Summary
Vi presenterar ett protokoll för att generera en minimalt invasiv ortotopisk bukspottkörtelcancermodell genom ultraljudsstyrd injektion av humana bukspottkörtelcancerceller och efterföljande övervakning av tumörtillväxt in vivo genom ultraljudsavbildning.
Abstract
Bukspottkörtelcancer (PCa) representerar en av de dödligaste cancertyperna i världen. Orsakerna till PCa-malignitet beror huvudsakligen på dess inneboende maligna beteende och höga resistens mot terapeutiska behandlingar. Trots många ansträngningar har både standardkemoterapi och innovativa målterapier väsentligt misslyckats när de flyttats från preklinisk utvärdering till klinisk miljö. I detta scenario är det angeläget att utveckla prekliniska musmodeller som bättre efterliknar in vivo-egenskaper hos PCa för att testa nyutvecklade läkemedel. Detta protokoll beskriver en metod för att generera en musmodell av PCa, representerad av en ortotopisk xenograft erhållen genom ultraljudsstyrd injektion av humana bukspottkörteltumörceller. Med hjälp av ett sådant tillförlitligt och minimalt invasivt protokoll ger vi också bevis på in vivo-engraftment och utveckling av tumörmassor, som kan övervakas genom ultraljudsavbildning (US). En anmärkningsvärd aspekt av PCa-modellen som beskrivs här är den långsamma utvecklingen av tumörmassorna över tiden, vilket möjliggör exakt identifiering av utgångspunkten för farmakologiska behandlingar och bättre övervakning av effekterna av terapeutiska ingrepp. Dessutom är tekniken som beskrivs här ett exempel på implementering av 3R-principerna eftersom den minimerar smärta och lidande och direkt förbättrar djurens välbefinnande i forskning.
Introduction
PCa, och dess vanligaste form, Pankreas duktalt adenokarcinom (PDAC), är en av de vanligaste orsakerna till cancerrelaterad död med en 1-årsöverlevnad lägre än 20% och en 5-årig överlevnad på 8%, oavsett steg 1,2. Sjukdomen är nästan alltid dödlig, och dess förekomst förväntas kontinuerligt växa under de närmaste åren, till skillnad från andra cancertyper, vars förekomst minskar3. Faktorer som sen upptäckt av cancer, tendensen till snabb progression och brist på specifika terapier leder till en dålig prognos för PCa4. Stora framsteg inom cancerforskningen har erhållits tack vare utvecklingen av mer exakta prekliniska musmodeller. Modellerna har gett lämpliga insikter till förståelsen av den molekylära mekanismen bakom cancer och till utvecklingen av nya behandlingar5. Dessa framsteg gäller dåligt för PCa, som trots stora ansträngningar på senare tid fortfarande är resistenta mot nuvarande kemoterapeutiska terapier1. Av dessa skäl är det obligatoriskt att utveckla nya metoder för att förbättra patienternas framtidsutsikter.
Under åren har många PCa-musmodeller utvecklats, inklusive xenografter, som är de mest använda modellerna idag5. Xenograft-modeller klassificeras som subkutan heterotopisk och ortotisk, beroende på placeringen av de implanterade tumörcellerna. Subkutana heterotopiska xenografter är lättare och billigare att åstadkomma men missar vissa karakteristiska egenskaper hos PCa (dvs. den speciella tumörmikromiljön, kännetecknad av ackumulering av fibrotisk vävnad, hypoxi, surhet och angiogenes)6,7. Detta förklarar varför subkutana xenografter ofta misslyckas med att tillhandahålla robusta data för terapeutiska behandlingar som leder till misslyckanden när de översätts till den kliniska inställningen8. Å andra sidan liknar ortotopiska xenografter tumörmikromiljön närmare, vilket leder till bättre efterlikning av den naturliga utvecklingen av sjukdomen. Dessutom är ortotopiska xenografter mer lämpade för att studera den metastatiska processen och de invasiva egenskaperna hos PCa, som nästan inte förekommer i subkutana modeller9. Sammantaget föredras ortotopiska xenograftmusmodeller numera att utföra prekliniska läkemedelstester 9,10. Ortotopiska xenografter förlitar sig vanligtvis på kirurgiska ingrepp för att implantera antingen celler eller mycket små tumörvävnadsbitar i bukspottkörteln. Faktum är att flera artiklar baserade på kirurgiska modeller av PCa har publicerats under de senaste decennierna11. Kvaliteten och resultatet av det kirurgiska ingreppet för upprättandet av en ortotopisk tumörmodell beror emellertid starkt på operatörens tekniska skicklighet. En annan viktig punkt för en framgångsrik ortotopisk PCa xenograft för ett translationellt kliniskt tillvägagångssätt är möjligheten att etablera lokaliserad sjukdom med förutsägbar tillväxtkinetik.
För att ta itu med dessa problem beskriver vi här ett innovativt förfarande för att producera en ortotopisk PCa-xenograft, som utnyttjar ultraljud (US) -styrd injektion av humana PCa-celler i bukspottkörtelns svans hos immunbristmöss. Denna procedur genererar en pålitlig PCa-musmodell. Tumörtillväxten följs in vivo av amerikansk avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll fick godkännande från det italienska hälsoministeriet med tillståndsnummer 843/2020-PR. För att säkerställa aseptiska förhållanden hölls djuren inne i barriärrummet för forskningsdjuret vivarium (Ce.S.A.L.) vid universitetet i Florens. Alla procedurer utfördes i samma utrymme där mössen var inrymda vid LIGeMA-anläggningen vid universitetet i Florens (Italien).
1. Cell förberedelse
- Odla PCa-celler från PCa-cellinjen i en 100 mm petriskål innehållande Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 2% L-glutamin och 10% Fetal Bovine Serum (FBS).
- Inkubera cellerna i normoxi vid 37 °C med 5 %CO2.
- Lossa cellerna med trypsin. Räkna och återsuspendera 1 x 106 celler i 20 μL PBS, 1 h före ympning.
2. Musförberedelse för ultraljudsstyrd injektion (US-GI)
OBS: Följande steg utfördes under sterila förhållanden. Hela proceduren för USA-styrd injektion, från början av anestesin tills musen tas bort från djurplattformen, tar cirka 10-12 min plus 5 min för fullständig musåterhämtning.
- Strax före ingreppet, administrera karprofen (NSAID) subkutant (s.c.) i en slutlig dos på 5 mg/kg eller tramadol i en sista dos på 5 mg/kg med en tuberkulinspruta med en 27 g nål.
OBS: För detta protokoll användes 20 athymiska naken-räv1nu honmöss. Mössen var 8 veckor gamla och vägde 20-22 g. - Slå på avbildaren och välj Mus (liten) buk på applikationsmenyn från givarpanelen. Se till att bildfönstret B-läge (ljusstyrka) visas och att systemet är redo att hämta B-lägesdata.
OBS: B-läge är systemets standardbildläge. Systemet visar ekon i en tvådimensionell (2D) vy genom att tilldela en ljusstyrka baserad på ekosignalamplituden. B-Mode är det mest effektiva läget för att lokalisera anatomiska strukturer.- Gå till studiebläddraren.
- Välj Ny studie och skriv studiens namn och information, dvs. datum för studien etc.
- Fyll i all nödvändig information i serienamnet, dvs. djurstam, ID, födelsedatum etc.
- Tryck på Klar; programmet är klart för B-lägesavbildning.
- Bedöva musen i anestesinduktionskammaren med 4% isofluran med ett gasflöde på 2 L/minO2.
OBS: Cirka 4 min räcker för korrekt anestesi (andas cirka 50-60 andetag per min). - När musen är bedövad, ändra anslutningen av bedövningsmaskinen för att rikta isofluran mot mushanteringsbordet.
- Placera den sövda musen på dess högra flank på hanteringsbordet (uppvärmd vid 37 °C) med nosen i en noskon för att säkerställa att musen bedövas med 2% isofluran med ett gasflöde på 0,8 l/min avO2 (figur 1A).
- Applicera en droppe konstgjorda tårar på musens ögon för att förhindra torrhet under anestesi.
- Tejpa höger hand, höger fot och svans ordentligt på elektrodkuddarna på djurplattformen med självhäftande gasväv.
OBS: Musens andningsfrekvens och elektrokardiogram (EKG) registreras genom elektrodkuddarna.
3. Injektion av PANC1-celler i bukspottkörteln med US-GI-metod
- Sanera mushuden med 70% etanol och håll huden på vänster flank sträckt med självhäftande gasväv.
OBS: Att hålla huden sträckt är viktigt för att minska motståndet mot insättning av nålen och för att förhindra nåldeformationer. - Applicera ultraljudsgel på buken och vänster flank av musen med en 20 ml spruta (utan nålen).
- Använd höjdkontrollvredet på den amerikanska givaren, sänk givaren för att röra musens vänstra flank och placera den tvärs över djurets kropp.
- Flytta givaren för att visualisera bukspottkörteln på givardisplayen med B-lägesavbildning (figur 1B).
- Bered en 50 μL Hamiltonspruta som innehåller 1 x 106 PANC1-celler upphängda i 20 μl PBS, med en 30 mm 28 G nål och placera sprutan på lämplig hållare (figur 1C).
OBS: Innan du använder, sanera sprutnålen med 70% etanol under en period av 5-10 minuter. - Använd hållarens mikromanipulator och sänk sprutan till mushuden, med nålfasningen uppåt och i samma plan som ultraljudsgivaren, och bilda en vinkel på 45° med givaren (figur 1D).
OBS: Från och med detta steg, fortsätt genom att övervaka den amerikanska bilden på displayen. - Använd mikromanipulatorn, perforera huden och sätt in sprutnålen i bukspottkörteln och observera den amerikanska bilden på displayen för att följa dess bana (figur 1E).
OBS: Innan injektion, ta svansen på bukspottkörteln som en referens som ligger bakom mjälten och nära vänster njure. - När nålen har förts in i bukspottkörteln, injicera en 20 μl bolus som innehåller cellerna direkt i bukspottkörteln genom att applicera konstant tryck på sprutkolven (figur 1F).
OBS: Rätt injektionsförfarande kontrolleras av närvaron av en liten bubbla i bukspottkörteln och flödet av hypoekogen vätska, som knappt är synlig från nålspetsen. - Låt nålen vara på plats i 5-10 s efter att hela bolusen har injicerats och dra sedan långsamt tillbaka den.
- Ta bort den amerikanska givaren, rengör gelén från flanken och placera musen ensam i en ny bur. Observera djuret tills det har återfått tillräckligt medvetande för att upprätthålla sternal recumbency.
4.3D amerikansk avbildning för övervakning av bukspottkörteltumörer hos möss
OBS: Utvärderingen av tumörutveckling utfördes med början 8 dagar efter cellinjektionen, med samma instrument som användes för den USA-styrda injektionen (listad i materialförteckningen). Därför matchar vissa procedurer, såsom systemtändning (steg 2.2), anestesi (steg 2.3. - 2.6.) och musplacering på djurplattformen (steg 2.7.), helt vad som beskrivs ovan i protokollet.
- Innan du startar den amerikanska avbildningen ska du konfigurera arbetsstationen enligt bild 2A.
- Fäst givaren på 3D-motorsystemet (bild 2A).
- Slå på bilden och välj Ny studie i studiebläddraren.
- Placera musen i anestesiinduktionskammaren (4% isofluran).
- Placera den sövda musen på dess högra flank på hanteringsbordet som värmts upp vid 37 °C med nosen i narkosröret och minska isofluran till 2 % (figur 2B).
OBS: Det är viktigt att musen placeras i samma position som den USA-styrda injektionen, för att bibehålla samma anatomiska referenser. - Applicera en droppe veterinärsalva på musens ögon.
- Applicera ett lager ultraljudsgel på musens buk och vänstra flank.
- Placera 55 MHz-givaren i tvärgående riktning för att vidröra den vänstra flankhuden så att bukspottkörteln är ungefär centrerad (figur 2C).
- Använd 3D-motorn för att få bilder av hela bukspottkörteln i tvärriktningen, helst samla 90-100 bilder per förvärv (antalet ramar kan variera beroende på personligt val).
- Välj 3D-motorpositionen på bildplattan.
- Ange skanningsavståndet genom att flytta markören för att få bilder av hela bukspottkörteln från båda extremiteterna.
- Välj Skanna ramar och börja 3D-förvärv.
- När 3D-avbildning är klar, ta bort givaren, rengör gelén från huden och placera musen ensam i en ny bur för återhämtning. Observera djuret tills det har återfått tillräckligt medvetande för att upprätthålla sternal recumbency.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter protokollet som beskrivs ovan bedövades möss först i en isoflurankammare och placerades på djurplattformen (figur 1A). Bukspottkörteln visualiserades med ultraljudsavbildning (figur 1B). En 50 μL Hamilton-spruta laddades med 1 x 106 PANC1-celler suspenderade i 20 μL PBS och placerades på nålhållaren (figur 1C). Den optimala vinkeln mellan sprutan och den amerikanska givaren var 45° (figur 1D). Med hjälp av mikromanipulatorn sattes sprutnålen in i bukspottkörteln och dess bana observerades på den amerikanska bilddisplayen (figur 1E). En 20 μL bolus av tumörceller injicerades sedan i bukspottkörteln (figur 1F) och efter 10 s drogs nålen tillbaka. Relevanta åtgärder för att förhindra rekyl av celler och deras efterföljande läckage i bukhålan eftersträvades, såsom att applicera ett konstant tryck under ympningen, pausa efter cellinjektion och använda en tunn nål med en 30 ° avfasningsvinkel. Efter den USA-styrda injektionen övervakades mössens vikt varje dag för att bedöma eventuella tecken på stress på grund av proceduren. Ingen signifikant förändring i vikten av injicerade möss observerades.
3D US-avbildning tillämpades sedan för att övervaka tumörcellstransplantation och tumörutveckling. Det första bildförvärvet utfördes dag 8 efter cellinjektion, följt av veckovisa förvärv (för totalt 6 förvärv). Under avbildningen placerades djuren på den högra flanken på den uppvärmda (37 °C) plattformen och bedövades genom inandning av isoflurangas (induktionsdos vid 4 % och underhållsdos vid 2 %) (figur 2). 3D-förvärvet utfördes i B-läge med hjälp av 3D-motorn som gör att givaren kan skanna buken i olika sektioner, vinkelrätt mot dess axel. En serie 2D-bilder erhölls, som sedan monterades av analysprogramvaran och rekonstruerade den 3D-anatomiska bilden av organet (3D-återgivning). För att utföra 3D-avbildning var det nödvändigt att synkronisera musandningsfaserna med förvärvet av 3D-skanningen. Protokollets reproducerbarhet bekräftades av närvaron av tumörmassan, en hypo-ekogen struktur (representerad med mörka färger) i bukspottkörtelns svans, från och med dag 8, hos 16 av 20 (80%) djur (Figur 3A). Hos fyra möss (20% av djuren) observerades utvecklingen av tumörmassa 2 veckor efter injektionen. Denna latens kunde spåras tillbaka till en suboptimal procedur för nålinsättning i bukspottkörteln, vilket orsakade läckage av celler i bukhinnan.
Figur 3B visar den genomsnittliga tumörvolymen (n = 16) utvärderad genom amerikansk avbildning av den USA-styrda injektionsmusmodellen. Dagen efter det senaste amerikanska förvärvet avlivades möss först genom CO 2-inandning och sedan genom livmoderhalsförskjutning. Bukhålan undersöktes och tumörmassorna explanterades för histologisk analys (figur 3C-E).
Figur 1: USA-styrd metod för etablering av en ortotopisk PCa-musmodell . (A) Musen placeras på höger flank på ett speciellt stöd uppvärmt vid 37 °C. (B) Den amerikanska givaren är placerad tvärs över djurkroppen vid mjältens nivå och bukspottkörteln visualiseras i B-läge. Flankvyn av musens buk visar bukspottkörteln (1) mellan mjälten (2) och vänster njure (3). Skalstång: 2 mm. (C) Hamiltonsprutan placeras på lämplig hållare. (D) I denna situation placeras givaren (2) och sprutan (1) i en vinkel på 45°. (E) Sprutans nål (1) sätts in i bukspottkörtelns svans, strax under mjälten. Skalstång: 2 mm. (F) En bolus innehållande 1 x 106 PANC1-celler i 20 μl PBS injiceras i bukspottkörtelns svans med en Hamilton-spruta med en 28 G-nål. Skalstreck: 2 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Imaging arbetsstation som används för övervakning av bukspottkörteltumörer hos möss . (A) Arbetsplats för avbildning i USA. (1) 55 MHz givare; (2) Mushanteringstabell; (3) 3D-motor; (4) Höjdkontrollknapp på US-givare. (B) Musen placeras på sin högra flank på hanteringsbordet med nosen i bedövningsröret (1), huden sträcks ut och US -gelén appliceras på höger flank. (C) Givaren sänks för att vidröra mushuden och placeras tvärs över djurkroppen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Utveckling av ortotopisk PCa xenograft i musens bukspottkörtel . (A) 2D US-bildförvärv av tumörmassan utvecklad efter ekostyrd cellinjektion. Utvecklingen av tumören övervakas med amerikansk avbildning efter 8 dagars cellinjektion, följt av förvärv en gång i veckan fram till dag 44, för totalt 6 förvärv. Tumören representeras av en hypo-ekogen struktur i bukspottskörtelparenkymen. Den hypo-ekogena strukturen representeras ekografiskt av ett område med ekon med reducerad intensitet, jämfört med den omgivande parenkymen eller en angränsande struktur. Skalstång: 2 mm. (B) Tidsförlopp för tumörvolymen av ortotopisk PDAC härledd från PANC1-celler. (C) Amerikanskt bildförvärv av en tumörmassa vid dag 43 efter cellinjektion. Skalstång: 2 mm.3D återgivning av tumörmassan visas i insatsen. (D) Efter avbildning avlivas djuren och obduktionsundersökning utförs. (1) Tumörmassa; (2) En liten del av en frisk bukspottkörtel; (3) Mjälte; (4) Mage; (5) Lever. Skalstång: 5 mm. (E) Hematoxylin och eosinfärgning av tumörmassan vid 4x förstoring. Skalstreck: 200 μm. På den högra övre sidan av panelen, infällning av tumörmassan i vilken pankreatiska acinarceller fortfarande är synliga; 40x förstoring. Skalstreck: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om användningen av amerikansk avbildning är utbredd i kliniken, beskrivs tumörutveckling i många prekliniska musmodeller vanligtvis med hjälp av bioluminescerande avbildning11. Det senare är ett indirekt sätt att utvärdera tumöringraftment och expansion och det ger inte heller en tillförlitlig tumörtillväxtkinetik. I den aktuella studien har vi tillämpat amerikansk avbildning för att utföra cellinjektion samt för att övervaka tumörutveckling. Protokollet vi har beskrivit och de resultat vi har tillhandahållit representerar ett relevant genombrott i PCa-forskningen.
Den USA-styrda metoden som beskrivs här för injektion av bukspottkörteltumörceller är minimalt invasiv och gör det möjligt att övervinna många nackdelar som orsakas av det kirurgiska ingreppet, vilket vanligtvis tillämpas för att upprätta en ortotopisk PCa-musmodell. Även om indikationer på dödlighet eller biverkningar på grund av det kirurgiska ingreppet saknas i litteraturen, tyder vår erfarenhet på att den kirurgiska metoden ger högre postoperativ dödlighet i en låg andel fall (cirka 10%), med frekvent djurlidande, vilket kräver en viss återhämtningstid12. Dessutom förhindrar stygnen som appliceras efter operationen korrekt tillämpning av bildprocedurer. Detta resulterar i förvärv av amerikanska bilder med mycket dålig kvalitet, vilket leder till felaktig dataextrapolering orsakad av artefakter, såsom efterklangs- och skuggregioner. Med hänsyn till alla dessa fakta föredras en metod som inte behöver ett kirurgiskt ingrepp för upprättandet av en ortotopisk musmodell och rekommenderas starkt för prekliniska forskningsändamål. Dessutom, eftersom den är minimalt invasiv, är återhämtningstiden från cellinokulering snabbare och djurets lidande är minimalt i den USA-styrda metoden. En stor fördel är att den USA-styrda metoden är kompatibel med användningen av isoflurananestesi som möjliggör snabbare induktion och återhämtning, relativt mindre sparsam effekt på kardiovaskulär funktion och cerebral blodflödesautoregulering, jämfört med andra anestesimetoder (dvs ketamin / xylazinlösning). Sammantaget gör den försumbara metabolismen av isofluran det särskilt användbart vid anestesihantering13. Faktum är att ungefär 5 minuter efter procedurens slut återfår djuren tillräckligt med medvetande för att upprätthålla sternal recumbency. Dessutom är möss förmedicinerade med smärtstillande medel (karprofen) för att minimera smärta, och inga postoperativa behandlingar är nödvändiga på grund av den snabba och fullständiga återhämtningen.
Ändå finns det några viktiga felsökningssteg i proceduren som måste övervägas. Antalet celler som skall inokuleras får inte överstiga 1 x 106 celler och cellinokulumvolymen får inte överstiga 20 μl för att undvika risken för cellläckage ut ur bukspottkörteln. Cellinjektion ska utföras omedelbart efter avlägsnandet, för att undvika en minskning av cellens vitalitet. Efter cellinjektion är det nödvändigt att vänta i minst 10 s innan nålen tas bort för att undvika läckage av celler ur bukspottkörteln.
En av de mest kritiska aspekterna av detta protokoll gäller musens placering på djurplattformen. Musen måste ligga på sin högra sida på djurhanteringsbordet och huden måste sträckas. Om huden inte sträcker sig ordentligt under injektionen, kommer nålen att kämpa för att genomborra och komma in i bukspottkörteln, med risk för att celler spills ut ur bukspottkörteln. Den ultraljudsstyrda injektionen för att producera en PCa-musmodell beskrevs först av Huynh et al. 201114. Här fokuserade vi på den metod som är lämplig för att producera en sådan modell och beskriver i detalj alla steg för att göra den reproducerbar. Dessutom, jämfört med Huynh et al.14, har vi introducerat några innovationer främst relaterade till de framsteg inom amerikansk teknik som inträffade under de senaste 5 åren. I detta protokoll rekommenderas starkt användning av en Hamilton-spruta med en styv nål och en avfasningsvinkel på 30 ° för att uppnå bättre noggrannhet under cellinjektion och för att minimera cellläckage. Slutligen, under den USA-styrda injektionen, säkrades möss på sin högra sida på djurplattformen, medan i Huynh et al.14 möss placerades i dorsal recumbency. Musens sidoposition gör det möjligt att visualisera bukspottkörtelns svans, strax under mjälten, som fungerar som en visuell referens (figur 1B) under cellinjektionen, vilket säkerställer teknikens reproducerbarhet.
Som med andra tekniker finns det också vissa begränsningar med det USA-styrda förfarandet. Den största begränsningen är att injektionen endast kan utföras i bukspottkörtelns svans eftersom kroppen och huvudet är täckta av andra organ och är svåra att nå med nålen. Dessutom är en annan begränsning i samband med användningen av amerikansk avbildning för att övervaka tumörtillväxt oförmågan att visualisera hela tumörmassan när den blir för stor, efter 6 veckors ympning (Figur 3C-E). Även om sådana stora volymer inte efterliknar sjukdomens kliniska förlopp.
En annan fördel med PCa-modellen erhållen med protokollet som beskrivs här är den långsamma cellingraftmenten och tillväxten av tumörmassorna (figur 3B). Detta är idealiskt för exakt identifiering av utgångspunkten för farmakologisk intervention och bättre övervakning av effekterna av terapeutiska ingrepp över tid.
Slutligen är den beskrivna tekniken ett exempel på implementering av 3R-principerna som involverar förfining av teknik och utveckling av procedurer som minimerar smärta, lidande, ångest eller bestående skada, vilket direkt förbättrar djurens välbefinnande i forskning.
Framtida tillämpningar av PCa-modellen som erhållits genom den USA-styrda injektionen inkluderar studier som syftar till att utveckla lämpliga terapeutiska behandlingar eller behandlingskombinationer. Faktum är att användningen av sådana innovativa in vivo-tekniker kan kombineras med användning av små molekyler, t.ex. antikroppar, antikroppsfragment och antikropps-läkemedelskonjugat (ADC), med ett teragnostiskt tillvägagångssätt. Den senare kan användas ensam, för terapeutiska ändamål, som vår grupp har visat i vårt senaste arbete15 eller efter en ordentlig fluoroforkonjugering, med målet att övervaka tumörtillväxt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, bidrag nr 15627, IG 21510 och IG 19766) till AA, PRIN Italian Ministry of University and Research (MIUR). Utnyttja grundläggande kunskaper om jonkanalnätverk i cancer för innovativa terapeutiska strategier (LIONESS) 20174TB8KW till AA, pHioniC: Europeiska unionens Horizon 2020-bidrag nr 813834 till AA. CD stöddes av ett AIRC-stipendium för Italien ID 24020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt, Germany | P5856 | |
| 3D-Mode package | Visualsonics Fujifilm, Italy | Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging | |
| Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel | PARKER LABORATORIES, INC. | 150 | Gel for ultrasound |
| Athymic Mice (Nude-Foxn1nu) | ENVIGO, Italy | 69 | 20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight |
| CO2 Incubator Function Line | Heraeus Instruments, Germany | BB16-ICN2 | |
| Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature | Visualsonics Fujifilm, Italy | 11426 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Euroclone Spa, Italy | ECM0101L | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) | Euroclone Spa, Italy | ECB4004L | |
| Eppendorf (1.5mL) | Sarstedt, Germany | 72.690.001 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone Spa, Italy | ECS0170L | |
| Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge | Permax S.r.l., Italy | 7803-02 | |
| Hamilton Syringe 705RM 50 µL | Permax S.r.l., Italy | 7637-01 | |
| Isoflo (250 mL) | Ecuphar | 7081219 | |
| L-glutamine 100X | Euroclone Spa, Italy | ECB3000D | |
| Mouse Handling table II | Visualsonics Fujifilm, Italy | 50249 | |
| MX550D: 55 MHz MX Series Transducer | Visualsonics Fujifilm, Italy | 51069 | Ultrasound Transducers |
| Oxygen/isofluorane mixer | Angelo Franceschini S.r.l. | LFY-I-5A | |
| PANC1 cell line | American Type Culture Collection (ATCC), USA | CRL-1469 | |
| Rimadyl (carprofen) | Pfizer | 11319 | 20 mL, injection solution |
| Trypsin-EDTA 1X in PBS | Euroclone Spa, Italy | ECB3052D | |
| Vet ointment for eyes, Systane nighttime | Alcon | 509/28555-1 | |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version) | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-12055 | complete with gas chamber |
| Vevo Imaging Station 2 | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-11983 | Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount |
| Vevo Lab | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20034 | Data Analysis Software |
| Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20054 | Includes analytic software package for B-mode |
| Vevo Photoacoustic Enclosure | Visualsonics Fujifilm, Italy | 53157 |
References
- Zeng, S., et al.
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: The unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the united states. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Rawla, P., Sunkara, T., Gaduputi, V. Epidemiology of pancreatic cancer: Global trends, etiology and risk factors. World Journal of Oncology. 10 (1), 10 (2019).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L.
- Hofschroer, V., et al. Ion channels orchestrate pancreatic ductal adenocarcinoma progression and therapy. Frontiers in Pharmacology. 11, 586599 (2021).
- Adamska, A., Domenichini, A., Falasca, M. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Current and evolving therapies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1338 (2017).
- Qiu, W., Su, G. H. Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models. Methods in Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice. Cancer Metastasis Reviews. 17 (3), 279-284 (1998).
- Qiu, W., Su, G. H. Challenges and advances in mouse modeling for human pancreatic tumorigenesis and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 32 (1-2), 83-107 (2013).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. DMM Disease Models and Mechanisms. 11 (7), (2018).
- Lottini, T., et al. Micro-ultrasound, non-linear contrast mode with microbubbles and Optical Flow software tool: together for a new translational method in the study of the tumoral rheology microenvironment. WMIC 2017: Imaging the Future from Molecules to Medicine. , (2017).
- Ludders, J. W. Advantages and guidelines for using isoflurane. The Veterinary Clinics of North America Small Animal Practice. 22 (2), 328-331 (1992).
- Huynh, S., et al. Development of an orthotopic human pancreatic cancer xenograft model using ultrasound guided injection of cells. PLoS One. 6 (5), 20330 (2011).
- Duranti, C., et al. Harnessing the hERG1/β1 Integrin Complex via a Novel Bispecific Single-chain Antibody: An Effective Strategy against Solid Cancers. Molecular Cancer Therapeutics. 20 (8), 1338-1349 (2021).
