm′) och icke-fotokemisk släckning (NPQNSV) för olika eukaryota alger och cyanobakterier, har nästan alla FRRf-studier hittills fokuserat på fytoplankton. Här beskriver protokollet hur man mäter PSII-fotofysiologi av en epizoisk alg Colacium sp. Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), i dess bifogade arrangerar (fäst till zooplankton), genom att använda cuvette-typ FRRf. Först uppskattade vi effekterna av substrat zooplankton (Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776, Cladocera, Daphniidae) på baslinjen fluorescens och σ PSII, Fv/Fm, Fq′/Fm′, och NPQNSV av planktonic Colacium sp. För att validera denna metod spelade vi in fotofysiologi mätningar av bifogade Colacium sp. på S. mucronata och jämförde dessa resultat med dess planktonic stadium. Representativa resultat visade hur protokollet kunde bestämma effekterna av kalcium (Ca) och mangan (Mn) på Colacium sp. fotofysiologi och identifiera de olika effekterna av Mn berikning mellan bifogade och planktoniska stadier. Slutligen diskuterar vi anpassningsförmågan hos detta protokoll till andra perifytiska alger.

Introduction

Klorofyll variabel fluorescens är ett användbart verktyg för att mäta algfotosystem II (PSII) fotofysiologi. Alger svarar på olika miljöbelastningar, såsom överskott av ljus och näringsbrist, genom att ändra sin PSII-fotofysiologi. Snabb repetitionshastighet fluorometer (FRRf) är en vanlig metod för att mäta PSII fotofysiologi1,2 och uppskatta primär produktivitet1,3,4, vilket möjliggör övervakning av fytoplankton PSII fotofysiologi, liksom primär produktivitet över breda rumsliga och tidsmässiga skalor5,6,7. FRRf kan samtidigt mäta PSII (σ PSII) absorptions tvärsnitt, reaktionscenterkoncentration ([RCII]) koncentration, maximal fotokemisk effektivitet (Fv/Fm), effektiv fotokemisk effektivitet (Fq′/Fm′) och icke-fotokemisk släckning (NPQNSV) (tabell 1). I allmänhet definieras Fv/Fm och Fq′/Fm′ som PSII-aktivitet8, medan NPQNSV definieras som relativ värmeavledningsenergi9.

Viktigt är att single turnover (ST) blinkningar av FRRf helt minskar den primära kinoneelektron acceptorn, QA, men inte plastoquinone poolen. Omvänt kan flera omsättningsblixtar (MT) blinkningar från en PAM-fluorometer (Pulse Amplitude Modulation) minska båda. ST-metoden har en klar fördel jämfört med MT-metoden när npqnsv kan identifieras genom att samtidigt mäta återhämtningskinetik för Fv/Fm, Fq′/Fm′, NPQNSV och σ PSII10. Hittills är flera typer av FRRf-instrument, såsom undervattens-typ, cuvette-typ och flödestyp, kommersiellt tillgängliga. FrRf av dränkbar typ möjliggör in situ-mätningar i hav och sjöar, medan frRf av cuvettetyp är lämplig för mätning av små provvolymer. Flödestypen används ofta för att kontinuerligt mäta fotofysiologin hos fytoplankton i ytvatten.

Med tanke på utvecklingen av PAM-fluorometrar, inklusive cuvette-typ, för ett brett spektrum av ämnen11, är PAM-fluorometrar fortfarande vanligare än FRRfs i algfotofysiologisk forskning12. Till exempel, även om provkammarstrukturen och cuvettekapaciteten mellan dessa verktyg bara skiljer sig något, har pam av cuvettetyp tillämpats på fytoplankton13,14,15, bentiska mikroalger16,17,18, isalger19 och epizoiska alger20, medan cuvette-typ FRRf främst har tillämpats på fytoplankton21,22,23 och ett begränsat antal isalgalsamhällen24,25. Med tanke på dess effektivitet är cuvette-typ FRRf lika tillämplig på bentiska och epizoiska alger. Därför kommer utvidgningen av dess tillämpning att ge betydande inblick i PSII-fotofysiologi, särskilt för mindre känd epizoisk algfotofysiologi.

Epizoiska alger har fått lite uppmärksamhet, med få studier som undersöker deras PSII-fotofysiologi20,26, troligtvis på grund av deras mindre roller i vattenlevande födovävar27,28. Epibionter, inklusive epizoiska alger, kan dock ha en positiv inverkan på zooplanktons samhällsdynamik, såsom ökad reproduktion och överlevnadsgrad29,30, samt negativt påverkade processer, såsom ökad försänkningshastighet29,31 och sårbarhet för visuella rovdjur32,33,34,35 36 . Därför är det avgörande att utforska de miljömässiga och biologiska faktorer som styr epibiontdynamiken i zooplanktonsamhällen.

Bland epizoiska alger är Colacium Ehrenberg 1834 (Euglenophyta) en vanlig, sötvatten, alggrupp32,37,38,39 med olika livsstadier, inklusive bifogade (figur 1A-D), icke-motil planktonisk (figur 1E,F) och motila planktoniska stadier40,41 . Under det icke-motila planktonstadiet lever cellerna som encelliga plankton, aggregerade kolonier eller ettskiktsarkkolonier, täckta av mucilage42. I det bifogade skedet använder Colacium sp. mucilage utsöndad från cellens främre ände37,39,41 för att fästa vid substratorganismer (basibionter), särskilt mikrocrustaceans41,43. Deras livscykel innebär också att lossa från det smälta exoskelettet eller död basibiont och simma med sin flagella för att hitta en annan substratorganism39. Både planktoniska och bifogade stadier kan öka sin populationsstorlek med mitos40. Även om deras bifogade stadium antas vara ett evolutionärt drag för att samla resurser, såsom light44 och spårämnen41,45,46, eller som en spridningsstrategi27, finns lite experimentella bevis tillgängliga om dessa aspekter37,41,44 och de viktigaste fästmekanismerna är till stor del okända. Rosowski och Kugrens förväntade sig till exempel att Colacium skulle få mangan (Mn) från substrat copepods41, koncentrerad till exoskelett47.

