Summary
אנו מציגים פרוטוקול ליצירת מודל סרטן לבלב אורתוטופי זעיר פולשני על ידי הזרקה מונחית אולטרסאונד של תאי סרטן הלבלב האנושיים וניטור לאחר מכן של צמיחת הגידול in vivo על ידי הדמיית אולטרסאונד.
Abstract
סרטן הלבלב (PCa) מייצג את אחד מסוגי הסרטן הקטלניים ביותר בעולם. הסיבות לממאירות PCa מסתמכות בעיקר על התנהגותה הממאירה הפנימית ועמידותה הגבוהה לטיפולים טיפוליים. ואכן, למרות מאמצים רבים, הן כימותרפיה סטנדרטית והן טיפולי מטרה חדשניים נכשלו באופן משמעותי כאשר הועברו מהערכה פרה-קלינית למסגרת הקלינית. בתרחיש זה, פיתוח מודלים של עכברים פרה-קליניים המחקים טוב יותר את מאפייני ה- in vivo של PCa נחוץ בדחיפות כדי לבדוק תרופות שפותחו לאחרונה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה ליצירת מודל עכברי של PCa, המיוצג על ידי קסנוגרפט אורתוטופי המתקבל על ידי הזרקה מונחית אולטרסאונד של תאי גידול בלבלב אנושי. באמצעות פרוטוקול כה אמין וזעיר פולשני, אנו מספקים גם עדויות לחריטה in vivo והתפתחות של מסות גידול, אשר ניתן לנטר על ידי הדמיית אולטרסאונד (US). היבט ראוי לציון של מודל PCa המתואר כאן הוא התפתחות איטית של המוני הגידול לאורך זמן, המאפשר זיהוי מדויק של נקודת המוצא לטיפולים תרופתיים וניטור טוב יותר של ההשפעות של התערבויות טיפוליות. יתר על כן, הטכניקה המתוארת כאן היא דוגמה ליישום עקרונות 3Rs שכן היא ממזערת כאב וסבל ומשפרת באופן ישיר את רווחתם של בעלי חיים במחקר.
Introduction
PCa, וצורתו הנפוצה ביותר, קרצינומה אדנו דוקטלית לבלב (PDAC), היא אחת הסיבות הנפוצות ביותר למוות הקשור לסרטן עם שיעור הישרדות של שנה אחת נמוך מ -20% ושיעור הישרדות של 5 שנים של 8%, ללא קשר לשלב 1,2. המחלה כמעט תמיד קטלנית, ושכיחותה צפויה לגדול ברציפות בשנים הקרובות, בניגוד לסוגי סרטן אחרים, ששכיחותם יורדת3. גורמים כגון גילוי מאוחר של סרטן, הנטייה להתקדמות מהירה והיעדר טיפולים ספציפיים מובילים לפרוגנוזה גרועה שלPCa 4. התקדמות רבה בחקר הסרטן הושגה, הודות לפיתוח מודלים מדויקים יותר של עכברים פרה-קליניים. המודלים סיפקו תובנות מתאימות להבנת המנגנון המולקולרי העומד בבסיס הסרטן ולפיתוח טיפולים חדשים5. התקדמות זו חלה בצורה גרועה על PCa, אשר, למרות מאמצים רבים לאחרונה, נשאר עמיד לטיפולים כימותרפיים הנוכחי1. מסיבות אלה, פיתוח גישות חדשניות לשיפור סיכויי המטופלים הוא חובה.
במהלך השנים פותחו דגמים רבים של עכברי PCa, כולל xenografts, שהם הדגמים הנפוצים ביותר כיום5. מודלים של Xenograft מסווגים כהטרוטופיים תת עוריים ואורתוטופיים, בהתאם למיקום תאי הגידול המושתלים. קסנוגראפטים הטרוטופיים תת-עוריים קלים וזולים יותר להשגה, אך מפספסים תכונות אופייניות מסוימות של PCa (כלומר, המיקרו-סביבה המוזרה של הגידול, המאופיינת בהצטברות של רקמה פיברוטית, היפוקסיה, חומציות ואנגיוגנזה)6,7. זה מסביר מדוע קסנוגרפטים תת-עוריים לעתים קרובות אינם מצליחים לספק נתונים חזקים לטיפולים טיפוליים המובילים לכישלונות כאשר הם מתורגמים לסביבה הקלינית8. מאידך גיסא, קסנוגרפטים אורתוטופיים דומים יותר למיקרו-סביבה של הגידול, מה שמוביל לחיקוי טוב יותר של ההתפתחות הטבעית של המחלה. בנוסף, קסנוגרפטים אורתוטופיים מתאימים יותר לחקר התהליך הגרורתי והתכונות הפולשניות של PCa, שכמעט אינן מתרחשות במודלים תת עוריים9. באופן כללי, מודלים של עכברי xenograft אורתוטופיים עדיפים כיום לבצע בדיקות פרה-קליניות של תרופות 9,10. קסנוגרפטים אורתוטופיים מסתמכים בדרך כלל על הליכים כירורגיים כדי להשתיל תאים או חתיכות רקמת גידול קטנות מאוד בלבלב. ואכן, כמה מאמרים המבוססים על מודלים כירורגיים של PCa פורסמו בעשורים האחרונים11. עם זאת, האיכות והתוצאה של ההליך הכירורגי להקמת מודל גידול אורתוטופי תלויים מאוד במיומנות הטכנית של המפעיל. נקודת מפתח נוספת עבור אורתוטופית מוצלחת PCa xenograft עבור גישה קלינית תרגומית היא האפשרות להקים מחלה מקומית עם קינטיקה צמיחה צפויה.
כדי להתמודד עם בעיות אלה, כאן אנו מתארים הליך חדשני לייצור PCa xenograft אורתוטופי, תוך ניצול הזרקה מונחית אולטרסאונד (US) של תאי PCa אנושיים לזנב הלבלב בעכברים מדוכאי חיסון. הליך זה יוצר מודל עכבר PCa אמין. הגידול מלווה ב-in vivo על ידי הדמיית US.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול הנוכחי קיבל אישור ממשרד הבריאות האיטלקי עם אישור מספר 843/2020-PR. על מנת להבטיח תנאים אספטיים, בעלי החיים הוחזקו בתוך חדר המחסום של חיות המחקר vivarium (Ce.S.A.L.) של אוניברסיטת פירנצה. כל ההליכים בוצעו באותו חלל שבו שוכנו העכברים במתקן LIGeMA של אוניברסיטת פירנצה (איטליה).
1. הכנת תאים
- תרבית תאי PCa מקו תאי ה-PCa בצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ המכילה את מדיום הנשר המעובד (DMEM) של דולבקו, בתוספת 2% L-גלוטמין ו-10% סרום בקר עוברי (FBS).
- דגירה של התאים בנורמוקסיה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
- לנתק את התאים עם טריפסין. לספור, ולהשהות 1 x 106 תאים ב 20 μL של PBS, 1 שעה לפני החיסון.
2. הכנת עכבר להזרקה מונחית אולטרסאונד (US-GI)
הערה: השלבים הבאים בוצעו בתנאים סטריליים. כל ההליך של הזרקה מונחית ארה"ב, מתחילת ההרדמה ועד להסרת העכבר מפלטפורמת החיה, לוקח בערך 10-12 דקות ועוד 5 דקות להתאוששות מלאה של העכבר.
- רגע לפני ההתערבות, יש לתת קרפרופן (NSAID) באופן תת עורי (s.c.) במינון סופי של 5 מ"ג/ק"ג או טרמדול במינון סופי של 5 מ"ג/ק"ג באמצעות מזרק שחפת עם מחט של 27 גרם.
הערה: עבור הפרוטוקול הנוכחי, נעשה שימוש ב-20 נקבות Athymic Nude-Foxn1nu . העכברים היו בני 8 שבועות ושקלו 20-22 גרם. - הפעל את התמונה ובחר עכבר (קטן) בטן בתפריט היישום מלוח המתמרים. ודא שחלון ההדמיה B-Mode (מצב בהירות) מופיע, ושהמערכת מוכנה לרכוש נתוני B-Mode.
הערה: B-Mode הוא מצב ההדמיה המוגדר כברירת מחדל של המערכת. המערכת מציגה הדים בתצוגה דו-ממדית (2D) על-ידי הקצאת רמת בהירות המבוססת על משרעת אות ההד. B-Mode הוא המצב היעיל ביותר לאיתור מבנים אנטומיים.- עבור אל דפדפן הלימוד.
- בחר מחקר חדש והקלד את שם המחקר והמידע, כלומר, תאריך המחקר וכו '.
- מלא את כל המידע הדרוש בשם הסדרה, כלומר, זן בעלי חיים, תעודת זהות, תאריך לידה וכו '.
- הקישו על ' סיום'; התוכנית מוכנה להדמיה במצב B.
- הרדמת העכבר בתא אינדוקציה של הרדמה באמצעות 4% איזופלורן עם זרימת גז של 2 ליטר/דקה של O2.
הערה: כ-4 דקות מספיקות להרדמה תקינה (נשימה סביב 50-60 נשימות לדקה). - לאחר הרדמת העכבר, שנה את החיבור של מכונת ההרדמה כדי לכוון את האיזופלורן לכיוון שולחן הטיפול בעכבר.
- הניחו את העכבר המרדים על האגף הימני שלו על שולחן הטיפול (מחומם ב-37 מעלות צלזיוס) עם חוטמו בתוך חרוט באף, כדי להבטיח שהעכבר מורדם באמצעות 2% איזופלוראן עם זרימת גז של 0.8 ליטר/דקה של O2 (איור 1A).
- יש למרוח טיפת דמעות מלאכותיות על עיני העכבר כדי למנוע יובש תחת הרדמה.
- הדביקו בחוזקה את יד ימין, רגל ימין וזנב על כריות האלקטרודות על משטח החיה באמצעות גזה דביקה.
הערה: קצב הנשימה והאלקטרוקרדיוגרמה (ECG) של העכבר נרשמים דרך רפידות האלקטרודות.
3. הזרקת תאי PANC1 ללבלב בשיטת US-GI
- לטהר את עור העכבר עם 70% אתנול ולשמור על העור של האגף השמאלי מתוח באמצעות גזה דבק.
הערה: שמירה על עור מתוח חשובה להפחתת ההתנגדות להחדרת המחט ולמניעת עיוותי מחט. - החל ג'ל אולטרסאונד על הבטן והאגף השמאלי של העכבר באמצעות מזרק 20 מ"ל (ללא המחט).
- באמצעות ידית בקרת הגובה של מתמר ארה"ב, הנמיכו את המתמר כדי לגעת באגף השמאלי של העכבר והניחו אותו באופן רוחבי לגוף החיה.
- הזיזו את המתמר כדי לדמיין את הלבלב על צג המתמר באמצעות הדמיה במצב B (איור 1B).
- הכינו מזרק המילטון 50 μL, המכיל 1 x 10 6תאי PANC1 המרחפים ב-20 μL של PBS, עם מחט 30 מ"מ 28 G והניחו את המזרק על המחזיק המתאים (איור 1C).
הערה: לפני השימוש, יש לחטא את מחט המזרק ב-70% אתנול לתקופה של 5-10 דקות. - באמצעות המיקרומניפולטור המחזיק, הורידו את המזרק לעור העכבר, כאשר שיקוע המחט פונה כלפי מעלה ובאותו מישור של מתמר האולטרסאונד, ויצרו זווית של 45° עם המתמר (איור 1D).
הערה: משלב זה ואילך, המשך על ידי ניטור התמונה האמריקאית בתצוגה. - באמצעות המיקרומניפולטור, נקב את העור והכנס את מחט המזרק ללבלב והתבונן בתמונת ארה"ב בתצוגה, כדי לעקוב אחר מסלולה (איור 1E).
הערה: לפני ההזרקה, קח את הזנב של הלבלב כהפניה אשר ממוקם מאחורי הטחול קרוב לכליה השמאלית. - לאחר החדרת המחט ללבלב, הזריקו בולוס של 20 μL המכיל את התאים ישירות ללבלב על ידי הפעלת לחץ קבוע על בוכנת המזרק (איור 1F).
הערה: הליך ההזרקה הנכון נבדק על ידי נוכחות של בועה קטנה בלבלב וזרימת נוזל היפואקוגני, אשר בקושי נראה מקצה המחט. - השאירו את המחט במקומה למשך 5-10 שניות לאחר הזרקת כל הבולוס, ואז נסוגו ממנה באיטיות.
- הסר את מתמר ארה"ב, נקה את הג'ל מהאגף והנח את העכבר לבדו בכלוב חדש. התבונן בבעל החיים עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה סטרנלית.
4.3D הדמיית US לניטור גידולי לבלב בעכברים
הערה: הערכת התפתחות הגידול בוצעה החל מ-8 ימים לאחר הזרקת התא, תוך שימוש באותו מכשיר המשמש להזרקה מונחית ארה"ב (מופיע בטבלת החומרים). לפיכך, חלק מההליכים, כגון הצתת המערכת (שלב 2.2.), הרדמה (שלבים 2.3. - 2.6.), ומיקום העכבר על פלטפורמת בעלי החיים (שלב 2.7.), תואמים באופן מלא את מה שתואר לעיל בפרוטוקול.
- לפני תחילת ההדמיה בארה"ב, הגדר את תחנת העבודה כפי שמוצג באיור 2A.
- תקן את המתמר במערכת המנוע התלת-ממדית (איור 2A).
- הפעל את התמונה ובחר מחקר חדש בדפדפן המחקר.
- מניחים את העכבר בתא אינדוקציה של הרדמה (4% איזופלוראן).
- הניחו את העכבר המרדים על האגף הימני שלו על שולחן הטיפול המחומם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם חוטמו בצינור ההרדמה והפחיתו את האיזופלוראן ל-2% (איור 2B).
הערה: חשוב שהעכבר ימוקם באותה תנוחה כמו ההזרקה בהנחיית ארה"ב, כדי לשמור על אותן הפניות אנטומיות. - יש למרוח טיפה משחה וטרינרית על עיני העכבר.
- החל שכבה של ג'ל אולטרסאונד על הבטן של העכבר ואת האגף השמאלי.
- מקם את מתמר ה-55 מגה-הרץ בכיוון הרוחבי כדי לגעת בעור האגף השמאלי כך שהלבלב יהיה ממורכז בקירוב (איור 2C).
- השתמש במנוע התלת-ממדי כדי לרכוש תמונות של הלבלב כולו בכיוון הרוחבי, באופן אידיאלי לאסוף 90-100 פריימים לרכישה (מספר המסגרות עשוי להשתנות בהתאם לבחירה האישית).
- בחר את מיקום המנוע התלת-ממדי בלוח המגע של התמונה .
- ציין את מרחק הסריקה על ידי הזזת הסמן כדי לקבל תמונות של הלבלב כולו משני הגפיים.
- בחר סרוק מסגרות והתחל ברכישה תלת-ממדית.
- לאחר סיום ההדמיה התלת-ממדית, הסר את המתמר, נקה את הג'ל מהעור והנח את העכבר לבדו בכלוב חדש להתאוששות. התבונן בבעל החיים עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה סטרנלית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעקבות הפרוטוקול שתואר לעיל, עכברים הורדמו תחילה בתא איזופלורן, והונחו על משטח החיה (איור 1A). הלבלב הודגם באמצעות דימות אולטרסאונד (איור 1B). מזרק המילטון 50 μL הועמס ב-1 x 106 תאי PANC1 שהיו תלויים ב-20 μL של PBS והונחו על מחזיק המחט (איור 1C). הזווית האופטימלית בין המזרק לבין המתמר האמריקאי הייתה 45° (איור 1D). באמצעות המיקרומניפולטור, מחט המזרק הוכנסה ללבלב ומסלולה נצפה בתצוגת התמונות בארה"ב (איור 1E). בולוס של 20 μL של תאים סרטניים הוזרק ללבלב (איור 1F) ולאחר 10 שניות המחט נסוגה. פעולות רלוונטיות למניעת רתיעה של תאים ודליפתם לאחר מכן לחלל הצפק נרדפו, כגון הפעלת לחץ קבוע במהלך החיסון, השהיה לאחר הזרקת התא, ושימוש במחט דקה עם זווית שיקוע של 30 מעלות. לאחר ההזרקה בהנחיית ארה"ב, משקלם של העכברים היה מנוטר מדי יום כדי להעריך סימנים של לחץ עקב ההליך. לא נצפה שינוי משמעותי במשקלם של עכברים מוזרקים.
לאחר מכן יושמה הדמיה תלת-ממדית של US כדי לעקוב אחר השתלת תאי הגידול והתפתחות הגידול. רכישת התמונה הראשונה בוצעה ביום 8 לאחר הזרקת תאים, ואחריה רכישות שבועיות (בסך הכל 6 רכישות). במהלך ההדמיה, בעלי חיים הונחו באגף ימין על הפלטפורמה המחוממת (37 מעלות צלזיוס) והורדמו על ידי שאיפת גז איזופלורן (מינון אינדוקציה ב-4% ומינון תחזוקה ב-2%) (איור 2). הרכישה התלת-ממדית בוצעה במצב B באמצעות מנוע תלת-ממד המאפשר למתמר לסרוק את הבטן במקטעים שונים, בניצב לצירו. סדרה של תמונות דו-ממדיות הושגו, אשר הורכבו לאחר מכן על ידי תוכנת הניתוח, תוך שחזור התמונה האנטומית התלת-ממדית של האיבר (עיבוד מחדש תלת-ממדי). כדי לבצע הדמיה תלת-ממדית, היה צורך לסנכרן את שלבי הנשימה של העכבר עם רכישת הסריקה התלת-ממדית. יכולת השחזור של הפרוטוקול אושרה על ידי נוכחות של מסת הגידול, מבנה היפו-אקוגני (המיוצג בצבעים כהים) בזנב הלבלב, החל מהיום השמיני, ב-16 מתוך 20 (80%) בעלי חיים (איור 3A). בארבעה עכברים (20% מבעלי החיים), התפתחות מסת הגידול נצפתה שבועיים לאחר ההזרקה. ניתן לייחס חביון זה להליך תת-אופטימלי של החדרת מחט ללבלב, שגרם לדליפה של תאים לתוך הצפק.
איור 3B מראה את נפח הגידול הממוצע (n = 16) שהוערך על-ידי הדמיה אמריקאית של מודל עכבר ההזרקה מונחה ארה"ב. יום לאחר הרכישה האחרונה בארה"ב, עכברים הומתו תחילה על ידי שאיפת CO2 ולאחר מכן על ידי נקע צוואר הרחם. חלל הבטן נבדק ומסות הגידול הושתלו לצורך ניתוח היסטולוגי (איור 3C-E).
איור 1: שיטה מונחית ארה"ב להקמת מודל עכבר PCa אורתוטופי . (A) העכבר ממוקם באגף ימין על תמיכה מיוחדת המחוממת ב-37 מעלות צלזיוס. (B) המתמר האמריקאי ממוקם באופן רוחבי לגוף החיה ברמת הטחול והלבלב מוצג באופן חזותי במצב B. מבט האגף של בטן העכבר מראה את הלבלב (1) בין הטחול (2) לבין הכליה השמאלית (3). סרגל קנה מידה: 2 מ"מ. (C) מזרק המילטון ממוקם על המחזיק המתאים. (D) במצב זה, המתמר (2) והמזרק (1) ממוקמים ויוצרים זווית של 45°. (E) המחט של המזרק (1) מוחדרת לזנב הלבלב, ממש מתחת לטחול. סרגל קנה מידה: 2 מ"מ. (F) בולוס המכיל 1 x 106 תאי PANC1 ב 20 μL של PBS מוזרק לתוך הזנב של הלבלב, באמצעות מזרק המילטון עם מחט 28 גרם. סרגל קנה מידה: 2 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: תחנת עבודה להדמיה המשמשת לניטור גידולי לבלב בעכברים . (A) מקום עבודה להדמיית ארה"ב. (1) מתמר 55 מגה-הרץ; (2) שולחן טיפול בעכבר; (3) מנוע תלת-ממדי; (4) ידית בקרת גובה של מתמר אמריקאי. (B) העכבר מונח על האגף הימני שלו על שולחן הטיפול עם החוטם שלו בצינור ההרדמה (1), העור נמתח, ואת ג'ל ארה"ב מורחים על האגף הימני. (C) המתמר מורד כדי לגעת בעור העכבר וממוקם באופן רוחבי לגוף החיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: התפתחות של קסנוגרפט PCa אורתוטופי בלבלב העכבר . (A) רכישת תמונת US דו-ממדית של מסת הגידול שפותחה לאחר הזרקת תאים מונחי הד. התפתחות הגידול מנוטרת באמצעות הדמיה אמריקאית לאחר 8 ימים של הזרקת תאים, ולאחר מכן רכישה פעם בשבוע עד יום 44, בסך הכל 6 רכישות. הגידול מיוצג על ידי מבנה היפו-אקוגני בפרנכימה הלבלב. המבנה ההיפו-אקוגני מיוצג באופן אקוגרפי על ידי אזור עם הדים בעוצמה מופחתת, בהשוואה לפרנכימה שמסביב או למבנה שכן. סרגל קנה מידה: 2 מ"מ. (B) מהלך הזמן של נפח הגידול של PDAC אורתוטופי שמקורו בתאי PANC1. (C) הדמיית US של מסת גידול ביום 43 לאחר הזרקת התא. סרגל קנה מידה: 2 מ"מ.3D עיבוד מחדש של מסת הגידול מוצג בכניסה. (D) לאחר ההדמיה מרדימים את בעלי החיים, ומתבצעת בדיקת נמק. (1) מסת הגידול; (2) חלק קטן מלבלב בריא; (3) טחול; (4) קיבה; (5) כבד. סרגל קנה מידה: 5 מ"מ. (E) המטוקסילין וכתם אוזין של מסת הגידול בהגדלה של פי 4. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. בצד העליון הימני של הלוח, כניסה של מסת הגידול שבו תאי acinar הלבלב עדיין גלויים; הגדלה של 40x. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות שהשימוש בהדמיית US נפוץ במרפאה, התפתחות גידולים במודלים פרה-קליניים רבים של עכברים מתוארת בדרך כלל באמצעות הדמיה ביולומינסנטית11. זו האחרונה היא דרך עקיפה להעריך את השתלת הגידול והרחבתו והיא גם אינה מספקת קינטיקה אמינה לגידול גידול. במחקר הנוכחי יישמנו הדמיית US לביצוע הזרקת תאים וכן למעקב אחר התפתחות הגידול. הפרוטוקול שתיארנו והתוצאות שסיפקנו מייצגים פריצת דרך רלוונטית במחקר PCa.
השיטה מונחית ארה"ב המתוארת כאן להזרקת תאי גידול בלבלב היא פולשנית מינימלית ומאפשרת להתגבר על חסרונות רבים הנגרמים על ידי ההליך הכירורגי, אשר מוחל בדרך כלל כדי להקים מודל עכבר PCa אורתוטופי. למרות שאינדיקציות על שיעור התמותה או תופעות הלוואי כתוצאה מההליך הכירורגי חסרות בספרות, הניסיון שלנו מצביע על כך שהשיטה הכירורגית מייצרת תמותה גבוהה יותר לאחר הניתוח באחוז נמוך של מקרים (סביב 10%), עם סבל תכוף של בעלי חיים, הדורש כמות מסוימת של זמן החלמה12. בנוסף, התפרים המיושמים לאחר הניתוח מונעים יישום נכון של הליכי הדמיה. התוצאה היא רכישת תמונות אמריקאיות באיכות ירודה מאוד, מה שמוביל לאקסטרפולציה לא מדויקת של נתונים הנגרמת על ידי חפצים, כגון אזורי הדהוד וצללים. בהתחשב בכל העובדות הללו, שיטה שאינה זקוקה להליך כירורגי להקמת מודל עכבר אורתוטופי עדיפה ומומלצת מאוד למטרות מחקר פרה-קליני. יתר על כן, בהיותו זעיר פולשני, זמן ההחלמה מחיסון התאים מהיר יותר וסבלם של בעלי החיים הוא מינימלי בשיטה המודרכת על ידי ארה"ב. יתרון גדול הוא שהשיטה בהנחיית ארה"ב תואמת את השימוש בהרדמה איזופלורן המאפשרת אינדוקציה והתאוששות מהירות יותר, השפעה פחותה יחסית על תפקוד הלב וכלי הדם ועל ויסות אוטומטי של זרימת הדם במוח, בהשוואה לשיטות הרדמה אחרות (כלומר, תמיסת קטמין/קסילזין). באופן כללי, חילוף החומרים הזניח של איזופלוראן הופך אותו לשימושי במיוחד בניהול הרדמה13. ואכן, בערך 5 דקות לאחר סיום ההליך, בעלי חיים חוזרים להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה סטרנלית. בנוסף, עכברים הם pre-medicated עם משכך כאבים (carprofen) כדי למזער את הכאב, ואין צורך בטיפולים לאחר הניתוח בשל ההתאוששות המהירה והשלמה.
עם זאת, ישנם כמה שלבים מכריעים לפתרון בעיות בהליך שיש לקחת בחשבון. מספר התאים שיש לחסן לא יעלה על 1 x 10 6 תאים ונפח התא inoculum לא צריך להיות גדול מ 20 μL כדי למנוע את הסיכון של דליפתתאים אל מחוץ ללבלב. הזרקת תאים צריכה להתבצע מיד לאחר ניתוקם, כדי למנוע ירידה בחיוניות התא. לאחר הזרקת התא, יש צורך לחכות לפחות 10 שניות לפני הסרת המחט כדי למנוע דליפה של תאים מתוך הלבלב.
אחד ההיבטים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול הנוכחי נוגע למיקום העכבר על פלטפורמת החיה. העכבר חייב להיות שוכב על צדו הימני על שולחן הטיפול בבעלי חיים ואת העור חייב להיות מתוח. אם העור אינו נמתח כראוי במהלך ההזרקה, המחט תתקשה לחדור ולהיכנס ללבלב, עם הסיכון של תאים שנשפכו מתוך הלבלב. ההזרקה מונחית האולטרסאונד לייצור מודל עכבר PCa תוארה לראשונה על ידי Huynh et al. בשנת 201114. כאן, התמקדנו במתודולוגיה המתאימה לייצור מודל כזה, המתאר בפירוט את כל השלבים כדי להפוך אותו לשחזור. יתר על כן, בהשוואה ל- Huynh et al.14, הצגנו כמה חידושים הקשורים בעיקר להתקדמות בטכנולוגיה האמריקאית שהתרחשה ב -5 השנים האחרונות. בפרוטוקול הנוכחי, מומלץ מאוד להשתמש במזרק המילטון עם מחט נוקשה וזווית משופעת של 30° כדי להשיג דיוק טוב יותר במהלך הזרקת התא ולמזער את דליפת התא. לבסוף, במהלך ההזרקה בהנחיית ארה"ב, עכברים הוחזקו בצדם הימני על פלטפורמת בעלי החיים, ואילו ב-Huynh et al.14 העכברים הוכנסו למשענת הגב. המיקום הצדדי של העכבר מאפשר לדמיין את הזנב של הלבלב, ממש מתחת לטחול, אשר פועל כייחוס חזותי (איור 1B) במהלך הזרקת התא, ומבטיח את יכולת השחזור של הטכניקה.
כמו בטכניקות אחרות, יש גם כמה מגבלות בהליך המונחה על ידי ארה"ב. המגבלה הגדולה ביותר היא כי ההזרקה יכולה להתבצע רק בזנב הלבלב כי הגוף והראש מכוסים על ידי איברים אחרים וקשה להגיע עם המחט. יתר על כן, מגבלה נוספת הקשורה לשימוש בהדמיית US לניטור צמיחת הגידול היא חוסר היכולת לדמיין את כל מסת הגידול כאשר הוא הופך להיות גדול מדי, לאחר 6 שבועות של חיסון (איור 3C-E). אמנם, כמויות גדולות כאלה אינן מחקות את הקורס הקליני של המחלה.
יתרון נוסף של מודל PCa המתקבל עם הפרוטוקול המתואר כאן הוא השתלת תאים איטית וצמיחה של מסות הגידול (איור 3B). זה אידיאלי לזיהוי מדויק של נקודת המוצא להתערבות פרמקולוגית וניטור טוב יותר של ההשפעות של התערבויות טיפוליות לאורך זמן.
לבסוף, הטכניקה המתוארת היא דוגמה ליישום עקרונות 3Rs הכוללים עידון של טכניקה ופיתוח הליך הממזער כאב, סבל, מצוקה או נזק מתמשך, ומשפר באופן ישיר את רווחת בעלי החיים במחקר.
יישומים עתידיים של מודל PCa שהושגו על ידי הזרקה מונחית ארה"ב כוללים מחקרים שמטרתם לפתח טיפולים טיפוליים מתאימים או שילובי טיפולים. למעשה, השימוש בטכניקות in vivo חדשניות כאלה יכול להיות משולב עם שימוש במולקולות קטנות, למשל, נוגדנים, שברי נוגדנים וצמדי נוגדנים-תרופות (ADC), עם גישה תרגנוסטית. זה האחרון יכול לשמש לבד, למטרות טיפוליות, כפי שהקבוצה שלנו הוכיחה בעבודה האחרונה שלנו15 או לאחר הצמדת פלואורופור נכונה, במטרה לעקוב אחר צמיחת הגידול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, מענק מס '15627, IG 21510, ו- IG 19766) ל- AA, PRIN משרד האוניברסיטה והמחקר האיטלקי (MIUR). מינוף ידע בסיסי ברשת תעלות יונים בסרטן לאסטרטגיות טיפוליות חדשניות (LIONESS) 20174TB8KW ל- AA, pHioniC: מענק Horizon 2020 של האיחוד האירופי ללא 813834 ל- AA. CD נתמך על ידי מלגת AIRC עבור איטליה ID 24020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt, Germany | P5856 | |
| 3D-Mode package | Visualsonics Fujifilm, Italy | Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging | |
| Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel | PARKER LABORATORIES, INC. | 150 | Gel for ultrasound |
| Athymic Mice (Nude-Foxn1nu) | ENVIGO, Italy | 69 | 20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight |
| CO2 Incubator Function Line | Heraeus Instruments, Germany | BB16-ICN2 | |
| Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature | Visualsonics Fujifilm, Italy | 11426 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Euroclone Spa, Italy | ECM0101L | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) | Euroclone Spa, Italy | ECB4004L | |
| Eppendorf (1.5mL) | Sarstedt, Germany | 72.690.001 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone Spa, Italy | ECS0170L | |
| Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge | Permax S.r.l., Italy | 7803-02 | |
| Hamilton Syringe 705RM 50 µL | Permax S.r.l., Italy | 7637-01 | |
| Isoflo (250 mL) | Ecuphar | 7081219 | |
| L-glutamine 100X | Euroclone Spa, Italy | ECB3000D | |
| Mouse Handling table II | Visualsonics Fujifilm, Italy | 50249 | |
| MX550D: 55 MHz MX Series Transducer | Visualsonics Fujifilm, Italy | 51069 | Ultrasound Transducers |
| Oxygen/isofluorane mixer | Angelo Franceschini S.r.l. | LFY-I-5A | |
| PANC1 cell line | American Type Culture Collection (ATCC), USA | CRL-1469 | |
| Rimadyl (carprofen) | Pfizer | 11319 | 20 mL, injection solution |
| Trypsin-EDTA 1X in PBS | Euroclone Spa, Italy | ECB3052D | |
| Vet ointment for eyes, Systane nighttime | Alcon | 509/28555-1 | |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version) | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-12055 | complete with gas chamber |
| Vevo Imaging Station 2 | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-11983 | Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount |
| Vevo Lab | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20034 | Data Analysis Software |
| Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20054 | Includes analytic software package for B-mode |
| Vevo Photoacoustic Enclosure | Visualsonics Fujifilm, Italy | 53157 |
References
- Zeng, S., et al.
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: The unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the united states. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Rawla, P., Sunkara, T., Gaduputi, V. Epidemiology of pancreatic cancer: Global trends, etiology and risk factors. World Journal of Oncology. 10 (1), 10 (2019).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L.
- Hofschroer, V., et al. Ion channels orchestrate pancreatic ductal adenocarcinoma progression and therapy. Frontiers in Pharmacology. 11, 586599 (2021).
- Adamska, A., Domenichini, A., Falasca, M. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Current and evolving therapies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1338 (2017).
- Qiu, W., Su, G. H. Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models. Methods in Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice. Cancer Metastasis Reviews. 17 (3), 279-284 (1998).
- Qiu, W., Su, G. H. Challenges and advances in mouse modeling for human pancreatic tumorigenesis and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 32 (1-2), 83-107 (2013).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. DMM Disease Models and Mechanisms. 11 (7), (2018).
- Lottini, T., et al. Micro-ultrasound, non-linear contrast mode with microbubbles and Optical Flow software tool: together for a new translational method in the study of the tumoral rheology microenvironment. WMIC 2017: Imaging the Future from Molecules to Medicine. , (2017).
- Ludders, J. W. Advantages and guidelines for using isoflurane. The Veterinary Clinics of North America Small Animal Practice. 22 (2), 328-331 (1992).
- Huynh, S., et al. Development of an orthotopic human pancreatic cancer xenograft model using ultrasound guided injection of cells. PLoS One. 6 (5), 20330 (2011).
- Duranti, C., et al. Harnessing the hERG1/β1 Integrin Complex via a Novel Bispecific Single-chain Antibody: An Effective Strategy against Solid Cancers. Molecular Cancer Therapeutics. 20 (8), 1338-1349 (2021).
