Summary
Bu protokolde, E7.5'teki fare amniyotik boşluğunun lentivirüs ile nasıl enjekte edileceğini açıklıyoruz, bu da tüm sinir plakasının düzgün bir şekilde transdüksiyonuna yol açarak, hayatta kalma veya embriyonik gelişim üzerinde minimum zararlı etkiye sahiptir.
Abstract
Utero'da gelişmekte olan fare beynindeki gen ekspresyonunu manipüle etmek , fonksiyonel genetik çalışmaları için büyük bir potansiyele sahiptir. Bununla birlikte, daha önce büyük ölçüde nörülasyon sonrası embriyonik aşamaların manipülasyonu ile sınırlandırılmıştır. Amniyotik boşluğu embriyonik günde (E)7.5 enjekte etmek ve lentivirüs vermek, cDNA veya shRNA'yı kodlamak, nöral plaka ve nöral krest hücrelerinin% >95'ini hedef alarak gelecekteki beyin, omurilik ve periferik sinir sistemine katkıda bulunan bir protokol geliştirilmiştir. Bu protokol, cam kılcal damar iğnelerinin öğütülmesi, gebelik doğrulaması, ultrason görüntüleme kullanılarak gelişimsel evreleme ve embriyonik aşamalarla eşleşen optimal enjeksiyon hacimleri dahil olmak üzere başarılı bir transdüksiyon elde etmek için gerekli adımları açıklamaktadır.
Bu protokolü takiben, gelişmekte olan beynin %>95'inin yüksek titreli lentivirüs ile transdüksiyonunu sağlamak ve böylece tüm beyin genetik manipülasyonunu gerçekleştirmek mümkündür. Buna karşılık, daha düşük viral titreler kullanarak mozaik transdüksiyonu elde etmek mümkündür, bu da genetik taramaya veya soy izlemeye izin verir. E7.5'teki enjeksiyon ayrıca göz, dil ve periferik sinir sisteminin farklı bölmelerine katkıda bulunan ektoderm ve nöral tepeyi de hedefler. Bu teknik, deneylerde kullanılan fare sayısını azaltma yararıyla, fare nöral plakası ve ektoderm kaynaklı dokulardaki gen ekspresyonunu prenörülasyon aşamalarından manipüle etme imkanı sunar.
Introduction
Beyin ve omurilik, embriyogenez 1,2 sırasında oluşumu başlatan ilk organlar arasındadır. Nörogelişimsel bozukluklarla ilişkili genler tanımlanmakla birlikte, genetik varyantların fonksiyonel sorgulaması 3,4'ün gerisinde kalmıştır. Koşullu nakavt farelerin üretimi aylar veya yıllar alabileceğinden, gelişmekte olan beyindeki gen fonksiyonunu hızlı bir şekilde araştırmak için alternatif bir teknik ilgi çekicidir. Fare embriyolarında, nörülasyon - nöral plakanın merkezi sinir sistemine (CNS) yol açmak için nöral tüpe dönüştüğü morfogenetik süreç - gebe kalmasonrası 8 ila 10. günler arasında gerçekleşir 5. Nörülasyonun başlamasından önce, nöral plaka, ektodermin bir parçası olarak, CNS 6,7 içindeki sayısız nöronal ve glial hücre tipine çoğalacak ve farklılaşacak tek bir sütunlu hücre katmanından oluşur. Bu nedenle, CNS'deki gen ekspresyonunda deneysel olarak uzun süreli değişiklikleri indüklemek için, nöral plakayı hedeflemek, tüm progenitör hücrelerin erişilebilirliği de dahil olmak üzere belirgin avantajlar sunar.
Nörobilimde, ovo elektroporasyonunda8,9 ve fare embriyolarının viral transdüksiyonu, embriyonik CNS gen ekspresyonunu manipüle etmek için kullanılmıştır. Gelişmekte olan civciv embriyosu, yumurtadaki civciv embriyosunun erişilebilirliği ve bunun sonucunda gen ekspresyonunu manipüle etmenin kolaylığı nedeniyle omurilik gelişimi sırasında gen fonksiyonunu incelemek için tercih edilen bir model olmuştur. Özellikle, ovo plazmidinde elektroporasyon, her civciv omuriliğinde deneysel ve kontrol koşulları oluşturur. Elektroporasyon, hücre zarı geçirgenliğine neden olur ve embriyoya iki elektrot aracılığıyla bir elektrik darbesi uygulayarak negatif yüklü DNA'yı (negatif) katottan (pozitif) anoda doğru yönlendirir. Farelerde, utero elektroporasyon genellikle nörülasyonun tamamlandığı embriyonik aşamalarla sınırlıdır ve beyin veya omurilik zaten birkaç hücre katmanından oluşur ve bu da düşük elektroporasyon verimliliği10 ile sonuçlanır. Plazmid elektroporasyonu geçici gen ekspresyonu ile sonuçlanır ve genellikle az sayıda hücreyi hedef alır.
Ultrason rehberliğinde utero mikroenjeksiyon, cilt ve beyin gibi farklı embriyonik yapıları manipüle etmek için kullanılmıştır11,12,13,14. Bununla birlikte, gelişmekte olan murin CNS'yi hedef alan enjeksiyonlar düşük etkinlik göstermiş veya embriyonik sağkalımı olumsuz etkilemiştir12,13,14. Bu nedenle, yüksek titreli lentivirüsün E7.5'teki amniyotik boşluğa (AC) verilmesi için geliştirilmiş bir protokol geliştirilmiştir; bu, in uteronano-injection15 ile neural pgeç targeting için NEPTÜN olarak adlandırılmıştır. Enjeksiyonlar, E13.5'te tüm beynin% >95'inin uzun süreli hedefleme etkinliği ile sonuçlandı. Ayrıca, gebeliğin ultrason doğrulaması sırasında, araştırma hayvanları üzerinde gereksiz prosedürleri en aza indirmek ve enjeksiyon başarısını en üst düzeye çıkarmak için kadınları ve gebelikleri gelişim aşamasına göre sıralamak için bir evreleme adımı tanıtıldı. Enjeksiyon verimliliği ve hayatta kalma, AC boyutundaki artışla sıkı sıkıya bağlantılıdır. Bu nedenle, bu makalede, embriyonun emilimine neden olmayacak AC'ye uygun bir hacim vermek için enjeksiyondan önce AC boyutunun nasıl ölçüleceği açıklanmaktadır. NEPTÜN, mevcut in utero yaklaşımlara sağlam bir alternatiftir ve fonksiyon çalışmaları kazancı ve kaybı, soy izleme veya tarama15,16 dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çeşitli kullanımlar için uyarlanabilir.
Protocol
CD1 vahşi tip fareler, Avrupa yönetmeliklerine göre, yiyecek ve su ad libitum ile standart bir gündüz ve gece döngüsü ile barındırıldı. CD1 dişileri gece boyunca CD1 erkekleriyle çiftleştirildi ve vajinal tıkaçlar sabah kontrol edildi (E0.3). Enjeksiyon için sadece hamile kadınlar kullanıldı. Burada açıklanan tüm deneyler için etik onay, İsveç Tarım Kurulu (Jordbruksverket) tarafından verilmiştir.
1. Cam iğnelerin hazırlanması: iğne çekme ve taşlama
NOT: Öğütülmüş iğneler satın alınabilse de, iğnelerin şirket içinde çekilmesi, iğne uzunluğunun, deliğinin ve konik açısının kolayca ayarlanmasını sağlar.
- Mikropipet/kılcal çektirme makinesine bir cam kılcal damar monte edin. Belirtilen ekipmanı kullanarak aşağıdaki ayarları kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın): 580 üniteyi ısıtın; hız 140 birim; zaman 200 birim; basınç 500-800 adet.
NOT: Farklı parametrelerin birimleri kılcal çektirme makinesi tarafından tanımlanır. Üniteler farklı ekipmanlar için değişebilir. - Konik uçlu iki cam kılcal damar üreten kılcal damarı ayırmak için Pull tuşuna basın.
NOT: Çektikten sonra, iki cam kılcal damarın uçları, mikropipet çektiricinin yüksek sıcaklığı nedeniyle kaynaştırılarak kapatılır. - ~7 mm'lik bir iğne uzunluğu elde etmek için ucu cerrahi makasla kesin (iğnenin konikleşmeye başladığı yerden ölçülür) (Şekil 1A).
NOT: E7.5 enjeksiyonları için, enjeksiyon bölgesi çok küçük ve hassas olduğu için uzun ve ince bir iğne kritik öneme sahiptir. Kısa ve geniş delikli iğneler embriyonik ölümlere neden olur. - Keskin bir eğim oluşturmak için kesilmiş iğne ucunu öğütün (Şekil 1C-F).
- İğneyi en az 30-45 dakika boyunca maksimum hızda 20°'lik bir açıyla öğütün.
NOT: Yağlayıcı görevi görmek, sürtünmeyi/sıcaklığı azaltmak ve cam parçacıklarını yıkamak için taşlama plakasına ultra saf su eklenir (Şekil 1B). Bununla birlikte, fazla sıvı öğütücüyü yavaşlatabilir. - İğne ucunun (Şekil 1C) taşlama plakası yüzeyine dokunduğundan (Şekil 1D) ancak bükülmediğinden (Şekil 1E) emin olun.
NOT: Bükülmüş taşlama, enjeksiyon sırasında kolayca kırılabilen yanlış eğim açısına sahip uzun ve kırılgan bir iğne ucuna neden olur. İğnelerin kırılması embriyoya zarar verebilir ve sağlam bir iğne ile değiştirilmelidir. Doğru bir taşlama ucu Şekil 1F,G'de gösterilmiştir. Taşlamadan sonra, elde edilen iğne deliğinin ~15 μm'lik bir iç çapa (ID) ve ~35 μm'lik bir dış çapa (OD) sahip olması beklenmektedir (Şekil 1G).
- İğneyi en az 30-45 dakika boyunca maksimum hızda 20°'lik bir açıyla öğütün.
- 1 mL'lik bir şırıngayı mineral yağ ile doldurun ve 27 G'lik bir iğne takın.
- İğne kapağını çıkarın ve şırınga iğnesini yeni buzlu cam kılcal damara yerleştirin. Kılcal uçtan yağ damlayana kadar mineral yağ enjekte edin. Kılcal iğne mineral yağ ile doldurulana kadar 27 G iğneyi geri çekerken enjekte etmeye devam edin, daha sonra şırınga iğnesi çıkarılabilir.
- Hasar ve toz birikmesini önlemek için zemin ve mineral yağ dolu iğneleri kapalı bir ortamda saklayın. Depolama için, tutucu olarak kullanılmak üzere normal bir Petri kabına iki rulo modelleme kili yerleştirin (Şekil 1H). İğneleri kil üzerine yavaşça tünemiş ve iğnelerin kolayca alınması için birbirinden uzağa yerleştirin.
NOT: İğne hazırlığı zaman alıcı olduğundan, iğneleri enjeksiyonlardan en az bir gün önce hazırlamak en iyisidir. İğneleri en fazla iki litreden sonra boşaltın, çünkü körelirler. Hazırlık veya enjeksiyon sırasında iğne hasarı olması durumunda daima yedek iğneler hazırlayın.
Şekil 1: E7.5 amniyotik kavite enjeksiyonları için iğne hazırlığı. (A) Çekilmiş ancak kesilmemiş cam kılcal iğnenin temsili örnekleri (solda), E7.5 enjeksiyonları için en uygun uzunlukta kesilmiş bir kılcal iğne (ortada) ve çok kısa bir kılcal kesim (sağda). (B) İğne taşlamaya hazır, düzgün su kaplamalı öğütücü. (C-F) Farklı iğne uçlarının temsili örnekleri. (C) Öğütücüye monte edilmiş kesilmiş ancak öğütülmemiş iğne ucu; (D) iğne ucunun sadece öğütücüye dokunduğu ideal taşlama pozisyonu; (E) iğnenin çok uzağa indirilmesi ve taşlama işlemi sırasında bükülmesi; (F) E7.5 AC enjeksiyonları için ideal bir öğütülmüş iğne ucu. (G) E7.5 AC enjeksiyonu için uygun olan ~15 μm iç çapa ve ~35 μm dış çapa sahip deliği gösteren bir öğütülmüş iğne ucu. İğne deliği kesikli çizgiler halinde gösterilir. Kırmızı ok uçlarıyla gösterilen dış çap; iç çap mavi ok uçları ile gösterilir. (H) İğne depolama: Çekilmiş ve öğütülmüş iğnelerle doldurulmuş Petri kabı. İki sıra modelleme kili tutucu görevi görür. NOT: C, F, G cinsinden oküler mikrometre için 1 cm 100 perdeye bölünmüştür; hedef 3x; bu nedenle, 1 adım = 10.000 μm/(100 × 3) 33,4 μm'≈. Kısaltmalar: AC = amniyotik boşluk; ID = iç çap; OD = dış çap. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Enjeksiyondan bir gün önce: gebeliğin ultrason doğrulaması için tezgah hazırlayın
NOT: Tüm çalışmalar, lentivirüs ile çalışırken havalandırılan bir Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL 2) tezgahında yapılmalıdır. Gebeliğin ultrason doğrulaması havalandırılan bir bankta yapılabilir.
- İzofluran pompası için ultrason makinesini, ısıtma masasını veO2 beslemesini açın (ekipman arasında değişebilir).
NOT: Havaya izofluran sızıntısı olmadığından emin olmak için izofluran sistemini kontrol edin. - BSL 2 tezgahının içine boş bir atık torbası (kolay erişim için iç duvara bantlanmış), epilasyon kremi, steril paketlenmiş pamuklu çubuklar, su, kağıt mendil ve cerrahi bant yerleştirin.
- Gebeliğin ultrason kontrolü sırasında fare uzuvlarını sabitlemek için dört parça cerrahi bant (~ 7 cm uzunluğunda) hazırlayın.
3. Gebeliği doğrulamak için ultrason kontrolü
NOT: Bu adım, E7.5 Enjeksiyonlarından bir gün önce, E6.5'te gerçekleştirilebilir. Gebelik yaşı kontrolü ile ilgili ayrıntılar için tartışmaya bakın.
- Zamanla çiftleşmiş dişi fareyi indüksiyon odasına yerleştirin.
- Anesteziyi indüklemek için gaz akışını ~ 2.1 LPM'lik bir oksijen akışı ve% 3-4'lük bir izofluran başlangıç dozu ile açın.
- Pençe refleksini kontrol ederek dişinin tamamen uyuşturulduğunu doğrulayın. Pençe refleksi yoksa, izofluranı% 1.5-2'ye düşürün.
NOT: Anesteziyi indüklemek yaklaşık 3 dakika sürer. - Gaz akışını indüksiyon odasından ısıtma masası burun konisine geçirin.
- Anestezi uygulanan dişiyi ısıtma masasına sırtüstü pozisyonda (karın yukarı) yerleştirin ve gebeliğin ultrason kontrolü sırasında anestezinin korunmasını sağlamak için burnu ekli burun konisine yerleştirin.
- Dört pençenin hepsini, dişinin vücudunu germeden veya bıyıkları yakalamadan hazırlanan cerrahi bant parçalarıyla masaya sabitleyin.
- Alt karın bölgesine bezelye büyüklüğünde bir miktar epilasyon kremi uygulayın. Bir pamuklu çubuk kullanarak, kremayı alt karın bölgesine (~ 3 x 3 cm kare) dağıtın ve pamuklu çubuğu ileri geri yuvarlayarak hafifçe masaj yapın.
- Kürk deriden ayrılmaya başladığında, bir mendil kağıdını nemlendirin ve kremi ve kürkü çıkarın. Tüm krem ve saçlar gidene kadar tüylerinden arındırılmış bölgeyi nemli kağıt mendille temizleyin. Cildi kurutun.
- Tıraş edilen bölgeye erik büyüklüğünde bir miktar ultrason jeli uygulayın ve aşağıdaki üç yaklaşımdan herhangi biriyle ultrason kullanarak uterusu tanımlamaya devam edin.
- Bunu manuel olarak yapmak için, ultrason probunu ultrason jelinde tutun ve uterusu bulmak için probu hareket ettirin.
- Yarı manuel yaklaşım # 1 için, ultrason probunu (korkuluk sistemine bağlı) rayın bir kısmını x-düzlemi boyunca gevşeterek ve hareket ettirerek kadın karnının üzerine yerleştirin. Ultrason probunu jele (z-düzlemi) indirin ve alt karın bölgesinden (y-düzlemi) tarayın (Şekil 2A).
- Yarı manuel yaklaşım # 2 için, alt karın bölgesini görüntülemek için ultrason probunu (korkuluk sistemine bağlı) jele indirin. İşlem sırasında ultrason probunu sabit tutun ve ısıtma masasını takılı tekerleklerle x ve / veya y- düzlemleri boyunca hareket ettirin (Şekil 2B).
NOT: Bu erken embriyonik aşamalarda, iç organlar, örneğin bağırsak, ultrason görüntülemede uterusa benzer görünebilir. Bununla birlikte, embriyolar ve desidua, bir küre dizisi olarak (bir kolye boyunca boncuklara benzer) görünürken, bağırsak sürekli bir tüp görünümündedir. Luminal boşlukların (ayrı küreler ve sürekli bir tüp) bağlantısı, yapının ayrı bir küre (embriyo / decidua) (Şekil 2C) veya sürekli bir tüp (bağırsak) olup olmadığını belirlemek için ilgili yapı boyunca ileri geri taranarak değerlendirilebilir (Şekil 2D). Bu aşamada, embriyo sayısını kaydetmek gerekli değildir; varlıklarını veya yokluklarını doğrulamak yeterlidir.
- Hamilelik durumu belirlendikten sonra, ultrason probunu karından uzağa kaldırın ve ultrason jelini çıkarmak için alt karın bölgesini nemli doku kağıdı ile temizleyin.
- İzofluran pompasını kapatın ve pençeleri serbest bırakmak için cerrahi bandı çıkarın.
- Dişini yüzüstü pozisyonda (göbek aşağı) 40 ° C'lik bir ısıtma plakası üzerinde temiz bir kafese yerleştirin. Bilinci yeniden kazanana kadar dişiyi yakın gözlem altında tutun, bu da 2-6 dakika sürer.
NOT: İzoflurana maruz kalmayı en aza indirmek için bir kadın için ultrason kontrolünün <10 dakika olduğundan emin olun. - Tüm malzemeleri ve atıkları temizleyin ve tüm yüzeyleri% 70 etanol ile temizleyin. Ultrason probundan arta kalan ultrason jelini kuru, yumuşak ve tüy bırakmayan bir kağıt mendille silin. Ultrason makinesini, havalandırmalı tezgahı / BSL2 tezgahını, ısıtma masasını veO2 beslemesini kapatın.
4. Embriyo evrelemesi için ultrason kontrolü
NOT: Bu adım ameliyattan önce gerçekleştirilir ve hamile kadınları AC boyutlarına göre sınıflandırmaya yarar. Bu adım, amaç gelişmekte olan CNS'yi hedeflemek olduğunda E7.5'te çok önemlidir. Gelişimin bu erken aşamasında, gelişimdeki birkaç saatlik bir fark, AC'nin boyutunu ve nörülasyonun ilerlemesini önemli ölçüde etkiler.
- 3.1-3.5 arasındaki adımları izleyerek ilk hamile dişi fareyi anestezi altına alın.
- Dişi, adım 3.6'da açıklandığı gibi masaya yerleştirin ve sabitleyin.
- Tıraş edilmiş karnına erik büyüklüğünde bir miktar ultrason jeli uygulayın ve dişinin alt karnını görüntülemek için ultrason probunu indirin.
NOT: Bu adım, dişinin hamilelik için önceki gün ultrasonla incelendiğini ve karın üzerindeki kürkün zaten çıkarıldığını varsayar. Durum böyle değilse, 3.7-3.8 adımlarını izleyerek ultrason jeli eklenmeden önce kürk çıkarılmalıdır. E7.5'te uterus ve desidualar daha büyüktür ve iç organlardan ayırt edilmesi daha kolaydır. Ek olarak, AC daha büyüktür ve ekzoselomik boşluktan (ExC) ayırt edilebilir. - Sol ve sağ uterus boynuzlarını mümkün olduğunca tamamen tarayın.
NOT: Bazı embriyolar dişinin vücudunun derinliklerinde bulunur ve kaçırılabilir. - Embriyoların sayısını ve aşamalarını kaydedin. İdeal büyüklükteki amniyotik boşlukların, kabul edilebilir boşlukların ve boşluksuz desiduaların sayısını not edin (Şekil 2E-G).
- Tüm gebelikleri aşamalandırın ve buna göre sıralayın.
- Kadınlara, 4.5-4.7 adımlarındaki talimatları izleyerek ultrason kontrolünden hemen sonra (adım 4.4) ideal boyutlu AC'lerin çoğunluğunu enjekte edin.
- Kabul edilebilir çoğunluğu olan (ekzoselomik ve amniyotik boşlukların henüz açıkça iki boşluğa bölünmediği) veya boşlukların bulunmadığı kadınlar için, enjeksiyonu erteleyin ve birkaç saat sonra tekrar sahneleyin. Boşlukların çoğu hala çok küçükse, enjeksiyonları 10-12 saat erteleyin.
Şekil 2: Ultrason kontrolü sırasında amniyotik boşlukların incelenmesi ve evrelendirilmesi. (A) Bağlı ultrason probu, nanoenjektör ve ısıtma masası ile raylı sisteme genel bakış. Ultrason probu, kadın karnı veya AC'ler ile optimum hizalama elde etmek için x, y ve z-düzlemlerinde hareket ettirilebilir. (B) Isıtma tablası, AC'lerin hassas bir şekilde taranmasını ve değerlendirilmesini sağlamak için x ve / veya y düzlemlerinde iki tekerlek üzerinden hareket ettirilebilirken, ultrason probu statik kalabilir. (C) Gebeliği doğrulamak için ultrason kontrolü sırasında kadın karnı içindeki E6.5 desidualarının temsili ultrason görüntüleri (beyaz noktalı ana hatlar). Bu noktada herhangi bir boşluk oluşmamıştır; Bununla birlikte, bazen, ektoplasental koni (beyaz yıldız işaretleri) görülebilir. Desidualar küresel şekilleriyle tanınabilir ve sürekli bir tüp olarak görünen bağırsaktan ayırt edilebilir. (D) Alt karın bölgesinden taramada sürekli olan ince bağırsağın temsili görüntü dizisi (beyaz noktalı ana hatlar). (E-G) E7.5 enjeksiyonlarından önce kavite evrelemesi sırasında temsili ultrason görüntüleri. Amniyotik ve ekzoselomik boşluklar oluşmuş ve amniyon tarafından ayrılmıştır. Ektoplasental koni ana kan kaynağı olarak hizmet eder ve ultrasonda parlak bir nokta olarak görünür. AC, ektoplasental koniden en distaldir. (E) İdeal boyutlu AC'ler ekzoselomik boşluktan daha büyükken, orta büyüklükteki boşluklar daha küçük görünür (F). Hiçbir boşluk görünmüyorsa (G), bu ya embriyonun emildiği ya da henüz E7.5'e ulaşmadığı anlamına gelir. Ölçek çubukları = 1 mm. Kısaltmalar: A = Amniyon; AC = Amniyotik Boşluk; ExC = Ekzoselomik Boşluk; EC = Ektoplasental Koni. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
5. Enjeksiyon günü: BSL2 tezgahını ameliyat için hazırlayın
- Bir parça elastik membranı, ticari olarak temin edilebilen, modifiye edilmiş bir Petri kabının yuvarlak, merkezi açıklığına yapıştırın. Sızıntıyı önlemek için membranın Petri kabına iyi tutturulmuş olduğundan emin olun.
NOT: Çanak sızdırmaz hale gelirse veya iyi yapıştırılmazsa, elastik membranın kenarları koli bandı ile daha da sabitlenebilir. - Elastik zarın merkezinde 1-1.5 cm uzunluğunda bir kesi yapın.
- Ultrason makinesini, BSL2 tezgahını, ısıtma plakasını, izofluran pompası içinO2 beslemesini ve cam boncuk sterilizatörünü (300 ° C'ye ayarlanmış) açın.
- BSL2 tezgahının içine bir boş atık torbası yerleştirin (kolay erişim için iç duvara bantlanmış); steril paketlenmiş pamuklu çubuklar (her ameliyat / her kadın için yeni bir tane kullanın); cerrahi aletler (makas, cımbız, klips, dikiş) ve cerrahi bant; bir adet oda sıcaklığında fosfat tamponlu salin (PBS) dolu şişe, atık toplama için bir boş şişe ve bir adet 25 mL pipet; ameliyat için elastik membranlı bir Petri kabı; Petri kabının kapağı, bir damla su ile kapağa tutturulmuş 2 x 2-3 x 3 cm'lik bir parafilm parçası; modelleme kili: 4 daha büyük top veya küp (~3 x 3 x 3 cm3) ve bir silindirik parça (~4 x 1 cm); analjezik (örneğin, buprenorfin, 0.05-0.1 mg / kg vücut ağırlığı) ve göz jeli içeren bir şırıngaNOT: Modelleme kilinin topları (veya küpleri), çanak dişinin karnının üstüne yerleştirildikten sonra Petri kabı için "ayak" veya stand/tutucu görevi görecektir. Silindirik kil parçası, kabın içindeki embriyoları sabitler. Birden fazla çözelti enjekte edilirse veya enjeksiyonlar sırasında iğnenin yeniden doldurulması gerekiyorsa, çözeltiler birbirinden ayrılabiliyorsa aynı parafilm parçası kullanılabilir.
6. İğne yükleme
- Daha iyi kavrama için fazla mineral yağı kağıt mendille silin.
NOT: Hasar veya yaralanmayı önlemek için daima uçtan uzak tutun. - Kılcal iğneyi yerinde tutmak ve hava geçirmez bir bağlantı oluşturmak için tüm bileşenlerin (bir sızdırmazlık O-ringi, bir ara parça ve bir ön conta - hepsi pensin altına yerleştirilmiş, Şekil 3A) doğru yönde monte edildiğinden emin olun (Şekil 3B, görselleştirme için çıkarılan pens), iğnenin içindeki metal pistonu ilerletirken veya geri çekerken kabarcık oluşumunu önler.
- Nanoenjektörün metal pistonunun tamamen geri çekildiğinden emin olun. Doldur'a basarak doğrulayın ve pistonun tamamen geri çekildiğini gösteren çift bip sesi bekleyin.
- Kolye takılıyken ancak hafifçe gevşetilmişken (45-90 derece sökülmüş), cam iğneyi metal pistonun üzerine kaydırın ve kılcal iğneyi metal pistonla birlikte ara parçaya ulaşana kadar ön contadan itin (Şekil 3C, D, görselleştirme için çıkarılan pens).
NOT: Piston contadan geçtiğinde bir miktar direnç ortaya çıkar ve ara parçaya ulaştığında azalır. Hava geçirmez bir bağlantı oluşturmak için kılcal iğnenin ara parçaya sıkıca yerleştirildiğinden emin olun (Şekil 3D). - Nanoenjektörün bileziğini sıkarak iğneyi sabitleyin (güvenli bir şekilde vidalayın).
NOT: İğneyi ezebileceğinden aşırı sıkmayın. - Pistonu iğnenin içine itmek ve yağı iğne ucundan dışarı atmak için Boş tuşuna basın. Cam iğne hareket ederse, pistonu geri çekin, iğneyi çıkarın ve yeniden yükleyin. Bu, hava kabarcıklarının oluşmasına neden olursa, iğneyi çıkarın ve mineral yağ ile doldurun.
NOT: Uygun şekilde sabitlenmiş bir iğne, pistonla birlikte hareket etmemelidir. - Bir damla virüs (~ 6 μL) veya başka bir enjeksiyon çözeltisini bir parça parafilm1 üzerine yerleştirin (Şekil 3E; Evans mavi boyası görselleştirme amacıyla kullanılır).
NOT: Nanoenjektörün maksimum hacmi ~5 μL'dir. - Yağ ve çözelti arasında bölücü görevi görecek bir hava kabarcığı oluşturmak için Doldur düğmesine basın (Şekil 3F).
NOT: Bu aynı zamanda iğneyi doldururken veya boşaltırken bir konumlandırma işaretçisi görevi görür. - İğneyi indirin, ucu çözeltiye batırın ve Doldur'a basın (Şekil 3F, G).
- Hava kabarcığından sonra çözelti yüklenirken sıvı seviyesini izleyin. Tıkanıklığı gidermek için Boş tuşuna basın ve sıvı iğneye girmeden hava kabarcığı uzarsa Doldur'a basarak yeniden yükleyin. Bu sorunu çözmezse, iğneyi değiştirin.
- İğne tamamen yüklendiğinde (Şekil 3H), iğneyi z-düzleminde kaldırın ve iğne ucundaki çözeltinin buharlaşmasını ve iğnenin tıkanmasını önlemek için uçta az miktarda hava aspire edin.
- Herhangi bir kazara hasar veya yaralanmayı önlemek için nanoenjektörü bağlı iğne ile operatörden uzaklaştırın, tezgahın arkasına doğru çevirin.
Şekil 3: İğnenin nanoenjektöre takılması ve çözelti yüklemesi. (A) İğne nanoenjektöre monte edilmeden önce başlangıç pozisyonu: metal piston tamamen geri çekilmiş ve pens takılı. (B) Kolletin altında, iğneyi tutmak ve sabitlemek için üç bileşenin tümü doğru sırada (soldan sağa) gösterilir: O-ring (ince ve siyah), ara parça (beyaz), O-ring (siyah) büyük delikli (iğnenin geçmesi gereken) sızdırmazlık. Hava geçirmez bir bağlantı sağlamak için, cam iğne metal pistonun (C) üzerine kaydırılır ve ara parçaya (D) ulaşana kadar ön O-ringin açıklığından itilir. (E-H) Çözeltinin iğneye yüklenmesi. (E) Bir plaka kapağı üzerindeki bir parafilm parçası üzerine bir damla çözelti yerleştirilir. (F) Çözeltiyi yüklemeden önce Doldur düğmesine basarak bir hava kabarcığı oluşturun ve iğne ucunu çözeltiye batırın. (G) Çözüm iğneye yükleniyor. (H) Çözelti iğneye yüklenir. NOT: Pens, görselleştirme için (B-D) içinde çıkarılmıştır, ancak deneyler sırasında bağlı kalmalıdır. İğneyi sabitlemenin son adımı penseyi sıkmaktır. Evans mavi boyası E-H'de görselleştirme için kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
7. Enjeksiyonlar
NOT: Bu prosedürde kullanılan tüm aletler ameliyattan önce ve her fare arasında sterilize edilir.
- İdeal büyüklükte boşlukları olan ilk dişiyi anestezi altına alın (bkz. bölüm 4).
- Dişi, 3.1-3.6 adımlarında açıklandığı gibi masaya yerleştirin ve sabitleyin.
- Kornea kurumamasını önlemek için gözlere göz jeli uygulayın ve ağrı kesiciyi deri altından enjekte edin.
NOT: Önerilen analjezikler: Yerel hayvan refahı yönetmeliklerine uygun olarak Buprenorfin (0.05-0.1 mg / kg vücut ağırlığı) veya Flunixin (2.5 mg / kg) veya benzeri. Multimodal perioperatif analjezi enjekte edilen analjezikler ve izofluran ile sürdürülür. - Alt karnı 0.5 mg / mL klorheksidin çözeltisi (veya benzeri) ile ıslatılmış bir bezle silerek aseptik olarak hazırlayın ve cildi kurutun. Alt karın bölgesinde 1.5-2.0 cm dikey orta hat cilt kesisi yapmak için cerrahi makas kullanın.
NOT: Lokal olarak onaylanmış dezenfeksiyon rutinlerini takip ederek cerrahi alanı hazırlayın. - Cildi nazikçe kaldırın ve ameliyattan sonra dikiş atmayı kolaylaştırmak için cildi kesi noktasının yaklaşık 1 cm etrafındaki altta yatan kas tabakasından serbest bırakın.
- Kas tabakasına 1 cm dikey orta hat kesisi yapın.
- Bir çift forseps ile cildin ve kas tabakasının bir tarafını kaldırın ve diğer çiftle uterus boynuzlarını arayın.
NOT: Desidualar bir kolye üzerindeki boncuklar gibi düzenlenirken, bağırsak uzun, sürekli bir tüptür (Şekil 4A). - Forseps ile, her iki uterus boynuzunu da karından dikkatlice çekin. Embriyolar arasındaki dokuyu tutun; doğrudan sıkmayın (Şekil 4B).
NOT: Rahim rahim ağzında vücuda bağlanır ve iki yumurtalık / yumurta kanalı bağlar yoluyla bağlanır. Uterusu bu ankraj noktalarından çekmeyin / ayırmayın. - Sol ve sağ taraftaki embriyo sayısını sayın ve not edin.
- Embriyoları yumurtalıktan servikse veya serviksten yumurtalıklara kadar numaralandırın.
NOT: Bu özellikle enjekte edilen embriyolar embriyonik aşamalarda toplanacaksa önemlidir. - Nemli bir pamuklu çubukla, enjekte edilecek ilk üçü hariç, tüm embriyoları nazikçe karın boşluğuna geri itin.
- Petri kabındaki elastik üzerine bir damla PBS yerleştirin ve embriyoların hemen üzerinde tutun.
- Elastik insizyona kapalı forseps yerleştirin ve elastik insizyonu açmak için forsepsleri serbest bırakın, böylece sıvı embriyoların üzerine düşer.
NOT: Bu, embriyoların rehidrasyonunu ve elastik zarın dişinin ıslak cildine yapışmasını sağlayarak sonraki adımlarda PBS'nin sızmasını önler. - Üç embriyoya karşılık gelen uterusun bir bölümünü forseps ile elastikiyetten çekin ve Petri kabını dişinin karnına hafifçe tüneyin.
- Forseps ve nemli bir pamuklu çubukla, PBS sızıntısını önlemek için elastiğin dişinin cildine kapatılmasını sağlamak için uterus konumlandırmasını ve elastiği ayarlayın.
- Petri kabını karnın hemen üzerine sabitlemek ve sabitlemek için dört kil ayağı kullanın, dişi üzerindeki baskıyı ve görüntülemenin dişinin nefes almasına ve kalp atışına duyarlılığını azaltın.
- Uterusu sabitlemek için modelleme kil silindirini embriyoların / uterusun sağına doğru bastırın (Şekil 4C).
NOT: Bu oryantasyon talimatı, iğnenin dişinin solunda olduğunu ve dişinin sol uterus boynuzunun embriyolarının açığa çıktığını varsayar. Uterusun tarafı (sol veya sağ uterus boynuzu), AC iğneye baktığı için çok önemlidir (sol boynuz; Şekil 4D) veya stabilize edici kil silindirine bakar (sağ boynuz; Şekil 4E). - Embriyoları sağ uterus boynuzundan enjekte etmek için, kil silindirini embriyoların sol tarafına yerleştirin (Şekil 4F) ve doğru oryantasyonu elde etmek için ısıtma tablasını 180 ° (Şekil 4G) çevirin. Bunun yerine iğne hareket ettirilebiliyorsa, ilgili kurulum için uygun şekilde uyarlayın.
- Embriyolar ve uterus PBS ile kaplanana kadar Petri kabına PBS ekleyin.
- Ultrason probunu PBS'ye indirin ve fareyi/cerrahi masayı, enjeksiyonların kaydedilmesini kolaylaştırmak için ilk embriyo ultrason probu ile hizalanacak şekilde ayarlayın.
NOT: "İlk", embriyoların yumurtalıktan servikse kadar numaralandırılmasını ifade eder. - Üç embriyoyu da tarayın ve AC'leri inceleyin. Enjeksiyon hacmini aşağıdaki gibi belirleyin:
- AC'nin çapını ultrason makinesi ile ölçün. AC çapı 0,2 mm ≤ ise 69 nL enjekte edin; AC çapı 0,2 mm ve >0,29 mm ise 2 x 69 nL (= 138 nL) enjekte ≤; ve AC çapı 0,29 mm'> 3 x 69 nL (= 207 nL) enjekte edin (Şekil 4H).
NOT: Önceki deneyler, E7.515'te 207 nL'ye kadar enjeksiyon hacminin iyi tolere edildiğini göstermiştir. Sağkalım üzerinde minimum etkiye sahip başarılı enjeksiyonlar, AC'nin göreceli hacim artışı% 90'ı geçmediğinde elde edilir15. Çöp arkadaşları veya fare suşları arasındaki AC boyutundaki farklılıklar yaygındır ve daha fazla optimizasyon gerektirebilir.
- AC'nin çapını ultrason makinesi ile ölçün. AC çapı 0,2 mm ≤ ise 69 nL enjekte edin; AC çapı 0,2 mm ve >0,29 mm ise 2 x 69 nL (= 138 nL) enjekte ≤; ve AC çapı 0,29 mm'> 3 x 69 nL (= 207 nL) enjekte edin (Şekil 4H).
- Enjeksiyon kontrolörü ile enjeksiyon hacimlerini ayarlayın.
- 23 nL/s enjeksiyon hızı ile enjeksiyon hızını yavaşlatacak şekilde ayarlayın.
NOT: Farklı ekipman modelleri farklı enjeksiyon kuvvetlerine neden olabilir. - Ray sistemindeki ana tekerlekleri kullanarak iğneyi PBS'ye indirin (x ve z düzlemleri, Şekil 4I) ve sıvı iğne ucuna ulaşana kadar nanoenjektör kontrolöründe Boş düğmesine basın.
NOT: İğne tıkanmışsa, Boş'a basmak tıkanıklığı çözebilir ve/veya tıkanıklığı dışarı atabilir. - İğneyi PBS'den kaldırın ve Enjekte Et düğmesine basın. Yaklaşık istenen hacimdeki bir damlanın boşaltıldığını doğrulayın.
- İğneyi PBS'ye indirin ve nanoenjektörü mikromanipülatör üzerindeki y-düzlemi tekerleği ile hareket ettirerek ultrason probu ve embriyo ile hizalayın (Şekil 4J).
NOT: İğne ucu, ultrason görüntüsünde parlak bir nokta olarak göründüğünde mükemmel bir şekilde hizalanır (Şekil 4K, L). İğne, mikromanipülatör ile her üç yön düzleminde de hareket ettirilebilir. - Rahim duvarına göre neredeyse dik bir enjeksiyon açısı sağlamak için enjeksiyon açısı tekerleği ile iğne açısını ayarlayın. Mikromanipülatör üzerindeki enjeksiyon tekerleğini kullanarak iğneyi tek hareketle AC'ye yerleştirin (Şekil 4J-M). İğne ucu parlaklığına dikkat edin. İğne ucu ultrason görüntüsünden kaybolursa, iğneyi tekrar odaklamak için ultrason probunu ileri veya geri hareket ettirin.
NOT: İğne AC'nin içine girdikten sonra, embriyoya zarar vermeden iğne pozisyonunda ve odağında küçük değişiklikler yapılabilir (~ 0,3 mm içindeki ayarlamalar). İğne pozisyonunu bundan daha fazla ayarlamayın. - Enjekte Et düğmesine basın (207 nL için, ses seviyesini 69 nL'ye ayarlayın ve üç kez enjekte edin). Enjeksiyondan sonra, iğneyi nazik bir hareketle geri çekmeden önce 5-10 s daha bekleyin.
Şekil 4: Başarılı enjeksiyonlar için amniyotik boşluğun optimal boyutu ve oryantasyonu . (A) Kalın bağırsağa (üstte) kıyasla bir dizi küre (alt) şeklinde çoklu E7.5 desidualı uterus boynuzu (B) Desidualar arasındaki uterus dokusunu (beyaz noktalı çizgiler) kavrayın. Desiduaları (beyaz ok uçları) doğrudan forseps ile sıkmaktan kaçının, çünkü desidualar ve gelişmekte olan embriyolar bu erken aşamada kırılgandır ve aşırı dış kuvvet üzerine emilime eğilimlidir. (C) PBS ile doldurulmuş bir Petri kabında açığa çıkan ve modelleme kilinin dört ayağına monte edilmiş desidualarla sırtüstü pozisyonda dişi. Desidualar, silindir şeklinde ek bir modelleme kili parçası ile stabilize edilir. (D, E) AC'nin oryantasyonu, uterus boynuzunun maruz kalan tarafından etkilenir. Sol uterus boynuzundan desiduas kullanılırsa, AC kil stabilizatöründen uzağa bakacak ve soldaki iğneye (D) kolayca erişilebilecektir. Bununla birlikte, sağ uterus boynuzu kullanılırsa, ektoplasental koni bunun yerine iğneye bakacak ve AC (E) 'ye erişimi zorlaştıracaktır. Bu nedenle, sağ uterus boynuzuna enjekte edilirken, kil stabilizatörü iğneye bakan tarafa (F) doğru yerleştirilir ve tüm ısıtma tablası 180 ° (G) döndürülür. (H) AC boyutlarına göre önerilen enjeksiyon hacimleri. Genel olarak, 0.2 mm çapında ≤ boşluklar maksimum 69 nL ile enjekte edilebilir. 0,2 mm'> çaplar ve 0,29 mm'≤ 2 x 69 nL'ye (138 nL) kadar hacimleri tolere eder ve 0,29 mm'> boşluklar 3 x 69 nL (207 nL) ile enjekte edilebilir. Ölçek çubukları = 1 mm. (I, J) Nanoenjektör raylı sisteme bağlanır ve x ve / veya z düzlemlerinde hareket ettirilebilir. İğnenin açısı, enjeksiyon açısı tekerleği ile ayarlanabilir. (K, L) İğne ucu (beyaz ok ucu), ultrasonda (L) en parlak göründüğünde AC ile hizalanır. (M) İğne ucunun AC'de olduğu ve iyi hizalanmış (beyaz ok ucu) enjeksiyon işlemini gösteren ultrason görüntüsü. Kısaltmalar: A = Amniyon; AC = Amniyotik Boşluk; ExC = Ekzoselomik Boşluk; EC = Ektoplasental Koni. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Aşamayı bir sonraki embriyoya taşıyın ve uygun AC boyutlarına sahiplerse diğer iki embriyo için 7.22-7.26 adımlarını tekrarlayın.
- Mikromanipülatörü kullanarak ultrason probunu ve iğneyi PBS'den kaldırın. Hasar ve yaralanmayı önlemek için iğneyi operatörden uzaklaştırın.
- Forsepsle, 1. ve 2. embriyoları elastik yoldan hafifçe iterek dişinin karnına geri yönlendirin. 3. embriyoya bitişik dokuyu yavaşça kavrayın ve uterusu elastik insizyonun üst ucuna doğru çekin. Forseps ile 4.-6. embriyoları yavaşça yukarı çekin ve 3. embriyonun karın bölgesine tekrar girmesine izin verin.
NOT: Bu adım, PBS'yi değiştirmeden veya Petri kabını çıkarmadan yapılabilir. - Optimal AC'li tüm embriyolar enjekte edilene veya zaman sınırına ulaşılana kadar gerektiği gibi tekrarlayın.
- Embriyoları / uterusu yavaşça dişinin karnına geri itin.
- PBS'yi aspire edin ve Petri kabını çıkarın. Bir virüs kullanılmışsa, bulaşıcı atık olarak kullanın.
- Vicryl (USP 6-0, iğne uzunluğu 13 mm, 3/8 Daire) ile kas tabakasını basit sürekli veya kesilmiş dikişlerde bir araya getirin ve cildi 1-2 klipsle kapatın (bkz.
- İzofluran pompasını kapatın.
- Cerrahi bandı çıkarın ve dişi 40 ° C'lik bir ısıtma plakası üzerinde temiz bir kafese yüzüstü pozisyonda (göbek aşağı) yerleştirin.
NOT: Dişinin bilincini yeniden kazanması ve 10 dakika içinde hareketli olması beklenir. İşlemin 30 dakika içinde tamamlandığından emin olun. Dişinin genetik geçmişi, yaşı ve ağırlığı anesteziye duyarlılığı etkileyebilir. Ameliyat sırasında fareleri yavaş nefes alma (yavaş nefes alma anestezinin çok derin olduğu anlamına gelir) veya hareket (anestezi çok hafif) belirtileri açısından izleyin. Buprenorfin (0.05-0.1 mg / kg vücut ağırlığı) veya Flunixin (2.5 mg / kg) veya benzeri, yerel hayvan refahı yönetmeliklerine uygun olarak, gerekirse ilk enjeksiyondan 8 saat sonra sağlanabilir. - Başka bir dişi enjekte edilecekse, ilkinin uyanışını izlerken cerrahi alanı hazırlayın.
- Artık kan veya dokuyu çıkarmak için cerrahi aletleri% 70 etanol ile silin ve önceden ısıtılmış cam boncuk sterilizatöründe 10 saniye boyunca sterilize edin. Pamuklu çubukları ve kullanılmış kağıt mendilleri atın. Petri kabını silin ve kil parçalarını kağıt mendille kurulayın.
- Tüm dişiler enjekte edilene kadar 7.1-7.35 arasındaki adımları tekrarlayın.
- İğneyi boşaltın ve atın.
- İğnede bir virüs veya enjeksiyon çözeltisi kalmışsa, nanoenjektör üzerinde Boş tuşuna basın ve iğnenin içeriğini doku kağıdına boşaltın.
- Kontrol cihazından çift bip sesi gelene kadar Doldur'a basarak metal pistonu tamamen geri çekin, bu da pistonun tamamen geri çekildiğini gösterir.
- Collet'i gevşetin ve iğneyi metal pistondan kaydırın. İğneyi keskin atık kabına atın.
- BSL-2 tezgahını temizleyin.
- Bir virüs kullanılmışsa, tüm cerrahi alana dezenfektan püskürtün ( Malzeme Tablosuna bakınız). 15 dakika sonra, dezenfektanı silin ve tüm cerrahi alanı% 70 etanol ile temizleyin. Virüs kullanılmadıysa, tüm yüzeyleri% 70 etanol ile temizleyin.
- Ultrason probundan kalan PBS'yi kuru, yumuşak ve tüy bırakmayan kağıt mendille silin.
- Atıkları biyogüvenlik kurallarına göre atın.
- Ultrason makinesini, ısıtma masasını, BSL2 tezgahını veO2 beslemesini kapatın.
Representative Results
E7.5'e hPGK-H2B-GFP lentivirüs11,12 enjekte edilen embriyolar E13.5'te toplandı ve floresan diseksiyon mikroskobu altında incelendi (Şekil 5A). Nöral plağın başarılı bir şekilde transdüksiyonu, esas olarak beyinde ve diğer ektoderm türevi dokularda, örneğin deride floresan bir muhabirin güçlü ekspresyonuna sahip embriyolarla sonuçlanır (Şekil 5A, B). Aşırı yüksek bir hacmin enjeksiyonu (burada önerilen hacimlerden daha büyük, örneğin, ≥500 nL) AC'deki basıncı arttırır ve tam rezorpsiyona (veriler gösterilmemiştir) veya ekzensefali gibi nöral tüp defektlerine (Şekil 5A) neden olabilir. E7.5'teki başarılı enjeksiyonlar, ön beyinden arka beyne düzgün bir şekilde transdüksiyonla sonuçlanır (Şekil 5C-J).
2 × 10 10bulaşıcı ünite (IFU) civarındaki lentiviral titreler% 95'in üzerinde hedefleme elde ederken, ~ 1 × 109 IFU'luk titreler% 15 hedefleme verimliliği15'e ulaşır. Ek olarak, koroid pleksus17,18 gibi elektroporasyon kullanılarak hedeflenmesi daha önce zor olan yapılar da hedeflenmektedir (Şekil 5 E,F). Düşük titreli enjeksiyonlar, tek hücreli klonların (Şekil 5C, Şekil 5E ve Şekil 5G, H) transdüksiyonu ile sonuçlanırken, yüksek titreli virüs kullanımı tüm beynin yaklaşık% 100'ünü dönüştürür (Şekil 5D, Şekil 5F, Şekil 5H ve Şekil 5J ). Bu nedenle, NEPTÜN klonal transdüksiyon, soy izleme ve genetik tarama yaklaşımları için veya tüm beyinde gen aşırı ekspresyonunun veya downregülasyonunun küresel etkilerini incelemek için kullanılabilir.
Memeli göz gelişimi, embriyonik ektodermin üç türevi arasındaki iyi organize edilmiş iletişimin sonucudur: nöral retina (NR) ve retinal pigment epiteli (RPE), ventral ön beynin nöroepitelinden türetilirken, yüzey ektodermi gelecekteki lens ve kornea epiteline yol açar. Bununla birlikte, korneanın diğer iki tabakası olan santral stroma ve posterior endotel, perioküler mezenkimin nöral krest hücrelerinden türetilir19,20. E7.5'te yüksek titreli lentivirüs ile enjekte edilen E13.5 embriyoları boyunca koronal kesitler, beyne benzer şekilde, gözün nöral dokusunun yanı sıra lens, kornea ve mezenkimin yüksek ve düzgün transdüksiyonunu göstermiştir (Şekil 5K). Nörülasyon ilerledikçe, E8.5 ve E9.5'teki enjeksiyonlar, lens ve kornea epitelinin (Şekil 5L ve Şekil 5N) sürekli hedeflenmesine neden olurken, gözün nöroektoderm kaynaklı dokularının transdüksiyonu E8.5'te (Şekil 5L, M) daha az verimlidir veya E9.5'i hedeflemez (Şekil 5N).
Çoğu viral partikül enjeksiyon üzerine maruz kalan dokuları enfekte ederken, bazı partiküller daha sonra gelişen ektodermal olmayan türetilmiş dokuları dönüştürür (Şekil 6A). Tükürük bezleri ve kanalları oral epitel21'den E11.5 civarında gelişir ve NEPTÜN ile hedeflenir (Şekil 6B). E9.5'teki enjeksiyonları takiben, dilin lingual epiteli iyi dönüştürülür; Bununla birlikte, altta yatan mezenkim negatiftir (Şekil 6C; parantezler dönüştürülmüş hücreleri gösterir; yıldız işaretleri dönüştürülmüş hücreleri değil otofloresan sinyalini gösterir). Ek olarak, lingual epitel içinde, negatif kesitlerle ayrılmış pozitif kümeler vardır (Şekil 6C, beyaz ok uçları), papilla yüzeyinin transdüksiyonunu düşündürmektedir. Nöral krest hücreleri, altta yatan dil mezenkiminde ve lingual epitel içinde, tat papillalarının ve tat tomurcuklarının gelişiminde rol oynadıkları tanımlanmıştır22. Gerçekten de, E7.5'teki enjeksiyonlar, E13.5'te dil mezenkiminin yaygın bir şekilde transdüksiyonuna neden olur (Şekil 6D), bu da erken enjeksiyonların nöral krest hücrelerini hedef aldığını ve dildeki mezenkimlere katkıda bulunduğunu düşündürmektedir.
Omurgalılarda, dorsal kök ganglionları (DRG'ler), periferik sinir sisteminin (PNS) merkezi bir bileşenidir, çünkü vücudun çevresinden gelen tüm somatosensoriyel girdiler (sıcaklık, ağrı, basınç) DRG nöronlarının aktivasyonu yoluyla beyne iletilir23. DRG'nin hem nöronları hem de glial hücreleri, gövde nöral krest hücrelerinden türetilir24. Her yerde bulunan hPGK promotörünün floresan muhabirin ekspresyonunu kontrol ettiği lentiviral enjeksiyon, merkezi ve periferik sinir sisteminin (Şekil 7A) yaygın bir şekilde hedeflenmesine yol açarak, omurilikteki hem nöronları hem de progenitörleri (Şekil 7B) ve DRG'yi (Şekil 7C) dönüştürür. Doublecortin25 için bir MiniPromoter kullanmak, GFP ekspresyonunu sadece nöronlarla sınırlamayı mümkün kılar (15 ve Şekil 7D, E).
Şekil 5: NEPTÜN ile yüksek verimlilik veya klonal transdüksiyon. (A) Standart aydınlatma ile aydınlatılmış diseksiyon mikroskobu altındaki E13.5 embriyoları (sol panel) ve GFP için aydınlatılmış aynı embriyolar (sağ panel). En solda enjekte edilmemiş embriyo, en sağda başarılı bir şekilde enjekte edilen embriyo, beyinde pozitif sinyal verir (en sağdaki embriyo). Enjekte edilen aşırı hacim nedeniyle ekzensefalik embriyo (orta embriyo). (B) E7.5 enjeksiyonu ile cilt ve beyin hedefleme. Ölçek çubuğu = 50 μm. (C, D) E13.5 düşük klonal transdüksiyon (C) veya yüksek verimli transdüksiyon (D) ile ön beynin konfokal görüntüleri. (C, E, G, I) Beyindeki farklı bölgelerin klonal transdüksiyonu. (D, F, H, J) Beyindeki farklı bölgelerin yüksek verimli transdüksiyonu. Ölçek çubukları = 200 μm. Farklı transdüksiyon etkinlikleri CNS'nin diğer alanlarını temsil eder. (E, F) Koroid Pleksus hedefleme, klonal olarak (E) veya yüksek verimlilikte (F). Ölçek çubukları = 200 μm. (G, H) Klonal hedefleme (G) ve arka beynin yüksek verimli (H) hedeflemesi, büyütülmüş (I, J). Ölçek çubukları = 200 μm. (K) E13.5'te gözde GFP muhabir ekspresyonu, E7.5'te utero enjeksiyondan sonra (L, M) E15.5'te gözde GFP muhabir ekspresyonu, E8.5'te (L) utero enjeksiyondan sonra, (M) veya E9.5'te (N) büyütülmüş kutulu bölge. Otofloresan kan damarları beyaz yıldızlarla işaretlenmiştir. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: NEPTÜN = neural pgeç t argeting ile in uteronano-injection; C = Kornea; LE = Lens Epiteli; LF = Lens lifleri; M = Mezenkim; NR = Nöral Retina; AÇIK = Optik Sinir; RPE = Retinal Pigment Epiteli; GFP = yeşil floresan protein; CNS = merkezi sinir sistemi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Nöral olmayan dokuların in utero transdüksiyonu. (A) E15.5 ağız boşluğunun konfokal görüntüsü. Embriyoya E9.5'te floresan muhabir lentivirüs enjekte edildi. Ölçek çubuğu = 200 μm. (B, C) (B) İç panelin büyütülmesi; tükürük kanalı epiteli virüs ile transdüe edilir. (C) İç panelin büyütülmesi; GFP muhabir virüsü (beyaz parantez) ile transdüke edilen dorsal lingual epitel. Nöral krest hücrelerinden türetilen altta yatan mezenkim negatiftir. Beyaz ok uçları, virüs tarafından dönüştürülmüş epitel hücreleri ile çevrili negatif nöral tepe hücrelerine sahip papillaları gösterir (otofloresan kan hücreleri / damarlar beyaz yıldızlarla işaretlenmiştir). Ölçek çubukları = 50 μm. (D) E7.5'te floresan muhabir virüsü ile enjeksiyonlardan sonra E13.5 dil mezenkiminin şematik ve konfokal görüntüsü. Ölçek çubuğu = 50 μm. Kısaltmalar: D = Dorsal; M = Mezenkim; N = Nazofarenks; SLD = Dil Altı Kanalı; SMD = Submandibuler Kanal; T = Dil; V = Ventral; GFP = yeşil floresan proteini. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Nöral tepe kaynaklı dorsal kök ganglion hücrelerinin transdüksiyonu. (A) E7.5'te NEPTÜN hedeflemesi hem CNS hem de PNS'nin hedeflenmesine izin verir. (B) E13.5 omuriliğin konfokal görüntüsü ve E7.5'te hPGK-H2B-GFP muhabir lentivirüsü ile enjekte edilen DRG'ler hem SOX2 + nöral progenitörlerin hem de NeuN + nöronlarının transdüksiyonunu göstermektedir. Ölçek çubuğu = 100 μm. (C) SOX2+ (beyaz oklar) ve NeuN+ (beyaz ok uçları) hücre popülasyonlarında GFP ekspresyonlu DRG'yi gösteren B'nin kutulu bölgesi. Ölçek çubuğu = 20 μm. (D) E13.5 omuriliğin ve DRG'nin konfokal görüntüsü, E7.5'te DCX-H2B-GFP lentivirüsü ile enjekte edilir ve yalnızca DCX + hücrelerini hedef alır. Ölçek çubuğu = 100 μm. (E) DCX+ nöronlarla sınırlı GFP ekspresyonuna sahip DRG'yi gösteren D'nin kutulu bölgesi (beyaz ok uçları). DCX hücreleri GFP (beyaz oklar) için negatiftir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Kısaltmalar: NEPTÜN = neural pgeç t argeting ile in utero nano-injection; CNS = merkezi sinir sistemi; PNS = periferik sinir sistemi; DRG'ler = sırt kökü gangliyonu; GFP = yeşil floresan proteini. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bu protokolde embriyonik sağkalımı, enjeksiyonların kalitesini ve okumayı etkileyen birkaç adım vardır. Embriyoların gebelik yaşı, gece çiftleşmesinden sonra vajinal tıkaç günü öğlen saatlerinde E0.5 olarak tanımlanır. Öğleden sonra / akşam geç saatlerde E6.5'te hamilelik için ultrason kontrolünün yapılması, embriyoların ultrason ile tanımlanabilecek kadar gelişmesini sağlar. Kontrol (1) kaç tane tıkaç pozitif farenin gerçekten hamile olduğunun önceden taranmasına izin verir, (2) tıkaç pozitif farelerin hamile olmaması durumunda hiçbir virüsün gereksiz yere çözülmemesini ve boşa harcanmamasını sağlar ve (3) fareler üzerindeki gereksiz müdahaleleri azaltır (hamile olmayan kadınlarda ameliyattan kaçınır).
E7.5'te, embriyolar dış kuvvetlere karşı hassastır ve dikkatle kullanılmalıdır. Örneğin, uterus boynuzlarını çekmek veya desiduaları sıkmak embriyo rezorpsiyonuna yol açabilir. Uterus dokusu, dokunun kurumasını önlemek için kadın karnının dışındayken daima nemli tutulmalıdır. Desiduaların çoğunluğu kadın karnının içinde kalmalı ve enjeksiyonlar için sadece 3-4 tanesi maruz kalmalıdır. İğne keskinliği, başarılı enjeksiyonlar için bir diğer önemli belirleyicidir. Künt veya kırık iğne uçları, AC'ye girmeden önce desiduaların tekrar tekrar dürtülmesine veya modelleme kiline karşı sıkıştırılmasına neden olur ve bu da rezorpsiyon oranını artırabilir. Bu nedenle, iyi öğütülmüş ve keskin iğneler her zaman güvenli bir şekilde saklanmalı ve en fazla 2 dişiden sonra değiştirilmelidir.
Bu protokol, nöral plakanın tek bir lentivirüs enjeksiyonu ile nasıl hedefleneceğini açıklar. Ayrıca, transdüksiyon etkinliğinin tek hücreli klonlardan tüm beyne nasıl uyarlanabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, cilt ve oral epitel de dahil olmak üzere diğer nöral olmayan dokular da hedeflenir. Ek olarak, tüm hücre tipleri (progenitörler ve farklılaşmış hücreler) dönüştürülür, bu da bu yaklaşımı verimli ancak spesifik olmayan hale getirir. MiniPromoter'ların viral yapıda kullanılması, nöronlarda veya astrositlerde transgenin spesifik ekspresyonuna yol açar15. Bu, özel transgenik Cre hayvanlarının kullanımından kaçınma avantajına sahiptir ve bu nedenle işgücü miktarını (gerinim bakımı ve genotipleme) ve maliyetleri azaltır.
NEPTÜN'ün sınırlamaları arasında teknik zorluğu, hamile kadınları öngörülebilir ve tutarlı bir oranda elde etmedeki zorluklar ve özel enstrümantasyon edinme maliyetleri bulunmaktadır. Ayrıca, lentivirüs tarafından hücrelerin seçici olmayan bir şekilde hedeflenmesi, tekniğin hem yararı hem de bir sınırlaması olarak görülebilir. AC'ye daha büyük hacimlerin enjeksiyonu ekzensefali13 ile sonuçlanır, ancak burada açıklanan hacimlerle beyin malformasyonları ve eksensefali önlenir15. Bu nedenle, beyin gelişimi üzerinde olumsuz bir etki, embriyonik aşamaya ve AC boyutuna uyarlanmış doğru hacimlerin enjekte edilmesiyle dikkatlice kaçınılması gereken utero nano enjeksiyonlarla ilgili bir risktir.
Tekniğin gelecekteki uyarlamaları viral tropizme odaklanabilir. Adeno ilişkili virüsler (AAV'ler), CNS 17,26'daki farklı hücre tiplerini sağlam bir şekilde hedeflediği gösterilen farklı serotiplere sahiptir. Bununla birlikte, AAV'ler konakçı hücre genomuna entegre olmaz ve bu nedenle yüksek bölünme oranına sahip hücrelerde kaybolabilir. NEPTÜN'ün özgüllüğünü arttırmanın birkaç yolu olmasına rağmen, transgenik hayvanlar in vivo gen manipülasyonu söz konusu olduğunda hala altın standarttır. Cas9 fareleri ve sgRNA kodlayan lentivirüs, embriyonik epidermis27'de genetik tarama için kullanılmıştır ve ayrıca gelişmekte olan CNS'ye uyarlanabilir.
E7.5'teki AC'ye enjeksiyonlar, nörülasyonun başlamasından önce nöroektodermin hücrelerini etkili bir şekilde hedefler ve gelişmekte olan beyni utero elektroporasyondan daha verimli bir şekilde hedefler. Bu, beyin gelişimi için önemli olan genetik ipuçlarının daha erken bir zaman noktasından incelenmesine izin verir. Klasik genetik fare modellerinin aksine, NEPTUNE fonksiyonel gen analizi yapmak için esnek bir yaklaşım sunar. Aşırı ekspresyon veya gen delesyonunu takip eden fenotipler, aylara veya yıllara kıyasla günler ila haftalar içinde incelenebilir. Birden fazla viral yapının enjeksiyonları, bir embriyo içinde birkaç genin manipülasyonuna izin verir ve çift veya üçlü nakavt hayvanlarının oluşumunu önler. Bu nedenle, NEPTÜN sadece zaman kazandırmakla kalmaz, aynı zamanda araştırmalarda kullanılan hayvan sayısını da azaltabilir.
Disclosures
Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bettina Semsch ve Jia Sun'a (Infinigene) farelere uzman bakımı için teşekkür ederiz; Görüntü yakalama ve konsültasyon konusunda yardım için Biomedicum Imaging Core'dan (BIC) Florian Salomons ve Göran Månsson. Finansman: Bu projeye verdikleri destek için aşağıdaki fon sağlayıcılara teşekkür ederiz: İsveç Araştırma Konseyi, Karolinska Enstitüsü (KI Vakıfları, Kariyer Geliştirme Hibesi, Ph.D. öğrenci KID finansmanı ve SFO StratNeuro finansmanı, Yenilikçi Tıp Merkezi), Ollie ve Elof Ericssons Vakfı, Tornspiran Vakfı, Jeansssons Vakfı, Sven ve Ebba-Christina Hagbergs Ödülü ve araştırma Bursu, Knut ve Alice Wallenberg Proje Hibesi, Fredrik ve Ingrid Thurings Vakfı, Lars Hiertas Minne, Çocukluk Çağı Kanseri Vakfı (Barncancerfonden), Åhlen Vakfı, Åke Wibergs Vakfı, Tore Nilssons Vakfı ve İsveç Vakıfları ERA'ya Hibe Vermeye Başladı. Şekil 4D, E BioRender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe | BD Bioscience | 309628 | |
| 27 G Needle | BD Bioscience | 300635 | |
| 3.5 inches capillaries | Drummond Scientific | 3000203G/X | Were used to pull in house needles |
| 70 MHz MS Series transducer | Visual Sonics | MS700 | |
| Aquasonic clear ultrasound gel | Parker Laboratories | Mar-50 | |
| Autoclip Applier 9 mm | Angthos | 12020-09 | |
| CD1 mice | Charles River, Germany | Crl:CD1(ICR) | Females: from age of 8 weeks old Males: from the age of 12 weeks old |
| Cotton Swab | OneMed Sverige AB | 120788 | |
| DPBS | Gibco | 14190094 | |
| Dressing forceps delicate straight 13 cm | Agnthos | 08-032-130 | |
| EG-400 Narishige Micropipette Grinder | Narishige | NA | |
| EZ clips 9 mm | Angthos | 59027 | clips |
| Iris Scissors, Super Cut, straight, 9 cm | Agnthos | 307-336-090 | |
| Isofluorane | Baxter Medical AB | EAN: 50085412586613 | Purchased from Swedish Pharmacy |
| Kimwipes | Kimberly Clarke | 7557 | |
| Membrane Tape | Visual Sonics | SA-11053 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Modeling Clay | Sense AB | 10209 | |
| Mouse Handling Table | Visual Sonics | 50249 | |
| Nanoject II Auto Injector Kit | Drummond | 3-000-205A | |
| Parafilm | Bemis | HS234526C | |
| Petri dish with central opening (low wall) | Visual Sonics | SA-11620 | |
| Petri dish, (ØxH): 92 x 16 mm | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| Rely+On Virkon | DuPont | 130000132037 | disinfectant |
| Silicone membrane | Visual Sonics | SA-11054 | |
| Steri 250, hot bead sterilizer | Angthos | 31100 | |
| Surgical Tape (1.25 cm x 9.14 m) | Medicarrier | 67034 | |
| Vevo Compact Dual (Med. Air & O2) Anesthesia System | Visual Sonics | VS-12055 | |
| Vevo Imaging Station 2 | Visual Sonics | VS-11983 | |
| Vevo2100 | Visual Sonics | VS-20047 | |
| Vicryl 6-0; C-3 needle, 45 cm purple filament | Agnthos | J384H |
References
- Theiler, K. The House mouse. Atlas of embryonic development. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1989).
- Barresi, M. J. F., Gilbert, S. F. Developmental biology. , Sinauer Associates Inc. Publishers. Sunderland, Massachusetts. (2016).
- Taylor, J. C., et al. Factors influencing success of clinical genome sequencing across a broad spectrum of disorders. Nature Genetics. 47 (7), 717-726 (2015).
- Pizzo, L., et al. Rare variants in the genetic background modulate cognitive and developmental phenotypes in individuals carrying disease-associated variants. Genetics in Medicine. 21 (4), 816-825 (2019).
- Sakai, Y. Neurulation in the mouse: Manner and timing of neural tube closure. The Anatomical Record. 223 (2), 194-203 (1989).
- Schoenwolf, G. C. Shaping and bending of the avian neuroepithelium: Morphometric analyses. Developmental Biology. 109 (1), 127-139 (1985).
- Smith, J. L., Schoenwolf, G. C., Quan, J. Quantitative analyses of neuroepithelial cell shapes during bending of the mouse neural plate. Journal of Comparative Neurology. 342 (1), 144-151 (1994).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Development Growth and Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. I. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230 (2), 376-380 (1997).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos. Nature Medicine. 16 (7), 821-827 (2010).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. Journal of Visualized Experiments JoVE. (45), e2047 (2010).
- Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system. Nature Neuroscience. 2 (9), 812-819 (1999).
- Slevin, J. C., et al. High resolution ultrasound-guided microinjection for interventional studies of early embryonic and placental development in vivo in mice. BMC Developmental Biology. 6, 10 (2006).
- Mangold, K., et al. Highly efficient manipulation of nervous system gene expression with NEPTUNE. Cell Reports Methods. 1, 100043 (2021).
- Kameneva, P., et al. Single-cell transcriptomics of human embryos identifies multiple sympathoblast lineages with potential implications for neuroblastoma origin. Nature Genetics. 53 (5), 694-706 (2021).
- Kaiser, K., et al. MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus. Development. 148 (10), (2021).
- Haddad, M. R., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. G. Fetal brain-directed AAV gene therapy results in rapid, robust, and persistent transduction of mouse choroid plexus epithelia. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 2 (6), 101 (2013).
- Heavner, W., Pevny, L.
- Swamynathan, S. K. Ocular surface development and gene expression. Journal of Ophthalmology. 2013, 103947 (2013).
- Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands: -overview of the Japan Salivary Gland Society-sponsored workshop. Acta Histochemica et Cytochemica. 45 (5), 241-250 (2012).
- Liu, H. X., Komatsu, Y., Mishina, Y., Mistretta, C. M. Neural crest contribution to lingual mesenchyme, epithelium and developing taste papillae and taste buds. Developmental Biology. 368 (2), 294-303 (2012).
- Marmigère, F., Ernfors, P. Specification and connectivity of neuronal subtypes in the sensory lineage. Nature Reviews. Neuroscience. 8 (2), 114-127 (2007).
- Zirlinger, M., Lo, L., McMahon, J., McMahon, A. P., Anderson, D. J. Transient expression of the bHLH factor neurogenin-2 marks a subpopulation of neural crest cells biased for a sensory but not a neuronal fate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 8084-8089 (2002).
- Portales-Casamar, E., et al. A regulatory toolbox of MiniPromoters to drive selective expression in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16589-16594 (2010).
- Tervo, D. G. R., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367 (6483), 1264-1269 (2020).