Här beskriver vi hur man mäter PSII fotofysiologi av planktoniska alger och den relaterade tillämpningsmetoden för att rikta in sig på bifogade alger (som fäster vid zooplankton) med Colacium sp. celler med hjälp av cuvette-typ FRRf. Vi använder Act2-systemet utrustat med tre lysdioder (LED) som ger blixtexcitationsenergi centrerad vid 444 nm, 512 nm och 633 nm48. Här motsvarar 444 nm (blå) absorptionstoppen av chrophyll a (Chl-a), medan 512 nm (grön) och 633 nm (orange) motsvarar absorptionstopparna av fycoerythrin respektive phycocyanin. Den fluorescerande signaldetekteringstoppen är 682 nm med 30 nm halv bandbredd. Eftersom det är svårt att hitta det planktoniska stadiet av Colacium sp. i naturliga miljöer samlades deras bifogade steg in för experimenten. Bland de talrika substratorganismerna, Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776 (Branchiopoda, Daphniidae; Figur 1A, B,G) är en av de enklaste att hantera på grund av deras långsamma simhastighet, stora kroppsstorlek (400-650 μm) och unika beteende (hänger upp och ner på vattenytan). Därför använder detta protokoll Colacium sp. bifogat på S. mucronata som en fallstudie av Colacium-basibiont systemet. För att undvika fluorescens som härrör från tarminnehållet var S. mucronata utsvulten. Som en tidigare studie rapporterade att fluorescenssignalen från tarminnehåll (intagna alger) visar en femfaldig minskning efter 40 min49, förväntade vi oss att 90 min svält skulle vara tillräckligt för att minimera risken för tarminnehåll fluorescens som påverkar FRRf-mätningen med minsta effekter av experimentell stress till Colacium sp., såsom näringsbrist. Dessutom tillämpades detta protokoll för att klargöra fästmekanismen för Colacium sp. och bestämma hur två metaller, kalcium (Ca) och mangan (Mn) påverkar fotofysiologin i både planktoniska och bifogade stadier. Kalcium spelar nyckelroller i de fotosyntetiska vägarna50 på flera sätt, och båda metallerna krävs för att konstruera psII51:s syreutvecklande komplex. Eftersom kalcium och mangan är mycket koncentrerade i karapacen av kräftdjur zooplankton47, vi t ställa hypotesen att Colacium sp. fotofysiologi kan svara mer framträdande på Ca och Mn anrikning under planktonic scenen om detta livsstadium erhåller dessa element från S. mucronata under det bifogade skedet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Provtagning

  1. Samla sjövatten från ytan med en hink. För att rikta in dig på Colacium sp. fäst vid S. mucronata (figur 1A-C) filter 0,5-10 L sjövatten med hjälp av ett 100 μm nylonnätnät52.
    OBS: S. mucronata aggregeras ofta tätt i grunt, eutrofiskt, lerigt vatten, såsom bland reed (phragmites) områden.
  2. Förvara de koncentrerade proverna i 500 ml plastflaskor med 350 ml sjövatten. Håll dig i mörka förhållanden.
  3. I laboratoriet häller du provvattnet i en 500 ml bägare och låt det lösa sig i några minuter.
  4. Filtrera sjövattnet genom ett 0,2 μm porstorleksfilter.
  5. Plocka upp S. mucronata individer som använder en pipett under ett optiskt mikroskop vid 100x förstoring. Utför artidentifiering enligt Błędzki och Rybak53.
  6. Överför dem till en droppe på 0,2-μm filtrerat sjövatten (FLW) placerat på en glasrutschbana.
    OBS: S. mucronata kan simma till ytan eller fästa på bägarens vägg.
  7. Kontrollera S. mucronata under lätt mikroskopi.
  8. Tvätta S. mucronatapersoner som använder FLW (3 droppar eller mer) för att förhindra kontaminering från andra organismer (figur 2).
  9. Behåll S. mucronata vid en in situ-temperatur i en tillväxtkammare under 40 μmol foton·m−2·s−1.

2. Effekter av S . mucronata på baslinjefluorescens

  1. S. mucronata odling
    1. Plocka upp S. mucronata individer med hjälp av en pipett under ett optiskt mikroskop vid 100x förstoring och tvätta med FLW, som i steg 1.8.
    2. Lufta kranvatten med hjälp av en elektrisk luftpump via en luftsten i minst 1 vecka. Häll 300 ml luftat kranvatten i en 350 ml glasburk.
    3. Mata Chlorella (1 mg C·L−1) och håll vid 20 °C under 40 μmol foton·m−2·s−1 i en tillväxtkammare.
    4. Efter cirka 14 dagar, plocka upp 5-30 personer med en pipett under ett optiskt mikroskop vid 100x förstoring och inokulera dem i 300 ml rent, luftat kranvatten för att hålla mediet färskt.
  2. Ställa in FRRf
    1. Starta Act2Run-programvaran.
    2. Klicka på fliken Alternativ och välj Act2 FLC (vita lysdioder) i driftsätt för att ställa in den aktiniska lysdiodfärgen.
    3. Klicka på värdet för Mörk i steg 1 i inställningarna för lysrörskurvan i huvudfönstret och skriv 30 för att ställa in varaktigheten för den mörka perioden (bild 3A).
    4. Klicka på LED-kombinationen B, C och D för att stänga av de gröna och orange lysdioderna (bild 3C).
    5. Klicka på värdet för Fets och Pitch under Lör och skriv 100 respektive 2 för att ställa in antalet och tonhöjden för flashlet i mättnadsfasen (bild 3D).
    6. Klicka på värdet på Fets och Pitch under Rel och skriv 40 respektive 60 för att ställa in antalet och tonhöjden för flashlet i avslappningsfasen (figur 3E).
    7. Aktivera vattenmantelpumpen genom att klicka på Under FLC (bild 3F) för att kontrollera provtemperaturen under mätningen.
    8. Aktivera genom att klicka på Auto-LED och Auto-PMT (bild 3F).
    9. Klicka på Synkronisera för att ansluta FRRf-Act2.
  3. FRRf-mätningar
    1. För att undersöka effekterna av zooplankton individer på baslinjen fluorescens, förbereda vuxna S. mucronata (kroppsstorlek 400-650 μm) från odlingen i steg 2.1.1-2.1.4 utan några bifogade organismer.
    2. För att undvika fluorescens från tarminnehållet, svält individerna i FLW vid 20 °C i minst 90 minuter.
    3. Häll 1,5 ml FLW i en cuvette. Plocka upp 0, 1, 5 och 10 S. mucronata individer med hjälp av en pipett under ett optiskt mikroskop vid 100x förstoring.
    4. Överför S. mucronata individer i cuvette och tillsätt FLW för att få provet upp till 2 ml.
    5. Acklimatisera dig under svagt ljus (1-10 μmol foton·m−2·s−1) vid 20 °C i 15 minuter före FRRf-mätning.
    6. Klicka på Act2 Run för att starta mätningen. Upprepa mätningarna >3 gånger per prov.
    7. Läs fo-värdet från resultatdiagrammet (bild 4).

3. Substratorganismens effekter på Chl- en fluorescens

  1. Colacium sp. odling
    1. Förbered FLW och AF-6 medium54 för odling (tabell 2).
    2. Samla colacium sp. fäst vid S. mucronata som i steg 1.1 och 1.2 och, håll vid in situ temperatur i en tillväxtkammare.
    3. Plocka upp Colacium sp. med en smält karapace (bild 1D) med en pipett under ett optiskt mikroskop vid 100x förstoring. Tvätta dem med FLW, som i steg 1.8.
    4. Aseptiskt inokulera Colacium sp. och AF-6 medium i ett 10 mL glasrör på en ren bänk.
    5. Håll kulturen vid in situ-temperatur under 200 μmol foton·m−2·s−1 i en tillväxtkammare. Skaka glasröret försiktigt för hand minst en gång per dag för att förhindra cellbosättning.
      OBS: För att hålla dämpningseffekten av aggregerade kolonier så låg som möjligt, kontrollera kolonierna under ett mikroskop före FRRf-mätning. Cellaggregering kan orsaka täta kolonier och påverka algfotofysiologi55.
  2. FRRf-mätningar
    1. För att undersöka effekterna av zooplankton individer på Chl-a fluorescens från Colacium sp., förbereda vuxna S. mucronata (kroppsstorlek 400-650 μm) utan några fastsatta organismer.
    2. För att undvika fluorescens från tarminnehållet, svält individerna i FLW i minst 90 min.
    3. Ställ in en cuvette-typ snabb repetitionshastighet fluorometer (FRRf).
    4. Häll en 1,5 ml undersampel av förcultured Colacium sp. i en cuvette. Överföring 0, 5, 10 och 15 S. mucronata individer i dessa cuvettes och tillsätt 2 μm filtrerat medium för att få provet upp till 2 ml.
    5. Acklimatisera dig under svagt ljus (1-10 μmol foton·m−2·s−1) vid 20 °C i 15 minuter innan FRRf-mätningen utförs.
      OBS: Håll proverna vid inkubationstemperatur under mätningar
    6. Klicka på Act2 Run för att starta mätningen. Upprepa mätningarna >3 gånger per prov.
    7. Läs FO- och FM-värdena från resultatdiagrammet (bild 4).
      OBS: Kontrollera RσPSII-värdet (tabell 1), som visar om LED-effekten ligger inom det optimala intervallet för att uppskatta PSII-parametrarna korrekt. När auto-LED är aktiverat styr Act2run-systemet LED-kraften för att uppnå ett optimalt RσPSII-intervall (0.042-0.064). Det experimentella RσPSII-brytvärdet definierades till 0, 03 och 0, 08 i en tidigare studie48.
    8. För att korrigera baslinjen fluorescens22 filtrerar du odlingsmediet med ett 0,2-μm porstorleksfilter och mäter fluorescensen. Subtrahera FO för original exemplet från FO och Fm i Colacium sp., eller ändra blank korrigerings värde i inställningarna på fliken Alternativ.

4. Fotofysiologi av Colacium sp. (bifogat steg)

  1. Isolera S. mucronata individer med Colacium sp. med hjälp av en pipett under ett optiskt mikroskop.
  2. Tvätta S. mucronata med FLW, som i steg 1.8.
  3. Överför S. mucronata i en 100 ml FLW. För svält, håll under mörka förhållanden vid in situ temperatur i 90 min.
  4. Häll 1,5 ml FLW i en cuvette.
  5. Överför ~10 S. mucronata individer med Colacium sp. i en cuvette. För mätningar behövs mer än 100 Colaciumceller per 2 ml. Tillsätt FLW för att få provet upp till 2 ml.
  6. Acklimatisera sig under svagt ljus (1-10 μmol foton·m−2·s−1) vid in situ-temperatur i 15 min. Mät Chl-a fluorescens som i steg 3.2.6-3.2.8.
  7. För att räkna upp antalet bifogade celler, fixera provet med glutaraldehyd (2% slutlig volym) efter att ha tagit FRRf-mätningen. Ta bilder på flera brännvidder och positioner i S. mucronata under ett ljusmikroskop.

5. Fotofysiologi av Colacium sp. (planktoniskt stadium)

  1. Odla prov i colacium sp. i AF-6 medium vid in situ temperatur som i steg 3.1.1-3.1.5.
  2. För den stationära fasen, ta 2 ml odlad Colacium sp. och häll i en cuvette.
  3. Acklimatisera sig under svagt ljus (1-10 μmol foton·m−2·s−1) vid in situ-temperatur i 15 min. Mät Chl-a fluorescens som i steg 3.2.6-3.2.8.

6. Effekter av Ca och Mn tillägg på fotofysiologi av Colacium sp.

  1. Effekter på bifogat stadium
    1. Isolera S. mucronata individer med Colacium sp. med hjälp av en pipett under ett optiskt mikroskop. Tvätta med FLW, som i steg 1.8.
    2. Överför sex personer vardera till 12 glasbägare med 30 ml FLW. Se till att varje bägare innehåller >100 Colacium sp. celler.
    3. Tillsätt 200 μmol· L−1 CaCl2· H2O (Ca-behandling), 40 μmol· L−1 MnCl4 (Mn-behandling) eller ultrapurvatten (kontroll) till varje bägare. Inkubera proverna under 200 μmol foton·m−2 ·s−1 vid in situ-temperatur i en tillväxtkammare.
    4. Vid 3 h och 21 h överför alla individer och smälta skinn till en cuvette med 2 ml medium.
    5. För att undersöka det snabba svaret på ökande ljus, klicka på Upp av perioderna med 8 aktiniska ljussteg och typ 20 (figur 3A) för att ställa in varaktigheten för varje steg i 20 s. Om du vill ställa in det stegvisa aktiniska ljuset som 0, 11, 25, 44, 68, 101, 144 och 200 μmol foton·m−2·s−1, klicka på Hög E och Steg upp och ändra värdena till 200 respektive 34 (figur 3B).
    6. Efter 15 minuters mörk acklimatisering mäter du Chl-a fluorescens för varje prov som liknar steg 3.2.6-3.2.8.
      OBS: Kontrollera att värdena RσPSII och RσPSII ligger inom det optimala intervallet (0,03-0,08)48.
  2. Effekter på planktonstadiet
    1. Odla prov i colacium sp. i AF-6 medium vid in situ temperatur som i steg 3.1.1-3.1.5.
    2. Överför den odlade Colacium-sp . till FLW och acklimatisera vid in situ temperatur mindre än 200 μmol foton·m−2·s−1 i 3 dagar.
    3. Överför 1 ml av de acklimatiserade proverna till tre glasflaskor med 10 ml FLW.
    4. Tillsätt 200 μmol· L−1 CaCl2· H2O (Ca-behandling), 40 μmol· L−1 MnCl3 (Mn-behandling) eller ultrapurvatten (kontroll) till injektionsflaska. Inkubera proverna under 200 μmol foton·m−2·s−1 vid in situ-temperatur i en tillväxtkammare.
    5. Mät Chl-a fluorescens för varje prov enligt steg 3.2.6-3.2.8 vid 3 timmar och 21 h.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det fanns ingen signifikant effekt av baslinjen fluorescens (figur 5) eller Chl-a fluorescens (figur 6) av S. mucronata upp till 5 individer (inds.) mL−1. Fv/Fm och NPQNSV påverkades dock avsevärt när S. mucronata var 7,5 inds·mL−1. För att mäta fotofysiologin av Colacium sp. under det bifogade steget valde vi S. mucronata med den högre bördan av Colacium sp. för att nå tillräcklig Colacium sp. överflöd (>50 celler·mL−1) och ett lågt antal S. mucronata (≤5 inds·mL−1) i cuvette.

Tabell 3 visar säsongsvariationer i fotofysiologi av Colacium sp. under det bifogade skedet. Även om provtagning temperaturen varierade, deras fotofysiologi förblev relativt konstant. σ PSII varierade från 3,42 nm2 till 3,76 nm2 (medelvärde 3,60 nm2), Fv/Fm varierade från 0,52 till 0,60 (medelvärde 0,55) och NPQNSV varierade från 0,66 till 0,85 (medelvärde 0,82). För att validera dessa resultat undersökte vi ytterligare variationer i Colacium sp. fotofysiologi under planktonstadiet för den stationära fasen i AF-6-mediet (tabell 4). Medelvärdet Fv/Fm och NPQNSV för det bifogade stadiet liknade det i planktonstadiet när det inkuberades i AF-6 medium.

För att bestämma effekten av Ca och Mn på Colacium sp. fotofysiologi i både bifogade och planktoniska stadier, utförde vi Ca och Mn anrikningsexperiment. Prover togs från reedområdet i Biwasjön den 7 maj 2021. För det bifogade skedet av Colacium sp. under mörka förhållanden fanns det ingen signifikant skillnad i fotofysiologiska parametrar mellan behandlingarna, med undantag för NPQNSV mellan Mn- och Ca-behandlingar vid 3 h, där Ca < Mn (figur 7A, C,E). Vidare visade σ PSII′, Fq′/Fm′och NPQNSV:s svar på ökande ljus under det bifogade skedet inga tydliga skillnader mellan behandlingarna (figur 8A, C,E och figur 9A,C,E). NPQNSV tenderade dock att vara lägre i Ca-behandlingen än kontrollen vid låg ljusintensitet vid 21 h (11 och 25 μmol foton·m−2·s−1, figur 9E). För planktonstadiet var σ PSII betydligt lägre i Mn än Ca-behandlingen vid 3 h (figur 7B). Fq′/Fm′ var betydligt högre, men NPQNSV var lägre i Mn-behandlingen än kontrollen vid 21 h (figur 7D, F). Under ökande ljus tenderade Mn att minska σ PSII och öka Fq′/Fm′ under planktonstadiet, jämfört med kontrollen vid 3 h (figur 8D). På samma sätt minskade Mn npqnsv avsevärt under planktonstadiet jämfört med kontrollen vid 21 h (figur 9F). I likhet med det bifogade skedet förbättrade kalcium NPQNSV något för det planktoniska stadiet under ökande ljus (figur 9F). Ca minskade dock Fq′/Fm′ och ökade NPQNSV för planktonstadiet jämfört med Mn-behandling under 44-200 μmol foton·m−2·s−1 vid 3 h (figur 8D,F).

Figure 1
Figur 1: Colacium sp. och ämnesorganismen Scapholeberis mucronata. A) Infekterad S. mucronata. B) Infekterad S. mucronata fixerad med glutaraldehyd. C) Bifogade Colaciumceller på levande S. mucronata. D) Bifogade Colaciumceller på den smälta karaffen. (E, F) Colacium sp. av planktonic (palmella) scenen. G) Icke-infekterad S. mucronata. Pilar indikerar Colacium celler. Skalstänger: 200 μm (A, B och G), 10 μm (C, E och F) och 100 μm (D). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Bild 2: Tvätta zooplankton genom pipettering under filtrerat sjövatten (FLW). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Bild 3: Act2Run-programvarans användargränssnitt. (A) Exponeringstid för varje aktiniskt ljussteg; B) Antal steg och fotonflöde av aktiniskt ljus. C) Kombination av excitationsvåglängd. D) Sekvens av mättnad och avslappning. E) Vattenmantelns och provblandningspumparnas frekvenser och intensitet. (F) Fotonflödet av excitationsblixt vid 444 (betecknat som 450 här), 512 (530) och 633 nm (624), fotomultipliktplierrör (PMT) spänning och replikat och intervall av sekvens. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Fluorescensavläsning av algprovet på Act2Run-programvaran. De röda och blå linjerna indikerar rå fluorescenssignal genom en sekvens av flashlet och kurvpassning i både mättnads- respektive avslappningsfaser. Se Kolber m.fl.2 för mer information. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Effekten av S. mucronatatäthet på baslinjen fluorescens. De små prickarna representerar replikat (n = 3). Resultaten av ANOVA-testet visas också. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6: Effekterna av S. mucronatatäthet på (A) FO (B) σ PSII, C) Fv/Fm och (D) NPQNSV för Colacium sp. under planktonstadiet. De små prickarna representerar replikat (n = 3). odlades i AF-6 medium. Resultaten av ANOVA och Tukey post-hoc-test presenteras också. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 7
Figur 7: Svar från (A,B) absorptions tvärsnitt, (C,D) PSII fotokemi och (E,F) icke-fotokemisk släckning av (A,C,E) bifogat stadium och (B,D,F) planktoniskt stadium av Colacium sp. vid 3 h och 21 h efter Ca och Mn tillägg. De små prickarna representerar replikat (n = 4). Resultaten av ANOVA och Tukey post-hoc-test presenteras också. * p < 0,05. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 8
Figur 8: Snabba ljussvar av (A, B) absorptions tvärsnitt, (C,D) PSII fotokemi och (E,F) icke-fotokemisk släckning av Colacium sp. i bifogade och planktoniska steg till stegvis ljusprotokoll vid 3 h efter Ca och Mn tillägg. C, kontroll; Ca, 200 μM Ca; Mn, 40 μM Mn. Signifikanta skillnader mellan a) C och Ca, b) C och Mn och c) Ca och Mn vid varje PAR-flöde, med en signifikansnivå på p < 0,05 som visas i varje panel. Felfält, Medelvärde SD (n = 4). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 9
Figur 9: Snabba ljussvar av (A,B) absorptions tvärsnitt, (C,D) PSII fotokemi och (E,F) icke-fotokemisk släckning av Colacium sp. i bifogade och planktoniska stadier till stegvis ljusprotokoll vid 21 h efter Ca och Mn tillägg. C, kontroll; Ca, 200 μM Ca; Mn, 40 μM Mn. Signifikanta skillnader mellan a) C och Ca, b) C och Mn och c) Ca och Mn vid varje PAR-flöde, med en signifikansnivå på p < 0,05 som visas i varje panel. Felfält, Medelvärde SD (n = 4). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Term Definition Enheter
Fluorescens vid baslinjen Fo value utan Chl-a fluorescens
F' Fluorescens vid nollpunkten i ett enda omsättningsmått när C>0
Fo () Minsta PSII Fluorescensutbyte (under bakgrundsljus) vid nollpunktens blinkning
Fv () Fm() − Fo()
Fm () Maximal PSII Fluorescensutbyte (under bakgrundsljus)
Fv/Fm Maximal PSII fotokemisk effektivitet under mörker
Fq/Fm Maximal PSII fotokemisk effektivitet under bakgrundsljus, (Fm− F)/(Fm)
NPQNSV Normaliserad Stern-Volmer släckning, FO/(FM − FO)
[RCII] Koncentration av reaktionscentrum
RσPSII () Sannolikheten för att en RCII stängs under den första blixten i en enda omsättningsmättnadsfas (under bakgrundsljus)
σ PSII () Funktionell absorption tvärsnitt av PSII för excitation flashlets (under bakgrundsljus) nm2

Tabell 1: Termer som används i detta protokoll.

Komponent Kvantitet
NaNO3 140 mg· L−1
NH4NO3 22 mg· L−1
MgSO4·7H2O 30 mg· L−1
KH2PO4 10 mg· L−1
K2HPO4 5 mg· L−1
CaCl2·2H2O 10 mg· L−1
CaCO3 10 mg· L−1
Fe-citrat* 2 mg· L−1
Citronsyra* 2 mg· L−1
Biotin 0.002 mg· L−1
Vit.B 1 0.01 mg· L−1
Vit.B 6 0.001 mg· L−1
Vit.B 12 0.001 mg· L−1
Spåra metaller 1 mL·L−1
(FeCl3·6H2O) (1,0 mg·mL−1)
(MnCl3·4H2O) (0,4 mg·mL−1)
(ZnSO4·7H2O) (0,005 mg·mL−1)
(CoCl2·6H2O) (0.002 mg·mL−1)
(Na2MoO4) (0,004 mg·mL−1)
(Na2-EDTA) (7,5 mg·mL−1)

Tabell 2: Recept på AF-6 medium. Justera pH-värdet till 6,6. Lös fecitrat och citronsyra i varm H2O separat och tillsätt HCl (1 mL·L−1) efter blandning av båda reagenserna. Innehållet i spårmetaller visas inom parentes.

Provtagningsdatum Provnr Vattentemperatur.
(°C) 		S. mucronata densitet
(inds.· mL−1)		 Colacium sp. celltäthet
(inds.· mL−1)		 σ PSII (nm2) Fv/Fm NPQNSV
27 april 2020 Nr 1 14.2 4.5 77 3.42 0.60 0.66
SE 0.22 0.01 0.04
21 maj 2020 Nr 2 19.4 2 282.5 3.62 0.54 0.85
SE 0.16 0.02 0.06
Nr.3 19.4 2 250.5 3.55 0.56 0.77
SE 0.09 0.01 0.02
Nr.4 19.4 5 204.5 3.76 0.52 0.94
SE 0.12 0.00 0.02
18 juni 2020 Nr.5 22.4 2.5 474 3.62 0.54 0.85
SE 0.16 0.02 0.06
Nr.6 22.4 2 410 3.55 0.56 0.77
SE 0.09 0.01 0.02
Nr.7 22.4 2.5 441 3.76 0.52 0.94
SE 0.12 0.00 0.02
20 juli 2020 Nr 8 27.5 5 109 3.49 0.58 0.74
SE 0.10 0.00 0.00
Betyda 3.60 0.55 0.82
S.D. 0.120349 0.03 0.10

Tabell 3: Fotofysiologi av Colacium sp. fäst på S. mucronata.

Provtagningsdatum Provnr Medium Tillväxttemperatur (°C) σ PSII (nm2) Fv/Fm NPQNSV
21 maj 2020 Nr 1 AF-6 19.4 2.72 0.65 0.53
SE 0.03 0.00 0.01
18 juni 2020 Nr 2 AF-6 22.4 3.07 0.55 0.84
SE 0.08 0.02 0.07
20 juli 2020 Nr.3 AF-6 27.5 2.90 0.58 0.73
SE 0.06 0.01 0.02
Betyda 2.90 0.59 0.70
S.D. 0.18 0.05 0.16

Tabell 4: Fotofysiologi av Colacium sp. planktonic stage. Varje prov mättes under den stationära fasen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll visade för första gången att fotofysiologi av Colacium sp. under det bifogade stadiet i en naturlig miljö är jämförbar med dess planktonic stadium i AF-6 medium. Dessutom påverkade inte tarminnehållet i svältande S. mucronata baslinjen och Chl-a fluorescens när densiteten var ≤5 inds·mL−1 (figur 5 och figur 6). Dessa resultat tyder på att detta protokoll kan mäta fotofysiologi av Colacium sp. under det bifogade steget utan korrigering under låg substrat organism överflöd. Resultat från steg 3.2.1-3.2.8 visade dock att den högsta S. mucronata överflöd påverkade Fv/Fm och NPQNSV signifikant, men inte FO och σ PSII (figur 4). Här är det möjligt högre organismtäthet förvärrade fysisk stress på Colacium sp. individer och därefter minskad fotosyntetisk aktivitet. För mätningar under ett högt överflöd av substratorganismer eller andra arter kräver effekterna av substratorganismens densitet på baslinjen och Chl-a fluorescens ytterligare uppmärksamhet.

FRRfs har använts för att undersöka effekterna av näringsmanipulation på det linjära elektronflödet och icke-fotokemisk släckning av fytoplankton22,56,57. De primära resultaten visar att Ca- och Mn-anrikningen skilde sig avsevärt mellan Colacium sp. livsstadier (figur 7, figur 8 och figur 9). Mangan förbättrade tydligt den (maximala) fotokemiska avkastningen för PSII (Fv/Fm och Fq′/Fm′) och minskade värmeavledning (NPQNSV)50 av planktoniska stadier under mörker (figur 7D, F) och ljusförhållanden (figur 8D, F och figur 9D,F). Dessa resultat kan härröra från minskad antennstorlek på PSII, σ PSII och σ PSII′ (figur 7B och figur 8B), vilket minskar överskottet av ljusabsorption58,59. Mätning av antennstorlek utöver energiflödet mellan PSII-komplex skulle möjliggöra mer exakta mätningar av algsvaret10. Detta protokoll tillåter också undersökning av fotosyntesbegränsningar med andra resurser. Till exempel har kväve- och fosforbegränsningar undersökts i olika växtplanktonsamhällen, men inte i epizoiska alger, trots förväntade effekter på Colacium41 och marina epizoiska kiselalger60,61. Förutom näringsämnen kan ljusmiljön ytterligare påverka epizoiska alger distribution44.

Som visas i figur 7, figur 8 och figur 9 gör cuvette-typ FRRf det möjligt för oss att samtidigt undersöka närings- och ljuseffekter utan långa inkubationstider och mätinsatser. Detta stegvisa ljusprotokoll (steg 6.1.5) kan också rita snabba ljuskurvor av relativa elektrontransporthastigheter (rETR = Fq′/Fm′× ljus) jämfört med ljus som analog för produktion kontra ljuskurvor62. Även om linjärt elektronflöde i PSII kan uppskattas från fotofysiologiska parametrar av FRRf, är det dock inte nödvändigtvis analogt med kolfixeringshastigheten63,64. För att uppskatta kolbaserad primärproduktion bör elektronbehovet per CO2-fixering (C), som kan variera tidsmässigt och rumsligt5,48, undersökas vid bedömning av ämnessamhällen.

Om planktonnätet är igensatt av skräp, förskärmas av ett större nät, till exempel ett 5 mm nätnät, eller plocka zooplankton direkt från sjövattnet med hjälp av en pipett utan filtrering. Det bör noteras att vissa skador kan uppstå på de bifogade algerna även när filtreringen utförs försiktigt med en relativt stor (200 μm) maskstorlek. Även om resultaten visar att standardavvikelsen för PSII-parametrarna var liten (tabell 3), och medelvärdena för parametrarna var mycket lika dem i det odlade planktonstadiet (tabell 4), kan provtagning utan filtrering vara idealisk.

En annan begränsning av denna studie var härleder σ PSII. Aktiniskt ljus och Chl-a fluorescensdämpning kan utöva ett stort inflytande/förvrängning på FRRFs, som förlitar sig på optiskt tunna prover för den exakta σ PSII-bestämning65. Även om vi visade att S. mucronata inte påverkade σ PSII av planktonic Colacium celler, bör detta undersökas relaterade till σ PSII av bifogade Colacium celler. Dessutom skulle det behövas en spektralkorrigeringsfaktor (SCF) för uppskattningen σ PSII in situ66 eftersom ACT2-systemets excitationsvåglängd (444 nm) skiljer sig från den spektrala fördelningen av in situ-ljusmiljön. I allmänhet används filterdynatekniken för att mäta Chl-ett specifikt absorptionsspektrum för att beräkna SCF. Detta förfarande är nödvändigt för att uppskatta alg primärproduktiviteten med frrfs. Eftersom vi inte kunde skörda tillräckligt många bifogade Colaciumceller under studieperioden bör Chl-a-ett specifikt absorptionsspektrum undersökas i framtida studier.

Implementering av cuvette-typ FRRf bör bero på substratstorlek eftersom perifytiska alger kräver en substratfäste. Till exempel kan studier av alger på oförstörbara ämnen, såsom stenar67, större organismer26,68 eller symbiotiska alger, inklusive Symbiodinium i samband med hårda koraller10,69,70, kräva den dränkbara typen FRRf69. Omvänt, om basibiont är tillräckligt liten för att suspendera sig i en cuvette, kan en cuvette-typ FRRf vara tillräcklig förutom en cuvette-typ PAM, såsom bentiska alger16,17,18. Nyligen genomförda studier har faktiskt undersökt en cuvette-typ FRRf för att mäta fotofysiologi av isalger24,25. Genom att slå på excitationsblixten vid 512 och 633 nm kan dessutom appliceringen på cyanobakterier med olika PSII-antennpigment, fycoerythrins och fycocyaniner, och därmed olika absorptionstoppar med Chl-a71. Eftersom nuvarande FRRf-modeller som innehåller multiexcitationsvåglängder är användbara verktyg för att undersöka cyanobakteriers fotofysiologi och produktivitet7,66,72, bör dessa vara användbara metoder för att bedöma bentiska cyanobakterier, om effekterna av provtjocklek på fotofysiologiska parametrar skulle förbättras65 . I framtida studier bör FRRfs riktas till ett bredare spektrum av ämnesorganismer för att ge ytterligare insikt om algfotofysiologins komplexa mekanismer i olika livsmiljöer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga upplysningar att deklarera.

Acknowledgments

Arbetet stöddes av Collaborative Research Fund från Shiga Prefecture med titeln "Study on water quality and lake-bottom environment for the protection of the soundness of water environment" under Det japanska bidraget för regional vitalisering och miljöforsknings- och teknikutvecklingsfonden (nr 5-1607) vid miljöministeriet, Japan. https://www.kantei.go.jp/jp/singi/tiiki/tiikisaisei/souseikoufukin.html. Författarna vill tacka Enago (www.enago.jp) för den engelskspråkiga recensionen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrodisc syringe filter Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA 0.2 μm pore size
Act2Run CTG Ltd., West Molesey, UK
Biotin Wako 023-08711 AF-6 medium
CaCl2·2H2O Wako 031-25031 AF-6 medium
CaCO3 Wako 036-00382 AF-6 medium
Citric acid Wako 036-05522 AF-6 medium
CoCl2·6H2O Wako 036-03682 AF-6 medium
Concentrated Chlorella Recenttec, Tokyo, Japan 20 mg C·mL−1 ; store at 4 °C
FastOcean Act2 CTG Ltd., West Molesey, UK
Fe-citrate Wako 093-00952 AF-6 medium
FeCl3·6H2O Wako 091-00872 AF-6 medium
HCLP-880PF Nippon Medical and Chemical Instruments
 Co., Ltd., Osaka, Japan		 With LED light bulbs
K2HPO4 Wako 160-04292 AF-6 medium
KH2PO4 Wako 167-04241 AF-6 medium
MgSO4·7H2O Wako 137-00402 AF-6 medium
MnCl3·4H2O Wako 139-00722 AF-6 medium
Na2EDTA Wako 343-01861 AF-6 medium
Na2MoO4 Wako 196-02472 AF-6 medium
NaNO3 Wako 191-02542 AF-6 medium
NH4NO3 Wako 015-03231 AF-6 medium
Plankton Counter Matsunami Glass, Osaka, Japan S6300
Pylex test tube CTG Ltd., West Molesey, UK With rim, 16 x 100 mm
Vit. B1 Wako 203-00851 AF-6 medium
Vit. B12 Wako 226-00343 AF-6 medium
Vit. B6 Wako 165-05401 AF-6 medium
ZnSO4·7H2O Wako 264-00402 AF-6 medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolber, Z., Falkowski, P. G. Use of active fluorescence to estimate phytoplankton photosynthesis in situ. Limnology and Oceanography. 38 (8), 1646-1665 (1993).
  2. Kolber, Z. S., Prášil, O., Falkowski, P. G. Measurements of variable chlorophyll fluorescence using fast repetition rate techniques: defining methodology and experimental protocols. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1367 (1), 88-106 (1998).
  3. Oxborough, K., Moore, C. M., Suggett, D. J., Lawson, T., Chan, H. G., Geider, R. J. Direct estimation of functional PSII reaction center concentration and PSII electron flux on a volume basis: a new approach to the analysis of Fast Repetition Rate fluorometry (FRRf) data. Limnology and Oceanography: Methods. 10 (3), 142-154 (2012).
  4. Smyth, T. J., Pemberton, K. L., Aiken, J., Geider, R. J. A methodology to determine primary production and phytoplankton photosynthetic parameters from fast repetition rate fluorometry. Journal of Plankton Research. 26 (11), 1337-1350 (2004).
  5. Lawrenz, E., et al. Predicting the electron requirement for carbon fixation in seas and oceans. PLoS ONE. 8 (3), 58137 (2013).
  6. Zhu, Y., et al. Relationship between light, community composition and the electron requirement for carbon fixation in natural phytoplankton. Marine Ecology Progress Series. 580, 83-100 (2017).
  7. Schuback, N., Tortell, P. D. Diurnal regulation of photosynthetic light absorption, electron transport and carbon fixation in two contrasting oceanic environments. Biogeosciences. 16 (7), 1381-1399 (2019).
  8. Cosgrove, J., Borowitzka, M. A. Chlorophyll fluorescence terminology: an introduction. Chlorophyll a Fluorescence in Aquatic Sciences: Methods and Applications. , Springer. Dordrecht. 1-17 (2010).
  9. McKew, B. A., et al. The trade-off between the light-harvesting and photoprotective functions of fucoxanthin-chlorophyll proteins dominates light acclimation in Emiliania huxleyi (clone CCMP 1516). New Phytologist. 200 (1), 74-85 (2013).
  10. Warner, M. E., Lesser, M. P., Ralph, P. J. Chlorophyll fluorescence in reef building corals. Chlorophyll a Fluorescence in Aquatic Sciences: Methods and Applications. , Springer. Dordrecht. 209-222 (2010).
  11. Bhagooli, R., et al. Chlorophyll fluorescence - A tool to assess photosynthetic performance and stress photophysiology in symbiotic marine invertebrates and seaplants. Marine Pollution Bulletin. 165, 112059 (2021).
  12. Zavafer, A., Labeeuw, L., Mancilla, C. Global trends of usage of chlorophyll fluorescence and projections for the next decade. Plant Phenomics. 2020, 6293145 (2020).
  13. Goto, N., Tanaka, Y., Mitamura, O. Relationships between carbon flow through freshwater phytoplankton and environmental factors in Lake Biwa, Japan. Fundamental and Applied Limnology/Archiv für Hydrobiologie. 184 (4), 261-275 (2014).
  14. Napoléon, C., Raimbault, V., Claquin, P. Influence of nutrient stress on the relationships between PAM measurements and carbon incorporation in four phytoplankton species. PLOS ONE. 8 (6), 66423 (2013).
  15. Morris, E. P., Kromkamp, J. C. Influence of temperature on the relationship between oxygen- and fluorescence-based estimates of photosynthetic parameters in a marine benthic diatom (Cylindrotheca closterium). European Journal of Phycology. 38 (2), 133-142 (2003).
  16. Fraga, S., Rodríguez, F., Bravo, I., Zapata, M., Marañón, E. Review of the main ecological features affecting benthic dinoflagellate blooms. Cryptogamie, Algologie. 33 (2), 171-179 (2012).
  17. McMinn, A., et al. Quantum yield of the marine benthic microflora of near-shore coastal Penang, Malaysia. Marine and Freshwater Research. 56 (7), 1047-1053 (2005).
  18. Salleh, S., McMinn, A. The effects of temperature on the photosynthetic parameters and recovery of two temperate benthic microalgae, Amphora cf. coffeaeformis and Cocconeis cf. sublittoralis (Bacillariophyceae). Journal of Phycology. 47 (6), 1413-1424 (2011).
  19. McMinn, A., Pankowskii, A., Ashworth, C., Bhagooli, R., Ralph, P., Ryan, K. In situ net primary productivity and photosynthesis of Antarctic sea ice algal, phytoplankton and benthic algal communities. Marine Biology. 157 (6), 1345-1356 (2010).
  20. Garbary, D. J., Bird, C. J., Kim, K. Y. Sporocladopsis jackii, sp. nov. (Chroolepidaceae, chlorophyta): a new species from eastern Canada and Maine symbiotic with the mud snail, Ilyanassa obsoleta (Gastropoda). Rhodora. 107 (929), 52-68 (2005).
  21. Suggett, D. J., Oxborough, K., Baker, N. R., MacIntyre, H. L., Kana, T. M., Geider, R. J. Fast repetition rate and pulse amplitude modulation chlorophyll a fluorescence measurements for assessment of photosynthetic electron transport in marine phytoplankton. European Journal of Phycology. 38 (4), 371-384 (2003).
  22. Hughes, D. J., et al. Impact of nitrogen availability upon the electron requirement for carbon fixation in Australian coastal phytoplankton communities. Limnology and Oceanography. 63 (5), 1891-1910 (2018).
  23. Melrose, D. C., Oviatt, C. A., O'Reilly, J. E., Berman, M. S. Comparisons of fast repetition rate fluorescence estimated primary production and 14C uptake by phytoplankton. Marine Ecology Progress Series. 311, 37-46 (2006).
  24. Yoshida, K., Seger, A., Kennedy, F., McMinn, A., Suzuki, K. Freezing, melting, and light stress on the photophysiology of ice algae: ex situ incubation of the ice algal diatom Fragilariopsis cylindrus (Bacillariophyceae) using an ice tank. Journal of Phycology. 56 (5), 1323-1338 (2020).
  25. Selz, V., et al. Ice algal communities in the Chukchi and Beaufort Seas in spring and early summer: composition, distribution, and coupling with phytoplankton assemblages. Limnology and Oceanography. 63 (3), 1109-1133 (2018).
  26. Falasco, E., Bo, T., Ghia, D., Gruppuso, L., Bona, F., Fenoglio, S. Diatoms prefer strangers: non-indigenous crayfish host completely different epizoic algal diatom communities from sympatric native species. Biological Invasions. 20 (10), 2767-2776 (2018).
  27. Møhlenberg, F., Kaas, H. Colacium vesiculosum Ehrenberg (Euglenophyceae), infestation of planktonic copepods in the Western Baltic. Ophelia. 31 (2), 125-132 (1990).
  28. Zalocar, Y., Frutos, S. M., Casco, S. L., Forastier, M. E., Vallejos, S. V. Prevalence of Colacium vesiculosum (Colaciales: Euglenophyceae) on planktonic crustaceans in a subtropical shallow lake of Argentina. Revista De Biologia Tropical. 59 (3), 1295-1306 (2011).
  29. Barea-Arco, J., Pérez-Martínez, C., Morales-Baquero, R. Evidence of a mutualistic relationship between an algal epibiont and its host, Daphnia pulicaria. Limnology and Oceanography. 46 (4), 871-881 (2001).
  30. Decaestecker, E., Declerck, S., De Meester, L., Ebert, D. Ecological implications of parasites in natural Daphnia populations. Oecologia. 144 (3), 382-390 (2005).
  31. Allen, Y. C., Stasio, B. T. D., Ramcharan, C. W. Individual and population level consequences of an algal epibiont on Daphnia. Limnology and Oceanography. 38 (3), 592-601 (1993).
  32. Willey, R. L., Cantrell, P. A., Threlkeld, S. T. Epibiotic euglenoid flagellates increase the susceptibility of some zooplankton to fish predation. Limnology and Oceanography. 35 (4), 952-959 (1990).
  33. Green, J. Parasites and epibionts of Cladocera. The Transactions of the Zoological Society of London. 32 (6), 417-515 (1974).
  34. Evans, M. S., Sicko-Goad, L. M., Omair, M. Seasonal occurrence of Tokophrya quadripartita (Suctoria) as epibionts on adult Limnocalanus macrurus (Copepoda: Calanoida) in southeastern Lake Michigan. Transactions of the American Microscopical Society. 98 (1), 102-109 (1979).
  35. Chiavelli, D. A., Mills, E. L., Threlkeld, S. T. Host preference, seasonality, and community interactions of zooplankton epibionts. Limnology and Oceanography. 38 (3), 574-583 (1993).
  36. Willey, R. L., Willey, R. B., Threlkeld, S. T. Planktivore effects on zooplankton epibiont communities: epibiont pigmentation effects. Limnology and Oceanography. 38 (8), 1818-1822 (1993).
  37. Rosowski, J. R., Willey, R. L. Colacium libellae sp. nov. (euglenophyceae), a photosynthetic inhabitant of the larval damselfly rectum. Journal of Phycology. 11 (3), 310-315 (1975).
  38. Willey, R. L., Threlkeld, S. T. Organization of crustacean epizoan communities in a chain of subalpine ponds. Limnology and Oceanography. 38 (3), 623-627 (1993).
  39. Al-Dhaheri, R. S., Willey, R. L. Colonization and reproduction of the epibiotic flagellate Colacium vesiculosum (euglenophyceae) on Daphnia pulex. Journal of Phycology. 32 (5), 770-774 (1996).
  40. Rosowski, J. R. Photosynthetic euglenoids. Freshwater Algae of North America. , Elsevier Science. USA. 383-422 (2003).
  41. Rosowski, J. R., Kugrens, P. Observations on the euglenoid Colacium with special reference to the formation and morphology of attachment material. Journal of Phycology. 9 (4), 370-383 (1973).
  42. Salmaso, N., Tolotti, M. Other phytoflagellates and groups of lesser importance. Encyclopedia of Inland Waters. , Academic Press. 174-183 (2009).
  43. Threlkeld, S. T., Chiavelli, D. A., Willey, R. L. The organization of zooplankton epibiont communities. Trends in Ecology & Evolution. 8 (9), 317-321 (1993).
  44. Bertolo, A., Rodríguez, M. A., Lacroix, G. Control mechanisms of photosynthetic epibionts on zooplankton: an experimental approach. Ecosphere. 6 (11), (2015).
  45. Pringsheim, E. G. Notiz über Colacium (Euglenaceae). Österreichische Botanische Zeitschrift. 100 (3), 270-275 (1953).
  46. Wołowski, K., Duangjan, K., Peerapornpisal, Y. Colacium minimum (Euglenophyta), a new epiphytic species for Asia. Polish Botanical Journal. 60 (2), 179-185 (2015).
  47. Martin, J. H., Knauer, G. A. The elemental composition of plankton. Geochimica et Cosmochimica Acta. 37 (7), 1639-1653 (1973).
  48. Kazama, T., Hayakawa, K., Kuwahara, V. S., Shimotori, K., Imai, A., Komatsu, K. Development of photosynthetic carbon fixation model using multi-excitation wavelength fast repetition rate fluorometry in Lake Biwa. PLOS ONE. 16 (2), 0238013 (2021).
  49. Chesney, T., Sastri, A. R., Beisner, B. E., Nandini, S., Sarma, S. S. S., Juneau, P. Application of fluorometry (Phyto-PAM) for assessing food selection by cladocerans. Hydrobiologia. 829 (1), 133-142 (2019).
  50. Wang, Q., Yang, S., Wan, S., Li, X. The significance of calcium in photosynthesis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1353 (2019).
  51. Dau, H., Haumann, M. Eight steps preceding O-O bond formation in oxygenic photosynthesis-A basic reaction cycle of the photosystem II manganese complex. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1767 (6), 472-483 (2007).
  52. Suthers, I., Bowling, L., Kobayashi, T., Rissik, D. Sampling methods for plankton. Plankton: A guide to their ecology and monitoring for water quality. , CSIRO Publishing. Melbourne. 63-90 (2019).
  53. Błędzki, L. A., Rybak, J. I. Freshwater Crustacean Zooplankton of Europe: Cladocera & Copepoda (Calanoida, Cyclopoida) Key to species identification, with notes on ecology, distribution, methods and introduction to data analysis. , Springer. Switzerland. (2016).
  54. Kato, S. Laboratory culture and morphology of Colacium vesiculosum Ehrb. (Euglenophyceae). Japanese Journal of Phycology (Sorui). 30, 63-67 (1982).
  55. Serôdio, J., Campbell, D. A. Photoinhibition in optically thick samples: Effects of light attenuation on chlorophyll fluorescence-based parameters. Journal of Theoretical Biology. 513, 110580 (2021).
  56. Sylvan, J. B., Quigg, A., Tozzi, S., Ammerman, J. W. Eutrophication-induced phosphorus limitation in the Mississippi River plume: evidence from fast repetition rate fluorometry. Limnology and Oceanography. 52 (6), 2679-2685 (2007).
  57. Browning, T. J., et al. P. Nutrient regulation of late spring phytoplankton blooms in the midlatitude North Atlantic. Limnology and Oceanography. 65 (6), 1136-1148 (2020).
  58. Pausch, F., Bischof, K., Trimborn, S. Iron and manganese co-limit growth of the Southern Ocean diatom Chaetoceros debilis. PLOS ONE. 14 (9), 0221959 (2019).
  59. Ferroni, L., Baldisserotto, C., Fasulo, M. P., Pagnoni, A., Pancaldi, S. Adaptive modifications of the photosynthetic apparatus in Euglena gracilis Klebs exposed to manganese excess. Protoplasma. 224 (3), 167-177 (2004).
  60. Gaiser, E. E., Bachmann, R. W. Seasonality, substrate pereference and attachment sites of epizoic diatoms on cladoceran zooplankton. Journal of Plankton Research. 16 (1), 53-68 (1994).
  61. Totti, C., et al. The diversity of epizoic diatoms: relationships between diatoms and marine invertebrates. The Diversity of Epizoic Diatoms. 16, 323-343 (2011).
  62. Perkins, M., Effler, S. W., Strait, C. M. Phytoplankton absorption and the chlorophyll a-specific absorption coefficient in dynamic Onondaga Lake. Inland Waters. 4 (2), 133-146 (2014).
  63. Kromkamp, J., Capuzzo, E., Philippart, C. J. M. Measuring phytoplankton primary production: review of existing methodologies and suggestions for a common approach. EcApRHA Deliverable WP 3.2. 28, (2017).
  64. Hughes, D., et al. Roadmaps and detours: active chlorophyll-a assessments of primary productivity across marine and freshwater systems. Environmental Science & Technology. 52 (21), 12039-12054 (2018).
  65. Perkins, R. G., et al. The application of variable chlorophyll fluorescence to microphytobenthic biofilms. Chlorophyll a Fluorescence in Aquatic Sciences: Methods and Applications. 4, Springer. Dordrecht. 237-275 (2010).
  66. Schuback, N., Flecken, M., Maldonado, M. T., Tortell, P. D. Diurnal variation in the coupling of photosynthetic electron transport and carbon fixation in iron-limited phytoplankton in the NE subarctic Pacific. Biogeosciences. 13 (4), 1019-1035 (2016).
  67. Schreiber, U., Gademann, R., Ralph, P. J., Larkum, A. W. D. Assessment of photosynthetic performance of Prochloron in Lissoclinum patella in hospite by chlorophyll fluorescence measurements. Plant and Cell Physiology. 38 (8), 945-951 (1997).
  68. Garbary, D. J., Miller, A. G., Scrosati, R. A. Ascophyllum nodosum and its symbionts: XI. The epiphyte Vertebrata lanosa performs better photosynthetically when attached to Ascophyllum than when alone. Algae. 29 (4), 321-331 (2014).
  69. Gorbunov, M. Y., Kolber, Z. S., Lesser, M. P., Falkowski, P. G. Photosynthesis and photoprotection in symbiotic corals. Limnology and Oceanography. 46 (1), 75-85 (2001).
  70. Yellowlees, D., Warner, M. Photosynthesis in symbiotic algae. Photosynthesis in Algae. 14, Springer. Dordrecht. 437-455 (2003).
  71. Wojtasiewicz, B., Stoń-Egiert, J. Bio-optical characterization of selected cyanobacteria strains present in marine and freshwater ecosystems. Journal of Applied Phycology. 28 (4), 2299-2314 (2016).
  72. Aardema, H. M., Rijkeboer, M., Lefebvre, A., Veen, A., Kromkamp, J. C. High-resolution underway measurements of phytoplankton photosynthesis and abundance as an innovative addition to water quality monitoring programs. Ocean Science. 15 (5), 1267-1285 (2019).

Tags

Biologi Nummer 177 bänkskiva FRRf Colacium sp. epibiont epizoiska alger Lake Biwa fotofysiologi
Mätning av fotofysiologi av bifogat stadium av <em>Colacium</em> sp. med en Cuvette-typ snabb repetitionshastighet fluorometer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kazama, T., Hayakawa, K., Shimotori, … More

Kazama, T., Hayakawa, K., Shimotori, K., Imai, A. Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer. J. Vis. Exp. (177), e63108, doi:10.3791/63108 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter