Summary
हम मानव अग्नाशयी कैंसर कोशिकाओं के अल्ट्रासाउंड-निर्देशित इंजेक्शन और अल्ट्रासाउंड इमेजिंग द्वारा विवो में ट्यूमर के विकास की बाद की निगरानी द्वारा न्यूनतम इनवेसिव ऑर्थोटोपिक अग्नाशयी कैंसर मॉडल उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
अग्नाशय का कैंसर (पीसीए) दुनिया भर में सबसे घातक कैंसर प्रकारों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है। पीसीए घातकता के कारण मुख्य रूप से इसके आंतरिक घातक व्यवहार और चिकित्सीय उपचार के लिए उच्च प्रतिरोध पर निर्भर करते हैं। दरअसल, कई प्रयासों के बावजूद, मानक कीमोथेरेपी और अभिनव लक्ष्य उपचार दोनों प्रीक्लिनिकल मूल्यांकन से नैदानिक सेटिंग में स्थानांतरित होने पर काफी हद तक विफल रहे हैं। इस परिदृश्य में, पीसीए की विवो विशेषताओं में बेहतर नकल करने वाले प्रीक्लिनिकल माउस मॉडल के विकास को नई विकसित दवाओं का परीक्षण करने की तत्काल आवश्यकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल पीसीए के माउस मॉडल को उत्पन्न करने की एक विधि का वर्णन करता है, जिसे मानव अग्नाशय ट्यूमर कोशिकाओं के अल्ट्रासाउंड-निर्देशित इंजेक्शन द्वारा प्राप्त ऑर्थोटोपिक जेनोग्राफ्ट द्वारा दर्शाया गया है। इस तरह के एक विश्वसनीय और न्यूनतम इनवेसिव प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम विवो एनग्राफमेंट और ट्यूमर द्रव्यमान के विकास के सबूत भी प्रदान करते हैं, जिसे अल्ट्रासाउंड (यूएस) इमेजिंग द्वारा निगरानी की जा सकती है। यहां वर्णित पीसीए मॉडल का एक उल्लेखनीय पहलू समय के साथ ट्यूमर द्रव्यमान का धीमा विकास है, जो औषधीय उपचार के लिए शुरुआती बिंदु की सटीक पहचान और चिकित्सीय हस्तक्षेप के प्रभावों की बेहतर निगरानी की अनुमति देता है। इसके अलावा, यहां वर्णित तकनीक 3आर सिद्धांतों के कार्यान्वयन का एक उदाहरण है क्योंकि यह दर्द और पीड़ा को कम करता है और सीधे अनुसंधान में जानवरों के कल्याण में सुधार करता है।
Introduction
पीसीए, और इसका सबसे आम रूप, अग्नाशयी डक्टल एडेनो कार्सिनोमा (पीडीएसी), कैंसर से संबंधित मृत्यु के सबसे आम कारणों में से एक है, जिसमें 1 साल की जीवित रहने की दर 20% से कम है और चरण 1,2 की परवाह किए बिना 8% की 5 साल की जीवित रहने की दर है। रोग लगभग हमेशा घातक होता है, और इसकी घटनाओं को अगले वर्षों में लगातार बढ़ने का अनुमान है, अन्य कैंसर प्रकारों के विपरीत, जिनकीघटनाओं में गिरावट आ रही है। देर से कैंसर का पता लगाने, तेजी से प्रगति की प्रवृत्ति और विशिष्ट उपचारों की कमी जैसे कारक पीसीए4 के खराब पूर्वानुमान का कारण बनते हैं। अधिक सटीक प्रीक्लिनिकल माउस मॉडल के विकास के लिए कैंसर अनुसंधान में महान प्रगति प्राप्त की गई है। मॉडल ने कैंसर के अंतर्निहित आणविक तंत्र की समझ और नएउपचारों के विकास के लिए उचित अंतर्दृष्टि प्रदान की है। ये प्रगति पीसीए पर खराब रूप से लागू होती है, जो हाल के प्रयासों के बावजूद, वर्तमान कीमोथेरेपीउपचारों के लिए प्रतिरोधी बनी हुई है। इन कारणों से, रोगियों की संभावनाओं में सुधार के लिए नए दृष्टिकोण का विकास अनिवार्य है।
वर्षों से, कई पीसीए माउस मॉडल विकसित किए गए हैं, जिनमें जेनोग्राफ्ट्स भी शामिल हैं, जोआजकल सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले मॉडल हैं। प्रत्यारोपित ट्यूमर कोशिकाओं के स्थान के आधार पर जेनोग्राफ्ट मॉडल को चमड़े के नीचे हेटरोटोपिक और ऑर्थोटोपिक के रूप में वर्गीकृत किया गया है। चमड़े के नीचे हेटरोटोपिक जेनोग्राफ्ट्स को पूरा करना आसान और सस्ता है, लेकिन पीसीए की कुछ विशिष्ट विशेषताओं (यानी, अजीबोगरीब ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट, फाइब्रोटिक ऊतक, हाइपोक्सिया, अम्लता और एंजियोजेनेसिस के संचय की विशेषता) 6,7 से चूक जाते हैं। यह बताता है कि क्यों चमड़े के नीचे के जेनोग्राफ्ट्स अक्सर चिकित्सीय उपचार के लिए मजबूत डेटा प्रदान करने में विफल रहते हैं, जिससे नैदानिक सेटिंग8 में अनुवादित होने पर विफलताएं होती हैं। दूसरी ओर, ऑर्थोटोपिक जेनोग्राफ्ट्स ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट से अधिक निकटता से मिलते जुलते हैं, जिससे रोग के प्राकृतिक विकास की बेहतर नकल होती है। इसके अलावा, ऑर्थोटोपिक जेनोग्राफ्ट्स मेटास्टैटिक प्रक्रिया और पीसीए की आक्रामक विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए अधिक उपयुक्त हैं, जो लगभग चमड़े के नीचे के मॉडल9 में नहीं होते हैं। कुल मिलाकर, ऑर्थोटोपिक जेनोग्राफ्ट माउस मॉडल आजकल प्रीक्लिनिकल दवा परीक्षण 9,10 करने के लिए पसंद किए जाते हैं। ऑर्थोटोपिक जेनोग्राफ्ट्स आमतौर पर अग्न्याशय में कोशिकाओं या बहुत छोटे ट्यूमर ऊतक टुकड़ों को प्रत्यारोपित करने के लिए सर्जिकल प्रक्रियाओं पर भरोसा करते हैं। दरअसल, पीसीए के सर्जिकल मॉडल पर आधारित कई पेपर पिछलेकुछ दशकों में प्रकाशित हुए हैं। हालांकि, ऑर्थोटोपिक ट्यूमर मॉडल की स्थापना के लिए शल्य चिकित्सा प्रक्रिया की गुणवत्ता और परिणाम ऑपरेटर के तकनीकी कौशल पर दृढ़ता से निर्भर करते हैं। ट्रांसलेशनल नैदानिक दृष्टिकोण के लिए एक सफल ऑर्थोटोपिक पीसीए जेनोग्राफ्ट के लिए एक और महत्वपूर्ण बिंदु अनुमानित विकास कैनेटीक्स के साथ स्थानीयकृत बीमारी स्थापित करने की संभावना है।
इन मुद्दों को संबोधित करने के लिए, यहां हम एक ऑर्थोटोपिक पीसीए जेनोग्राफ्ट का उत्पादन करने के लिए एक अभिनव प्रक्रिया का वर्णन करते हैं, जो इम्यूनोडेफिशिएंसी चूहों में अग्न्याशय की पूंछ में मानव पीसीए कोशिकाओं के अल्ट्रासाउंड (यूएस) निर्देशित इंजेक्शन का फायदा उठाता है। यह प्रक्रिया एक विश्वसनीय पीसीए माउस मॉडल उत्पन्न करता है। ट्यूमर के विकास के बाद विवो में यूएस इमेजिंग द्वारा किया जाता है।
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Protocol
वर्तमान प्रोटोकॉल को प्राधिकरण संख्या 843/2020-पीआर के साथ इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय से अनुमोदन प्राप्त हुआ। सड़न रोकनेवाली स्थितियों को सुनिश्चित करने के लिए, जानवरों को फ्लोरेंस विश्वविद्यालय के अनुसंधान पशु विवेरियम (सी.एस.ए.एल.) के बैरियर रूम के अंदर बनाए रखा गया था। सभी प्रक्रियाओं को उसी स्थान पर किया गया था जहां चूहों को फ्लोरेंस विश्वविद्यालय (इटली) की LIGeMA सुविधा में रखा गया था।
1. सेल की तैयारी
- पीसीए सेल लाइन से कल्चर पीसीए कोशिकाएं 100 मिमी पेट्री डिश में डलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) युक्त 2% एल-ग्लूटामाइन और 10% भ्रूण बोवाइन सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक हैं।
- नॉर्मोक्सिया में कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 के साथ इनक्यूबेट करें।
- ट्रिप्सिन के साथ कोशिकाओं को अलग करें। टीकाकरण से 1 घंटे पहले पीबीएस के 20 μL में 1 x 106 कोशिकाओं की गणना करें, और पुन: निलंबित करें।
2. अल्ट्रासाउंड-निर्देशित इंजेक्शन (यूएस-जीआई) के लिए माउस की तैयारी
नोट: बाँझ परिस्थितियों में निम्नलिखित चरण किए गए थे। यूएस-निर्देशित इंजेक्शन की पूरी प्रक्रिया, संज्ञाहरण की शुरुआत से लेकर माउस को पशु मंच से हटा दिए जाने तक, पूर्ण माउस रिकवरी के लिए लगभग 10-12 मिनट और 5 मिनट लगते हैं।
- हस्तक्षेप से ठीक पहले, 27 ग्राम सुई के साथ ट्यूबरकुलिन सिरिंज का उपयोग करके 5 मिलीग्राम / किग्रा की अंतिम खुराक पर कारप्रोफेन (एनएसएआईडी) को (एससी) या 5 मिलीग्राम / किलोग्राम की अंतिम खुराक पर ट्रामाडोल का प्रशासन करें।
नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए, 20 एथिमिक न्यूड-फॉक्सएन1नू मादा चूहों का उपयोग किया गया था। चूहे 8 सप्ताह के थे और उनका वजन 20-22 ग्राम था। - इमेजर चालू करें और ट्रांसड्यूसर पैनल से एप्लिकेशन मेनू पर माउस (छोटा) पेट का चयन करें। सुनिश्चित करें कि बी-मोड (ब्राइटनेस मोड) इमेजिंग विंडो दिखाई देती है, और सिस्टम बी-मोड डेटा प्राप्त करने के लिए तैयार है।
नोट: बी-मोड सिस्टम का डिफ़ॉल्ट इमेजिंग मोड है। सिस्टम इको सिग्नल आयाम के आधार पर चमक स्तर निर्दिष्ट करके दो-आयामी (2 डी) दृश्य में प्रतिध्वनि प्रदर्शित करता है। शारीरिक संरचनाओं का पता लगाने के लिए बी-मोड सबसे प्रभावी मोड है।- अध्ययन ब्राउज़र पर जाएँ.
- नए अध्ययन का चयन करें और अध्ययन का नाम और जानकारी टाइप करें, यानी, अध्ययन की तारीख, आदि।
- श्रृंखला नाम में सभी आवश्यक जानकारी भरें, अर्थात, पशु तनाव, आईडी, जन्म तिथि, आदि।
- टैप किया गया; कार्यक्रम बी-मोड इमेजिंग के लिए तैयार है।
- एनेस्थीसिया प्रेरण कक्ष में माउस को 4% आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके 2 एल / मिनट ओ 2 के गैस प्रवाह के साथ एनेस्थेटाइज करें।
नोट: लगभग 4 मिनट उचित संज्ञाहरण के लिए पर्याप्त हैं (प्रति मिनट लगभग 50-60 सांस लेना)। - एक बार जब माउस एनेस्थेटाइज हो जाता है, तो माउस हैंडलिंग टेबल की ओर आइसोफ्लुरेन को निर्देशित करने के लिए एनेस्थेटिक मशीन के कनेक्शन को बदलें।
- एनेस्थेटाइज्ड माउस को हैंडलिंग टेबल पर (37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म) अपने दाहिने फ्लैंक पर नाक शंकु में अपने स्नूट के साथ रखें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि माउस को ओ 2 के 0.8 एल / मिनट के गैस प्रवाह के साथ 2% आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके एनेस्थेटाइज्ड कियागया है (चित्रा 1 ए)।
- संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए माउस की आंखों पर कृत्रिम आँसू की एक बूंद लागू करें।
- चिपकने वाली धुंध के साथ पशु मंच पर इलेक्ट्रोड पैड पर दाएं हाथ, दाएं पैर और पूंछ को मजबूती से टेप करें।
नोट: माउस की श्वसन दर और इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम (ईसीजी) इलेक्ट्रोड पैड के माध्यम से दर्ज किए जाते हैं।
3. यूएस-जीआई विधि द्वारा अग्न्याशय में PANC1 कोशिकाओं का इंजेक्शन
- 70% इथेनॉल के साथ माउस त्वचा को साफ करें और चिपकने वाली धुंध का उपयोग करके बाएं फ्लैंक की त्वचा को फैलाकर रखें।
नोट: सुई के सम्मिलन के प्रतिरोध को कम करने और सुई विरूपण को रोकने के लिए त्वचा को फैलाकर रखना महत्वपूर्ण है। - 20 एमएल सिरिंज (सुई के बिना) का उपयोग करके माउस के पेट और बाएं फ्लैंक पर अल्ट्रासाउंड जेल लागू करें।
- यूएस ट्रांसड्यूसर की ऊंचाई नियंत्रण नॉब का उपयोग करके, माउस के बाएं फ्लैंक को छूने के लिए ट्रांसड्यूसर को कम करें और इसे जानवर के शरीर पर अनुप्रस्थ रूप से रखें।
- बी-मोड इमेजिंग (चित्रा 1 बी) का उपयोग करके ट्रांसड्यूसर डिस्प्ले पर अग्न्याशय की कल्पना करने के लिए ट्रांसड्यूसर को स्थानांतरित करें।
- एक 50 μL हैमिल्टन सिरिंज तैयार करें, जिसमें 30 मिमी 28 G सुई के साथ 20 μL PBS में निलंबित 1 x 106 PANC1 कोशिकाएं हों और सिरिंज को उपयुक्त धारक पर रखें (चित्रा 1C)।
नोट: उपयोग करने से पहले, सिरिंज सुई को 5-10 मिनट की अवधि के लिए 70% इथेनॉल के साथ साफ करें। - होल्डर माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करके, सिरिंज को माउस की त्वचा पर कम करें, सुई को ऊपर और अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर के समान विमान में रखें, ट्रांसड्यूसर के साथ 45 ° का कोण बनाएं (चित्रा 1 डी)।
नोट: इस चरण से आगे, डिस्प्ले पर अमेरिकी छवि की निगरानी करके आगे बढ़ें। - माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करके, त्वचा को छिद्रित करें और सिरिंज सुई को अग्न्याशय में डालें और इसके प्रक्षेपवक्र का पालन करने के लिए डिस्प्ले पर अमेरिकी छवि का निरीक्षण करें (चित्रा 1 ई)।
नोट: इंजेक्शन से पहले, अग्न्याशय की पूंछ को एक संदर्भ के रूप में लें जो प्लीहा के पीछे स्थित है और बाईं किडनी के करीब है। - एक बार जब सुई अग्न्याशय में डाली जाती है, तो सिरिंज प्लंजर (चित्रा 1 एफ) पर निरंतर दबाव डालकर सीधे अग्न्याशय में कोशिकाओं वाले 20 μL बोलस इंजेक्ट करें।
नोट: सही इंजेक्शन प्रक्रिया अग्न्याशय में एक छोटे बुलबुले की उपस्थिति और हाइपोचोजेनिक द्रव के प्रवाह से जांच की जाती है, जो सुई की नोक से मुश्किल से दिखाई देती है। - पूरे बोलस इंजेक्शन के बाद सुई को 5-10 सेकंड के लिए छोड़ दें, और फिर धीरे-धीरे इसे वापस ले लें।
- यूएस ट्रांसड्यूसर को हटा दें, फ्लैंक से जेल को साफ करें, और माउस को एक नए पिंजरे में अकेले रखें। जानवर का निरीक्षण तब तक करें जब तक कि वह उरोस्थि पुनरावृत्ति बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले।
4.3D चूहों में अग्नाशय के ट्यूमर की निगरानी के लिए यूएस इमेजिंग
नोट: ट्यूमर के विकास का मूल्यांकन सेल इंजेक्शन के 8 दिन बाद शुरू किया गया था, यूएस-निर्देशित इंजेक्शन ( सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध) के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही उपकरण का उपयोग करके। इसलिए, कुछ प्रक्रियाएं, जैसे सिस्टम इग्निशन (चरण 2.2.), संज्ञाहरण (चरण 2.3. - 2.6.), और पशु मंच पर माउस प्लेसमेंट (चरण 2.7.), प्रोटोकॉल में ऊपर वर्णित पूरी तरह से मेल खाते हैं।
- यूएस इमेजिंग शुरू करने से पहले, वर्कस्टेशन सेट करें जैसा कि चित्रा 2 ए में दिखाया गया है।
- ट्रांसड्यूसर को 3 डी मोटर सिस्टम (चित्रा 2 ए) पर ठीक करें।
- इमेजर चालू करें और अध्ययन ब्राउज़र पर नया अध्ययन चुनें।
- माउस को संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष (4% आइसोफ्लुरेन) में रखें।
- एनेस्थेटाइज्ड माउस को एनेस्थेटिक ट्यूब में अपने स्नूट के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म हैंडलिंग टेबल पर रखें और आइसोफ्लुरेन को 2% तक कम करें (चित्रा 2 बी)।
नोट: यह महत्वपूर्ण है कि माउस को यूएस-निर्देशित इंजेक्शन के समान स्थिति में रखा जाए, ताकि समान शारीरिक संदर्भों को बनाए रखा जा सके। - माउस की आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम की एक बूंद लागू करें।
- माउस के पेट और बाएं फ्लैंक पर अल्ट्रासाउंड जेल की एक परत लागू करें।
- बाएं फ्लैंक त्वचा को छूने के लिए अनुप्रस्थ अभिविन्यास में 55 मेगाहर्ट्ज ट्रांसड्यूसर को इस तरह रखें कि अग्न्याशय लगभग केंद्रित हो (चित्रा 2 सी)।
- अनुप्रस्थ अभिविन्यास में पूरे अग्न्याशय की छवियों को प्राप्त करने के लिए 3 डी मोटर का उपयोग करें, आदर्श रूप से प्रति अधिग्रहण 90-100 फ्रेम इकट्ठा करें (व्यक्तिगत पसंद के आधार पर फ्रेम की संख्या भिन्न हो सकती है)।
- इमेजर टचपैड पर 3 डी मोटर स्थिति का चयन करें।
- दोनों छोरों से पूरे अग्न्याशय की छवियों को प्राप्त करने के लिए कर्सर को स्थानांतरित करके स्कैनिंग दूरी इंगित करें।
- स्कैन फ्रेम का चयन करें और 3 डी अधिग्रहण शुरू करें।
- एक बार 3 डी इमेजिंग हो जाने के बाद, ट्रांसड्यूसर को हटा दें, जेल को त्वचा से साफ करें, और माउस को वसूली के लिए एक नए पिंजरे में अकेले रखें। जानवर का निरीक्षण तब तक करें जब तक कि वह उरोस्थि पुनरावृत्ति बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले।
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Representative Results
ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के बाद, चूहों को पहले एक आइसोफ्लुरेन कक्ष में एनेस्थेटाइज्ड किया गया था, और पशु मंच (चित्रा 1 ए) पर रखा गया था। अग्न्याशय को अल्ट्रासाउंड इमेजिंग (चित्रा 1 बी) के साथ कल्पना की गई थी। एक 50 μL हैमिल्टन सिरिंज को 1 x 106 PANC1 कोशिकाओं के साथ लोड किया गया था, जिसे पीबीएस के 20 μL में निलंबित कर दिया गया था और सुई धारक पर रखा गया था (चित्रा 1 सी)। सिरिंज और यूएस ट्रांसड्यूसर के बीच इष्टतम कोण 45 ° था (चित्रा 1 डी)। माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करके, सिरिंज सुई को अग्न्याशय में डाला गया था और इसके प्रक्षेपवक्र को यूएस इमेजर डिस्प्ले (चित्रा 1 ई) पर देखा गया था। ट्यूमर कोशिकाओं के 20 μL बोलस को तब अग्न्याशय (चित्रा 1 एफ) में इंजेक्ट किया गया था और 10 सेकंड के बाद सुई को वापस ले लिया गया था। कोशिकाओं के पुनरावृत्ति और पेरिटोनियल गुहा में उनके बाद के रिसाव को रोकने के लिए प्रासंगिक कार्यों का पीछा किया गया था, जैसे कि टीकाकरण के दौरान निरंतर दबाव डालना, सेल इंजेक्शन के बाद रोकना, और 30 डिग्री बेवेल कोण के साथ एक पतली सुई का उपयोग करना। यूएस-निर्देशित इंजेक्शन के बाद, प्रक्रिया के कारण तनाव के किसी भी संकेत का आकलन करने के लिए हर दिन चूहों के वजन की निगरानी की गई। इंजेक्शन वाले चूहों के वजन में कोई महत्वपूर्ण बदलाव नहीं देखा गया था।
3 डी यूएस इमेजिंग को तब ट्यूमर सेल एनग्राफमेंट और ट्यूमर के विकास की निगरानी के लिए लागू किया गया था। सेल इंजेक्शन के बाद 8 वें दिन पहला छवि अधिग्रहण किया गया था, इसके बाद साप्ताहिक अधिग्रहण (कुल 6 अधिग्रहण के लिए) किया गया था। इमेजिंग के दौरान, जानवरों को गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) प्लेटफॉर्म पर दाहिने फ्लैंक पर रखा गया था और आइसोफ्लुरेन गैस (4% पर प्रेरण खुराक और 2% पर रखरखाव खुराक) के साँस द्वारा एनेस्थेटाइज्ड किया गया था (चित्रा 2)। 3 डी मोटर का उपयोग करके बी-मोड में 3 डी अधिग्रहण किया गया था जो ट्रांसड्यूसर को अपनी धुरी के लंबवत विभिन्न वर्गों में पेट को स्कैन करने की अनुमति देता है। 2 डी छवियों की एक श्रृंखला प्राप्त की गई थी, जिसे तब विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा इकट्ठा किया गया था, अंग की 3 डी शारीरिक छवि का पुनर्निर्माण (3 डी पुन: प्रतिपादन)। 3 डी इमेजिंग करने के लिए, 3 डी स्कैन के अधिग्रहण के साथ माउस सांस चरणों को सिंक्रनाइज़ करना आवश्यक था। प्रोटोकॉल की प्रजनन क्षमता की पुष्टि ट्यूमर द्रव्यमान की उपस्थिति से की गई थी, अग्न्याशय की पूंछ में एक हाइपो-इकोजेनिक संरचना (गहरे रंगों के साथ दर्शाया गया है), 20 (80%) जानवरों में से 16 में 8 वें दिन शुरू होता है (चित्रा 3 ए)। चार चूहों (जानवरों के 20%) में, इंजेक्शन के 2 सप्ताह बाद ट्यूमर द्रव्यमान का विकास देखा गया था। इस विलंबता को अग्न्याशय में सुई सम्मिलन की एक उप-इष्टतम प्रक्रिया में वापस पाया जा सकता है, जिसके कारण पेरिटोनियम में कोशिकाओं का रिसाव होता है।
चित्रा 3 बी यूएस-निर्देशित इंजेक्शन माउस मॉडल के यूएस इमेजिंग द्वारा मूल्यांकन किए गए औसत ट्यूमर वॉल्यूम (एन = 16) को दर्शाता है। पिछले अमेरिकी अधिग्रहण के एक दिन बाद, चूहों को पहले सीओ2 इनहेलेशन और फिर गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा इच्छामृत्यु दी गई थी। पेट की गुहा की जांच की गई और ट्यूमर द्रव्यमान को हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण (चित्रा 3 सी-ई) के लिए खोजा गया।
चित्र 1: ऑर्थोटोपिक पीसीए माउस मॉडल की स्थापना के लिए यूएस-निर्देशित विधि। (A) माउस को 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म एक विशेष समर्थन पर दाएं फ्लैंक पर रखा जाता है। (B) यूएस ट्रांसड्यूसर प्लीहा के स्तर पर पशु शरीर के अनुप्रस्थ रूप से स्थित है और अग्न्याशय को बी-मोड में देखा जाता है। माउस पेट का फ्लैंक दृश्य प्लीहा (2) और बाएं गुर्दे (3) के बीच अग्न्याशय (1) को दर्शाता है। स्केल बार: 2 मिमी (सी) हैमिल्टन सिरिंज को उपयुक्त धारक पर रखा गया है। (D) इस स्थिति में, ट्रांसड्यूसर (2) और सिरिंज (1) को 45° के कोण का निर्माण करते हुए तैनात किया जाता है। (ई) सिरिंज (1) की सुई अग्न्याशय की पूंछ में डाली जाती है, प्लीहा के ठीक नीचे। स्केल बार: 2 मिमी (एफ) पीबीएस के 20 μL में 1 x 106 PANC1 कोशिकाओं वाले एक बोलस को अग्न्याशय की पूंछ में इंजेक्ट किया जाता है, जिसमें 28 G सुई के साथ हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग किया जाता है। स्केल पट्टी: 2 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2: चूहों में अग्नाशय के ट्यूमर की निगरानी के लिए उपयोग किए जाने वाले इमेजिंग वर्कस्टेशन। (1) 55 मेगाहर्ट्ज ट्रांसड्यूसर; (2) माउस हैंडलिंग टेबल; (3) 3 डी मोटर; (4) यूएस ट्रांसड्यूसर की ऊंचाई नियंत्रण नॉब। (बी) माउस को एनेस्थेटिक ट्यूब (1) में अपने स्नूट के साथ हैंडलिंग टेबल पर अपने दाहिने फ्लैंक पर रखा जाता है, त्वचा को फैलाया जाता है, और यूएस जेल को दाएं फ्लैंक पर लगाया जाता है। (सी) ट्रांसड्यूसर को माउस की त्वचा को छूने के लिए उतारा जाता है और जानवरों के शरीर में अनुप्रस्थ रूप से तैनात किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: माउस अग्न्याशय में ऑर्थोटोपिक पीसीए जेनोग्राफ्ट का विकास। (ए) इको-निर्देशित सेल इंजेक्शन के बाद विकसित ट्यूमर द्रव्यमान का 2 डी यूएस छवि अधिग्रहण। सेल इंजेक्शन के 8 दिनों के बाद यूएस इमेजिंग के साथ ट्यूमर के विकास की निगरानी की जाती है, इसके बाद कुल 6 अधिग्रहणों के लिए 44 वें दिन तक सप्ताह में एक बार अधिग्रहण किया जाता है। ट्यूमर को अग्नाशयी पैरेन्काइमा में एक हाइपो-इकोजेनिक संरचना द्वारा दर्शाया जाता है। हाइपो-इकोजेनिक संरचना को आसपास के पैरेन्काइमा या पड़ोसी संरचना की तुलना में कम तीव्रता की प्रतिध्वनियों वाले क्षेत्र द्वारा प्रतिध्वनिक रूप से दर्शाया जाता है। स्केल बार: 2 मिमी (बी) पैनसी 1 कोशिकाओं से प्राप्त ऑर्थोटोपिक पीडीएसी के ट्यूमर की मात्रा का समय पाठ्यक्रम। (सी) सेल इंजेक्शन के बाद 43 वें दिन ट्यूमर द्रव्यमान का यूएस इमेजिंग अधिग्रहण। स्केल बार: 2 मिमी.3D ट्यूमर द्रव्यमान का पुन: प्रतिपादन इनसेट में दिखाया गया है। (डी) इमेजिंग के बाद, जानवरों को इच्छामृत्यु दी जाती है, और नेक्रोपसी परीक्षा की जाती है। (1) ट्यूमर द्रव्यमान; (2) एक स्वस्थ अग्न्याशय का एक छोटा सा हिस्सा; (3) तिल्ली; (4) पेट; (5) यकृत। स्केल बार: 5 मिमी (ई) हेमेटॉक्सिलिन और 4 एक्स आवर्धन पर ट्यूमर द्रव्यमान का ईओसिन धुंधला होना। स्केल बार: 200 μm. पैनल के दाईं ओर, ट्यूमर द्रव्यमान का इनसेट जिसमें अग्नाशयी एसिनार कोशिकाएं अभी भी दिखाई देती हैं; 40x आवर्धन। स्केल पट्टी: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
यद्यपि यूएस इमेजिंग का उपयोग क्लिनिक में व्यापक है, कई प्रीक्लिनिकल माउस मॉडल में ट्यूमर के विकास को आमतौर पर बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग11 का उपयोग करके वर्णित किया जाता है। उत्तरार्द्ध ट्यूमर एनग्राफमेंट और विस्तार का मूल्यांकन करने का एक अप्रत्यक्ष तरीका है और यह एक विश्वसनीय ट्यूमर विकास कैनेटीक्स भी प्रदान नहीं करता है। वर्तमान अध्ययन में, हमने सेल इंजेक्शन के प्रदर्शन के साथ-साथ ट्यूमर के विकास की निगरानी के लिए यूएस इमेजिंग लागू की है। हमारे द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल और हमारे द्वारा प्रदान किए गए परिणाम पीसीए अनुसंधान में एक प्रासंगिक सफलता का प्रतिनिधित्व करते हैं।
अग्नाशय ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन के लिए यहां वर्णित यूएस-निर्देशित विधि न्यूनतम इनवेसिव है और सर्जिकल प्रक्रिया के कारण कई कमियों को दूर करने की अनुमति देती है, जिसे आमतौर पर ऑर्थोटोपिक पीसीए माउस मॉडल स्थापित करने के लिए लागू किया जाता है। यद्यपि शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के कारण मृत्यु दर या दुष्प्रभावों पर संकेत साहित्य में गायब हैं, हमारे अनुभव से पता चलता है कि सर्जिकल विधि मामलों के कम प्रतिशत (लगभग 10%) में उच्च पोस्टऑपरेटिव मृत्यु दर पैदा करती है, जिसमें लगातार जानवरों की पीड़ा होती है,जिसमें एक निश्चित मात्रा में वसूली समय की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, सर्जरी के बाद लगाए गए टांके इमेजिंग प्रक्रियाओं के सही आवेदन को रोकते हैं। इसके परिणामस्वरूप बहुत खराब गुणवत्ता वाली अमेरिकी छवियों का अधिग्रहण होता है, जिससे कलाकृतियों के कारण गलत डेटा बहिर्वेशन होता है, जैसे कि पुनरावृत्ति और छाया क्षेत्र। इन सभी तथ्यों को ध्यान में रखते हुए, एक विधि जिसे ऑर्थोटोपिक माउस मॉडल की स्थापना के लिए शल्य चिकित्सा प्रक्रिया की आवश्यकता नहीं है, को प्रीक्लिनिकल अनुसंधान उद्देश्यों के लिए पसंद किया जाता है और दृढ़ता से अनुशंसित किया जाता है। इसके अलावा, न्यूनतम इनवेसिव होने के नाते, सेल टीकाकरण से वसूली का समय तेज होता है और यूएस-निर्देशित विधि में पशु पीड़ा न्यूनतम होती है। एक बड़ा लाभ यह है कि यूएस-निर्देशित विधि आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया के उपयोग के साथ संगत है जो एनेस्थीसिया के अन्य तरीकों (यानी, केटामाइन / ज़ाइलज़िन समाधान) की तुलना में तेजी से प्रेरण और वसूली, कार्डियोवैस्कुलर फ़ंक्शन और सेरेब्रल रक्त प्रवाह ऑटोरेग्यूलेशन पर अपेक्षाकृत कम संयम प्रभाव की अनुमति देता है। कुल मिलाकर, आइसोफ्लुरेन का नगण्य चयापचय इसे एनेस्थेटिकप्रबंधन में विशेष रूप से उपयोगी बनाता है। दरअसल, प्रक्रिया के अंत के लगभग 5 मिनट बाद, जानवरों को उरोस्थि पुनरावृत्ति बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना मिलती है। इसके अलावा, चूहों को दर्द को कम करने के लिए एनाल्जेसिक (कारप्रोफेन) के साथ पूर्व-चिकित्सा की जाती है, और तेजी से और पूर्ण वसूली के कारण कोई पोस्ट-ऑपरेटिव उपचार आवश्यक नहीं है।
फिर भी, प्रक्रिया में कुछ महत्वपूर्ण समस्या निवारण कदम हैं जिन पर विचार किया जाना चाहिए। टीका लगाए जाने वाली कोशिकाओं की संख्या 1 x 106 कोशिकाओं से अधिक नहीं होनी चाहिए और अग्न्याशय से सेल रिसाव के जोखिम से बचने के लिए सेल इनोकुलम की मात्रा 20 μL से अधिक नहीं होनी चाहिए। सेल जीवन शक्ति में कमी से बचने के लिए, उनकी टुकड़ी के तुरंत बाद सेल इंजेक्शन किया जाना चाहिए। सेल इंजेक्शन के बाद, अग्न्याशय से कोशिकाओं के रिसाव से बचने के लिए सुई को हटाने से पहले कम से कम 10 सेकंड तक इंतजार करना आवश्यक है।
वर्तमान प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक पशु मंच पर माउस की स्थिति से संबंधित है। माउस को जानवरों को संभालने की मेज पर अपनी दाईं ओर लेटना चाहिए और त्वचा को फैला हुआ होना चाहिए। यदि इंजेक्शन के दौरान त्वचा ठीक से फैली नहीं है, तो सुई अग्न्याशय को छेदने और प्रवेश करने के लिए संघर्ष करेगी, जिसमें अग्न्याशय से कोशिकाओं के फैलने का खतरा होगा। पीसीए माउस मॉडल का उत्पादन करने के लिए अल्ट्रासाउंड-निर्देशित इंजेक्शन को पहली बार 201114 में ह्यून एट अल द्वारा वर्णित किया गया था। यहां, हमने इस तरह के मॉडल का उत्पादन करने के लिए उपयुक्त पद्धति पर ध्यान केंद्रित किया, इसे प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बनाने के लिए सभी चरणों का विस्तार से वर्णन किया। इसके अलावा, ह्यून एट अल .14 की तुलना में, हमने मुख्य रूप से पिछले 5 वर्षों में अमेरिकी प्रौद्योगिकी में प्रगति से संबंधित कुछ नवाचारों को पेश किया है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, सेल इंजेक्शन के दौरान बेहतर सटीकता प्राप्त करने और सेल रिसाव को कम करने के लिए एक कठोर सुई और 30 ° के बेवेल कोण के साथ हैमिल्टन सिरिंज के उपयोग की जोरदार सिफारिश की जाती है। अंत में, यूएस-निर्देशित इंजेक्शन के दौरान, चूहों को पशु मंच पर इसके दाईं ओर सुरक्षित किया गया था, जबकि ह्यून एट अल.14 चूहों को पृष्ठीय पुनरावृत्ति में रखा गया था। माउस की साइड स्थिति प्लीहा के ठीक नीचे अग्न्याशय की पूंछ की कल्पना करने की अनुमति देती है, जो सेल इंजेक्शन के दौरान एक दृश्य संदर्भ (चित्रा 1 बी) के रूप में कार्य करती है, जिससे तकनीक की प्रजनन क्षमता सुनिश्चित होती है।
अन्य तकनीकों के साथ, यूएस-निर्देशित प्रक्रिया के साथ कुछ सीमाएं भी हैं। सबसे बड़ी सीमा यह है कि इंजेक्शन केवल अग्न्याशय की पूंछ में किया जा सकता है क्योंकि शरीर और सिर अन्य अंगों द्वारा कवर किए जाते हैं और सुई के साथ पहुंचना मुश्किल होता है। इसके अलावा, ट्यूमर के विकास की निगरानी के लिए यूएस इमेजिंग के उपयोग से जुड़ी एक और सीमा पूरे ट्यूमर द्रव्यमान की कल्पना करने में असमर्थता है जब यह टीकाकरण के 6 सप्ताह के बाद बहुत बड़ा हो जाता है (चित्रा 3 सी-ई)। हालांकि, इतनी बड़ी मात्रा रोग के नैदानिक पाठ्यक्रम की नकल नहीं करती है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त पीसीए मॉडल का एक और लाभ ट्यूमर द्रव्यमान (चित्रा 3 बी) की धीमी सेल एनग्राफमेंट और वृद्धि है। यह औषधीय हस्तक्षेप के लिए शुरुआती बिंदु की सटीक पहचान और समय के साथ चिकित्सीय हस्तक्षेप के प्रभावों की बेहतर निगरानी के लिए आदर्श है।
अंत में, वर्णित तकनीक 3आर सिद्धांतों के कार्यान्वयन का एक उदाहरण है जिसमें तकनीक का शोधन और प्रक्रिया का विकास शामिल है जो दर्द, पीड़ा, संकट या स्थायी नुकसान को कम करता है, सीधे अनुसंधान में जानवरों के कल्याण में सुधार करता है।
यूएस-निर्देशित इंजेक्शन द्वारा प्राप्त पीसीए मॉडल के भविष्य के अनुप्रयोगों में उचित चिकित्सीय उपचार या उपचार संयोजनों के विकास के उद्देश्य से अध्ययन शामिल हैं। वास्तव में, विवो तकनीकों में इस तरह के अभिनव का उपयोग छोटे अणुओं के उपयोग के साथ जोड़ा जा सकता है, जैसे, एंटीबॉडी, एंटीबॉडी टुकड़े, और एंटीबॉडी-ड्रग कंजुगेट (एडीसी), एक थेराग्नोस्टिक दृष्टिकोण के साथ। उत्तरार्द्ध का उपयोग अकेले चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए किया जा सकता है, जैसा कि हमारे समूह ने ट्यूमर के विकास की निगरानी के लक्ष्य के साथ हमारे हाल के काम15 या उचित फ्लोरोफोर संयुग्मन के बाद प्रदर्शित किया है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को एए, पीआरआईएन इतालवी विश्वविद्यालय और अनुसंधान मंत्रालय (एमआईयूआर) को एसोचैमज़िओन इटालियाना पर ला राइसर्का सुल कैनक्रो (एआईआरसी, अनुदान संख्या 15627, आईजी 21510 और आईजी 19766) द्वारा समर्थित किया गया था। अभिनव चिकित्सीय रणनीतियों (LIONESS) 20174TB8KW के लिए कैंसर में आयन चैनल नेटवर्क के बुनियादी ज्ञान का लाभ उठाना, pHioniC: यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 एए को कोई 813834 नहीं देता है। सीडी को इटली आईडी 24020 के लिए एआईआरसी फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt, Germany | P5856 | |
| 3D-Mode package | Visualsonics Fujifilm, Italy | Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging | |
| Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel | PARKER LABORATORIES, INC. | 150 | Gel for ultrasound |
| Athymic Mice (Nude-Foxn1nu) | ENVIGO, Italy | 69 | 20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight |
| CO2 Incubator Function Line | Heraeus Instruments, Germany | BB16-ICN2 | |
| Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature | Visualsonics Fujifilm, Italy | 11426 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Euroclone Spa, Italy | ECM0101L | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) | Euroclone Spa, Italy | ECB4004L | |
| Eppendorf (1.5mL) | Sarstedt, Germany | 72.690.001 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone Spa, Italy | ECS0170L | |
| Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge | Permax S.r.l., Italy | 7803-02 | |
| Hamilton Syringe 705RM 50 µL | Permax S.r.l., Italy | 7637-01 | |
| Isoflo (250 mL) | Ecuphar | 7081219 | |
| L-glutamine 100X | Euroclone Spa, Italy | ECB3000D | |
| Mouse Handling table II | Visualsonics Fujifilm, Italy | 50249 | |
| MX550D: 55 MHz MX Series Transducer | Visualsonics Fujifilm, Italy | 51069 | Ultrasound Transducers |
| Oxygen/isofluorane mixer | Angelo Franceschini S.r.l. | LFY-I-5A | |
| PANC1 cell line | American Type Culture Collection (ATCC), USA | CRL-1469 | |
| Rimadyl (carprofen) | Pfizer | 11319 | 20 mL, injection solution |
| Trypsin-EDTA 1X in PBS | Euroclone Spa, Italy | ECB3052D | |
| Vet ointment for eyes, Systane nighttime | Alcon | 509/28555-1 | |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version) | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-12055 | complete with gas chamber |
| Vevo Imaging Station 2 | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-11983 | Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount |
| Vevo Lab | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20034 | Data Analysis Software |
| Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20054 | Includes analytic software package for B-mode |
| Vevo Photoacoustic Enclosure | Visualsonics Fujifilm, Italy | 53157 |
References
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