Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Генерация ортотопического ксенотрансплантата раковых клеток поджелудочной железы с помощью ультразвуковой инъекции

Published: November 1, 2021 doi: 10.3791/63123
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Experimental and Clinical Medicine, Section of Internal Medicine, University of Florence

Summary

Представлен протокол генерации минимально инвазивной ортотопической модели рака поджелудочной железы путем ультразвуковой инъекции раковых клеток поджелудочной железы человека и последующего мониторинга роста опухоли in vivo с помощью ультразвуковой визуализации.

Abstract

Рак поджелудочной железы (PCa) представляет собой один из самых смертоносных типов рака во всем мире. Причины злокачественности PCa в основном зависят от ее внутреннего злокачественного поведения и высокой устойчивости к терапевтическому лечению. Действительно, несмотря на многие усилия, как стандартная химиотерапия, так и инновационные целевые методы лечения существенно потерпели неудачу при переходе от доклинической оценки к клиническим условиям. В этом сценарии разработка доклинических мышиных моделей, лучше имитирующих in vivo характеристики PCa, срочно необходима для тестирования недавно разработанных препаратов. Настоящий протокол описывает способ генерации мышиной модели PCa, представленной ортотопическим ксенотрансплантатом, полученным путем ультразвуковой инъекции опухолевых клеток поджелудочной железы человека. Используя такой надежный и минимально инвазивный протокол, мы также предоставляем доказательства приживления in vivo и развития опухолевых масс, которые можно контролировать с помощью ультразвуковой (УЗИ) визуализации. Примечательным аспектом модели PCa, описанной здесь, является медленное развитие опухолевых масс с течением времени, что позволяет точно определить отправную точку для фармакологического лечения и лучше контролировать эффекты терапевтических вмешательств. Кроме того, описанная здесь методика является примером реализации принципов 3R, поскольку она минимизирует боль и страдания и непосредственно улучшает благополучие животных в исследованиях.

Introduction

PCa и его наиболее распространенная форма, аденокарцинома протоков поджелудочной железы (PDAC), является одной из наиболее распространенных причин смерти, связанной с раком, с 1-летней выживаемостью ниже 20% и 5-летней выживаемостью 8%, независимо от стадии 1,2. Заболевание почти всегда приводит к летальному исходу, и прогнозируется, что его заболеваемость будет непрерывно расти в ближайшие годы, в отличие от других видов рака, заболеваемость которым снижаетсяна 3. Такие факторы, как позднее выявление рака, тенденция быстрого прогрессирования и отсутствие специфических методов лечения, приводят к плохому прогнозу PCa4. Большие успехи в исследованиях рака были получены благодаря разработке более точных доклинических моделей мышей. Модели обеспечили соответствующее понимание понимания молекулярного механизма, лежащего в основе рака, и разработки новых методов лечения5. Эти достижения плохо применимы к PCa, который, несмотря на большие усилия в последнее время, остается устойчивым к современным химиотерапевтическим методам лечения1. По этим причинам разработка новых подходов к улучшению перспектив пациентов является обязательной.

На протяжении многих лет было разработано много моделей мышей PCa, в том числе ксенотрансплантаты, которые являются наиболее широко используемыми моделями в настоящее время5. Модели ксенотрансплантатов классифицируются как подкожные гетеротопные и ортотопные, в зависимости от расположения имплантированных опухолевых клеток. Подкожные гетеротопные ксенотрансплантаты легче и дешевле выполнять, но упускают некоторые характерные особенности PCa (т.е. своеобразное опухолевое микроокружение, характеризующееся накоплением фиброзной ткани, гипоксией, кислотностью и ангиогенезом)6,7. Это объясняет, почему подкожные ксенотрансплантаты часто не могут предоставить надежные данные для терапевтического лечения, что приводит к сбоям при переводе в клинические условия8. С другой стороны, ортотопические ксенотрансплантаты больше напоминают микроокружение опухоли, что приводит к лучшему имитированию естественного развития заболевания. Кроме того, ортотопические ксенотрансплантаты больше подходят для изучения метастатического процесса и инвазивных особенностей ПКа, которые почти не встречаются в подкожных моделях9. В целом, ортотопические ксенотрансплантатные мышиные модели в настоящее время предпочтительны для выполнения доклинического тестирования лекарств 9,10. Ортотопические ксенотрансплантаты обычно полагаются на хирургические процедуры для имплантации либо клеток, либо очень маленьких кусочков опухолевой ткани в поджелудочную железу. Действительно, несколько статей, основанных на хирургических моделях PCa, были опубликованы за последние несколько десятилетий11. Однако качество и результат хирургической процедуры по установлению ортотопической модели опухоли сильно зависят от технического мастерства оператора. Другим ключевым моментом для успешного ортотопического ксенотрансплантата PCa для трансляционного клинического подхода является возможность установления локализованного заболевания с предсказуемой кинетикой роста.

Чтобы решить эти проблемы, здесь мы описываем инновационную процедуру получения ортотопического ксенотрансплантата PCa, использующего ультразвуковую (УЗИ) инъекцию клеток PCa человека в хвост поджелудочной железы у иммунодефицитных мышей. Эта процедура создает надежную модель мыши PCa. Рост опухоли отслеживается in vivo с помощью УЗИ-визуализации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Настоящий протокол получил одобрение Министерства здравоохранения Италии с номером авторизации 843/2020-PR. Чтобы обеспечить асептические условия, животные содержались внутри барьерной комнаты вивария исследуемых животных (Ce.S.A.L.) Флорентийского университета. Все процедуры проводились в том же помещении, где мышей размещали на объекте LIGeMA Флорентийского университета (Италия).

1. Клеточная подготовка

  1. Культивируйте клетки PCa из клеточной линии PCa в 100-миллиметровой чашке Петри, содержащей модифицированную орлиную среду Dulbecco (DMEM), дополненную 2% L-глутамином и 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS).
  2. Инкубируют клетки в нормоксии при 37 °C с 5% CO2.
  3. Отделите клетки трипсином. Подсчитайте и повторно суспендируйте 1 х 106 клеток в 20 мкл PBS за 1 ч до инокуляции.

2. Подготовка мыши к ультразвуковой инъекции (US-GI)

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие этапы были выполнены в стерильных условиях. Вся процедура инъекции под руководством УЗИ, от начала анестезии до удаления мыши с платформы животного, занимает около 10-12 мин плюс 5 мин для полного выздоровления мыши.

  1. Непосредственно перед вмешательством вводят карпрофен (НПВП) подкожно (s.c.) в конечной дозе 5 мг/кг или трамадол в конечной дозе 5 мг/кг с использованием туберкулинового шприца с иглой 27 г.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего протокола было использовано 20 атипичных мышей Nude-Foxn1nu . Мышам было 8 недель и они весили 20-22 г.
  2. Включите тепловизор и выберите Мышь (Маленькая) Брюшная в меню приложения на панели преобразователя. Убедитесь, что отображается окно изображения B-Mode (Режим яркости), и система готова к получению данных B-Mode.
    ПРИМЕЧАНИЕ: B-Mode - это режим создания образов системы по умолчанию. Система отображает эхо в двумерном (2D) представлении, назначая уровень яркости на основе амплитуды эхо-сигнала. B-Mode является наиболее эффективным режимом для обнаружения анатомических структур.
    1. Перейдите в учебный браузер.
    2. Выберите Новое исследование и введите название и информацию об исследовании, т.е. дату исследования и т.д.
    3. Заполните всю необходимую информацию в названии серии, т.е. штамм животного, удостоверение личности, дату рождения и т.д.
    4. Нажмите Готово; программа готова к созданию образов в B-режиме.
  3. Обезболивают мышь в индукционной камере анестезии с использованием 4% изофлурана с расходом газа 2 л/мин O2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно 4 минуты достаточно для правильной анестезии (дыхание около 50-60 вдохов в минуту).
  4. Как только мышь будет обезболена, измените соединение анестезиологической машины, чтобы направить изофлуран к столу обработки мыши.
  5. Поместите обезболенную мышь на правый бок на стол для обработки (нагретый при 37 °C) мордой в носовом конусе, чтобы мышь была обезболена с использованием 2% изофлурана с расходом газа 0,8 л /мин O2 (рисунок 1A).
  6. Нанесите каплю искусственных слез на глаза мыши, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
  7. Плотно приклейте правую руку, правую ногу и хвост к электродным подушечкам на платформе животного клейкой марлей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Частота дыхания мыши и электрокардиограмма (ЭКГ) регистрируются через электродные прокладки.

3. Инъекция клеток PANC1 в поджелудочную железу методом US-GI

  1. Продезинфицируйте кожу мыши 70% этанолом и держите кожу левого бока растянутой с помощью клеевой марли.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сохранение растяжения кожи важно для снижения сопротивления введению иглы и предотвращения деформаций иглы.
  2. Нанесите ультразвуковой гель на живот и левый бок мыши с помощью шприца 20 мл (без иглы).
  3. Используя ручку управления высотой американского преобразователя, опустите датчик, чтобы коснуться левого фланга мыши и поместите его поперечно к телу животного.
  4. Переместите датчик для визуализации поджелудочной железы на дисплее преобразователя с помощью визуализации B-Mode (рисунок 1B).
  5. Подготовьте шприц Гамильтона объемом 50 мкл, содержащий 1 х 106 клеток PANC1, взвешенных в 20 мкл PBS, с иглой 30 мм 28 G и поместите шприц на соответствующий держатель (рисунок 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием продезинфицируйте иглу шприца с 70% этанолом в течение 5-10 минут.
  6. Используя держатель микроманипулятора, опустите шприц к коже мыши, сконуком иглы лицевой стороной вверх и в той же плоскости, что и ультразвуковой преобразователь, образуя угол 45° с датчиком (рисунок 1D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого шага, продолжайте следить за изображением США на дисплее.
  7. Используя микроманипулятор, перфорируйте кожу и вставьте иглу шприца в поджелудочную железу и наблюдайте за изображением США на дисплее, чтобы проследить его траекторию (рисунок 1E).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед инъекцией возьмите хвост поджелудочной железы в качестве эталона, который расположен за селезенкой и близко к левой почке.
  8. После того, как игла введена в поджелудочную железу, введите болюс 20 мкл, содержащий клетки, непосредственно в поджелудочную железу, оказывая постоянное давление на плунжер шприца (рисунок 1F).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Правильная процедура инъекции проверяется наличием небольшого пузырька в поджелудочной железе и потоком гипоэхогенной жидкости, которая едва видна с кончика иглы.
  9. Оставьте иглу на месте на 5-10 с после введения всего болюса, а затем медленно втягивайте ее.
  10. Извлеките американский датчик, очистите гель с бока и поместите мышь в одну в новую клетку. Наблюдайте за животным до тех пор, пока оно не придет в достаточное сознание для поддержания грудинного покоя.

4.3D визуализация США для мониторинга опухолей поджелудочной железы у мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка развития опухоли проводилась начиная с 8 дней после инъекции клетки, с использованием того же инструмента, который использовался для инъекции под руководством УЗИ (указан в Таблице материалов). Следовательно, некоторые процедуры, такие как системное зажигание (этап 2.2.), анестезия (этапы 2.3. - 2.6.) и размещение мыши на платформе животного (этап 2.7.), полностью соответствуют тому, что было описано выше в протоколе.

  1. Перед запуском визуализации США настройте рабочую станцию, как показано на рисунке 2A.
  2. Закрепите преобразователь на системе 3D-двигателя (рисунок 2A).
  3. Включите тепловизор и выберите Новое исследование в учебном браузере.
  4. Поместите мышь в индукционную камеру анестезии (4% изофлурана).
  5. Поместите обезболенную мышь на правый бок на стол для обработки, нагретый при 37 °C мордой в анестезирующую трубку, и уменьшите изофлуран до 2% (рисунок 2B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы мышь была помещена в то же положение, что и инъекция под руководством США, чтобы поддерживать те же анатомические ссылки.
  6. Нанесите каплю ветеринарной мази на глаза мыши.
  7. Нанесите слой ультразвукового геля на живот мыши и левый бок.
  8. Расположите датчик 55 МГц в поперечной ориентации, чтобы коснуться кожи левого фланга таким образом, чтобы поджелудочная железа была приблизительно центрирована (рисунок 2C).
  9. Используйте 3D-двигатель для получения изображений всей поджелудочной железы в поперечной ориентации, в идеале собирая 90-100 кадров за одно приобретение (количество кадров может варьироваться в зависимости от личного выбора).
    1. Выберите положение 3D-двигателя на сенсорной панели тепловизора.
    2. Укажите расстояние сканирования, переместив курсор для получения изображений всей поджелудочной железы с обеих конечностей.
    3. Выберите Сканировать кадры и начните 3D-сбор.
  10. После того, как 3D-визуализация сделана, извлеките датчик, очистите гель с кожи и поместите мышь в одну в новую клетку для восстановления. Наблюдайте за животным до тех пор, пока оно не придет в достаточное сознание для поддержания грудинного покоя.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Следуя протоколу, описанному выше, мышей сначала анестезировали в изофлурановой камере и помещали на платформу животных (рисунок 1А). Поджелудочную железу визуализировали с помощью ультразвуковой визуализации (рисунок 1B). Шприц Гамильтона объемом 50 мкл был загружен 1 x 10 6 ячейками PANC1, взвешенными в 20 мкл PBS и помещенными на держатель иглы (рисунок 1C). Оптимальный угол между шприцем и американским преобразователем составлял 45° (рисунок 1D). С помощью микроманипулятора иглу шприца вводили в поджелудочную железу и наблюдали ее траекторию на дисплее тепловизора США (рисунок 1E). Затем болюс опухолевых клеток объемом 20 мкл вводили в поджелудочную железу (рисунок 1F) и через 10 с иглу втягивали. Проводились соответствующие действия по предотвращению отдачи клеток и их последующей утечки в брюшинную полость, такие как применение постоянного давления во время прививки, пауза после инъекции клетки и использование тонкой иглы с углом скоса 30°. После инъекции под руководством США вес мышей контролировался каждый день, чтобы оценить любые признаки стресса из-за процедуры. Никаких существенных изменений в весе вводимых мышей не наблюдалось.

Затем была применена 3D-визуализация УЗИ для мониторинга приживления опухолевых клеток и развития опухоли. Первое получение изображения было выполнено на 8-й день после инъекции клеток, за которым последовали еженедельные приобретения (в общей сложности 6 приобретений). Во время визуализации животных помещали на правый фланг на нагретую (37 °C) платформу и обезболивали путем вдыхания газообразного изофлурана (индукционная доза в 4% и поддерживающая доза в 2%) (Рисунок 2). 3D-сбор осуществлялся в B-режиме с использованием 3D-двигателя, что позволяет преобразователю сканировать живот в различных участках, перпендикулярных его оси. Была получена серия 2D-изображений, которые затем были собраны аналитическим программным обеспечением, реконструирующим 3D-анатомическое изображение органа (3D-рендеринг). Для выполнения 3D-визуализации необходимо было синхронизировать фазы дыхания мыши с получением 3D-сканирования. Воспроизводимость протокола была подтверждена наличием опухолевой массы, гипоэхогенной структуры (представленной темными цветами) в хвосте поджелудочной железы, начиная с 8-го дня, у 16 из 20 (80%) животных (рисунок 3А). У четырех мышей (20% животных) развитие опухолевой массы наблюдалось через 2 недели после инъекции. Эта латентность может быть прослежена до неоптимальной процедуры введения иглы в поджелудочную железу, которая вызвала утечку клеток в брюшину.

На рисунке 3B показан средний объем опухоли (n = 16), оцененный с помощью визуализации США модели инъекционной мыши под руководством США. На следующий день после последнего приобретения в США мышей усыпляли сначала вдыханиемCO2, а затем вывихом шейки матки. Исследовали брюшную полость и эксплантировали опухолевые массы для гистологического анализа (рисунок 3С-Е).

Figure 1
Рисунок 1: Управляемый США метод создания ортотопической модели мыши PCa. (A) Мышь размещается на правом фланге на специальной опоре, нагретой при 37 °C. (B) Американский преобразователь расположен поперечно к телу животного на уровне селезенки, а поджелудочная железа визуализируется в B-режиме. Боковой вид брюшка мыши показывает поджелудочную железу (1) между селезенкой (2) и левой почкой (3). Шкала: 2 мм. (C) Шприц Гамильтона помещается на соответствующий держатель. D) В этой ситуации преобразователь (2) и шприц (1) расположены под углом 45°. (E) Игла шприца (1) вводится в хвост поджелудочной железы, чуть ниже селезенки. Шкала стержня: 2 мм. (F) Болюс, содержащий 1 х 106 клеток PANC1 в 20 мкл PBS, вводится в хвост поджелудочной железы с помощью шприца Гамильтона с иглой 28 G. Шкала: 2 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Рабочая станция визуализации, используемая для мониторинга опухолей поджелудочной железы у мышей. (A) Рабочее место для визуализации США. (1) преобразователь 55 МГц; (2) Таблица управления мышью; (3) 3D-двигатель; (4) Ручка регулировки высоты американского преобразователя. (B) Мышь помещается на правый фланг стола для обработки мордой в анестезирующей трубке (1), кожа растягивается, а гель США наносится на правый фланг. (C) Датчик опускается, чтобы коснуться кожи мыши, и позиционируется поперечно к телу животного. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Развитие ортотопического ксенотрансплантата PCa в поджелудочной железе мыши. (A) 2D УЗИ получение изображения опухолевой массы, полученного после эхо-управляемой клеточной инъекции. Развитие опухоли контролируется с помощью визуализации УЗИ после 8 дней инъекции клеток, с последующим приобретением один раз в неделю до 44-го дня, в общей сложности 6 приобретений. Опухоль представлена гипоэхогенной структурой в паренхиме поджелудочной железы. Гипоэхогенная структура эхографически представлена областью с эхом пониженной интенсивности, по сравнению с окружающей паренхимой или соседней структурой. Шкала: 2 мм. (B) Временной ход опухолевого объема ортотопического PDAC, полученного из клеток PANC1. (C) Получение УЗИ опухолевой массы на 43-й день после инъекции клеток. Шкала: 2 мм.3D повторная визуализация опухолевой массы показана во вставке. (D) После визуализации животных усыпляют, и проводится обследование некропсии. (1) Опухолевая масса; (2) Небольшая часть здоровой поджелудочной железы; (3) Селезенка; (4) Желудок; (5) Печень. Шкала стержня: 5 мм. (E) Окрашивание гематоксилина и эозина опухолевой массы при 4-кратном увеличении. Шкала: 200 мкм. На правой верхней стороне панели, вставка опухолевой массы, в которой еще видны ацинарные клетки поджелудочной железы; 40-кратное увеличение. Шкала: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Хотя использование визуализации США широко распространено в клинике, развитие опухоли во многих доклинических моделях мышей обычно описывается с использованием биолюминесцентной визуализации11. Последний является косвенным способом оценки приживления и расширения опухоли, а также не обеспечивает надежной кинетики роста опухоли. В настоящем исследовании мы применили визуализацию США для выполнения инъекций клеток, а также для мониторинга развития опухоли. Протокол, который мы описали, и результаты, которые мы предоставили, представляют собой соответствующий прорыв в исследованиях PCa.

Описанный здесь метод под руководством США для инъекции опухолевых клеток поджелудочной железы является минимально инвазивным и позволяет преодолеть многие недостатки, вызванные хирургической процедурой, которая обычно применяется для создания ортотопической модели мыши PCa. Хотя указания на смертность или побочные эффекты из-за хирургической процедуры отсутствуют в литературе, наш опыт показывает, что хирургический метод дает более высокую послеоперационную смертность в низком проценте случаев (около 10%), при частых страданиях животных, требующих определенного количества времени восстановления12. Кроме того, швы, наложенные после операции, препятствуют правильному применению процедур визуализации. Это приводит к получению изображений США с очень низким качеством, что приводит к неточной экстраполяции данных, вызванной артефактами, такими как реверберация и области теней. Принимая во внимание все эти факты, метод, который не нуждается в хирургической процедуре для создания ортотопической мышиной модели, является предпочтительным и настоятельно рекомендуется для доклинических исследовательских целей. Кроме того, будучи минимально инвазивным, время восстановления после посева клеток быстрее, а страдания животных минимальны в методе, управляемом США. Большим преимуществом является то, что метод под руководством УЗИ совместим с использованием изофлурановой анестезии, которая позволяет быстрее индукции и восстановления, относительно менее щадящее влияние на сердечно-сосудистую функцию и ауторегуляцию мозгового кровотока, по сравнению с другими методами анестезии (т.е. раствором кетамина/ксилазина). В целом, незначительный метаболизм изофлурана делает его особенно полезным в анестезиологическом менеджменте13. Действительно, примерно через 5 минут после окончания процедуры животные приходят в достаточное сознание для поддержания грудинного покоя. Кроме того, мышей предварительно лечат анальгетиком (карпрофеном), чтобы минимизировать боль, и послеоперационное лечение не требуется из-за быстрого и полного выздоровления.

Тем не менее, есть некоторые важные шаги по устранению неполадок в процедуре, которые необходимо рассмотреть. Количество клеток, подлежащих вакцинации, не должно превышать 1 х 106 клеток, а объем клеточного инокулята не должен превышать 20 мкл, чтобы избежать риска утечки клеток из поджелудочной железы. Инъекции клеткам следует выполнять сразу после их отслоения, чтобы избежать снижения жизнеспособности клеток. После инъекции клетки необходимо подождать не менее 10 с, прежде чем удалить иглу, чтобы избежать утечки клеток из поджелудочной железы.

Один из наиболее важных аспектов настоящего протокола касается позиционирования мыши на платформе животных. Мышь должна лежать на правом боку на столе для обработки животных, а кожа должна быть растянута. Если кожа не растягивается должным образом во время инъекции, игла будет изо всех сил пытаться проколоть и проникнуть в поджелудочную железу, с риском выплескивания клеток из поджелудочной железы. Ультразвуковая инъекция для получения мышиной модели PCa была впервые описана Huynh et al. в 2011году 14. Здесь мы сосредоточились на методологии, подходящей для создания такой модели, подробно описав все этапы, чтобы сделать ее воспроизводимой. Кроме того, по сравнению с Huynh et al.14, мы внедрили некоторые инновации, в основном связанные с достижениями в области технологий США, которые произошли за последние 5 лет. В настоящем протоколе настоятельно рекомендуется использовать шприц Гамильтона с жесткой иглой и углом скоса 30° для получения большей точности во время инъекции клеток и минимизации утечки клеток. Наконец, во время инъекции под руководством США мыши были закреплены на правой стороне на платформе животных, в то время как в Huynh et al.14 мыши были помещены в спинное лежание. Боковое положение мыши позволяет визуализировать хвост поджелудочной железы, чуть ниже селезенки, который выступает в качестве визуального ориентира (рисунок 1В) во время инъекции клетки, обеспечивая воспроизводимость методики.

Как и в случае с другими методами, существуют также некоторые ограничения с процедурой, управляемой США. Самым большим ограничением является то, что инъекция может быть выполнена только в хвост поджелудочной железы, потому что тело и голова покрыты другими органами и трудно доступны с помощью иглы. Кроме того, еще одним ограничением, связанным с использованием визуализации США для мониторинга роста опухоли, является невозможность визуализации всей опухолевой массы, когда она становится слишком большой, после 6 недель инокуляции (рисунок 3C-E). Хотя, такие большие объемы не имитируют клиническое течение болезни.

Еще одним преимуществом модели PCa, полученной с помощью описанного здесь протокола, является медленное приживление клеток и рост опухолевых масс (рисунок 3B). Это идеально подходит для точной идентификации отправной точки для фармакологического вмешательства и лучшего мониторинга эффектов терапевтических вмешательств с течением времени.

Наконец, описанный метод является примером реализации принципов 3R, включающих совершенствование техники и разработку процедуры, которая сводит к минимуму боль, страдания, дистресс или длительный вред, непосредственно улучшая благополучие животных в исследованиях.

Будущие применения модели PCa, полученной с помощью инъекции под руководством США, включают исследования, направленные на разработку соответствующих терапевтических методов лечения или комбинаций лечения. Фактически, использование таких инновационных методов in vivo может сочетаться с использованием малых молекул, например, антител, фрагментов антител и конъюгатов антител-лекарств (ADC), с терагностическим подходом. Последний может быть использован отдельно, в терапевтических целях, как наша группа продемонстрировала в нашей недавней работе15 или после правильной конъюгации флуорофоров, с целью мониторинга роста опухоли.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, грант No 15627, IG 21510 и IG 19766) для AA, PRIN Итальянского министерства университетов и исследований (MIUR). Использование базовых знаний о сети ионных каналов при раке для инновационных терапевтических стратегий (LIONESS) 20174TB8KW to AA, pHioniC: грант Европейского Союза Horizon 2020 No 813834 для AA. CD был поддержан стипендией AIRC для Италии ID 24020.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Petri dish Sarstedt, Germany P5856
3D-Mode package Visualsonics Fujifilm, Italy Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging
Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel PARKER LABORATORIES, INC. 150 Gel for ultrasound
Athymic Mice (Nude-Foxn1nu) ENVIGO, Italy 69 20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight
CO2 Incubator Function Line Heraeus Instruments, Germany BB16-ICN2
Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature Visualsonics Fujifilm, Italy 11426
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) Euroclone Spa, Italy ECM0101L
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) Euroclone Spa, Italy ECB4004L
Eppendorf (1.5mL) Sarstedt, Germany 72.690.001
FBS (Fetal Bovine Serum) Euroclone Spa, Italy ECS0170L
Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge Permax S.r.l., Italy 7803-02
Hamilton Syringe 705RM 50 µL Permax S.r.l., Italy 7637-01
Isoflo (250 mL) Ecuphar 7081219
L-glutamine 100X Euroclone Spa, Italy ECB3000D
Mouse Handling table II Visualsonics Fujifilm, Italy 50249
MX550D: 55 MHz MX Series Transducer Visualsonics Fujifilm, Italy 51069 Ultrasound Transducers
Oxygen/isofluorane mixer Angelo Franceschini S.r.l. LFY-I-5A
PANC1 cell line American Type Culture Collection (ATCC), USA CRL-1469
Rimadyl (carprofen) Pfizer 11319 20 mL, injection solution
Trypsin-EDTA 1X in PBS Euroclone Spa, Italy ECB3052D
Vet ointment for eyes, Systane nighttime Alcon 509/28555-1
Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version) Visualsonics Fujifilm, Italy VS-12055 complete with gas chamber
Vevo Imaging Station 2 Visualsonics Fujifilm, Italy VS-11983 Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount
Vevo Lab Visualsonics Fujifilm, Italy VS-20034 Data Analysis Software
Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System Visualsonics Fujifilm, Italy VS-20054 Includes analytic software package for B-mode
Vevo Photoacoustic Enclosure Visualsonics Fujifilm, Italy 53157

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zeng, S., et al. Chemoresistance in pancreatic cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20 (18), 4504 (2019).
  2. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  3. Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: The unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the united states. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
  4. Rawla, P., Sunkara, T., Gaduputi, V. Epidemiology of pancreatic cancer: Global trends, etiology and risk factors. World Journal of Oncology. 10 (1), 10 (2019).
  5. Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. Mouse models of pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).
  6. Hofschroer, V., et al. Ion channels orchestrate pancreatic ductal adenocarcinoma progression and therapy. Frontiers in Pharmacology. 11, 586599 (2021).
  7. Adamska, A., Domenichini, A., Falasca, M. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Current and evolving therapies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1338 (2017).
  8. Qiu, W., Su, G. H. Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models. Methods in Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).
  9. Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice. Cancer Metastasis Reviews. 17 (3), 279-284 (1998).
  10. Qiu, W., Su, G. H. Challenges and advances in mouse modeling for human pancreatic tumorigenesis and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 32 (1-2), 83-107 (2013).
  11. Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. DMM Disease Models and Mechanisms. 11 (7), (2018).
  12. Lottini, T., et al. Micro-ultrasound, non-linear contrast mode with microbubbles and Optical Flow software tool: together for a new translational method in the study of the tumoral rheology microenvironment. WMIC 2017: Imaging the Future from Molecules to Medicine. , (2017).
  13. Ludders, J. W. Advantages and guidelines for using isoflurane. The Veterinary Clinics of North America Small Animal Practice. 22 (2), 328-331 (1992).
  14. Huynh, S., et al. Development of an orthotopic human pancreatic cancer xenograft model using ultrasound guided injection of cells. PLoS One. 6 (5), 20330 (2011).
  15. Duranti, C., et al. Harnessing the hERG1/β1 Integrin Complex via a Novel Bispecific Single-chain Antibody: An Effective Strategy against Solid Cancers. Molecular Cancer Therapeutics. 20 (8), 1338-1349 (2021).

Tags

Исследование рака выпуск 177
Генерация ортотопического ксенотрансплантата раковых клеток поджелудочной железы с помощью ультразвуковой инъекции
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lottini, T., Buonamici, M., Duranti, … More

Lottini, T., Buonamici, M., Duranti, C., Arcangeli, A. Generation of an Orthotopic Xenograft of Pancreatic Cancer Cells by Ultrasound-Guided Injection. J. Vis. Exp. (177), e63123, doi:10.3791/63123 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter