Summary
I denne protokollen beskriver vi hvordan man injiserer musefosterhulen ved E7.5 med lentivirus, noe som fører til jevn transduksjon av hele nevrale platen, med minimale skadelige effekter på overlevelse eller embryonal utvikling.
Abstract
Manipulering av genuttrykk i den utviklende musehjernen i utero har stort potensial for funksjonelle genetikkstudier. Imidlertid har det tidligere i stor grad vært begrenset til manipulering av embryonale stadier etter neurulasjon. En protokoll ble utviklet for å injisere fosterhulen på embryonal dag (E) 7.5 og levere lentivirus, som koder for cDNA eller shRNA, rettet mot >95% av nevrale plate og nevrale kamceller, noe som bidrar til fremtidens hjerne, ryggmarg og perifert nervesystem. Denne protokollen beskriver trinnene som er nødvendige for å oppnå vellykket transduksjon, inkludert sliping av glasskapillærnålene, graviditetsverifisering, utviklingsmessig iscenesettelse ved hjelp av ultralydavbildning og optimale injeksjonsvolumer tilpasset embryonale stadier.
Etter denne protokollen er det mulig å oppnå transduksjon av >95% av den utviklende hjernen med høytiter lentivirus og dermed utføre helhjernegenetisk manipulasjon. I motsetning til dette er det mulig å oppnå mosaikktransduksjon ved bruk av lavere virale titere, noe som muliggjør genetisk screening eller avstamningssporing. Injeksjon ved E7.5 retter seg også mot ektoderm og nevrale kam som bidrar til forskjellige rom i øyet, tungen og det perifere nervesystemet. Denne teknikken gir dermed muligheten til å manipulere genuttrykk i mus nevral-plate- og ektoderm-avledet vev fra preneurulasjonsstadier, med fordelen av å redusere antall mus som brukes i eksperimenter.
Introduction
Hjernen og ryggmargen er blant de første organene som initierer dannelse under embryogenese 1,2. Selv om genene assosiert med nevroutviklingsforstyrrelser blir identifisert, har den funksjonelle forhøret av genetiske varianter ligget bak 3,4. Siden genereringen av betingede knockoutmus kan ta måneder eller år, er en alternativ teknikk for raskt å undersøke genfunksjonen i den utviklende hjernen av interesse. I museembryoer oppstår neurulasjon - den morfogenetiske prosessen der nevralplaten forvandles til nevrale røret for å gi opphav til sentralnervesystemet (CNS) - mellom dag 8 og 10 etter unnfangelse5. Før begynnelsen av neurulasjonen består nevralplaten, som en del av ektodermen, av et enkelt lag av søyleceller som vil proliferere og differensiere til de mange nevron- og glialcelletypene i CNS 6,7. Derfor, for å eksperimentelt indusere langvarige endringer i genuttrykk i CNS, gir målretting av nevrale platen åpenbare fordeler, inkludert tilgjengeligheten til alle stamceller.
I nevrovitenskap, i ovo elektroporering 8,9 og viral transduksjon av museembryoer har blitt brukt til å manipulere embryonale CNS-genuttrykk. Det utviklende kyllingembryoet har vært en valgfri modell for å studere genfunksjon under ryggmargsutvikling på grunn av tilgjengeligheten til kyllingembryoet i egget og den resulterende enkle manipuleringen av genuttrykk. Spesielt i ovo plasmid genererer elektroporering eksperimentelle og kontrollforhold i hver kylling ryggmargen. Elektroporering forårsaker cellemembranpermeabilisering og leder negativt ladet DNA bort fra den (negative) katoden mot den (positive) anoden ved å påføre en elektrisk puls via to elektroder til embryoet. Hos mus har elektroporering in utero generelt vært begrenset til embryonale stadier der neurulasjonen er fullført, og hjernen eller ryggmargen består allerede av flere cellelag, noe som resulterer i lav elektroporeringseffektivitet10. Plasmidelektroporering resulterer i forbigående genuttrykk og retter seg generelt mot få celler.
Ultralydveiledet in utero mikroinjeksjon har blitt brukt til å manipulere forskjellige embryonale strukturer som hud og hjerne11,12,13,14. Injeksjoner rettet mot det utviklende murine CNS har imidlertid vist lav effekt eller har negativt påvirket embryonal overlevelse12,13,14. Derfor ble det utviklet en forbedret protokoll for levering av høytiter lentivirus i fosterhulen (AC) ved E7.5, som ble kalt NEPTUNE for neural plate targeting with in uteronano-injection15. Injeksjoner resulterte i en langvarig målrettingseffekt på >95 % av hele hjernen ved E13.5. Videre ble det innført et iscenesettelsestrinn under ultralydverifisering av graviditet for å sortere kvinner og graviditeter etter utviklingsstadium for å minimere unødvendige prosedyrer på forsøksdyr og maksimere injeksjonssuksessen. Injeksjonseffektivitet og overlevelse er tett knyttet til økningen i AC-størrelse. Derfor beskriver denne artikkelen hvordan man måler vekselstrømsstørrelse før injeksjon for å levere et passende volum til vekselstrømmen som ikke vil forårsake resorpsjon av embryoet. NEPTUNE er et robust alternativ til nåværende in utero-tilnærminger og kan tilpasses for flere bruksområder, inkludert, men ikke begrenset til, gevinst og tap av funksjonsstudier, avstamningssporing eller screening15,16.
Protocol
CD1 villtype mus ble plassert i henhold til europeiske forskrifter, med en standard dag og natt syklus med mat og vann ad libitum. CD1-hunner ble parret med CD1-hanner over natten, og skjedeplugger ble sjekket om morgenen (E0.3). Bare gravide kvinner ble brukt til injeksjonen. Etisk godkjenning for alle forsøkene som er beskrevet her, ble gitt av Jordbruksverket.
1. Klargjøring av glassnåler: nåletrekking og sliping
MERK: Selv om preground nåler kan kjøpes, trekke nåler in-house gjør det enkelt å justere nål lengde, bore, og skrå vinkel.
- Monter en glasskapillær i mikropipetten/kapillærtrekkeren. Bruk følgende innstillinger ved hjelp av det angitte utstyret (se materialtabellen): varme 580 enheter; hastighet 140 enheter; tid 200 enheter; trykk 500-800 enheter.
MERK: Enhetene med forskjellige parametere er definert av kapillærtrekkeren. Enhetene kan variere for forskjellig utstyr. - Trykk på Trekk for å trekke fra hverandre kapillæren og produsere to glasskapillærer med koniske ender.
MERK: Etter trekking er spissene på de to glasskapillærene smeltet lukket på grunn av den høye temperaturen på mikropipettetrekkeren. - Klipp spissen med kirurgisk saks for å få en nållengde på ~ 7 mm (målt hvor nålen begynner å avta) (figur 1A).
MERK: For injeksjoner med E7.5 er en lang og fin nål kritisk, da injeksjonsområdet er svært lite og delikat. Korte og brede nåler vil resultere i embryonale dødsfall. - Slip den kuttede nålespissen for å lage en skarp skråkant (figur 1C-F).
- Slip nålen i en vinkel på 20° ved maksimal hastighet i minst 30-45 min.
MERK: Ultrarent vann tilsettes slipeplaten for å fungere som smøremiddel, redusere friksjon/temperatur og vaske bort glasspartikler (figur 1B). Imidlertid kan overflødig væske bremse kvernen. - Forsikre deg om at nålespissen (figur 1C) berører slipeplateoverflaten (figur 1D), men ikke bøyes (figur 1E).
MERK: Bøyd sliping resulterer i en lang og skjør nålespiss med feil skråvinkel, som lett kan gå i stykker under injeksjonen. Knusing av nåler kan skade embryoet og må erstattes med en intakt nål. En korrekt jordet spiss er vist i figur 1F,G. Etter sliping forventes den resulterende nåleboringen å ha en innvendig diameter (ID) på ~ 15 μm og en utvendig diameter (OD) på ~ 35 μm (figur 1G).
- Slip nålen i en vinkel på 20° ved maksimal hastighet i minst 30-45 min.
- Fyll en 1 ml sprøyte med mineralolje og fest en 27 G kanyle.
- Fjern kanylehetten og stikk sprøytekanylen inn i den nymalte glasskapillæren. Injiser mineralolje til olje drypper fra kapillærspissen. Fortsett å injisere mens du trekker opp 27 G nålen til kapillærnålen er fylt med mineralolje, hvoretter sprøytekanylen kan fjernes.
- Oppbevar jord- og mineraloljefylte nåler i et lukket miljø for å forhindre skade og støvakkumulering. For lagring, sett inn to ruller med modelleringsleire i en vanlig petriskål for å tjene som holdere (figur 1H). Legg nålene forsiktig på leiren og plasser dem langt fra hverandre for enkel henting av nålene.
MERK: Siden forberedelse av kanylen er tidkrevende, er det best å tilberede kanyler minst én dag før injeksjoner. Kast nålene etter to kull maksimalt, da de blir stumpe. Klargjør alltid reservekanyler i tilfelle kanyleskader under tilberedning eller injeksjon.
Figur 1: Klargjøring av kanyle til E7.5 fosterhuleinjeksjoner. (A) Representative eksempler på en trukket men uklippet kapillærnål i glass (venstre), en kapillærnål kuttet i optimal lengde for E7.5-injeksjoner (midten) og et kapillærsnitt for kort (høyre). (B) Kvernen med jevn dekning av vann, som er klar for nålesliping. (C-F) Representative eksempler på ulike nålespisser. (C) Kutt, men ujordet nålespiss montert i kvern; (D) ideell slipeposisjon med nålespissen som bare berører kvernen; (E) nål senket for langt og bøyes under slipeprosessen; (F) en ideell kanylespiss for AC-injeksjoner med E7.5. (G) En kanylespiss som viser boringen med en innvendig diameter på ~15 μm og en utvendig diameter på ~35 μm, som er egnet for E7.5 AC-injeksjon. Nåleboringen vises som stiplede linjer. Ytre diameter betegnet med røde pilspisser; indre diameter betegnet med blå pilspisser. (H) Oppbevaring av kanyle: Ildfast form fylt med trukket og malte nåler. To rader med modelleringsleire tjener som holdere. MERK: For det okulære mikrometeret i C, F, G er 1 cm delt inn i 100 plasser; målet er 3x; derfor ≈ 10 000 μm/(100 × 3) 33,4 μm. Forkortelser: AC = fosterhule; ID = intern diameter; OD = ytre diameter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
2. Dag før injeksjon: klargjør benk for ultralyd-verifisering av graviditet
MERK: Alt arbeid skal utføres i en ventilert biosikkerhetsnivå 2 (BSL 2) benk ved arbeid med lentivirus. Ultralyd-verifisering av graviditet kan utføres på en ventilert benk.
- Slå på ultralydmaskinen, varmebordet og O 2-tilførselen til isofluranpumpen (kan variere fra utstyr til utstyr).
MERK: Kontroller isofluransystemet for å sikre at isofluran ikke lekker ut i luften. - Plasser en tom avfallspose (teipet til innsiden av veggen for enkel tilgang), hårfjerningskrem, sterile pakkede bomullspinner, vann, silkepapir og kirurgisk tape inne i BSL 2-benken.
- Forbered fire stykker kirurgisk tape (~ 7 cm lang) for å sikre muselemmene under ultralydkontrollen av graviditeten.
3. Ultralydkontroll for å bekrefte graviditet
MERK: Dette trinnet kan utføres dagen før E7.5 injeksjoner, ved E6.5. Se diskusjonen for detaljer om sjekken for svangerskapsalder.
- Plasser den tidsparrede hunnmusen i induksjonskammeret.
- Slå på gasstrømmen med en oksygenstrøm på ~2,1 LPM og en startdose på 3-4 % isofluran for å indusere anestesi.
- Kontroller at kvinnen er fullstendig bedøvet ved å sjekke poterefleksen. Hvis poterefleksen er fraværende, senk isofluran til 1,5-2%.
MERK: Det tar omtrent 3 minutter å indusere anestesi. - Bytt gasstrømmen fra induksjonskammeret til nesekjeglen på varmebordet.
- Plasser den bedøvede kvinnen i en liggende stilling (magen opp) på varmebordet og plasser snuten i den vedlagte nesekeglen for å sikre vedlikehold av anestesi under ultralydkontrollen av svangerskapet.
- Fest alle fire potene til bordet med de forberedte delene av kirurgisk tape uten å strekke kvinnens kropp eller fange whiskers.
- Påfør en mengde hårfjerningskrem på størrelse med en ert på underlivet. Bruk en bomullspinne til å spre kremen over underlivet (en ~ 3 x 3 cm firkant) og masser den forsiktig inn ved å rulle bomullspinnen frem og tilbake.
- Når pelsen begynner å løsne fra huden, fukt et silkepapir og fjern krem og pels. Rengjør det de-furred området med fuktig silkepapir til all krem og hår er borte. Tørk huden.
- Påfør en plommestørrelse mengde ultralydgel til det barberte området og fortsett å identifisere livmoren ved hjelp av ultralyd ved hjelp av en av følgende tre tilnærminger.
- For å gjøre dette manuelt, hold ultralydssonden i ultralydgelen og flytt sonden for å finne livmoren.
- For semimanuell tilnærming #1, plasser ultralydssonden (festet til rekkverksystemet) over den kvinnelige buken ved å løsne og flytte en del av skinnen langs x-planet. Senk ultralydproben ned i gelen (z-plan) og skann gjennom underlivet (y-plan) (figur 2A).
- For semimanuell tilnærming # 2, senk ultralydssonden (festet til rekkverksystemet) inn i gelen for å avbilde underlivet. Hold ultralydproben stasjonær under prosessen, og flytt varmebordet med de vedlagte hjulene langs x- og/eller y-plan (figur 2B).
MERK: I disse tidlige embryonale stadiene kan indre organer, for eksempel tarmen, se ut som livmoren i ultralydavbildning. Men mens embryoer og decidua vises som en sekvens av kuler (beslektet med perler langs et halskjede), har tarmen utseendet til et kontinuerlig rør. Tilkoblingen av luminale rom (separate kuler vs. et kontinuerlig rør) kan vurderes ved å skanne frem og tilbake gjennom strukturen av interesse for å avgjøre om strukturen er en diskret sfære (embryo / decidua) (figur 2C) eller et kontinuerlig rør (tarm) (figur 2D). På dette stadiet er det ikke nødvendig å registrere antall embryoer; det er tilstrekkelig å bekrefte deres tilstedeværelse eller fravær.
- Når graviditetsstatusen er bestemt, løft ultralydssonden bort fra magen og tørk underlivet rent med fuktig silkepapir for å fjerne ultralydgelen.
- Slå av isofluranpumpen og fjern den kirurgiske tapen for å frigjøre potene.
- Plasser hunnen i mageleie (magen ned) i et rent bur på en varmeplate på 40 °C. Hold kvinnen under nøye observasjon til hun gjenvinner bevisstheten, noe som tar 2-6 minutter.
MERK: Sørg for at ultralydkontrollen for en kvinne er <10 minutter for å minimere eksponering for isofluran. - Fjern alt materiale og avfall og rengjør alle overflater med 70% etanol. Tørk av eventuell gjenværende ultralydgel fra ultralydssonden med et tørt, mykt og lofritt papirvev. Slå av ultralydmaskinen, ventilert benk / BSL2-benk, varmebord og O2-forsyning .
4. Ultralydkontroll for embryo-iscenesettelse
MERK: Dette trinnet utføres før operasjonen og tjener til å stratifisere de gravide kvinnene i henhold til deres AC-størrelser. Dette trinnet er avgjørende på E7.5 når målet er å målrette utviklingen av CNS. På dette tidlige utviklingsstadiet påvirker en forskjell på noen få timer i utviklingen betydelig størrelsen på AC og utviklingen av neurulasjon.
- Bedøv den første gravide kvinnelige musen ved å følge trinnene i trinn 3.1-3.5.
- Plasser og fest kvinnen på bordet som beskrevet i trinn 3.6.
- Påfør en plommestørrelse mengde ultralydgel til den barberte magen og senk ultralydssonden for å avbilde kvinnens underliv.
MERK: Dette trinnet forutsetter at kvinnen ble inspisert av ultralyd dagen før for graviditet og allerede har fjernet pels på magen. Hvis dette ikke er tilfelle, må pelsen fjernes før tilsetning av ultralydgel etter trinn 3.7-3.8. Ved E7.5 er livmor og deciduas større og lettere å skille fra indre organer. I tillegg er vekselstrømmen større og kan skilles fra det eksocelomiske hulrommet (ExC). - Skann gjennom venstre og høyre livmorhorn så fullstendig som mulig.
MERK: Noen embryoer ligger dypere inne i kvinnens kropp og kan gå glipp av. - Registrer antall og stadier av embryoene. Noter antall amniotiske hulrom i ideell størrelse, akseptable hulrom og deciduas uten hulrom (figur 2E-G).
- Stage alle svangerskapene og rangere dem deretter.
- Injiser kvinner med et flertall av ideell størrelse AC umiddelbart etter ultralydskontrollen (trinn 4.4) etter instruksjonene i trinn 4.5-4.7.
- For kvinner med et flertall av akseptable (hvor de eksocelomiske og amniotiske hulrommene ennå ikke er tydelig delt inn i to hulrom) eller fraværende hulrom, utsett injeksjonen og iscenesett dem igjen etter et par timer. Hvis de fleste hulrommene fortsatt er for små, utsett injeksjonene med 10-12 timer.
Figur 2: Inspeksjon og iscenesettelse av fosterhulrom ved ultralydkontroll. (A) Oversikt over skinnesystemet med vedlagt ultralydsonde, nanoinjektor og varmebord. Ultralydproben kan flyttes i x-, y- og z-plan for å oppnå optimal justering med den kvinnelige magen eller AC-ene. (B) Varmebord kan flyttes via to hjul i x- og / eller y-plan for å muliggjøre presis skanning og vurdering av AC-ene, mens ultralydssonden kan forbli statisk. (C) Representative ultralydbilder av E6.5 deciduas inne i den kvinnelige magen under ultralydkontroll for å bekrefte graviditet (hvite stiplede konturer). Ingen hulrom har dannet seg på dette punktet; Noen ganger er imidlertid den ektoplacentale kjeglen (hvite stjerner) synlig. Deciduas kan gjenkjennes av deres sfæriske form og skille seg fra tarmen, som fremstår som ett kontinuerlig rør. (D) Representativ bildesekvens av tynntarmen (hvite stiplede konturer), som er kontinuerlig i skanning gjennom underlivet. (E-G) Representative ultralydbilder under hulrom iscenesettelse før E7.5 injeksjoner. De fosterformede og eksocelomiske hulrommene har dannet seg og er adskilt av amnion. Den ektoplacentale kjeglen fungerer som hovedblodtilførsel og fremstår som et lyspunkt i ultralydet. AC er mest distal fra ektoplacental kjegle. (E) Ideelle AC-er virker større enn det eksocelomiske hulrommet, mens mellomstore hulrom virker mindre (F). Hvis ingen hulrom er synlige (G), betyr dette enten at embryoet er resorbert eller ikke har nådd E7.5 ennå. Skala barer = 1 mm. Forkortelser: A = Amnion; AC = fosterhulrom; ExC = Eksocelomisk hulrom; EC = Ektoplacental kjegle. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
5. Injeksjonsdag: klargjør BSL2-benken for kirurgi
- Lim ett stykke elastisk membran til den runde, sentrale åpningen av en kommersielt tilgjengelig, modifisert petriskål. Sørg for at membranen er godt festet til petriskålen for å forhindre lekkasje.
MERK: Hvis parabolen blir lekk eller ikke er godt limt, kan kantene på den elastiske membranen festes ytterligere med tape. - Lag et 1-1,5 cm langt snitt i midten av den elastiske membranen.
- Slå på ultralydmaskinen, BSL2-benken, varmeplaten,O2-tilførselen til isofluranpumpen og glassperlesterilisatoren (satt til 300 °C).
- Inne i BSL2-benken, plasser en tom avfallspose (teipet til innsiden av veggen for enkel tilgang); sterile pakkede bomullspinner (bruk en ny for hver operasjon / hver kvinne); kirurgiske verktøy (saks, pinsett, klipp, sutur) og kirurgisk tape; en full flaske romtemperert fosfatbufret saltvann (PBS), en tom flaske for avfallsinnsamling og en 25 ml pipette; en petriskål med elastisk membran for kirurgi; lokket på petriskålen med et 2 x 2-3 x 3 cm stykke parafilm festet til lokket med en dråpe vann; modellering leire: 4 større baller eller terninger (~ 3 x 3 x 3 cm3) og ett sylindrisk stykke (~ 4 x 1 cm); en sprøyte med smertestillende (f.eks. buprenorfin, 0,05-0,1 mg/kg kroppsvekt) og øyegelMERK: Ballene (eller kubene) av modelleringsleire vil fungere som "føtter" eller stativ/holdere for petriskålen når parabolen er plassert på toppen av hunnens underliv. Det sylindriske stykke leire sikrer embryoene inne i parabolen. Dersom mer enn én oppløsning injiseres, eller kanylen må etterfylles under injeksjoner, kan samme parafilm brukes hvis oppløsningen kan holdes atskilt.
6. Kanylebelastning
- Tørk av overflødig mineralolje med silkepapir for bedre grep.
MERK: Rengjør alltid vekk fra tuppen for å unngå skade eller personskade. - Forsikre deg om at alle komponenter (en forseglende O-ring, en avstandsstykke og en frontpakning - alt plassert under hylsen, figur 3A) er installert i riktig retning (figur 3B, hylse fjernet for visualisering) for å holde kapillærnålen på plass og skape en lufttett forbindelse, unngå bobledannelse når du går frem eller trekker inn metallstemplet inne i nålen.
- Forsikre deg om at metallstempelet på nanoinjektoren er trukket helt inn. Kontroller ved å trykke på Fyll og vent på et dobbelt pip som indikerer at stempelet er trukket helt inn.
- Med hylsen festet, men litt løsnet (skrudd ut 45-90 grader), skyv glassnålen på metallstemplet og skyv kapillærnålen sammen med metallstemplet gjennom den fremre pakningen til den når avstandsstykket (figur 3C, D, hylse fjernet for visualisering).
MERK: Noe motstand vises når stempelet passerer gjennom pakningen og avtar når det når avstandsstykket. Forsikre deg om at kapillærnålen er satt godt inn i avstandsstykket for å skape en lufttett forbindelse (figur 3D). - Fest nålen ved å stramme hylsen til nanoinjektoren (skru godt på).
MERK: Ikke stram for mye, da dette kan knuse kanylen. - Trykk på Tøm for å presse stempelet inn i kanylen og fjern oljen fra nålespissen. Hvis kanylen beveger seg, må du trekke inn stempelet, fjerne nålen og fylle på nytt. Hvis dette fører til at det dannes luftbobler, fjern nålen og fyll på med mineralolje.
MERK: En godt festet nål skal ikke bevege seg med stempelet. - Plasser en dråpe av viruset (~ 6 μL) eller annen injeksjonsoppløsning på et stykke parafilm1 (figur 3E; Evans blå fargestoff brukes til visualiseringsformål).
MERK: Maksimalt volum av nanoinjektoren er ~ 5 μL. - Trykk på Fyll for å opprette en luftboble som skal fungere som et skille mellom oljen og løsningen (figur 3F).
MERK: Dette fungerer også som en plasseringsmarkør når du fyller eller tømmer nålen. - Senk kanylen, senk spissen ned i oppløsningen og trykk på Fyll (figur 3F,G).
- Se væskenivået når løsningen lastes etter luftboblen. Trykk Tøm for å fjerne tilstoppingen og last den på nytt ved å trykke på Fyll hvis luftboblen blir langstrakt uten at væsken kommer inn i kanylen. Hvis dette ikke løser problemet, bytt kanyle.
- Når nålen er fullastet (figur 3H), løft nålen i z-planet og aspirer et lite volum luft på spissen for å forhindre fordampning av oppløsningen ved nålespissen og tilstopping av nålen.
- Vri nanoinjektoren med den påmonterte nålen bort fra operatøren, mot baksiden av benken, for å forhindre utilsiktet skade eller personskade.
Figur 3: Feste nålen til nanoinjektoren og masseutløse. (A) Startposisjon før nålen monteres på nanoinjektoren: metallstempelet trekkes helt inn og hylser festes. (B) Under hylsen vises alle tre komponentene for å holde og feste nålen i riktig rekkefølge (fra venstre til høyre): forsegling av O-ring (tynn og svart), avstandsstykke (hvit), O-ring (svart) med stort hull (som nålen må passere gjennom). For å sikre en lufttett tilkobling, skyves glassnålen over metallstemplet (C) og skyves gjennom åpningen av den fremre O-ringen til den når avstandsstykket (D). (E-H) Påføring av oppløsningen i kanylen. (E) En dråpe oppløsning er plassert på et stykke parafilm på et platelokk. (F) Lag en luftboble ved å trykke på Fyll før du legger i oppløsningen og senk kanylespissen ned i oppløsningen. (G) Oppløsningen lastes inn i kanylen. (H) Oppløsningen er lagt inn i kanylen. MERK: Hylsen er fjernet i (B-D) for visualisering, men skal forbli festet under eksperimenter. Det siste trinnet for å feste nålen er å stramme hylsen. Evans blå fargestoff brukes til visualisering i E-H. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
7. Injeksjoner
MERK: Alle instrumenter som brukes i denne prosedyren steriliseres før kirurgi og mellom hver mus.
- Bedøv den første hunnen med hulrom i ideell størrelse (se avsnitt 4).
- Plasser og fikser kvinnen på bordet, som beskrevet i trinn 3.1-3.6.
- Påfør øyegel på øynene for å forhindre uttørking av hornhinnen og injiser smertestillende subkutant.
MERK: Anbefalte analgetika: Buprenorfin (0,05-0,1 mg/kg kroppsvekt) eller Flunixin (2,5 mg/kg) eller lignende i henhold til lokale dyrevelferdsforskrifter. Multimodal perioperativ analgesi opprettholdes med injiserte analgetika og isofluran. - Forbered underlivet aseptisk ved å tørke av med en klut gjennomvåt med 0,5 mg / ml klorhexidinoppløsning (eller lignende) og tørk huden. Bruk kirurgisk saks for å lage et 1,5-2,0 cm vertikalt midtlinje hudinnsnitt i underlivet.
MERK: Forbered operasjonsområdet etter lokalt godkjente desinfiseringsrutiner. - Løft huden forsiktig og frigjør huden fra det underliggende muskellaget, ca. 1 cm rundt snittpunktet, for å lette suturering etter operasjonen.
- Lag et 1 cm vertikalt midtlinjesnitt i muskellaget.
- Med et par tang, løft den ene siden av huden og muskellaget, og med det andre paret, se etter livmorhornene.
MERK: Ciduaene er ordnet som perler på et halskjede, mens tarmen er ett langt, kontinuerlig rør (figur 4A). - Med tang, trekk forsiktig ut begge livmorhornene fra magen. Hold vevet mellom embryoer; Ikke klem dem direkte (figur 4B).
MERK: Livmoren er festet til kroppen i livmorhalsen, og de to eggstokkene/oviduktene festes via leddbånd. Ikke trekk/løsne livmoren fra disse ankerpunktene. - Tell og noter antall embryoer på venstre og høyre side.
- Nummer embryoene enten fra eggstokken til livmorhalsen eller fra livmorhalsen til eggstokken.
MERK: Dette er spesielt viktig hvis injiserte embryoer skal samles inn på embryostadiet. - Med en fuktig bomullspinne skyver du forsiktig alle embryoene tilbake i bukhulen, bortsett fra de tre første som skal injiseres.
- Plasser en dråpe PBS på elastikken i petriskålen og hold den rett over embryoene.
- Sett lukket tang inn i snittet av elastikken og slipp tangen for å åpne det elastiske snittet slik at væsken faller på embryoene.
MERK: Dette sikrer rehydrering av embryoene og at den elastiske membranen fester seg til kvinnens våte hud, og forhindrer lekkasje av PBS i de neste trinnene. - Trekk en del av livmoren, som tilsvarer tre embryoer, gjennom elastikken med tang, og legg forsiktig petriskålen på kvinnens underliv.
- Med tangen og en fuktig bomullspinne, juster livmorens posisjonering og elastikk for å sikre at elastikken er forseglet til kvinnens hud for å forhindre PBS-lekkasje.
- Bruk de fire leireføttene til å sikre og feste petriskålen rett over magen, noe som reduserer trykket på hunnen og følsomheten for avbildning for kvinnens pust og hjerteslag.
- Trykk leirsylinderen ned til høyre for embryoene/livmoren for å fikse livmoren (figur 4C).
MERK: Denne orienteringsinstruksjonen forutsetter at nålen er til venstre for hunnen og at embryoene til kvinnens venstre livmorhorn blir utsatt. Siden av livmoren (venstre eller høyre livmorhorn) er avgjørende da AC enten vender mot nålen (venstre horn; Figur 4D) eller vender mot den stabiliserende leiresylinderen (høyre horn; Figur 4E). - For å injisere embryoer fra høyre livmorhorn, plasser leiresylinderen på venstre side av embryoene (figur 4F) og vri varmebordet 180 ° (figur 4G) for å oppnå riktig orientering. Hvis nålen kan flyttes i stedet, må du tilpasse den etter behov for det aktuelle oppsettet.
- Legg PBS til petriskålen til embryoene og livmoren er dekket med PBS.
- Senk ultralydproben inn i PBS og juster musen / operasjonsbordet slik at det første embryoet er justert med ultralydssonden for å lette opptaket av injeksjonene.
MERK: "Først" refererer til nummerering av embryoer fra eggstokken til livmorhalsen. - Skann gjennom alle tre embryoene og inspiser AC-ene. Bestem injeksjonsvolumet som følger:
- Mål diameteren på vekselstrømmen med ultralydsmaskinen. Injiser 69 nL hvis AC-diameteren er ≤0,2 mm; injiser 2 x 69 nL (= 138 nL) hvis AC-diameteren er >0,2 mm og ≤0,29 mm; og injiser 3 x 69 nL (= 207 nL) hvis AC-diameteren > 0,29 mm (figur 4H).
MERK: Tidligere forsøk har vist at opptil 207 nL injeksjonsvolumer tolereres godt ved E7.515. Vellykkede injeksjoner med minimal innvirkning på overlevelse oppnås når den relative volumøkningen av vekselstrømmen ikke overstiger 90 %15. Variasjon i vekselstrømstørrelse mellom kullkamerater eller musestammer er vanlig og kan kreve ytterligere optimalisering.
- Mål diameteren på vekselstrømmen med ultralydsmaskinen. Injiser 69 nL hvis AC-diameteren er ≤0,2 mm; injiser 2 x 69 nL (= 138 nL) hvis AC-diameteren er >0,2 mm og ≤0,29 mm; og injiser 3 x 69 nL (= 207 nL) hvis AC-diameteren > 0,29 mm (figur 4H).
- Still inn injeksjonsvolumene med injeksjonskontrolleren.
- Still injeksjonshastigheten til å synke med en injeksjonshastighet på 23 nL/s.
MERK: Ulike utstyrsmodeller kan resultere i forskjellige injeksjonskrefter. - Senk nålen inn i PBS ved hjelp av hovedhjulene på skinnesystemet (x- og z-plan, figur 4I) og trykk Tøm på nanoinjektorkontrolleren til væsken når nålespissen.
MERK: Hvis kanylen har tilstoppet, kan du trykke på Tom for å løse opp treskoen og/eller fjerne tilstoppingen. - Løft nålen ut av PBS og trykk på Inject. Kontroller at en dråpe av omtrentlig ønsket volum er utladet.
- Senk nålen inn i PBS og juster den med ultralydssonden og embryoet ved å bevege nanoinjektoren med y-planhjulet på mikromanipulatoren (figur 4J).
MERK: Nålespissen er perfekt justert når den vises som et lyspunkt på ultralydbildet (figur 4K, L). Nålen kan beveges i alle tre retningsplan med mikromanipulatoren. - Juster nålvinkelen med injeksjonsvinkelhjulet for å sikre en nær vinkelrett injeksjonsvinkel i forhold til livmorveggen. Stikk nålen inn i vekselstrømmen i én bevegelse ved å bruke injeksjonshjulet på mikromanipulatoren (figur 4J-M). Hold øye med lysstyrken på nålespissen. Hvis nålespissen forsvinner fra ultralydbildet, flytter du ultralydproben fremover eller bakover for å bringe nålen tilbake i fokus.
MERK: Når nålen er inne i vekselstrømmen, kan mindre endringer i nålens posisjon og fokus gjøres uten å skade embryoet (justeringer innen ~0,3 mm). Ikke juster kanylens posisjon mer enn dette. - Trykk på Inject (for 207 nL, sett volumet på 69 nL og injiser tre ganger). Etter injeksjon, vent til ytterligere 5-10 s før du trekker nålen inn i en forsiktig bevegelse.
Figur 4: Optimal størrelse og orientering av fosterhulen for vellykkede injeksjoner . (A) Livmorhorn med flere E7.5 deciduaer, formet som en streng av kuler (nederst) sammenlignet med tykktarmen (øverst). (B) Ta tak i livmorvev (hvite stiplede linjer) mellom deciduaer. Unngå å klemme deciduaene (hvite pilspisser) direkte med tang, da deciduas og utviklende embryoer er skjøre på dette tidlige stadiet og utsatt for resorpsjon ved overdreven ekstern kraft. (C) Kvinne i liggende stilling med deciduas eksponert i en petriskål fylt med PBS og montert på fire fot modelleringsleire. Beslutningene stabiliseres av et ekstra stykke modelleringsleire, formet som en sylinder. (D, E) Orientering av AC påvirkes av siden av livmorhornet som er utsatt. Hvis det brukes deciduas fra venstre livmorhorn, vil AC vende bort fra leirestabilisatoren og vil være lett tilgjengelig for nålen til venstre (D). Men hvis det høyre livmorhornet brukes, vil ektoplacentaglen i stedet vende mot nålen, noe som gjør det vanskeligere å få tilgang til AC (E). Derfor, når du injiserer i høyre livmorhorn, plasseres leirestabilisatoren mot den nålvendte siden (F), og hele varmebordet roteres 180 ° (G). (H) Anbefalte injeksjonsvolumer i henhold til vekselstrømstørrelser. Generelt kan hulrom med diameter ≤ 0,2 mm injiseres med maksimalt 69 nL. Diametere > 0,2 mm og ≤ 0,29 mm tåler volumer opp til 2 x 69 nL (138 nL) og hulrom > 0,29 mm kan injiseres med 3 x 69 nL (207 nL). Skalastenger = 1 mm. (I, J) Nanoinjektor er festet til skinnesystemet og kan flyttes i x- og / eller z-plan. Vinkelen på nålen kan justeres med injeksjonsvinkelhjulet . (K, L) Nålespissen (hvit pilspiss) er justert med vekselstrømmen når den vises sterkest i ultralydet (L). (M) Ultralydbilde som viser injeksjonsprosessen, der nålespissen er i vekselstrømmen og godt justert (hvit pilspiss). Forkortelser: A = Amnion; AC = fosterhulrom; ExC = Eksocelomisk hulrom; EC = Ektoplacental kjegle. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Flytt scenen til neste embryo og gjenta trinn 7.22-7.26 for de to andre embryoene hvis de har passende AC-størrelser.
- Løft ultralydssonden og nålen ut av PBS ved hjelp av mikromanipulatoren. Vri nålen bort fra operatøren for å unngå skade og personskade.
- Med tang, rett 1st og 2nd embryoene tilbake i kvinnens underliv ved å skyve dem forsiktig gjennom elastikken. Ta forsiktig tak i vevet ved siden av det 3. embryoet og trekk livmoren mot den øvre enden av det elastiske snittet. Trekk forsiktig opp de 4.-6. embryoene med tang og la det 3. embryoet komme inn i magen igjen.
MERK: Dette trinnet kan gjøres uten å endre PBS eller fjerning av petriskålen. - Gjenta etter behov til alle embryoer med optimal AC er injisert eller tidsgrensen er nådd.
- Skyv embryoene/livmoren forsiktig tilbake i kvinnens underliv.
- Aspirer PBS og fjern petriskålen. Hvis et virus har blitt brukt, håndteres som smittsomt avfall.
- Sy sammen det muskulære laget med Vicryl (USP 6-0, nållengde 13 mm, 3/8 sirkel) i enkle kontinuerlige eller avbrutte suturer og lukk huden med 1-2 klips (se materialtabellen).
- Slå av isofluranpumpen.
- Fjern operasjonstapen og plasser hunnen i mageleie (magen ned) i et rent bur på en 40 °C varmeplate.
MERK: Hunnen forventes å gjenvinne bevisstheten og være mobil innen 10 minutter. Sørg for at prosedyren er fullført innen 30 minutter. Den genetiske bakgrunnen, alderen og vekten til kvinnen kan påvirke følsomheten for anestesi. Overvåk musene under operasjonen for tegn på langsom pust (langsom pust betyr at anestesi er for dyp) eller bevegelse (anestesi er for lett). Buprenorfin (0,05-0,1 mg/kg kroppsvekt) eller Flunixin (2,5 mg/kg) eller lignende i henhold til lokale dyrevelferdsforskrifter, kan gis 8 timer etter første injeksjon om nødvendig. - Hvis en annen kvinne skal injiseres, må du forberede det kirurgiske området mens du overvåker oppvåkningen av den første.
- Tørk de kirurgiske verktøyene med 70% etanol for å fjerne gjenværende blod eller vev og steriliser dem i den forvarmede glassperlesterilisatoren i 10 s. Kast bomullspinnene og brukt silkepapir. Tørk petriskålen og leirebitene tørre med silkepapir.
- Gjenta trinn 7.1-7.35 til alle hunnene er injisert.
- Tøm kanylen og kast den.
- Hvis det er virus eller injeksjonsoppløsning igjen i nålen, trykk Tøm på nanoinjektoren og tøm nålens innhold på silkepapir.
- Trekk metallstempelet helt inn ved å trykke på Fyll til det kommer et dobbeltpip fra kontrolleren, noe som indikerer at stempelet er helt trukket inn.
- Løsne hylsen og skyv nålen av metallstempelet. Kast kanylen i avfallsbeholderen for skarpe gjenstander.
- Rengjør BSL-2-benken.
- Hvis et virus ble brukt, spray hele det kirurgiske feltet med desinfeksjonsmiddel (se materialtabellen). Etter 15 min, tørk av desinfeksjonsmiddelet og rengjør hele operasjonsfeltet med 70% etanol. Hvis det ikke ble brukt virus, rengjør du alle overflater med 70% etanol.
- Tørk av eventuelle gjenværende PBS fra ultralydssonden med tørt, mykt og lofritt silkepapir.
- Kast avfall i henhold til retningslinjer for biosikkerhet.
- Slå av ultralydmaskinen, varmebordet, BSL2-benken og O 2-forsyningen.
Representative Results
Embryoer injisert ved E7.5 med hPGK-H2B-GFP lentivirus11,12 ble samlet inn ved E13.5 og undersøkt under fluorescerende disseksjonsmikroskop (figur 5A). Vellykket transduksjon av nevralplaten resulterer i embryoer med sterkt uttrykk for en fluorescerende reporter i hjernen hovedsakelig og i andre ektodermavledede vev, for eksempel huden (figur 5A, B). Injeksjon av et for høyt volum (større enn volumene som er anbefalt her, f.eks. ≥500 nL) øker trykket i vekselstrømmen og kan resultere i enten fullstendig resorpsjon (data ikke vist) eller nevralrørsdefekter som eksencefali (figur 5A). Vellykkede injeksjoner ved E7.5 gir jevn transduksjon fra forhjernen til bakhjernen (figur 5C-J).
Lentivirale titere rundt 2 × 10 10 infeksjonsenheter (IFU) oppnår over 95 % målretting, mens titere på ~1 ×10 9 IFU oppnår 15 % måleffektivitet15. I tillegg er strukturer som tidligere har vært vanskelig å målrette mot ved hjelp av elektroporering, for eksempel choroid plexus17,18, også målrettet (figur 5 E, F). Transduksjonseffekten kan modifiseres ved å justere viral titer levert inn i AC. Injeksjoner med lav titer resulterer i transduksjon av encellede kloner (figur 5C, figur 5E og figur 5G, H), mens bruk av høytitervirus transduserer nesten 100% av hele hjernen (figur 5D, figur 5F, figur 5H og figur 5J ). Derfor kan NEPTUNE brukes til enten klonal transduksjon, avstamningssporing og genetiske screeningsmetoder eller studere de globale effektene av genoveruttrykk eller nedregulering i hele hjernen.
Pattedyrs øyeutvikling er resultatet av velorganisert kommunikasjon mellom tre derivater av den embryonale ektodermen: nevrale retina (NR) og retinalpigmentepitel (RPE) er avledet fra nevroepitelet i den ventrale forhjernen, mens overflateektodermen gir opphav til det fremtidige linse- og hornhinneepitelet. Imidlertid er det sentrale stroma og det bakre endotelet, de to andre lagene i hornhinnen, avledet fra nevrale kamceller i periokulær mesenkym19,20. Koronale seksjoner gjennom E13.5-embryoer, injisert ved E7.5 med høytiter lentivirus, viste, lik hjernen, høy og jevn transduksjon av øyets nevrale vev, samt linsen, hornhinnen og mesenkymet (figur 5K). Etter hvert som neurulasjonen utvikler seg, resulterer injeksjoner ved E8.5 og E9.5 i fortsatt målretting av linsen og hornhinneepitelet (figur 5L og figur 5N), mens transduksjon av øyets nevroektodermavledede vev er mindre effektiv ved E8.5 (figur 5L, M) eller ikke rettet mot E9.5 (figur 5N).
Mens de fleste viruspartikler infiserer det eksponerte vevet ved injeksjon, transduserer noen partikler ikke-ektodermal avledet vev som utvikler seg senere (figur 6A). Spyttkjertler og -kanaler utvikler seg rundt E11.5 fra det orale epitelet21 og er målrettet mot NEPTUN (figur 6B). Etter injeksjoner på E9.5 er det språklige epitelet i tungen godt gjennomført; Imidlertid er det underliggende mesenkymet negativt (figur 6C; parenteser betegner transduserte celler; stjerner betegner autofluorescenssignal ikke transduserte celler). I tillegg er det positive klynger i det språklige epitelet, adskilt av negative seksjoner (figur 6C, hvite pilspisser), noe som tyder på transduksjon av papillaoverflaten. Nevrale kamceller er beskrevet i det underliggende tungemesenkymet og i det språklige epitelet, hvor de er involvert i utviklingen av smakspapiller og smaksløker22. Faktisk resulterer injeksjoner ved E7.5 i utbredt transduksjon av tungemesenkymet ved E13.5 (figur 6D), noe som tyder på at tidlige injeksjoner retter seg mot nevrale kamceller, noe som bidrar til mesenkym i tungen.
Hos virveldyr er dorsale rotganglier (DRG) en sentral komponent i det perifere nervesystemet (PNS), da all somatosensorisk inngang fra kroppens periferi (temperatur, smerte, trykk) overføres til hjernen via aktivering av DRG-nevronene23. Både nevroner og gliaceller i DRG er avledet fra trunk nevrale kamceller24. Lentiviral injeksjon, der den allestedsnærværende hPGK-promotoren styrer uttrykket til den fluorescerende reporteren, fører til utbredt målretting av det sentrale og perifere nervesystemet (figur 7A), og transduserer både nevroner og forfedre i ryggmargen (figur 7B), samt DRG (figur 7C). Bruk av MiniPromoter for dobbeltkortin25 gjør det mulig å begrense GFP-uttrykket til kun nevroner (15 og figur 7D,E).
Figur 5: Høyeffektiv eller klonal transduksjon med NEPTUN. (A) E13.5 embryoer under et disseksjonsmikroskop opplyst med standard belysning (venstre panel) og samme embryoer opplyst for GFP (høyre panel). Uinjisert embryo helt til venstre, vellykket injisert embryo helt til høyre, noe som gir positivt signal i hjernen (embryo lengst til høyre). Eksencefalisk embryo på grunn av overskytende volum injisert (midtre embryo). (B) Hud- og hjernemålretting med E7.5 injeksjon. Skalalinje = 50 μm. (C, D) E13.5 konfokale bilder av forhjernen med lav klonal transduksjon (C) eller høyeffektiv transduksjon (D). (C, E, G, I) Klonal transduksjon av forskjellige regioner i hjernen. (D, F, H, J) Høyeffektiv transduksjon av forskjellige regioner i hjernen. Skala barer = 200 μm. Ulike transduksjonseffekter er representative for andre områder av CNS. (E, F) Choroid Plexus målretting, klonalt (E) eller med høy effektivitet (F). Skalastenger = 200 μm. (G, H) Klonal målretting (G) og høyeffektiv (H) målretting av bakhjerne, forstørret i (I, J). Skalastenger = 200 μm. (K) GFP reporteruttrykk i øyet ved E13.5 etter in utero injeksjon ved E7.5 (L, M) GFP reporteruttrykk i øyet ved E15.5 etter in utero injeksjon ved E8.5 (L), bokset region forstørret i (M), eller ved E9.5 (N). Autofluorescerende blodkar er merket med hvite stjerner. Skala barer = 100 μm. Forkortelser: NEPTUNE = neural plate targeting with in uteronano-injection; C = hornhinnen; LE = linseepitel; LF = Linsefibre; M = Mesenkym; NR = nevrale netthinnen; ON = optisk nerve; RPE = retinal pigmentepitel; GFP = grønt fluorescerende protein; CNS = sentralnervesystemet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: In utero transduksjon av ikke-nevrale vev. (A) Konfokalt bilde av E15.5 munnhule. Embryo ble injisert med fluorescerende reporter lentivirus på E9.5. Skala bar = 200 μm. (B, C) (B) Forstørrelse av innfelt panel; spyttkanalepitel transducert med virus. (C) Forstørrelse av innfelt panel; dorsalt lingual epitel transduced med GFP reporter virus (hvit brakett). Det underliggende mesenkymet avledet fra nevrale kamceller er negativt. Hvite pilspisser indikerer papiller med negative nevrale kamceller omgitt av virustransduserte epitelceller (autofluorescerende blodceller/kar er merket med hvite stjerner). Skalastenger = 50 μm. (D) Skjematisk og konfokalt bilde av E13.5 tungemesenkym etter injeksjoner med fluorescerende reportervirus ved E7.5. Skala bar = 50 μm. Forkortelser: D = Dorsal; M = Mesenkym; N = Nasopharynx; SLD = Sublingual kanal; SMD = submandibulær kanal; T = Tunge; V = Ventral; GFP = grønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Transduksjon av nevrale kamavledede dorsale rotganglionceller. (A) NEPTUN-målretting ved E7.5 tillater målretting av både CNS og PNS. (B) Konfokalt bilde av E13.5 ryggmarg og DRG-er injisert med hPGK-H2B-GFP reporter lentivirus ved E7.5 viser transduksjon av både SOX2+ nevrale forfedre og NeuN+-nevroner. Skalalinje = 100 μm. (C) Bokset region av B som viser DRG med GFP-uttrykk i SOX2+ (hvite piler) og NeuN+ (hvite pilspisser) cellepopulasjoner. Skalalinje = 20 μm. (D) Konfokalt bilde av E13.5 ryggmarg og DRG injisert med DCX-H2B-GFP lentivirus ved E7.5, rettet mot bare DCX + celler. Skalalinje = 100 μm. (E) Bokset region av D som viser DRG med GFP-uttrykk begrenset til DCX + nevroner (hvite pilspisser). DCX-celler er negative for GFP (hvite piler). Skala bar = 20 μm. Forkortelser: NEPTUNE = neural plate targeting with in utero nano-injection; CNS = sentralnervesystemet; PNS = perifert nervesystem; DRGs = dorsal rot ganglia; GFP = grønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Det er flere trinn i denne protokollen som påvirker embryonal overlevelse, kvaliteten på injeksjonene og avlesningen. Embryoenes svangerskapsalder er definert som E0.5 ved middagstid dagen for vaginalpluggen etter parring over natten. Ultralydkontroll ved E6.5 sent på ettermiddagen/kvelden sikrer at embryoene utvikles nok til å kunne identifiseres med ultralyd. Kontrollen (1) tillater prescreening av hvor mange plug-positive mus som faktisk er gravide, (2) sikrer at ingen virus tines unødvendig og bortkastes i tilfelle plug-positive mus ikke er gravide, og (3) reduserer unødvendige inngrep på mus (unngår kirurgi på ikke-gravide kvinner).
Ved E7.5 er embryoer følsomme for ytre krefter og bør håndteres med forsiktighet. For eksempel kan det å trekke på livmorhornene eller klemme deciduaene føre til embryoresorpsjon. Livmorvevet skal alltid holdes fuktig når det er utenfor den kvinnelige magen for å forhindre at vevet tørker. Flertallet av deciduaene skal forbli inne i den kvinnelige magen, med bare 3-4 utsatt for injeksjoner. Nåleskarphet er en annen avgjørende faktor for vellykkede injeksjoner. Stumpe eller ødelagte nålespisser resulterer i gjentatt poking av deciduas eller kompresjon mot modelleringsleiren før de kommer inn i AC, noe som kan øke resorpsjonshastigheten. Derfor bør velmalte og skarpe nåler alltid lagres trygt og erstattes etter maksimalt 2 kvinner.
Denne protokollen beskriver hvordan du målretter nevralplaten med en enkelt injeksjon av lentivirus. Videre viser den hvordan transduksjonseffekten kan tilpasses fra encellede kloner til hele hjernen. Imidlertid er andre ikke-nevrale vev, inkludert hud og oralt epitel, også målrettet. I tillegg transduseres alle celletyper (forfedre og differensierte celler), noe som gjør denne tilnærmingen effektiv, men ikke-spesifikk. Bruken av MiniPromoters i viruskonstruksjonen fører til det spesifikke uttrykket av transgenet i nevroner eller astrocytter15. Dette har fordelen av å unngå bruk av dedikerte transgene Cre-dyr og reduserer derfor mengden arbeidskraft (belastningsvedlikehold og genotyping) og kostnader.
Begrensningene til NEPTUNE inkluderer tekniske vanskeligheter, utfordringer med å skaffe gravide kvinner til en forutsigbar og konsistent hastighet, og kostnadene ved å anskaffe spesialisert instrumentering. Videre kan ikke-selektiv målretting av celler av lentivirus ses som både en fordel og en begrensning av teknikken. Injeksjon av større volumer i AC resulterer i exencephaly13, selv om hjernemisdannelser og exencephaly unngås med volumene beskrevet her15. En negativ innvirkning på hjernens utvikling er dermed en risiko med in utero nano-injeksjoner som må unngås nøye ved å injisere riktige volumer tilpasset embryonale stadium og AC-størrelse.
Fremtidige tilpasninger av teknikken kan fokusere på viral tropisme. Adeno-assosierte virus (AAV) har forskjellige serotyper, som har vist seg å robust målrette mot forskjellige celletyper i CNS17,26. AAV-er integreres imidlertid ikke i vertscellegenomet og kan derfor gå tapt i celler med høy delingshastighet. Selv om det er flere måter å øke spesifisiteten til NEPTUN, er transgene dyr fortsatt gullstandarden når det gjelder genmanipulering in vivo. Cas9-mus og sgRNA-kodende lentivirus har blitt brukt til genetisk screening i embryonalepidermis 27 og kan også tilpasses utviklingen av CNS.
Injeksjoner i AC ved E7.5 retter seg effektivt mot celler i nevroektodermen før initiering av neurulasjon og retter seg mot den utviklende hjernen mer effektivt enn i utero elektroporering. Dette gjør det mulig å studere genetiske signaler som er viktige for hjernens utvikling fra et tidligere tidspunkt. I motsetning til klassiske genetiske musemodeller tilbyr NEPTUNE en fleksibel tilnærming til å utføre funksjonell genanalyse. Fenotyper etter overekspresjon eller gensletting kan studeres i løpet av dager til uker sammenlignet med måneder eller år. Injiseringer av flere virale konstruksjoner tillater manipulering av flere gener i ett embryo og unngår generering av doble eller trippel knockout dyr. Derfor sparer NEPTUNE ikke bare tid, men kan også redusere antall dyr som brukes i forskning.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Bettina Semsch og Jia Sun (Infinigene) for ekspertpleie av mus; Florian Salomons og Göran Månsson fra Biomedicum Imaging Core (BIC) for hjelp med bildeinnhenting og konsultasjon. Finansiering: Vi takker følgende finansiører for deres støtte til dette prosjektet: Det svenske Vetenskapsrådet, Karolinska Institutet (KI Foundations, Career Development Grant, Ph.D. student KID finansiering, og SFO StratNeuro finansiering, Center of Innovative Medicine), The Ollie og Elof Ericssons Foundation, Tornspiran Foundation, Jeansssons Foundation, Sven og Ebba-Christina Hagbergs Prize og forskningsstipend, Knut og Alice Wallenberg Prosjektstipend, Fredrik og Ingrid Thürings Stiftelse, Lars Hiertas Minne, Barncancerfonden, Åhlenstiftelsen, Åke Wibergs Stiftelse, Tore Nilssons Stiftelsesfond, og Stiftelsen Stiftelsesstipend til ERA. Figur 4D,E ble opprettet med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe | BD Bioscience | 309628 | |
| 27 G Needle | BD Bioscience | 300635 | |
| 3.5 inches capillaries | Drummond Scientific | 3000203G/X | Were used to pull in house needles |
| 70 MHz MS Series transducer | Visual Sonics | MS700 | |
| Aquasonic clear ultrasound gel | Parker Laboratories | Mar-50 | |
| Autoclip Applier 9 mm | Angthos | 12020-09 | |
| CD1 mice | Charles River, Germany | Crl:CD1(ICR) | Females: from age of 8 weeks old Males: from the age of 12 weeks old |
| Cotton Swab | OneMed Sverige AB | 120788 | |
| DPBS | Gibco | 14190094 | |
| Dressing forceps delicate straight 13 cm | Agnthos | 08-032-130 | |
| EG-400 Narishige Micropipette Grinder | Narishige | NA | |
| EZ clips 9 mm | Angthos | 59027 | clips |
| Iris Scissors, Super Cut, straight, 9 cm | Agnthos | 307-336-090 | |
| Isofluorane | Baxter Medical AB | EAN: 50085412586613 | Purchased from Swedish Pharmacy |
| Kimwipes | Kimberly Clarke | 7557 | |
| Membrane Tape | Visual Sonics | SA-11053 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Modeling Clay | Sense AB | 10209 | |
| Mouse Handling Table | Visual Sonics | 50249 | |
| Nanoject II Auto Injector Kit | Drummond | 3-000-205A | |
| Parafilm | Bemis | HS234526C | |
| Petri dish with central opening (low wall) | Visual Sonics | SA-11620 | |
| Petri dish, (ØxH): 92 x 16 mm | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| Rely+On Virkon | DuPont | 130000132037 | disinfectant |
| Silicone membrane | Visual Sonics | SA-11054 | |
| Steri 250, hot bead sterilizer | Angthos | 31100 | |
| Surgical Tape (1.25 cm x 9.14 m) | Medicarrier | 67034 | |
| Vevo Compact Dual (Med. Air & O2) Anesthesia System | Visual Sonics | VS-12055 | |
| Vevo Imaging Station 2 | Visual Sonics | VS-11983 | |
| Vevo2100 | Visual Sonics | VS-20047 | |
| Vicryl 6-0; C-3 needle, 45 cm purple filament | Agnthos | J384H |
References
- Theiler, K. The House mouse. Atlas of embryonic development. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1989).
- Barresi, M. J. F., Gilbert, S. F. Developmental biology. , Sinauer Associates Inc. Publishers. Sunderland, Massachusetts. (2016).
- Taylor, J. C., et al. Factors influencing success of clinical genome sequencing across a broad spectrum of disorders. Nature Genetics. 47 (7), 717-726 (2015).
- Pizzo, L., et al. Rare variants in the genetic background modulate cognitive and developmental phenotypes in individuals carrying disease-associated variants. Genetics in Medicine. 21 (4), 816-825 (2019).
- Sakai, Y. Neurulation in the mouse: Manner and timing of neural tube closure. The Anatomical Record. 223 (2), 194-203 (1989).
- Schoenwolf, G. C. Shaping and bending of the avian neuroepithelium: Morphometric analyses. Developmental Biology. 109 (1), 127-139 (1985).
- Smith, J. L., Schoenwolf, G. C., Quan, J. Quantitative analyses of neuroepithelial cell shapes during bending of the mouse neural plate. Journal of Comparative Neurology. 342 (1), 144-151 (1994).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Development Growth and Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. I. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230 (2), 376-380 (1997).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos. Nature Medicine. 16 (7), 821-827 (2010).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. Journal of Visualized Experiments JoVE. (45), e2047 (2010).
- Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system. Nature Neuroscience. 2 (9), 812-819 (1999).
- Slevin, J. C., et al. High resolution ultrasound-guided microinjection for interventional studies of early embryonic and placental development in vivo in mice. BMC Developmental Biology. 6, 10 (2006).
- Mangold, K., et al. Highly efficient manipulation of nervous system gene expression with NEPTUNE. Cell Reports Methods. 1, 100043 (2021).
- Kameneva, P., et al. Single-cell transcriptomics of human embryos identifies multiple sympathoblast lineages with potential implications for neuroblastoma origin. Nature Genetics. 53 (5), 694-706 (2021).
- Kaiser, K., et al. MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus. Development. 148 (10), (2021).
- Haddad, M. R., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. G. Fetal brain-directed AAV gene therapy results in rapid, robust, and persistent transduction of mouse choroid plexus epithelia. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 2 (6), 101 (2013).
- Heavner, W., Pevny, L.
- Swamynathan, S. K. Ocular surface development and gene expression. Journal of Ophthalmology. 2013, 103947 (2013).
- Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands: -overview of the Japan Salivary Gland Society-sponsored workshop. Acta Histochemica et Cytochemica. 45 (5), 241-250 (2012).
- Liu, H. X., Komatsu, Y., Mishina, Y., Mistretta, C. M. Neural crest contribution to lingual mesenchyme, epithelium and developing taste papillae and taste buds. Developmental Biology. 368 (2), 294-303 (2012).
- Marmigère, F., Ernfors, P. Specification and connectivity of neuronal subtypes in the sensory lineage. Nature Reviews. Neuroscience. 8 (2), 114-127 (2007).
- Zirlinger, M., Lo, L., McMahon, J., McMahon, A. P., Anderson, D. J. Transient expression of the bHLH factor neurogenin-2 marks a subpopulation of neural crest cells biased for a sensory but not a neuronal fate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 8084-8089 (2002).
- Portales-Casamar, E., et al. A regulatory toolbox of MiniPromoters to drive selective expression in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16589-16594 (2010).
- Tervo, D. G. R., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367 (6483), 1264-1269 (2020).
