Summary
İnsan pankreas kanseri hücrelerinin ultrason eşliğinde enjeksiyonu ve ardından ultrason görüntüleme ile tümör büyümesinin in vivo olarak izlenmesi ile minimal invaziv bir ortopik pankreas kanseri modeli oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Pankreas kanseri (PCa) dünya çapında en ölümcül kanser türlerinden birini temsil eder. PCa malignitesinin nedenleri esas olarak içsel malign davranışına ve terapötik tedavilere karşı yüksek direncine dayanır. Gerçekten de, birçok çabaya rağmen, hem standart kemoterapi hem de yenilikçi hedef tedaviler, klinik öncesi değerlendirmeden klinik ortama geçtiğinde önemli ölçüde başarısız olmuştur. Bu senaryoda, yeni geliştirilen ilaçları test etmek için PCa'nın in vivo özelliklerini daha iyi taklit eden preklinik fare modellerinin geliştirilmesine acilen ihtiyaç vardır. Mevcut protokol, insan pankreas tümör hücrelerinin ultrason rehberliğinde enjeksiyonu ile elde edilen ortotopik bir ksenogreft ile temsil edilen bir fare PCa modeli oluşturma yöntemini açıklamaktadır. Böyle güvenilir ve minimal invaziv bir protokol kullanarak, ultrason (US) görüntüleme ile izlenebilen in vivo engraftment ve tümör kitlelerinin gelişiminin kanıtlarını da sunuyoruz. Burada tarif edilen PCa modelinin dikkat çekici bir yönü, tümör kitlelerinin zaman içinde yavaş gelişmesidir, bu da farmakolojik tedaviler için başlangıç noktasının kesin olarak belirlenmesini ve terapötik müdahalelerin etkilerinin daha iyi izlenmesini sağlar. Dahası, burada açıklanan teknik, 3R ilkelerinin uygulanmasına bir örnektir, çünkü acı ve ıstırabı en aza indirir ve araştırmadaki hayvanların refahını doğrudan artırır.
Introduction
PCa ve en yaygın formu olan Pankreatik Duktal Adeno Karsinom (PDAC), evre 1,2'den bağımsız olarak, 1 yıllık sağkalım oranı% 20'nin altında ve 5 yıllık sağkalım oranı% 8 olan kansere bağlı ölümlerin en yaygın nedenlerinden biridir. Hastalık neredeyse her zaman ölümcüldür ve insidansı3 azalan diğer kanser türlerinin aksine, önümüzdeki yıllarda insidansının sürekli olarak artacağı tahmin edilmektedir. Geç kanser tespiti, hızlı progresyon eğilimi ve spesifik tedavilerin eksikliği gibi faktörler PCa4'ün kötü prognozuna yol açmaktadır. Daha doğru preklinik fare modellerinin geliştirilmesi sayesinde kanser araştırmalarında büyük ilerlemeler kaydedilmiştir. Modeller, kanserin altında yatan moleküler mekanizmanın anlaşılması ve yeni tedavilerin geliştirilmesi için uygun bilgiler sağlamıştır5. Bu ilerlemeler, son zamanlardaki büyük çabalara rağmen, mevcut kemoterapötik tedavilere dirençli kalan PCa için zayıf bir şekilde geçerlidir1. Bu nedenlerden dolayı, hastaların beklentilerini iyileştirmek için yeni yaklaşımların geliştirilmesi zorunludur.
Yıllar geçtikçe, günümüzde en yaygın kullanılan modeller olan ksenogreftler de dahil olmak üzere birçok PCa fare modeli geliştirilmiştir5. Ksenograft modelleri, implante edilen tümör hücrelerinin konumuna bağlı olarak subkutan heterotopik ve ortotopik olarak sınıflandırılır. Subkutan heterotopik ksenogreftlerin gerçekleştirilmesi daha kolay ve ucuzdur, ancak PCa'nın bazı karakteristik özelliklerini (yani, fibrotik doku, hipoksi, asitlik ve anjiyogenez birikimi ile karakterize edilen kendine özgü tümör mikroçevresi) kaçırırlar6,7. Bu, deri altı ksenogreftlerin neden klinik ayar8'e çevrildiğinde başarısızlıklara yol açan terapötik tedaviler için sağlam veriler sağlayamadığını açıklar. Öte yandan, ortotopik ksenogreftler tümör mikroçevresine daha yakından benzemekte ve hastalığın doğal gelişiminin daha iyi taklit edilmesine yol açmaktadır. Ek olarak, ortotopik ksenogreftler, metastatik süreci ve PCa'nın invaziv özelliklerini incelemek için daha uygundur, bu da deri altı modellerde neredeyse hiç görülmez9. Genel olarak, ortotopik ksenograft fare modelleri günümüzde preklinik ilaç testi yapmak için tercih edilmektedir 9,10. Ortotopik ksenogreftler genellikle hücreleri veya çok küçük tümör dokusu parçalarını pankreasa implante etmek için cerrahi prosedürlere dayanır. Gerçekten de, PCa'nın cerrahi modellerine dayanan birkaç makale son birkaç on yılda yayınlanmıştır11. Bununla birlikte, ortotopik tümör modelinin oluşturulması için cerrahi prosedürün kalitesi ve sonucu, operatörün teknik becerisine büyük ölçüde bağlıdır. Translasyonel klinik yaklaşım için başarılı bir ortotopik PCa ksenogreft için bir diğer önemli nokta, öngörülebilir büyüme kinetik ile lokalize hastalık oluşturma olasılığıdır.
Bu sorunları ele almak için, burada, immün yetmezlikli farelerde pankreasın kuyruğuna insan PCa hücrelerinin ultrason (US) rehberliğinde enjeksiyonundan yararlanan ortopik bir PCa ksenogreft üretmek için yenilikçi bir prosedürü açıklıyoruz. Bu yordam güvenilir bir PCa fare modeli oluşturur. Tümör büyümesi in vivo olarak US görüntülemesi ile takip edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, İtalya Sağlık Bakanlığı'ndan 843/2020-PR yetki numarası ile onay almıştır. Aseptik koşulları sağlamak için, hayvanlar Floransa Üniversitesi'nin araştırma hayvanı vivaryumunun (Ce.S.A.L.) bariyer odasında tutuldu. Tüm prosedürler, farelerin Floransa Üniversitesi'nin (İtalya) LIGeMA tesisinde bulunduğu aynı alanda gerçekleştirildi.
1. Hücre hazırlığı
- Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamını (DMEM) içeren 100 mm'lik bir Petri kabındaki PCa hücre hattından Kültür PCa hücreleri% 2 L-glutamin ve% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile desteklenir.
- Normoxi'deki hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 ile inkübe edin.
- Hücreleri tripsin ile ayırın. Aşılamadan 1 saat önce, 20 μL PBS'de 1 x 106 hücreyi sayın ve yeniden askıya alın.
2. Ultrason rehberliğinde enjeksiyon için fare hazırlığı (US-GI)
NOT: Aşağıdaki adımlar steril koşullar altında gerçekleştirilmiştir. Anestezinin başlangıcından farenin hayvan platformundan çıkarılmasına kadar ABD rehberliğinde enjeksiyon prosedürünün tamamı, farenin tamamen iyileşmesi için yaklaşık 10-12 dakika artı 5 dakika sürer.
- Müdahaleden hemen önce, karprofen (NSAID) deri altından (SC) 5 mg / kg'lık son dozda veya tramadol 27 G iğneli bir tüberkülin şırıngası kullanarak 5 mg / kg'lık son dozda uygulayın.
NOT: Mevcut protokol için 20 adet Amimik Çıplak-Foxn1nu dişi fare kullanılmıştır. Fareler 8 haftalıktı ve 20-22 g ağırlığındaydı. - Görüntüleyiciyi açın ve dönüştürücü panelinden uygulama menüsünde Fare (Küçük) Karın öğesini seçin. B-Modu (Parlaklık Modu) görüntüleme penceresinin göründüğünden ve sistemin B-Modu verilerini almaya hazır olduğundan emin olun.
NOT: B Modu, sistemin varsayılan görüntüleme modudur. Sistem, yankı sinyali genliğine göre bir parlaklık düzeyi atayarak yankıları iki boyutlu (2B) bir görünümde görüntüler. B-Modu, anatomik yapıları bulmak için en etkili moddur.- Çalışma Tarayıcısına gidin.
- Yeni Etüt'ü seçin ve çalışma adını ve bilgilerini, yani çalışmanın tarihini vb. yazın.
- Seri Adı'ndaki gerekli tüm bilgileri, yani hayvan suşlarını, kimliğini, doğum tarihini vb. Doldurun.
- Bitti'ye dokunun; program B modu görüntüleme için hazırdır.
- Anestezi indüksiyon odasındaki fareyi, 2 L / dak O2 gaz akışı ile% 4 izofluran kullanarak anesteziyapın.
NOT: Uygun anestezi için yaklaşık 4 dakika yeterlidir (dakikada yaklaşık 50-60 nefes almak). - Fare anestezi uygulandıktan sonra, izofluranı fare taşıma masasına doğru yönlendirmek için anestezik makinenin bağlantısını değiştirin.
- Anestezi uygulanan fareyi sağ kanadındaki tutma masasına (37 °C'de ısıtılır) yerleştirin ve farenin 0,8 L/dk O2 gaz akışına sahip %2 izofluran kullanılarak anestezi altına alındığından emin olun (Şekil 1A).
- Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için farenin gözlerine bir damla yapay gözyaşı uygulayın.
- Sağ eli, sağ ayağı ve kuyruğu yapışkan gazlı bezle hayvan platformundaki elektrot pedlerine sıkıca bantlayın.
NOT: Farenin solunum hızı ve elektrokardiyogramı (EKG) elektrot pedleri aracılığıyla kaydedilir.
3. US-GI yöntemi ile pankreasta PANC1 hücrelerinin enjeksiyonu
- Fare derisini% 70 etanol ile sterilize edin ve yapışkan gazlı bez kullanarak sol kanadın cildini gerilmiş halde tutun.
NOT: Cildin gerilmiş halde tutulması, iğnenin yerleştirilmesine karşı direnci azaltmak ve iğne deformasyonlarını önlemek için önemlidir. - 20 mL'lik bir şırınga kullanarak (iğne olmadan) farenin karnına ve sol kanadına ultrason jeli uygulayın.
- ABD dönüştürücüsünün yükseklik kontrol düğmesini kullanarak, farenin sol kanadına dokunmak için dönüştürücüyü indirin ve hayvanın vücuduna enine olarak yerleştirin.
- B-Mode görüntülemeyi kullanarak transdüser ekranındaki pankreası görselleştirmek için dönüştürücüyü hareket ettirin (Şekil 1B).
- 20 μL PBS'de asılı 1 x 106 PANC1 hücresi içeren 50 μL Hamilton şırıngasını 30 mm 28 G iğne ile hazırlayın ve şırıngayı uygun tutucuya yerleştirin (Şekil 1C).
NOT: Kullanmadan önce, şırınga iğnesini 5-10 dakikalık bir süre boyunca% 70 etanol ile sterilize edin. - Tutucu mikromanipülatörü kullanarak, şırıngayı fare derisine, iğne eğimi yukarı bakacak şekilde ve ultrason dönüştürücü ile aynı düzlemde, dönüştürücü ile 45 ° 'lik bir açı oluşturarak indirin (Şekil 1D).
NOT: Bu adımdan itibaren, ekrandaki ABD görüntüsünü izleyerek devam edin. - Mikromanipülatörü kullanarak, cildi delin ve şırınga iğnesini pankreasın içine yerleştirin ve yörüngesini takip etmek için ekrandaki ABD görüntüsünü gözlemleyin (Şekil 1E).
NOT: Enjeksiyondan önce, pankreasın kuyruğunu dalağın arkasında ve sol böbreğe yakın bir yerde bulunan bir referans olarak alın. - İğne pankreas içine yerleştirildikten sonra, şırınga pistonuna sabit basınç uygulayarak hücreleri içeren 20 μL'lik bir bolusu doğrudan pankreasın içine enjekte edin (Şekil 1F).
NOT: Doğru enjeksiyon prosedürü, pankreasta küçük bir kabarcığın varlığı ve iğne ucundan zar zor görülebilen hipoekojenik sıvının akışı ile kontrol edilir. - Tüm bolus enjekte edildikten sonra iğneyi 5-10 s yerinde bırakın ve ardından yavaşça geri çekin.
- ABD dönüştürücüsünü çıkarın, jeli yandan temizleyin ve fareyi tek başına yeni bir kafese yerleştirin. Sternal yassılığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı gözlemleyin.
4.3D Farelerde pankreas tümörlerini izlemek için ABD görüntüleme
NOT: Tümör gelişiminin değerlendirilmesi, hücre enjeksiyonundan 8 gün sonra, ABD rehberliğinde enjeksiyon için kullanılan aynı alet kullanılarak ( Malzeme Tablosunda listelenmiştir) gerçekleştirilmiştir. Bu nedenle, sistem ateşlemesi (adım 2.2.), anestezi (adım 2.3. - 2.6.) ve hayvan platformuna fare yerleştirme (adım 2.7.) gibi bazı prosedürler, protokolde yukarıda açıklananlarla tam olarak eşleşir.
- ABD görüntülemeye başlamadan önce, iş istasyonunu Şekil 2A'da gösterildiği gibi ayarlayın.
- Transdüseri 3D motor sistemine sabitleyin (Şekil 2A).
- Görüntüleyiciyi açın ve Etüt Tarayıcısında Yeni Etüt'ü seçin.
- Fareyi anestezi indüksiyon odasına yerleştirin (% 4 izofluran).
- Anestezi uygulanan fareyi sağ kanadında, burnu anestezik tüpün içinde olacak şekilde 37 °C'de ısıtılmış taşıma masasına yerleştirin ve izofluranı %2'ye düşürün (Şekil 2B).
NOT: Aynı anatomik referansları korumak için farenin ABD rehberliğindeki enjeksiyonla aynı konuma yerleştirilmesi önemlidir. - Farenin gözlerine bir damla veteriner merhem uygulayın.
- Farenin karnına ve sol kanadına bir ultrason jeli tabakası uygulayın.
- 55 MHz dönüştürücüyü, pankreas yaklaşık olarak ortalanmış olacak şekilde sol yan cilde dokunmak için enine yönde konumlandırın (Şekil 2C).
- Tüm pankreasın enine yönde görüntülerini elde etmek için 3D motoru kullanın, ideal olarak edinme başına 90-100 kare toplayın (çerçeve sayısı kişisel seçime bağlı olarak değişebilir).
- Görüntüleyici dokunmatik yüzeyindeki 3B Motor Konumu'nu seçin.
- Her iki ekstremiteden tüm pankreasın görüntülerini elde etmek için imleci hareket ettirerek tarama mesafesini belirtin.
- Çerçeveleri Tara'yı seçin ve 3B almaya başlayın.
- 3D görüntüleme yapıldıktan sonra, dönüştürücüyü çıkarın, jeli ciltten temizleyin ve fareyi iyileşme için tek başına yeni bir kafese yerleştirin. Sternal yassılığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı gözlemleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan protokolü takiben, fareler ilk önce bir izofluran odasında anestezi altına alındı ve hayvan platformuna yerleştirildi (Şekil 1A). Pankreas ultrasonografi ile görüntülendi (Şekil 1B). 50 μL'lik bir Hamilton şırıngası, 20 μL PBS'de asılı olan ve iğne tutucuya yerleştirilen 1 x 106 PANC1 hücresi ile yüklendi (Şekil 1C). Şırınga ve US transdüseri arasındaki optimum açı 45° idi (Şekil 1D). Mikromanipülatör kullanılarak, şırınga iğnesi pankreasın içine sokuldu ve yörüngesi ABD görüntüleyici ekranında gözlendi (Şekil 1E). Daha sonra pankreasa 20 μL'lik bir tümör hücresi bolusu enjekte edildi (Şekil 1F) ve 10 s'den sonra iğne geri çekildi. Hücrelerin geri tepmesini ve ardından periton boşluğuna sızmasını önlemek için aşılama sırasında sabit bir basınç uygulamak, hücre enjeksiyonundan sonra duraklamak ve 30 ° eğim açısına sahip ince bir iğne kullanmak gibi ilgili eylemler takip edildi. ABD rehberliğindeki enjeksiyondan sonra, prosedür nedeniyle herhangi bir stres belirtisini değerlendirmek için farelerin ağırlığı her gün izlendi. Enjekte edilen farelerin ağırlığında önemli bir değişiklik gözlenmedi.
Daha sonra tümör hücresi engraftmanını ve tümör gelişimini izlemek için 3D US görüntüleme uygulandı. İlk görüntü alımı, hücre enjeksiyonundan sonraki 8. günde gerçekleştirildi, bunu haftalık alımlar izledi (toplam 6 edinim için). Görüntüleme sırasında, hayvanlar ısıtılmış (37 ° C) platforma sağ kanatta yerleştirildi ve izofluran gazının solunmasıyla (indüksiyon dozu% 4 ve idame dozu% 2) anestezi altına alındı (Şekil 2). 3D alımı, dönüştürücünün karnı eksenine dik olarak çeşitli bölümlerde taramasına izin veren 3D motor kullanılarak B modunda gerçekleştirildi. Bir dizi 2D görüntü elde edildi, bunlar daha sonra analiz yazılımı tarafından bir araya getirildi ve organın 3D anatomik görüntüsünü yeniden yapılandırdı (3D yeniden oluşturma). 3D görüntüleme yapmak için, fare nefes fazlarını 3D taramanın elde edilmesiyle senkronize etmek gerekiyordu. Protokolün tekrarlanabilirliği, pankreasın kuyruğunda, 8. günden başlayarak, 20 hayvandan 16'sında (% 80) hipo-ekojenik bir yapı (koyu renklerle temsil edilen) tümör kütlesinin varlığı ile doğrulandı (Şekil 3A). Dört farede (hayvanların% 20'si), enjeksiyondan 2 hafta sonra tümör kütlesinin gelişimi gözlendi. Bu gecikme, pankreasa iğne sokmanın optimal olmayan bir prosedürüne kadar izlenebilir ve bu da hücrelerin peritona sızmasına neden olur.
Şekil 3B, ABD rehberliğinde enjeksiyon fare modelinin ABD görüntülemesi ile değerlendirilen ortalama tümör hacmini (n = 16) göstermektedir. Son ABD kazanımından bir gün sonra, fareler önce CO2 inhalasyonu ve daha sonra servikal çıkık ile ötenazi yapıldı. Karın boşluğu incelendi ve tümör kitleleri histolojik analiz için eksize edildi (Şekil 3C-E).
Şekil 1: Ortotopik PCa fare modelinin oluşturulması için ABD güdümlü yöntem . (A) Fare, 37 ° C'de ısıtılan özel bir destek üzerinde sağ kanada yerleştirilir. (B) ABD dönüştürücüsü, dalak seviyesinde hayvan vücuduna enine olarak yerleştirilir ve pankreas B Modunda görselleştirilir. Fare karnının yan görünümü dalak (2) ile sol böbrek (3) arasındaki pankreası (1) gösterir. Ölçek çubuğu: 2 mm. (C) Hamilton şırıngası uygun tutucuya yerleştirilir. (D) Bu durumda, dönüştürücü (2) ve şırınga (1) 45°'lik bir açı oluşturacak şekilde konumlandırılır. (E) Şırınganın iğnesi (1) pankreasın kuyruğuna, dalağın hemen altına sokulur. Ölçek çubuğu: 2 mm. (F) 20 μL PBS'de 1 x 106 PANC1 hücresi içeren bir bolus, 28 G iğneli bir Hamilton şırıngası kullanılarak pankreasın kuyruğuna enjekte edilir. Ölçek çubuğu: 2 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Farelerde pankreas tümörlerini izlemek için kullanılan görüntüleme iş istasyonu . (A) ABD görüntüleme için işyeri. (1) 55 MHz dönüştürücü; (2) Fare işleme masası; (3) 3D Motor; (4) ABD dönüştürücünün yükseklik kontrol düğmesi. (B) Fare, burnu anestezik tüpün içinde olacak şekilde (1) sağ kanadına tutma masasına yerleştirilir, cilt gerilir ve US jeli sağ kanada uygulanır. (C) Dönüştürücü, fare derisine temas edecek şekilde alçaltılır ve hayvan gövdesine enine olarak yerleştirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Fare pankreasında ortopik PCa ksenogreftinin gelişimi . (A) Yankı rehberliğinde hücre enjeksiyonundan sonra gelişen tümör kitlesinin 2D US görüntü alımı. Tümörün gelişimi, 8 günlük hücre enjeksiyonundan sonra US görüntüleme ile izlenir, ardından 44. güne kadar haftada bir kez edinilir ve toplam 6 edinim yapılır. Tümör, pankreas parankiminde hipo-ekojenik bir yapı ile temsil edilir. Hipo-ekojenik yapı, ekografik olarak, çevredeki parankim veya komşu bir yapıya kıyasla, azaltılmış yoğunlukta yankıları olan bir alanla temsil edilir. Ölçek çubuğu: 2 mm. (B) PANC1 hücrelerinden türetilen ortopik PDAC'ın tümör hacminin zaman seyri. (C) Hücre enjeksiyonundan sonraki 43. günde bir tümör kitlesinin ABD görüntülemesiyle elde edilmesi. Ölçek çubuğu: 2 mm.3D tümör kütlesinin yeniden oluşturulması iç kısımda gösterilir. (D) Görüntülemeden sonra hayvanlar ötenazi yapılır ve nekropsi muayenesi yapılır. (1) Tümör kitlesi; (2) Sağlıklı bir pankreasın küçük bir kısmı; (3) Dalak; (4) Mide; (5) Karaciğer. Ölçek çubuğu: 5 mm. (E) Tümör kütlesinin 4x büyütmede hematoksilin ve eozin boyanması. Ölçek çubuğu: 200 μm. Panelin sağ üst tarafında, pankreas asinar hücrelerinin hala görülebildiği tümör kütlesinin girişi; 40x büyütme. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Klinikte US görüntüleme kullanımı yaygın olmasına rağmen, birçok preklinik fare modelinde tümör gelişimi genellikle biyolüminesan görüntüleme kullanılarak tanımlanmaktadır11. İkincisi, tümör engraftmanını ve genişlemesini değerlendirmenin dolaylı bir yoludur ve ayrıca güvenilir bir tümör büyüme kinetik sağlamaz. Bu çalışmada, hücre enjeksiyonu yapmak ve tümör gelişimini izlemek için US görüntülemeyi uyguladık. Tanımladığımız protokol ve sağladığımız sonuçlar, PCa araştırmasında ilgili bir atılımı temsil ediyor.
Pankreas tümör hücrelerinin enjeksiyonu için burada açıklanan ABD rehberliğindeki yöntem minimal invazivdir ve genellikle ortopik bir PCa fare modeli oluşturmak için uygulanan cerrahi prosedürün neden olduğu birçok dezavantajın üstesinden gelmeye izin verir. Literatürde cerrahi işleme bağlı mortalite oranı veya yan etkiler ile ilgili endikasyonlar eksik olmakla birlikte, deneyimlerimiz cerrahi yöntemin vakaların düşük bir yüzdesinde (yaklaşık% 10) daha yüksek postoperatif mortalite ürettiğini, hayvanların sık sık acı çektiğini, belirli bir iyileşme süresi gerektirdiğini göstermektedir12. Ayrıca ameliyat sonrası uygulanan dikişler, görüntüleme işlemlerinin doğru uygulanmasını engellemektedir. Bu, ABD görüntülerinin çok düşük kalitede elde edilmesine neden olur ve yankılanma ve gölge bölgeleri gibi eserlerin neden olduğu yanlış veri ekstrapolasyonuna yol açar. Tüm bu gerçekler göz önünde bulundurulduğunda ortotopik fare modelinin kurulması için cerrahi bir işleme ihtiyaç duymayan bir yöntem tercih edilmekte ve klinik öncesi araştırmalar için şiddetle önerilmektedir. Ayrıca, minimal invaziv olduğundan, hücre aşılamasından iyileşme süresi daha hızlıdır ve ABD rehberliğindeki yöntemde hayvan ıstırabı minimumdur. Büyük bir avantaj, ABD rehberliğindeki yöntemin, diğer anestezi yöntemlerine (yani, ketamin / ksilazin çözeltisi) kıyasla, daha hızlı indüksiyon ve iyileşme, kardiyovasküler fonksiyon ve serebral kan akışı otoregülasyonu üzerinde nispeten daha az koruyucu etki sağlayan izofluran anestezisinin kullanımı ile uyumlu olmasıdır. Genel olarak, izofluran'ın ihmal edilebilir metabolizması, anestezik yönetimde özellikle yararlı olmasını sağlar13. Gerçekten de, prosedürün bitiminden yaklaşık 5 dakika sonra, hayvanlar sternal yassılığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanırlar. Ek olarak, fareler ağrıyı en aza indirmek için bir analjezik (karprofen) ile önceden ilaçlanır ve hızlı ve tam iyileşme nedeniyle ameliyat sonrası tedaviye gerek yoktur.
Bununla birlikte, prosedürde dikkate alınması gereken bazı önemli sorun giderme adımları vardır. Pankreastan hücre sızıntısı riskini önlemek için aşılanacak hücre sayısı 1 x 106 hücreyi geçmemeli ve hücre inokulum hacmi 20 μL'den büyük olmamalıdır. Hücre enjeksiyonu, hücre canlılığında bir azalmayı önlemek için ayrılmalarından hemen sonra yapılmalıdır. Hücre enjeksiyonundan sonra, hücrelerin pankreastan sızmasını önlemek için iğneyi çıkarmadan önce en az 10 s beklemek gerekir.
Mevcut protokolün en kritik yönlerinden biri, farenin hayvan platformunda konumlandırılmasıyla ilgilidir. Fare, hayvan taşıma masasının üzerine sağ tarafında uzanmalı ve cilt gerilmelidir. Enjeksiyon sırasında cilt düzgün bir şekilde gerilmezse, iğne pankreası delmek ve girmek için mücadele eder ve hücrelerin pankreastan dökülme riski vardır. Bir PCa fare modeli üretmek için ultrason rehberliğinde enjeksiyon ilk olarak Huynh ve ark. tarafından 2011 yılında14. Burada, böyle bir modeli üretmek için uygun metodolojiye odaklandık ve tekrarlanabilir hale getirmek için tüm adımları ayrıntılı olarak açıkladık. Ayrıca, Huynh ve ark.14 ile karşılaştırıldığında, esas olarak son 5 yılda meydana gelen ABD teknolojisindeki gelişmelerle ilgili bazı yenilikler getirdik. Mevcut protokolde, hücre enjeksiyonu sırasında daha iyi doğruluk elde etmek ve hücre sızıntısını en aza indirmek için sert bir iğne ve 30 ° eğim açısına sahip bir Hamilton şırıngasının kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Son olarak, ABD rehberliğinde enjeksiyon sırasında, fareler sağ tarafında hayvan platformuna sabitlenirken, Huynh ve ark.14 fareler dorsal yassılığa yerleştirildi. Farenin yan pozisyonu, pankreasın kuyruğunu, dalağın hemen altında, hücre enjeksiyonu sırasında görsel bir referans görevi gören (Şekil 1B) ve tekniğin tekrarlanabilirliğini sağlayan görselleştirmeye izin verir.
Diğer tekniklerde olduğu gibi, ABD rehberliğindeki prosedürde de bazı sınırlamalar vardır. En büyük sınırlama, enjeksiyonun sadece pankreasın kuyruğunda yapılabilmesidir, çünkü vücut ve kafa diğer organlarla kaplıdır ve iğne ile ulaşılması zordur. Ayrıca, tümör büyümesini izlemek için ABD görüntülemesinin kullanılmasıyla ilişkili bir başka sınırlama, 6 haftalık aşılamadan sonra, çok büyük hale geldiğinde tüm tümör kütlesinin görselleştirilememesidir (Şekil 3C-E). Bununla birlikte, bu kadar büyük hacimler hastalığın klinik seyrini taklit etmemektedir.
Burada anlatılan protokol ile elde edilen PCa modelinin bir diğer avantajı da yavaş hücre engraftmanı ve tümör kitlelerinin büyümesidir (Şekil 3B). Bu, farmakolojik müdahale için başlangıç noktasının kesin olarak tanımlanması ve terapötik müdahalelerin zaman içindeki etkilerinin daha iyi izlenmesi için idealdir.
Son olarak, açıklanan teknik, tekniğin iyileştirilmesini ve ağrı, ıstırap, sıkıntı veya kalıcı zararı en aza indirgeyen, araştırmadaki hayvanların refahını doğrudan artıran prosedürün geliştirilmesini içeren 3R ilkelerinin uygulanmasına bir örnektir.
ABD rehberliğinde enjeksiyon ile elde edilen PCa modelinin gelecekteki uygulamaları, uygun terapötik tedavilerin veya tedavi kombinasyonlarının geliştirilmesine yönelik çalışmaları içermektedir. Aslında, bu tür yenilikçi in vivo tekniklerin kullanımı, küçük moleküllerin, örneğin antikorların, antikor fragmanlarının ve antikor-ilaç konjugatlarının (ADC) teragnostik bir yaklaşımla kullanılmasıyla birleştirilebilir. İkincisi, grubumuzun son çalışmamızda gösterdiği gibi, terapötik amaçlar için tek başına kullanılabilir15 veya tümör büyümesini izlemek amacıyla uygun bir florofor konjugasyonundan sonra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, hibe no. 15627, IG 21510 ve IG 19766) tarafından AA, PRIN İtalyan Üniversite ve Araştırma Bakanlığı'na (MIUR) desteklenmiştir. AA'ya yenilikçi terapötik stratejiler (LIONESS) 20174TB8KW için kanserde iyon kanalı ağı hakkındaki temel bilgilerden yararlanmak, pHioniC: Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 hibesi AA'ya 813834 Yok. CD, İtalya ID 24020 için bir AIRC bursu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt, Germany | P5856 | |
| 3D-Mode package | Visualsonics Fujifilm, Italy | Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging | |
| Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel | PARKER LABORATORIES, INC. | 150 | Gel for ultrasound |
| Athymic Mice (Nude-Foxn1nu) | ENVIGO, Italy | 69 | 20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight |
| CO2 Incubator Function Line | Heraeus Instruments, Germany | BB16-ICN2 | |
| Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature | Visualsonics Fujifilm, Italy | 11426 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Euroclone Spa, Italy | ECM0101L | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) | Euroclone Spa, Italy | ECB4004L | |
| Eppendorf (1.5mL) | Sarstedt, Germany | 72.690.001 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone Spa, Italy | ECS0170L | |
| Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge | Permax S.r.l., Italy | 7803-02 | |
| Hamilton Syringe 705RM 50 µL | Permax S.r.l., Italy | 7637-01 | |
| Isoflo (250 mL) | Ecuphar | 7081219 | |
| L-glutamine 100X | Euroclone Spa, Italy | ECB3000D | |
| Mouse Handling table II | Visualsonics Fujifilm, Italy | 50249 | |
| MX550D: 55 MHz MX Series Transducer | Visualsonics Fujifilm, Italy | 51069 | Ultrasound Transducers |
| Oxygen/isofluorane mixer | Angelo Franceschini S.r.l. | LFY-I-5A | |
| PANC1 cell line | American Type Culture Collection (ATCC), USA | CRL-1469 | |
| Rimadyl (carprofen) | Pfizer | 11319 | 20 mL, injection solution |
| Trypsin-EDTA 1X in PBS | Euroclone Spa, Italy | ECB3052D | |
| Vet ointment for eyes, Systane nighttime | Alcon | 509/28555-1 | |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version) | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-12055 | complete with gas chamber |
| Vevo Imaging Station 2 | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-11983 | Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount |
| Vevo Lab | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20034 | Data Analysis Software |
| Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20054 | Includes analytic software package for B-mode |
| Vevo Photoacoustic Enclosure | Visualsonics Fujifilm, Italy | 53157 |
References
- Zeng, S., et al.
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: The unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the united states. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Rawla, P., Sunkara, T., Gaduputi, V. Epidemiology of pancreatic cancer: Global trends, etiology and risk factors. World Journal of Oncology. 10 (1), 10 (2019).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L.
- Hofschroer, V., et al. Ion channels orchestrate pancreatic ductal adenocarcinoma progression and therapy. Frontiers in Pharmacology. 11, 586599 (2021).
- Adamska, A., Domenichini, A., Falasca, M. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Current and evolving therapies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1338 (2017).
- Qiu, W., Su, G. H. Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models. Methods in Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice. Cancer Metastasis Reviews. 17 (3), 279-284 (1998).
- Qiu, W., Su, G. H. Challenges and advances in mouse modeling for human pancreatic tumorigenesis and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 32 (1-2), 83-107 (2013).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. DMM Disease Models and Mechanisms. 11 (7), (2018).
- Lottini, T., et al. Micro-ultrasound, non-linear contrast mode with microbubbles and Optical Flow software tool: together for a new translational method in the study of the tumoral rheology microenvironment. WMIC 2017: Imaging the Future from Molecules to Medicine. , (2017).
- Ludders, J. W. Advantages and guidelines for using isoflurane. The Veterinary Clinics of North America Small Animal Practice. 22 (2), 328-331 (1992).
- Huynh, S., et al. Development of an orthotopic human pancreatic cancer xenograft model using ultrasound guided injection of cells. PLoS One. 6 (5), 20330 (2011).
- Duranti, C., et al. Harnessing the hERG1/β1 Integrin Complex via a Novel Bispecific Single-chain Antibody: An Effective Strategy against Solid Cancers. Molecular Cancer Therapeutics. 20 (8), 1338-1349 (2021).
