Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Misurazione della fotofisiologia dello stadio collegato di Colacium sp. da un fluorometro a velocità di ripetizione rapida di tipo cuvetta

Published: November 12, 2021 doi: 10.3791/63108
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2, 1
1Lake Biwa Branch Office, National Institute for Environmental Studies, 2Center for Regional Environmental Research, National Institute for Environmental Studies, 3Graduate School of Human Development and Environment, Kobe University, 4Lake Biwa Environmental Research Institute

Summary

Il fluorometro a velocità di ripetizione rapida (FRRf) è un metodo utile per misurare la fotofisiologia del fotosistema II e la produttività primaria. Qui descriviamo un protocollo per misurare la fotofisiologia PSII dell'alga epizoica, Colacium sp. su substrato zooplancton utilizzando FRRf di tipo cuvetta.

Abstract

Il fluorometro a velocità di ripetizione rapida (FRRf) è un metodo utile per misurare la fotofisiologia del fotosistema II (PSII) e la produttività primaria. Sebbene FRRf possa misurare la sezione trasversale di assorbimento PSII (σ PSII), la massima efficienza fotochimica (Fv / Fm), l'efficienza fotochimica efficace (Fq ′ / Fm′) e la tempra non fotochimica (NPQNSV) per varie alghe eucariotiche e cianobatteri, quasi tutti gli studi FRRf fino ad oggi si sono concentrati sul fitoplancton. Qui, il protocollo descrive come misurare la fotofisiologia PSII di un'alga epizoica Colacium sp. Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), nel suo stadio annesso (attaccato allo zooplancton), usando FRRf di tipo cuvetta. In primo luogo, abbiamo stimato gli effetti dello zooplancton substrato (Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776, Cladocera, Daphniidae) sulla fluorescenza basale e σ PSII, Fv/Fm, Fq′/Fm′ e NPQNSV del planctonico Colacium sp. Per convalidare questa metodologia, abbiamo registrato misurazioni fotofisiologiche di Colacium sp. allegato su S. mucronata e confrontato questi risultati con il suo stadio planctonico. I risultati rappresentativi hanno mostrato come il protocollo potrebbe determinare gli effetti del calcio (Ca) e del manganese (Mn) sulla fotofisiologia di Colacium sp. e identificare i vari effetti dell'arricchimento di Mn tra stadi attaccati e planctonici. Infine, discutiamo l'adattabilità di questo protocollo ad altre alghe perifite.

Introduction

La fluorescenza variabile della clorofilla è uno strumento utile per misurare la fotofisiologia del fotosistema algale II (PSII). Le alghe rispondono a vari stress ambientali, come l'eccesso di luce e la carenza di nutrienti, alterando la loro fotofisiologia PSII. Il fluorometro a velocità di ripetizione rapida (FRRf) è un metodo comune per misurare la fotofisiologia PSII1,2 e stimare la produttività primaria1,3,4, che consente di monitorare la fotofisiologia del fitoplancton PSII e la produttività primaria su ampie scale spaziali e temporali5,6,7. FRRf può misurare simultaneamente la sezione trasversale di assorbimento PSII (σ PSII), la concentrazione del centro di reazione ([RCII]), la massima efficienza fotochimica (Fv / Fm), l'efficienza fotochimica efficace (Fq ′ / Fm′) e la tempra non fotochimica (NPQNSV) (Tabella 1). In generale, Fv/Fm e Fq′/Fm′ sono definiti come attività PSII8, mentre NPQNSV è definito come energia relativa dissipata dal calore9.

È importante sottolineare che i flash a singolo turnover (ST) di FRRf riducono completamente l'accettore di elettroni chinoni primari, QA, ma non il pool di plastochinoni. Al contrario, i flash di rotazione multipla (MT) da un fluorometro a modulazione di ampiezza dell'impulso (PAM) possono ridurre entrambi. Il metodo ST ha un chiaro vantaggio rispetto al metodo MT nell'identificare le possibili origini di NPQNSV misurando contemporaneamente la cinetica di recupero di Fv/Fm, Fq′/Fm′, NPQNSV e σ PSII10. Ad oggi, diversi tipi di strumenti FRRf, come il tipo sommergibile, il tipo cuvetta e il tipo flow-through, sono disponibili in commercio. Il FRRf di tipo sommergibile consente misurazioni in situ in oceani e laghi, mentre il FRRf di tipo cuvetta è adatto per misurare piccoli volumi di campioni. Il tipo flow-through è comunemente usato per misurare continuamente la fotofisiologia del fitoplancton nelle acque superficiali.

Dato lo sviluppo di fluorometri PAM, incluso il tipo a cuvetta, per una vasta gamma di soggetti11, i fluorometri PAM sono ancora più comuni dei FRRf nella ricerca di fotofisiologia algale12. Ad esempio, sebbene la struttura della camera del campione e la capacità della cuvetta tra questi strumenti differiscano solo leggermente, il PAM di tipo cuvetta è stato applicato ai fitoplancton13,14,15, alle microalghe bentoniche16,17,18, alle alghe ghiacciate19 e alle alghe epizoiche20, mentre la FRRf di tipo cuvetta è stata applicata principalmente ai fitoplancton21,22,23 e un numero limitato di comunità algali di ghiaccio24,25. Data la sua efficacia, il FRRf di tipo cuvetta è ugualmente applicabile alle alghe bentoniche ed epizoiche. Pertanto, l'espansione della sua applicazione fornirà una notevole comprensione della fotofisiologia PSII, in particolare per la fotofisiologia algale epizoica meno conosciuta.

Le alghe epizoiche hanno ricevuto poca attenzione, con pochi studi che esaminano la loro fotofisiologia PSII20,26, molto probabilmente a causa dei loro ruoli minori nelle reti alimentari acquatiche27,28. Tuttavia, gli epibionti, comprese le alghe epizoiche, possono influenzare positivamente le dinamiche della comunità dello zooplancton, come l'aumento dei tassi di riproduzione e sopravvivenza29,30, nonché i processi di impatto negativo, come l'aumento del tasso di affondamento29,31 e la vulnerabilità ai predatori visivi32,33,34,35,36 . Pertanto, è fondamentale esplorare i fattori ambientali e biologici che controllano le dinamiche epibionti nelle comunità di zooplancton.

Tra le alghe epizoiche, Colacium Ehrenberg 1834 (Euglenophyta) è un gruppo algale comune, d'acqua dolce32,37,38,39 con vari stadi di vita, tra cui annesso (Figura 1A-D), planctonico non mobile (Figura 1E,F) e stadio planctonico mobile40,41 . Durante lo stadio planctonico non mobile, le cellule vivono come plancton unicellulari, colonie aggregate o colonie di fogli monostrato, coperte da mucillagini42. Nella fase attaccata, Colacium sp. utilizza mucillagini escrete dall'estremità anteriore della cellula37,39,41 per attaccarsi agli organismi substrati (basibionti), in particolare ai microcrustaceani41,43. Il loro ciclo vitale comporta anche il distacco dall'esoscheletro fuso o dal basibionte morto e il nuoto con i loro flagelli per trovare un altro organismo substrato39. Sia gli stadi planctonici che quelli attaccati possono aumentare le dimensioni della popolazione di mitosi40. Sebbene il loro stadio collegato sia ipotizzato come un tratto evolutivo per la raccolta di risorse, come la luce44 e gli oligoelementi41,45,46, o come strategia di dispersione27, sono disponibili poche prove sperimentali su questi aspetti37,41,44 e i meccanismi di attaccamento chiave sono in gran parte sconosciuti. Ad esempio, Rosowski e Kugrens si aspettavano che Colacium ottenesse manganese (Mn) dai copepodi del substrato41, concentrati nell'esoscheletro47.

Qui, descriviamo come misurare la fotofisiologia PSII delle alghe planctoniche e il relativo metodo di applicazione per il targeting delle alghe attaccate (che si attaccano allo zooplancton) con le cellule colacium sp. usando il FRRf di tipo cuvetta. Utilizziamo il sistema Act2 dotato di tre diodi emettitori di luce (LED) che forniscono energia di eccitazione del flash centrata a 444 nm, 512 nm e 633 nm48. Qui, 444 nm (blu) corrisponde al picco di assorbimento della corofilla a (Chl-a), mentre 512 nm (verde) e 633 nm (arancione) corrispondono ai picchi di assorbimento della ficoeritrina e della ficocianina, rispettivamente. Il picco di rilevamento del segnale fluorescente è di 682 nm con una mezza larghezza di banda di 30 nm. Poiché è difficile trovare lo stadio planctonico di Colacium sp. in ambienti naturali, il loro stadio attaccato è stato raccolto per gli esperimenti. Tra i numerosi organismi substrato, Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776 (Branchiopoda, Daphniidae; La Figura 1A, B, G) è una delle più semplici da gestire a causa della loro bassa velocità di nuoto, delle grandi dimensioni del corpo (400-650 μm) e del comportamento unico (appeso a testa in giù sulla superficie dell'acqua). Pertanto, questo protocollo utilizza Colacium sp. attaccato su S. mucronata come caso di studio del sistema Colacium-basibiont. Per evitare la fluorescenza derivata dal contenuto intestinale, S. mucronata è stata affamata. Poiché uno studio precedente ha riportato che il segnale di fluorescenza dal contenuto intestinale (alghe ingerite) mostra una diminuzione di cinque volte dopo 40 min49, ci aspettavamo che 90 minuti di fame sarebbero stati sufficienti per ridurre al minimo la possibilità che la fluorescenza del contenuto intestinale influenzasse la misurazione FRRf con effetti minimi di stress sperimentale a Colacium sp., come la carenza di nutrienti. Inoltre, questo protocollo è stato applicato per chiarire il meccanismo di attacco di Colacium sp. e determinare come due metalli, calcio (Ca) e manganese (Mn) influenzano la fotofisiologia di entrambi gli stadi planctonici e attaccati. Il calcio svolge un ruolo chiave nelle vie fotosintetiche50 in diversi modi, ed entrambi i metalli sono necessari per costruire i complessi in evoluzione dell'ossigeno del PSII51. Poiché il calcio e il manganese sono altamente concentrati nel carapace dello zooplancton dei crostacei47, ipotizziamo che la fotofisiologia di Colacium sp. potrebbe rispondere in modo più prominente all'arricchimento di Ca e Mn durante lo stadio planctonico se questa fase di vita ottiene questi elementi da S. mucronata durante lo stadio attaccato.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Campionamento

  1. Raccogli l'acqua del lago dalla superficie con un secchio. Per colpire Colacium sp. attaccato a S. mucronata (Figura 1A-C) filtrare 0,5-10 L di acqua di lago utilizzando una rete a rete di nylon da 100 μm52.
    NOTA: S. mucronata spesso si aggrega densamente in acque poco profonde, eutrofiche, fangose, come tra le aree di canna (phragmites).
  2. Conservare i campioni concentrati in bottiglie di plastica da 500 ml con 350 ml di acqua di lago. Conservare in condizioni di oscurità.
  3. In laboratorio, versare l'acqua del campione in un becher da 500 ml e lasciarlo depositare per alcuni minuti.
  4. Filtrare l'acqua del lago attraverso un filtro di dimensioni dei pori di 0,2 μm.
  5. Raccogli S. individui mucronata che usano una pipetta al microscopio ottico con ingrandimento 100x. Eseguire l'identificazione delle specie secondo Błędzki e Rybak53.
  6. Trasferirli in una goccia di acqua di lago filtrata (FLW) da 0,2 μm posta su un vetrino.
    NOTA: S. mucronata può nuotare in superficie o attaccarsi alla parete del becher.
  7. Controllare S. mucronata al microscopio ottico.
  8. Lavare S. individui mucronata che usano FLW (3 gocce o più) per prevenire la contaminazione da altri organismi (Figura 2).
  9. Mantenere S. mucronata ad una temperatura in situ in una camera di crescita inferiore a 40 μmol fotone·m−2·s−1.

2. Effetti di S . mucronata alla fluorescenza basale

  1. S. coltivazione mucronata
    1. Prelevare gli individui di S. mucronata usando una pipetta al microscopio ottico con ingrandimento 100x e lavare con FLW, come nel passaggio 1.8.
    2. Aerare l'acqua del rubinetto utilizzando una pompa dell'aria elettrica tramite una pietra d'aria per almeno 1 settimana. Versare 300 ml di acqua di rubinetto aerata in un barattolo di vetro da 350 ml.
    3. Nutrire la clorella (1 mg C·L−1) e mantenere a 20 °C sotto 40 μmol fotone·m−2·s−1 in una camera di crescita.
    4. Dopo circa 14 giorni, raccogliere 5-30 individui usando una pipetta al microscopio ottico con ingrandimento 100x e inocularli in 300 ml di acqua di rubinetto pulita e aerata per mantenere il mezzo fresco.
  2. Configurazione di FRRf
    1. Avvia il software Act2Run.
    2. Fare clic sulla scheda Opzioni e selezionare Act2 FLC (LED bianchi) in Modalità di funzionamento per impostare il colore dei LED attinici.
    3. Fare clic sul valore di Buio al passaggio 1 delle impostazioni della curva di luce fluorescente nella finestra principale e digitare 30 per impostare la durata del periodo di buio (Figura 3A).
    4. Fare clic sulla combinazione di LED B, C e D per disattivare i LED verdi e arancioni (Figura 3C).
    5. Fare clic sul valore di Fets e Pitch in Sat e digitare rispettivamente 100 e 2 per impostare il numero e il pitch del flashlet nella fase di saturazione (Figura 3D).
    6. Fare clic sul valore di Fets e Pitch sotto Rel e digitare rispettivamente 40 e 60 per impostare il numero e il pitch del flashlet nella fase di rilassamento (Figura 3E).
    7. Attivare la pompa a camicia d'acqua facendo clic su During FLC (Figura 3F) per controllare la temperatura del campione durante la misurazione.
    8. Attivare facendo clic su Auto-LED e Auto-PMT (Figura 3F).
    9. Fare clic su Sincronizza per connettersi a FRRf-Act2.
  3. Misure FRRf
    1. Per esaminare gli effetti degli individui di zooplancton sulla fluorescenza basale, preparare S adulto. mucronata (dimensioni corporee 400-650 μm) dalla coltura nei passaggi 2.1.1-2.1.4 senza organismi attaccati.
    2. Per evitare la fluorescenza dal contenuto intestinale, affamare gli individui in FLW a 20 ° C per almeno 90 minuti.
    3. Versare 1,5 ml di FLW in una cuvetta. Raccogli individui con 0, 1, 5 e 10 S. mucronata usando una pipetta al microscopio ottico con ingrandimento 100x.
    4. Trasferimento S. mucronata individui nella cuvetta e aggiungere FLW per portare il campione fino a 2 ml.
    5. Acclimatarsi in condizioni di scarsa illuminazione (1-10 μmol foton·m−2·s−1) a 20 °C per 15 minuti prima della misurazione FRRf.
    6. Fare clic su Act2 Run per avviare la misurazione. Ripetere le misurazioni >3 volte per campione.
    7. Leggere il valore Fo dal grafico dei risultati (Figura 4).

3. Effetti dell'organismo substrato sulla fluorescenza Chl- a

  1. Colacium sp. coltivazione
    1. Preparare il FLW e l'AF-6 medium54 per la coltivazione (Tabella 2).
    2. Raccogliere Colacium sp. attaccato a S. mucronata come nei passaggi 1.1 e 1.2 e, mantenere a temperatura in situ in una camera di crescita.
    3. Prelevare Colacium sp. con un carapace fuso (Figura 1D) utilizzando una pipetta al microscopio ottico con ingrandimento 100x. Lavarli con FLW, come nel passaggio 1.8.
    4. Inoculare inoculare asetticamente Colacium sp. e AF-6 medium in un tubo di vetro da 10 ml su un banco pulito.
    5. Mantenere la coltura a temperatura in situ sotto 200 μmol fotone·m−2·s−1 in una camera di crescita. Agitare delicatamente il tubo di vetro a mano almeno una volta al giorno per evitare l'insediamento cellulare.
      NOTA: Per mantenere l'effetto di attenuazione delle colonie aggregate il più basso possibile, controllare le colonie al microscopio prima della misurazione FRRf. L'aggregazione cellulare può causare colonie dense e influenzare la fotofisiologia algale55.
  2. Misure FRRf
    1. Per esaminare gli effetti degli individui di zooplancton sulla fluorescenza Chl-a da Colacium sp., preparare S adulto. mucronata (dimensioni corporee 400-650 μm) senza organismi attaccati.
    2. Per evitare la fluorescenza dal contenuto intestinale, affamare gli individui in FLW per almeno 90 minuti.
    3. Impostare un fluorometro a velocità di ripetizione rapida di tipo cuvetta (FRRf).
    4. Versare un sottocampione da 1,5 ml di Colacium sp. precolto in una cuvetta. Trasferisci 0, 5, 10 e 15 S. mucronata individui in queste cuvette e aggiungere 2 μm di mezzo filtrato per portare il campione fino a 2 ml.
    5. Acclimatarsi in condizioni di scarsa illuminazione (1-10 μmol fotone·m−2·s−1) a 20 °C per 15 minuti prima di effettuare la misurazione FRRf.
      NOTA: Mantenere i campioni alla temperatura di incubazione durante le misurazioni
    6. Fare clic su Act2 Run per avviare la misurazione. Ripetere le misurazioni >3 volte per campione.
    7. Leggere i valori FO e Fm dal grafico dei risultati (Figura 4).
      NOTA: Controllare il valore RσPSII (Tabella 1), che mostra se la potenza del LED rientra nell'intervallo ottimale per stimare correttamente i parametri PSII. Quando l'Auto-LED è attivato, il sistema Act2run controlla la potenza del LED per ottenere un intervallo RσPSII ottimale (0,042-0,064). Il valore di cut-off sperimentale RσPSII è stato definito a 0,03 e 0,08 in uno studio precedente48.
    8. Per correggere la fluorescenza basale22, filtrare il terreno di coltura utilizzando un filtro di dimensioni dei pori di 0,2 μm e misurare la fluorescenza. Sottrarre FO del campione di base da FO e Fm di Colacium sp. oppure modificare il valore di correzione Blank nelle Impostazioni della scheda Opzioni.

4. Fotofisiologia di Colacium sp. (stadio allegato)

  1. Isolare gli individui di S. mucronata con Colacium sp. usando una pipetta al microscopio ottico.
  2. Lavare S. mucronata utilizzando FLW, come nel passaggio 1.8.
  3. Trasferimento S. mucronata in un 100 mL di FLW. Per la fame, tenere in condizioni di oscurità a temperatura in situ per 90 minuti.
  4. Versare 1,5 ml di FLW in una cuvetta.
  5. Trasferimento ~10 S. mucronata individui con Colacium sp. in una cuvetta. Per le misurazioni sono necessarie più di 100 cellule di Colacium per 2 ml. Aggiungere FLW per portare il campione fino a 2 ml.
  6. Acclimatarsi in condizioni di scarsa illuminazione (1-10 μmol fotone·m−2·s−1) a temperatura in situ per 15 min. Misurare la fluorescenza Chl-a come nei passaggi 3.2.6-3.2.8.
  7. Per enumerare il numero di cellule attaccate, fissare il campione con glutaraldeide (volume finale del 2%) dopo aver effettuato la misurazione FRRf. Scatta foto a diverse profondità focali e posizioni di S. mucronata al microscopio ottico.

5. Fotofisiologia del Colacium sp. (stadio planctonico)

  1. Coltivare Colacium sp. campionato in mezzo AF-6 a temperatura in situ come nei passaggi 3.1.1-3.1.5.
  2. Per la fase stazionaria, prendere 2 ml di Colacium sp. coltivato e versare in una cuvetta.
  3. Acclimatarsi in condizioni di scarsa illuminazione (1-10 μmol fotone·m−2·s−1) a temperatura in situ per 15 min. Misurare la fluorescenza Chl-a come nei passaggi 3.2.6-3.2.8.

6. Effetti dell'addizione di Ca e Mn sulla fotofisiologia di Colacium sp.

  1. Effetti sul palco collegato
    1. Isolare gli individui di S. mucronata con Colacium sp. usando una pipetta al microscopio ottico. Lavare con FLW, come nel passaggio 1.8.
    2. Trasferire sei individui ciascuno in 12 bicchieri di vetro con 30 ml di FLW. Assicurarsi che ogni becher contenga >100 cellule colacium sp.
    3. Aggiungere 200 μmol· L−1 CaCl2· H2O (trattamento Ca), 40 μmol· L−1 MnCl4 (trattamento Mn), o acqua ultrapura (controllo) a ciascun becher. Incubare i campioni sotto 200 μmol fotoni·m−2 ·s−1 a temperatura in situ in una camera di crescita.
    4. A 3 h e 21 h, trasferire tutti gli individui e le pelli mutate in una cuvetta con 2 ml del mezzo.
    5. Per esaminare la risposta rapida all'aumento della luce, fare clic su Su dei periodi di 8 passi di luce attinica e digitare 20 (Figura 3A) per impostare la durata di ciascun passaggio in 20 s. Per impostare la luce attinica graduale come 0, 11, 25, 44, 68, 101, 144 e 200 μmol foton·m−2·s−1, fare clic su High E e Step Up e modificare i valori rispettivamente in 200 e 34 (Figura 3B).
    6. Dopo 15 minuti di acclimatazione scura, misurare la fluorescenza Chl-a di ciascun campione in modo simile ai passaggi 3.2.6-3.2.8.
      NOTA: verificare che i valori RσPSII e RσPSII' rientrino nell'intervallo ottimale (0,03-0,08)48.
  2. Effetti sullo stadio planctonico
    1. Coltivare Colacium sp. campionato in mezzo AF-6 a temperatura in situ come nei passaggi 3.1.1-3.1.5.
    2. Trasferire il Colacium sp. coltivato in FLW e acclimatarsi a temperatura in situ inferiore a 200 μmol fotone·m−2·s−1 per 3 giorni.
    3. Trasferire 1 mL dei campioni acclimatati in tre flaconcini di vetro con 10 mL di FLW.
    4. Aggiungere 200 μmol· L−1 CaCl2· H2O (trattamento Ca), 40 μmol· L−1 MnCl3 (trattamento Mn) o acqua ultrapura (controllo) ai flaconcini. Incubare i campioni sotto 200 μmol fotoni·m−2·s−1 a temperatura in situ in una camera di crescita.
    5. A 3 ore e 21 ore, misurare la fluorescenza Chl-a di ciascun campione come nei passaggi 3.2.6-3.2.8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Non vi è stato alcun effetto significativo della fluorescenza al basale (Figura 5) o della fluorescenza Chl-a (Figura 6) da parte di S. mucronata fino a 5 individui (inds.) mL−1. Tuttavia, Fv/Fm e NPQNSV sono stati significativamente colpiti quando S. mucronata era di 7,5 inds·mL−1. Pertanto, per misurare la fotofisiologia di Colacium sp. durante la fase annessa, abbiamo scelto S. mucronata con il carico più elevato di Colacium sp. al fine di raggiungere una sufficiente abbondanza di Colacium sp. (>50 cellule·mL−1) e un basso numero di S. mucronata (≤5 inds·mL−1) nella cuvetta.

La tabella 3 mostra la variazione stagionale della fotofisiologia di Colacium sp. durante la fase allegata. Sebbene la temperatura di campionamento variasse, la loro fotofisiologia è rimasta relativamente costante. σ PSII variava da 3,42 nm2 a 3,76 nm2 (media 3,60 nm2), Fv/Fm variava da 0,52 a 0,60 (media 0,55) e NPQNSV variava da 0,66 a 0,85 (media 0,82). Per convalidare questi risultati, abbiamo ulteriormente studiato le variazioni nella fotofisiologia di Colacium sp. durante lo stadio planctonico per la fase stazionaria nel mezzo AF-6 (Tabella 4). Fv/Fm e NPQNSV medi per lo stadio attaccato erano simili a quelli dello stadio planctonico quando incubati nel mezzo AF-6.

Per determinare l'effetto di Ca e Mn sulla fotofisiologia di Colacium sp. sia nello stadio annesso che in quello planctonico, abbiamo eseguito esperimenti di arricchimento di Ca e Mn. I campioni sono stati prelevati dall'area di canna del lago Biwa il 7 maggio 2021. Per lo stadio collegato di Colacium sp. in condizioni di oscurità, non vi è stata alcuna differenza significativa nei parametri fotofisiologici tra i trattamenti, ad eccezione di NPQNSV tra i trattamenti Mn e Ca a 3 h, dove Ca < Mn (Figura 7A,C,E). Inoltre, le risposte σ PSII′, Fq′/Fm′ e NPQNSV all'aumento della luce durante la fase allegata non hanno mostrato chiare differenze tra i trattamenti (Figura 8A,C,E e Figura 9A,C,E). Tuttavia, NPQNSV tendeva ad essere inferiore nel trattamento con Ca rispetto al controllo a bassa intensità luminosa a 21 h (11 e 25 μmol photon·m−2·s−1, Figura 9E). Per lo stadio planctonico, σ PSII è risultato significativamente inferiore nel trattamento con Mn rispetto a Ca a 3 ore (Figura 7B). Fq′/Fm′ era significativamente più alto, ma NPQNSV era più basso nel trattamento Mn rispetto al controllo a 21 h (Figura 7D,F). Sotto l'aumentare della luce, Mn tendeva a diminuire σ PSII e aumentare Fq′/Fm′ durante lo stadio planctonico, rispetto al controllo a 3 h (Figura 8D). Allo stesso modo, Mn ha ridotto significativamente NPQNSV durante la fase planctonica rispetto al controllo a 21 h (Figura 9F). Simile allo stadio collegato, il calcio ha leggermente migliorato NPQNSV per lo stadio planctonico sotto luce crescente (Figura 9F). Tuttavia, Ca ha diminuito Fq′/Fm′ e aumentato NPQNSV per lo stadio planctonico rispetto al trattamento Mn sotto 44-200 μmol fotoni·m−2·s−1 a 3 h (Figura 8D,F).

Figure 1
Figura 1: Colacium sp. e organismo della sostanza Scapholeberis mucronata. (A) S. mucronata infetta. (B) S. mucronata infetta fissata con glutaraldeide. (C) Cellule di Colacium attaccate su S. mucronata vivente. (D) Cellule di Colacium attaccate sul carapace fuso. (E, F) Colacium sp. di stadio planctonico (palmella). (G) S. mucronata non infetta. Le frecce indicano le cellule di Colacium. Barre di scala: 200 μm (A, B e G), 10 μm (C, E e F) e 100 μm (D). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Lavaggio dello zooplancton mediante pipettaggio sotto l'acqua filtrata del lago (FLW). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Interfaccia utente del software Act2Run. (A) Tempo di esposizione a ciascun gradino della luce attinica; (B) Numero di passi e flusso fotonico della luce attinica; (C) Combinazione di lunghezza d'onda di eccitazione; (D) Sequenza flashlet di saturazione e rilassamento; E) frequenze e intensità della camicia d'acqua e delle pompe di miscelazione dei campioni; (F) Flusso fotonico del flash di eccitazione a 444 (indicato come 450 qui), 512 (530) e 633 nm (624), tensione del tubo fotomoltiplicatore (PMT) e repliche e intervallo di sequenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Lettura fluorescente del campione algale sul software Act2Run. Le linee rosse e blu indicano il segnale di fluorescenza grezza da una sequenza di flashlet e curve che si adattano rispettivamente alle fasi di saturazione e rilassamento. Vedi Kolber et al.2 per maggiori dettagli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: L'effetto della densità di S. mucronata sulla fluorescenza basale. I piccoli punti rappresentano le repliche (n = 3). Vengono mostrati anche i risultati del test ANOVA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Gli effetti delle densità di S. mucronata su (A) FO (B) σ PSII, (C) Fv/Fm e (D) NPQNSV per Colacium sp. durante lo stadio planctonico. I piccoli punti rappresentano le repliche (n = 3). Colacium sp. è stato coltivato in mezzo AF-6. Vengono inoltre presentati i risultati del test post-hoc ANOVA e Tukey. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Risposte della sezione trasversale di assorbimento (A,B), della fotochimica (C,D) PSII e (E,F) della tempra non fotochimica dello stadio attaccato (A,C,E) e dello stadio planctonico (B,D,F) del Colacium sp. a 3 ore e 21 ore dopo l'addizione di Ca e Mn. I piccoli punti rappresentano le repliche (n = 4). Vengono inoltre presentati i risultati del test post-hoc ANOVA e Tukey. * p < 0,05. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Risposte rapide alla luce della sezione trasversale di assorbimento (A, B), della fotochimica (C,D) PSII e (E,F) della tempra non fotochimica di Colacium sp. in stadi attaccati e planctonici al protocollo di luce graduale a 3 ore dopo l'aggiunta di Ca e Mn. C, controllo; Ca, 200 μM Ca; Mn, 40 μM Mn. Differenze significative tra (a) C e Ca, (b) C e Mn, e (c) Ca e Mn a ciascun flusso PAR, con un livello di significatività di p < 0,05 mostrato in ciascun pannello. Barra di errore, SD media (n = 4). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9: Risposte rapide alla luce della sezione trasversale di assorbimento (A,B), della fotochimica (C,D) PSII e (E,F) della tempra non fotochimica di Colacium sp. in stadi attaccati e planctonici al protocollo di luce graduale a 21 ore dopo l'aggiunta di Ca e Mn. C, controllo; Ca, 200 μM Ca; Mn, 40 μM Mn. Differenze significative tra (a) C e Ca, (b) C e Mn, e (c) Ca e Mn a ciascun flusso PAR, con un livello di significatività di p < 0,05 mostrato in ciascun pannello. Barra di errore, SD media (n = 4). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Termine Definizione Unità
Fluorescenza al basale Valore Fo senza fluorescenza Chl-a
F' Fluorescenza a zeroth flashlet di una singola misura di turnover quando C>0
Fo (ʹ) Resa minima di fluorescenza PSII (sotto la luce di fondo) a zeroth flashlet
Fv (ʹ) Fm(ʹ) − Fo(ʹ)
Fm (ʹ) Resa massima di fluorescenza PSII (sotto la luce di fondo)
Fv/Fm Massima efficienza fotochimica PSII al buio
Fqʹ/Fmʹ Massima efficienza fotochimica PSII sotto la luce di fondo, (Fmʹ− F)/(Fmʹ)
NPQNSV Tempra normalizzata di Stern-Volmer, FOʹ/(Fmʹ − FOʹ)
[RCII] Concentrazione del centro di reazione
RσPSII (ʹ) Probabilità che un RCII venga chiuso durante il primo flashlet di una singola fase di saturazione del turnover (sotto la luce di fondo)
σ PSII (ʹ) Sezione trasversale di assorbimento funzionale di PSII per flashlet di eccitazione (sotto la luce di sfondo) NM2

Tabella 1: Termini utilizzati in questo protocollo.

Componente Quantità
NaNO3 · 140 mg· L−1
NH4NO3 · 22 mg· L−1
MgSO4·7H2O 30 mg· L−1
KH2PO4 · 10 mg· L−1
K2HPO4 · 5 mg· L−1
CaCl2·2H2O 10 mg· L−1
CaCO3 · 10 mg· L−1
Fe-citrato* 2 mg· L−1
Acido citrico* 2 mg· L−1
Biotina 0,002 mg· L−1
Vit.B 1 0,01 mg· L−1
Vit.B 6 0,001 mg· L−1
Vit.B 12 0,001 mg· L−1
Metalli in traccia 1 ml·L−1
(FeCl3·6H2O) (1,0 mg·mL−1)
(MnCl3·4H2O) (0,4 mg·mL−1)
(ZnSO4·7H2O) (0,005 mg·mL−1)
(CoCl2·6H2O) (0,002 mg·mL−1)
(Na2MoO4) (0,004 mg·mL−1)
(Na2-EDTA) (7,5 mg·mL−1)

Tabella 2: Ricetta per il mezzo AF-6. Regolare il pH a 6,6. Sciogliere separatamente il fe-citrato e l'acido citrico in H2O caldo e aggiungere HCl (1 mL·L−1) dopo aver miscelato entrambi i reagenti. Il contenuto di metalli in traccia è mostrato tra parentesi.

Data di campionamento Esempio n. Temperatura dell'acqua.
(°C) 		Densità di S. mucronata
(inds.· mL−1)		 Densità cellulare Colacium sp.
(inds.· mL−1)		 σ PSII (nm2) Fv/Fm NPQNSV
Aprile 27/2020 N° 1 14.2 4.5 77 3.42 0.60 0.66
SE 0.22 0.01 0.04
Maggio 21/2020 N° 2 19.4 2 282.5 3.62 0.54 0.85
SE 0.16 0.02 0.06
No.3 19.4 2 250.5 3.55 0.56 0.77
SE 0.09 0.01 0.02
No.4 19.4 5 204.5 3.76 0.52 0.94
SE 0.12 0.00 0.02
Giugno 18/2020 N. 5 22.4 2.5 474 3.62 0.54 0.85
SE 0.16 0.02 0.06
No.6 22.4 2 410 3.55 0.56 0.77
SE 0.09 0.01 0.02
No.7 22.4 2.5 441 3.76 0.52 0.94
SE 0.12 0.00 0.02
Luglio 20/2020 N° 8 27.5 5 109 3.49 0.58 0.74
SE 0.10 0.00 0.00
Significare 3.60 0.55 0.82
S.D. 0.120349 0.03 0.10

Tabella 3: Fotofisiologia di Colacium sp. allegata su S. mucronata.

Data di campionamento Esempio n. Medio Temperatura di crescita (°C) σ PSII (nm2) Fv/Fm NPQNSV
Maggio 21/2020 N° 1 AF-6 · 19.4 2.72 0.65 0.53
SE 0.03 0.00 0.01
Giugno 18/2020 N° 2 AF-6 · 22.4 3.07 0.55 0.84
SE 0.08 0.02 0.07
Luglio 20/2020 No.3 AF-6 · 27.5 2.90 0.58 0.73
SE 0.06 0.01 0.02
Significare 2.90 0.59 0.70
S.D. 0.18 0.05 0.16

Tabella 4: Fotofisiologia dello stadio planctonico di Colacium sp. Ogni campione è stato misurato durante la fase stazionaria.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Questo protocollo ha dimostrato per la prima volta che la fotofisiologia di Colacium sp. durante la fase attaccata in un ambiente naturale è paragonabile al suo stadio planctonico nel mezzo AF-6. Inoltre, il contenuto intestinale di S. mucronata affamato non ha influenzato la fluorescenza al basale e Chl-a quando la densità era ≤5 inds·mL−1 (Figura 5 e Figura 6). Questi risultati suggeriscono che questo protocollo può misurare la fotofisiologia di Colacium sp. durante la fase attaccata senza correzione sotto bassa abbondanza di organismi di substrato. Tuttavia, i risultati dei passaggi 3.2.1-3.2.8 hanno mostrato che la più alta abbondanza di S. mucronata ha influenzato significativamente Fv/Fm e NPQNSV, ma non FO e σ PSII (Figura 4). Qui, è possibile che una maggiore densità dell'organismo abbia esacerbato lo stress fisico sugli individui Colacium sp. e successivamente diminuito l'attività fotosintetica. Per le misurazioni sotto un'elevata abbondanza di organismi substrato o altre specie, gli effetti della densità dell'organismo del substrato sulla linea di base e della fluorescenza Chl-a richiedono ulteriore attenzione.

I FRRf sono stati utilizzati per esaminare l'impatto della manipolazione dei nutrienti sul flusso lineare di elettroni e sulla tempra non fotochimica del fitoplancton22,56,57. I risultati primari mostrano che l'arricchimento di Ca e Mn differiva significativamente tra le fasi di vita di Colacium sp. (Figura 7, Figura 8 e Figura 9). In particolare, il manganese ha chiaramente migliorato la resa fotochimica (massima) di PSII (Fv/Fm e Fq′/Fm′) e ha diminuito la dissipazione del calore (NPQNSV)50 degli stadi planctonici in condizioni scure (Figura 7D,F) e di luce (Figura 8D,F e Figura 9D,F). Questi risultati possono derivare dalla riduzione delle dimensioni dell'antenna su PSII, σ PSII e σ PSII′ (Figura 7B e Figura 8B), che riduce l'assorbimento di luce in eccesso58,59. La misurazione delle dimensioni dell'antenna oltre al flusso di energia tra i complessi PSII consentirebbe misurazioni più precise della risposta algale10. Questo protocollo consente anche l'esame delle limitazioni della fotosintesi da parte di altre risorse. Ad esempio, le limitazioni di azoto e fosforo sono state esaminate in varie comunità di fitoplancton, ma non nelle alghe epizoiche, nonostante gli effetti previsti su Colacium41 e diatomee epizoiche marine60,61. Oltre ai nutrienti, l'ambiente luminoso può influenzare ulteriormente la distribuzione delle alghe epizoiche44.

Come mostrato nella Figura 7, nella Figura 8 e nella Figura 9, il FRRf di tipo cuvetta ci consente di esaminare contemporaneamente gli effetti nutritivi e luminosi senza lunghi tempi di incubazione e sforzo di misurazione. Questo protocollo di luce graduale (passo 6.1.5) può anche disegnare curve a luce rapida di velocità di trasporto di elettroni relative (rETR = Fq′/Fm′× luce) rispetto alla luce come analogo per la produzione rispetto alle curve di luce62. Tuttavia, sebbene il flusso lineare di elettroni nel PSII possa essere stimato dai parametri fotofisiologici dal FRRf, non è necessariamente analogo al tasso di fissazione del carbonio63,64. Per stimare la produzione primaria a base di carbonio, il fabbisogno di elettroni per fissazione di CO2 (Фe, C), che può variare temporalmente e spazialmente5,48, dovrebbe essere esaminato quando si valutano le comunità di soggetti.

Se la rete di plancton è ostruita da detriti, preselezionare da una rete più grande, come una rete a maglie da 5 mm, o raccogliere zooplancton direttamente dall'acqua del lago usando una pipetta senza filtrazione. Va notato che alcuni danni potrebbero verificarsi alle alghe attaccate anche quando la filtrazione viene condotta delicatamente utilizzando una dimensione di maglia relativamente grande (200 μm). Sebbene i risultati mostrino che la deviazione standard dei parametri PSII era piccola (Tabella 3) e i valori medi dei parametri erano molto simili a quelli dello stadio planctonico coltivato (Tabella 4), il campionamento senza filtrazione potrebbe essere l'ideale.

Un'altra limitazione di questo studio è stata la derivazione σ PSII. La luce attinica e l'attenuazione della fluorescenza Chl-a possono esercitare una grande influenza/distorsione sui FRRf, che si basano su campioni otticamente sottili per l'accurata determinazione σ PSII65. Sebbene abbiamo dimostrato che S. mucronata non ha influenzato la σ PSII delle cellule planctoniche di Colacium, ciò dovrebbe essere esaminato in relazione alla σ PSII delle cellule di Colacium attaccate. Inoltre, sarebbe necessario un fattore di correzione spettrale (SCF) per la stima σ PSII in situ66 poiché la lunghezza d'onda di eccitazione del sistema ACT2 (444 nm) differisce dalla distribuzione spettrale dell'ambiente luminoso in situ. In generale, la tecnica del tampone filtrante viene utilizzata per misurare lo spettro di assorbimento specifico Chl-a per calcolare l'SCF. Questa procedura è necessaria per stimare la produttività primaria algale da parte dei FRRf. Poiché non siamo riusciti a raccogliere abbastanza cellule di Colacium attaccate durante il periodo di studio, lo spettro di assorbimento specifico di Chl-a dovrebbe essere esaminato in studi futuri.

L'implementazione di FRRf di tipo cuvetta dovrebbe dipendere dalle dimensioni del substrato poiché le alghe perifite richiedono un attacco al substrato. Ad esempio, studi di alghe su sostanze indistruttibili, come rocce67, organismi più grandi26,68 o alghe simbiotiche, incluso il Symbiodinium associato a coralli duri10,69,70, potrebbero richiedere il sommergibile di tipo FRRf69. Al contrario, se il basibionte è abbastanza piccolo da sospendersi in una cuvetta, un FRRf di tipo cuvetta potrebbe essere sufficiente in aggiunta a un PAM di tipo cuvetta, come l'alga bentonica16,17,18. Infatti, studi recenti hanno esplorato un FRRf di tipo cuvetta per misurare la fotofisiologia delle alghe di ghiaccio24,25. Inoltre, l'attivazione del flash di eccitazione a 512 e 633 nm consente l'applicazione a cianobatteri con diversi pigmenti dell'antenna PSII, ficoeritrine e ficocianine, e quindi diversi picchi di assorbimento con Chl-a71. Poiché gli attuali modelli FRRf che incorporano lunghezze d'onda multi-eccitazione sono strumenti utili per esaminare la fotofisiologia e la produttività dei cianobatteri7,66,72, questi dovrebbero essere metodi utili per valutare i cianobatteri bentonici, se gli effetti dello spessore del campione sui parametri fotofisiologici sarebbero migliorati65 . Negli studi futuri, i FRRf dovrebbero essere rivolti a una gamma più ampia di organismi soggetti per fornire ulteriori informazioni sui complessi meccanismi della fotofisiologia algale in vari habitat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno divulgazioni da dichiarare.

Acknowledgments

Il lavoro è stato sostenuto dal Collaborative Research Fund della Prefettura di Shiga dal titolo "Studio sulla qualità dell'acqua e sull'ambiente del fondo lago per la protezione della solidità dell'ambiente idrico" nell'ambito della sovvenzione giapponese per la rivitalizzazione regionale e il Fondo per la ricerca e lo sviluppo tecnologico dell'ambiente (n. 5-1607) del Ministero dell'Ambiente, Giappone. https://www.kantei.go.jp/jp/singi/tiiki/tiikisaisei/souseikoufukin.html. Gli autori desiderano ringraziare Enago (www.enago.jp) per la recensione in lingua inglese.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrodisc syringe filter Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA 0.2 μm pore size
Act2Run CTG Ltd., West Molesey, UK
Biotin Wako 023-08711 AF-6 medium
CaCl2·2H2O Wako 031-25031 AF-6 medium
CaCO3 Wako 036-00382 AF-6 medium
Citric acid Wako 036-05522 AF-6 medium
CoCl2·6H2O Wako 036-03682 AF-6 medium
Concentrated Chlorella Recenttec, Tokyo, Japan 20 mg C·mL−1 ; store at 4 °C
FastOcean Act2 CTG Ltd., West Molesey, UK
Fe-citrate Wako 093-00952 AF-6 medium
FeCl3·6H2O Wako 091-00872 AF-6 medium
HCLP-880PF Nippon Medical and Chemical Instruments
 Co., Ltd., Osaka, Japan		 With LED light bulbs
K2HPO4 Wako 160-04292 AF-6 medium
KH2PO4 Wako 167-04241 AF-6 medium
MgSO4·7H2O Wako 137-00402 AF-6 medium
MnCl3·4H2O Wako 139-00722 AF-6 medium
Na2EDTA Wako 343-01861 AF-6 medium
Na2MoO4 Wako 196-02472 AF-6 medium
NaNO3 Wako 191-02542 AF-6 medium
NH4NO3 Wako 015-03231 AF-6 medium
Plankton Counter Matsunami Glass, Osaka, Japan S6300
Pylex test tube CTG Ltd., West Molesey, UK With rim, 16 x 100 mm
Vit. B1 Wako 203-00851 AF-6 medium
Vit. B12 Wako 226-00343 AF-6 medium
Vit. B6 Wako 165-05401 AF-6 medium
ZnSO4·7H2O Wako 264-00402 AF-6 medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolber, Z., Falkowski, P. G. Use of active fluorescence to estimate phytoplankton photosynthesis in situ. Limnology and Oceanography. 38 (8), 1646-1665 (1993).
  2. Kolber, Z. S., Prášil, O., Falkowski, P. G. Measurements of variable chlorophyll fluorescence using fast repetition rate techniques: defining methodology and experimental protocols. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1367 (1), 88-106 (1998).
  3. Oxborough, K., Moore, C. M., Suggett, D. J., Lawson, T., Chan, H. G., Geider, R. J. Direct estimation of functional PSII reaction center concentration and PSII electron flux on a volume basis: a new approach to the analysis of Fast Repetition Rate fluorometry (FRRf) data. Limnology and Oceanography: Methods. 10 (3), 142-154 (2012).
  4. Smyth, T. J., Pemberton, K. L., Aiken, J., Geider, R. J. A methodology to determine primary production and phytoplankton photosynthetic parameters from fast repetition rate fluorometry. Journal of Plankton Research. 26 (11), 1337-1350 (2004).
  5. Lawrenz, E., et al. Predicting the electron requirement for carbon fixation in seas and oceans. PLoS ONE. 8 (3), 58137 (2013).
  6. Zhu, Y., et al. Relationship between light, community composition and the electron requirement for carbon fixation in natural phytoplankton. Marine Ecology Progress Series. 580, 83-100 (2017).
  7. Schuback, N., Tortell, P. D. Diurnal regulation of photosynthetic light absorption, electron transport and carbon fixation in two contrasting oceanic environments. Biogeosciences. 16 (7), 1381-1399 (2019).
  8. Cosgrove, J., Borowitzka, M. A. Chlorophyll fluorescence terminology: an introduction. Chlorophyll a Fluorescence in Aquatic Sciences: Methods and Applications. , Springer. Dordrecht. 1-17 (2010).
  9. McKew, B. A., et al. The trade-off between the light-harvesting and photoprotective functions of fucoxanthin-chlorophyll proteins dominates light acclimation in Emiliania huxleyi (clone CCMP 1516). New Phytologist. 200 (1), 74-85 (2013).
  10. Warner, M. E., Lesser, M. P., Ralph, P. J. Chlorophyll fluorescence in reef building corals. Chlorophyll a Fluorescence in Aquatic Sciences: Methods and Applications. , Springer. Dordrecht. 209-222 (2010).
  11. Bhagooli, R., et al. Chlorophyll fluorescence - A tool to assess photosynthetic performance and stress photophysiology in symbiotic marine invertebrates and seaplants. Marine Pollution Bulletin. 165, 112059 (2021).
  12. Zavafer, A., Labeeuw, L., Mancilla, C. Global trends of usage of chlorophyll fluorescence and projections for the next decade. Plant Phenomics. 2020, 6293145 (2020).
  13. Goto, N., Tanaka, Y., Mitamura, O. Relationships between carbon flow through freshwater phytoplankton and environmental factors in Lake Biwa, Japan. Fundamental and Applied Limnology/Archiv für Hydrobiologie. 184 (4), 261-275 (2014).
  14. Napoléon, C., Raimbault, V., Claquin, P. Influence of nutrient stress on the relationships between PAM measurements and carbon incorporation in four phytoplankton species. PLOS ONE. 8 (6), 66423 (2013).
  15. Morris, E. P., Kromkamp, J. C. Influence of temperature on the relationship between oxygen- and fluorescence-based estimates of photosynthetic parameters in a marine benthic diatom (Cylindrotheca closterium). European Journal of Phycology. 38 (2), 133-142 (2003).
  16. Fraga, S., Rodríguez, F., Bravo, I., Zapata, M., Marañón, E. Review of the main ecological features affecting benthic dinoflagellate blooms. Cryptogamie, Algologie. 33 (2), 171-179 (2012).
  17. McMinn, A., et al. Quantum yield of the marine benthic microflora of near-shore coastal Penang, Malaysia. Marine and Freshwater Research. 56 (7), 1047-1053 (2005).
  18. Salleh, S., McMinn, A. The effects of temperature on the photosynthetic parameters and recovery of two temperate benthic microalgae, Amphora cf. coffeaeformis and Cocconeis cf. sublittoralis (Bacillariophyceae). Journal of Phycology. 47 (6), 1413-1424 (2011).
  19. McMinn, A., Pankowskii, A., Ashworth, C., Bhagooli, R., Ralph, P., Ryan, K. In situ net primary productivity and photosynthesis of Antarctic sea ice algal, phytoplankton and benthic algal communities. Marine Biology. 157 (6), 1345-1356 (2010).
  20. Garbary, D. J., Bird, C. J., Kim, K. Y. Sporocladopsis jackii, sp. nov. (Chroolepidaceae, chlorophyta): a new species from eastern Canada and Maine symbiotic with the mud snail, Ilyanassa obsoleta (Gastropoda). Rhodora. 107 (929), 52-68 (2005).
  21. Suggett, D. J., Oxborough, K., Baker, N. R., MacIntyre, H. L., Kana, T. M., Geider, R. J. Fast repetition rate and pulse amplitude modulation chlorophyll a fluorescence measurements for assessment of photosynthetic electron transport in marine phytoplankton. European Journal of Phycology. 38 (4), 371-384 (2003).
  22. Hughes, D. J., et al. Impact of nitrogen availability upon the electron requirement for carbon fixation in Australian coastal phytoplankton communities. Limnology and Oceanography. 63 (5), 1891-1910 (2018).
  23. Melrose, D. C., Oviatt, C. A., O'Reilly, J. E., Berman, M. S. Comparisons of fast repetition rate fluorescence estimated primary production and 14C uptake by phytoplankton. Marine Ecology Progress Series. 311, 37-46 (2006).
  24. Yoshida, K., Seger, A., Kennedy, F., McMinn, A., Suzuki, K. Freezing, melting, and light stress on the photophysiology of ice algae: ex situ incubation of the ice algal diatom Fragilariopsis cylindrus (Bacillariophyceae) using an ice tank. Journal of Phycology. 56 (5), 1323-1338 (2020).
  25. Selz, V., et al. Ice algal communities in the Chukchi and Beaufort Seas in spring and early summer: composition, distribution, and coupling with phytoplankton assemblages. Limnology and Oceanography. 63 (3), 1109-1133 (2018).
  26. Falasco, E., Bo, T., Ghia, D., Gruppuso, L., Bona, F., Fenoglio, S. Diatoms prefer strangers: non-indigenous crayfish host completely different epizoic algal diatom communities from sympatric native species. Biological Invasions. 20 (10), 2767-2776 (2018).
  27. Møhlenberg, F., Kaas, H. Colacium vesiculosum Ehrenberg (Euglenophyceae), infestation of planktonic copepods in the Western Baltic. Ophelia. 31 (2), 125-132 (1990).
  28. Zalocar, Y., Frutos, S. M., Casco, S. L., Forastier, M. E., Vallejos, S. V. Prevalence of Colacium vesiculosum (Colaciales: Euglenophyceae) on planktonic crustaceans in a subtropical shallow lake of Argentina. Revista De Biologia Tropical. 59 (3), 1295-1306 (2011).
  29. Barea-Arco, J., Pérez-Martínez, C., Morales-Baquero, R. Evidence of a mutualistic relationship between an algal epibiont and its host, Daphnia pulicaria. Limnology and Oceanography. 46 (4), 871-881 (2001).
  30. Decaestecker, E., Declerck, S., De Meester, L., Ebert, D. Ecological implications of parasites in natural Daphnia populations. Oecologia. 144 (3), 382-390 (2005).
  31. Allen, Y. C., Stasio, B. T. D., Ramcharan, C. W. Individual and population level consequences of an algal epibiont on Daphnia. Limnology and Oceanography. 38 (3), 592-601 (1993).
  32. Willey, R. L., Cantrell, P. A., Threlkeld, S. T. Epibiotic euglenoid flagellates increase the susceptibility of some zooplankton to fish predation. Limnology and Oceanography. 35 (4), 952-959 (1990).
  33. Green, J. Parasites and epibionts of Cladocera. The Transactions of the Zoological Society of London. 32 (6), 417-515 (1974).
  34. Evans, M. S., Sicko-Goad, L. M., Omair, M. Seasonal occurrence of Tokophrya quadripartita (Suctoria) as epibionts on adult Limnocalanus macrurus (Copepoda: Calanoida) in southeastern Lake Michigan. Transactions of the American Microscopical Society. 98 (1), 102-109 (1979).
  35. Chiavelli, D. A., Mills, E. L., Threlkeld, S. T. Host preference, seasonality, and community interactions of zooplankton epibionts. Limnology and Oceanography. 38 (3), 574-583 (1993).
  36. Willey, R. L., Willey, R. B., Threlkeld, S. T. Planktivore effects on zooplankton epibiont communities: epibiont pigmentation effects. Limnology and Oceanography. 38 (8), 1818-1822 (1993).
  37. Rosowski, J. R., Willey, R. L. Colacium libellae sp. nov. (euglenophyceae), a photosynthetic inhabitant of the larval damselfly rectum. Journal of Phycology. 11 (3), 310-315 (1975).
  38. Willey, R. L., Threlkeld, S. T. Organization of crustacean epizoan communities in a chain of subalpine ponds. Limnology and Oceanography. 38 (3), 623-627 (1993).
  39. Al-Dhaheri, R. S., Willey, R. L. Colonization and reproduction of the epibiotic flagellate Colacium vesiculosum (euglenophyceae) on Daphnia pulex. Journal of Phycology. 32 (5), 770-774 (1996).
  40. Rosowski, J. R. Photosynthetic euglenoids. Freshwater Algae of North America. , Elsevier Science. USA. 383-422 (2003).
  41. Rosowski, J. R., Kugrens, P. Observations on the euglenoid Colacium with special reference to the formation and morphology of attachment material. Journal of Phycology. 9 (4), 370-383 (1973).
  42. Salmaso, N., Tolotti, M. Other phytoflagellates and groups of lesser importance. Encyclopedia of Inland Waters. , Academic Press. 174-183 (2009).
  43. Threlkeld, S. T., Chiavelli, D. A., Willey, R. L. The organization of zooplankton epibiont communities. Trends in Ecology & Evolution. 8 (9), 317-321 (1993).
  44. Bertolo, A., Rodríguez, M. A., Lacroix, G. Control mechanisms of photosynthetic epibionts on zooplankton: an experimental approach. Ecosphere. 6 (11), (2015).
  45. Pringsheim, E. G. Notiz über Colacium (Euglenaceae). Österreichische Botanische Zeitschrift. 100 (3), 270-275 (1953).
  46. Wołowski, K., Duangjan, K., Peerapornpisal, Y. Colacium minimum (Euglenophyta), a new epiphytic species for Asia. Polish Botanical Journal. 60 (2), 179-185 (2015).
  47. Martin, J. H., Knauer, G. A. The elemental composition of plankton. Geochimica et Cosmochimica Acta. 37 (7), 1639-1653 (1973).
  48. Kazama, T., Hayakawa, K., Kuwahara, V. S., Shimotori, K., Imai, A., Komatsu, K. Development of photosynthetic carbon fixation model using multi-excitation wavelength fast repetition rate fluorometry in Lake Biwa. PLOS ONE. 16 (2), 0238013 (2021).
  49. Chesney, T., Sastri, A. R., Beisner, B. E., Nandini, S., Sarma, S. S. S., Juneau, P. Application of fluorometry (Phyto-PAM) for assessing food selection by cladocerans. Hydrobiologia. 829 (1), 133-142 (2019).
  50. Wang, Q., Yang, S., Wan, S., Li, X. The significance of calcium in photosynthesis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1353 (2019).
  51. Dau, H., Haumann, M. Eight steps preceding O-O bond formation in oxygenic photosynthesis-A basic reaction cycle of the photosystem II manganese complex. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1767 (6), 472-483 (2007).
  52. Suthers, I., Bowling, L., Kobayashi, T., Rissik, D. Sampling methods for plankton. Plankton: A guide to their ecology and monitoring for water quality. , CSIRO Publishing. Melbourne. 63-90 (2019).
  53. Błędzki, L. A., Rybak, J. I. Freshwater Crustacean Zooplankton of Europe: Cladocera & Copepoda (Calanoida, Cyclopoida) Key to species identification, with notes on ecology, distribution, methods and introduction to data analysis. , Springer. Switzerland. (2016).
  54. Kato, S. Laboratory culture and morphology of Colacium vesiculosum Ehrb. (Euglenophyceae). Japanese Journal of Phycology (Sorui). 30, 63-67 (1982).
  55. Serôdio, J., Campbell, D. A. Photoinhibition in optically thick samples: Effects of light attenuation on chlorophyll fluorescence-based parameters. Journal of Theoretical Biology. 513, 110580 (2021).
  56. Sylvan, J. B., Quigg, A., Tozzi, S., Ammerman, J. W. Eutrophication-induced phosphorus limitation in the Mississippi River plume: evidence from fast repetition rate fluorometry. Limnology and Oceanography. 52 (6), 2679-2685 (2007).
  57. Browning, T. J., et al. P. Nutrient regulation of late spring phytoplankton blooms in the midlatitude North Atlantic. Limnology and Oceanography. 65 (6), 1136-1148 (2020).
  58. Pausch, F., Bischof, K., Trimborn, S. Iron and manganese co-limit growth of the Southern Ocean diatom Chaetoceros debilis. PLOS ONE. 14 (9), 0221959 (2019).
  59. Ferroni, L., Baldisserotto, C., Fasulo, M. P., Pagnoni, A., Pancaldi, S. Adaptive modifications of the photosynthetic apparatus in Euglena gracilis Klebs exposed to manganese excess. Protoplasma. 224 (3), 167-177 (2004).
  60. Gaiser, E. E., Bachmann, R. W. Seasonality, substrate pereference and attachment sites of epizoic diatoms on cladoceran zooplankton. Journal of Plankton Research. 16 (1), 53-68 (1994).
  61. Totti, C., et al. The diversity of epizoic diatoms: relationships between diatoms and marine invertebrates. The Diversity of Epizoic Diatoms. 16, 323-343 (2011).
  62. Perkins, M., Effler, S. W., Strait, C. M. Phytoplankton absorption and the chlorophyll a-specific absorption coefficient in dynamic Onondaga Lake. Inland Waters. 4 (2), 133-146 (2014).
  63. Kromkamp, J., Capuzzo, E., Philippart, C. J. M. Measuring phytoplankton primary production: review of existing methodologies and suggestions for a common approach. EcApRHA Deliverable WP 3.2. 28, (2017).
  64. Hughes, D., et al. Roadmaps and detours: active chlorophyll-a assessments of primary productivity across marine and freshwater systems. Environmental Science & Technology. 52 (21), 12039-12054 (2018).
  65. Perkins, R. G., et al. The application of variable chlorophyll fluorescence to microphytobenthic biofilms. Chlorophyll a Fluorescence in Aquatic Sciences: Methods and Applications. 4, Springer. Dordrecht. 237-275 (2010).
  66. Schuback, N., Flecken, M., Maldonado, M. T., Tortell, P. D. Diurnal variation in the coupling of photosynthetic electron transport and carbon fixation in iron-limited phytoplankton in the NE subarctic Pacific. Biogeosciences. 13 (4), 1019-1035 (2016).
  67. Schreiber, U., Gademann, R., Ralph, P. J., Larkum, A. W. D. Assessment of photosynthetic performance of Prochloron in Lissoclinum patella in hospite by chlorophyll fluorescence measurements. Plant and Cell Physiology. 38 (8), 945-951 (1997).
  68. Garbary, D. J., Miller, A. G., Scrosati, R. A. Ascophyllum nodosum and its symbionts: XI. The epiphyte Vertebrata lanosa performs better photosynthetically when attached to Ascophyllum than when alone. Algae. 29 (4), 321-331 (2014).
  69. Gorbunov, M. Y., Kolber, Z. S., Lesser, M. P., Falkowski, P. G. Photosynthesis and photoprotection in symbiotic corals. Limnology and Oceanography. 46 (1), 75-85 (2001).
  70. Yellowlees, D., Warner, M. Photosynthesis in symbiotic algae. Photosynthesis in Algae. 14, Springer. Dordrecht. 437-455 (2003).
  71. Wojtasiewicz, B., Stoń-Egiert, J. Bio-optical characterization of selected cyanobacteria strains present in marine and freshwater ecosystems. Journal of Applied Phycology. 28 (4), 2299-2314 (2016).
  72. Aardema, H. M., Rijkeboer, M., Lefebvre, A., Veen, A., Kromkamp, J. C. High-resolution underway measurements of phytoplankton photosynthesis and abundance as an innovative addition to water quality monitoring programs. Ocean Science. 15 (5), 1267-1285 (2019).

Tags

Biologia Numero 177 PANCA FRRf Colacium sp. epibionte alghe epizoiche Lago Biwa fotofisiologia
Misurazione della fotofisiologia dello stadio collegato di <em>Colacium</em> sp. da un fluorometro a velocità di ripetizione rapida di tipo cuvetta
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kazama, T., Hayakawa, K., Shimotori, … More

Kazama, T., Hayakawa, K., Shimotori, K., Imai, A. Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer. J. Vis. Exp. (177), e63108, doi:10.3791/63108 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter