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Developmental Biology

पूर्व गर्भाशय माउस भ्रूण की संस्कृति Pregastrulation से उन्नत Organogenesis करने के लिए

Published: October 19, 2021 doi: 10.3791/63160
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Genetics, Weizmann Institute of Science

Summary

पूरे भ्रूण संस्कृति के लिए एक बढ़ाया मंच छह दिनों तक पोस्टइम्प्लांटेशन माउस भ्रूण के निरंतर और मजबूत पूर्व गर्भाशय विकास की अनुमति देता है, प्रीगैस्ट्रुलेशन चरणों से उन्नत ऑर्गेनोजेनेसिस तक। इस प्रोटोकॉल में, हम स्थैतिक प्लेटों और घूर्णन बोतल प्रणालियों का उपयोग करके सफल भ्रूण संस्कृति के लिए मानक प्रक्रिया का विस्तार करते हैं।

Abstract

पोस्टइम्प्लांटेशन स्तनधारी भ्रूण संस्कृति विधियां आम तौर पर अक्षम रही हैं और गर्भाशय से बाहर विच्छेदन के बाद संक्षिप्त अवधि तक सीमित हैं। प्लेटफार्मों को हाल ही में उन्नत ऑर्गेनोजेनेसिस तक अंडे-सिलेंडर चरणों से माउस भ्रूण की अत्यधिक मजबूत और लंबे समय तक पूर्व गर्भाशय संस्कृति के लिए विकसित किया गया है। ये प्लेटफ़ॉर्म हिंद अंग गठन चरण (E11) तक pregastrulating भ्रूण (E5.5) के उचित और वफादार विकास को सक्षम करते हैं। देर से gastrulating भ्रूण (E7.5) इन सेटिंग्स में घूर्णन बोतलों में उगाया जाता है, जबकि pregastrulation चरणों (E5.5 या E6.5) से विस्तारित संस्कृति को स्थैतिक और घूर्णन बोतल संस्कृतियों के संयोजन की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, O2 और CO2 एकाग्रता, गैस दबाव, ग्लूकोज के स्तर, और एक विशिष्ट पूर्व गर्भाशय संस्कृति माध्यम का उपयोग का संवेदनशील विनियमन उचित भ्रूण विकास के लिए महत्वपूर्ण है। यहां, विस्तारित पूर्व गर्भाशय माउस भ्रूण संस्कृति के लिए एक विस्तृत चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। सामान्य माउस भ्रूण को विकसित करने की क्षमता गैस्ट्रुलेशन से ऑर्गेनोजेनेसिस तक पूर्व गर्भाशय भ्रूण विकास के दौरान विभिन्न प्रयोगात्मक गड़बड़ी के प्रभाव की विशेषता के लिए एक मूल्यवान उपकरण का प्रतिनिधित्व करती है।

Introduction

स्तनधारी भ्रूण के अंतर्गर्भाशयी विकास ने पोस्टइम्प्लांटेशन विकास के शुरुआती चरणों के अध्ययन को सीमित कर दिया है1,2। विकासशील भ्रूण की दुर्गमता गर्भाशय में भ्रूण प्रत्यारोपण के बाद होने वाली प्रमुख विकास प्रक्रियाओं की समझ को बाधित करती है, जैसे कि पशु शरीर की योजना की स्थापना, रोगाणु परतों का विनिर्देश, या ऊतकों और अंगों का गठन। इसके अलावा, प्रारंभिक पोस्टरिप्लांटेड भ्रूण का बहुत छोटा आकार ई 103 से पहले गर्भाशय में इंट्रावाइटल इमेजिंग द्वारा निरीक्षण करना मुश्किल बनाता है। इन चरणों में जीवित भ्रूणों का निरीक्षण करने और हेरफेर करने में असमर्थता ने विकास के दौरान स्नैपशॉट के लिए प्रारंभिक पोस्टइम्प्लांटेशन भ्रूणजनन के अध्ययन को सीमित कर दिया है।

प्रीइम्प्लांटेशन स्तनधारी भ्रूण की इन विट्रो संस्कृति के लिए प्रोटोकॉल अच्छी तरह से स्थापित, विश्वसनीय और नियमित रूप से उपयोग किए जाते हैं4। फिर भी, उचित स्तनधारी पोस्टइम्प्लांटेशन भ्रूण विकास का समर्थन करने में सक्षम पूर्व गर्भाशय संस्कृति प्रणालियों को स्थापित करने के प्रयासों में सीमित सफलता मिली। एक सदी से अधिक समय से विभिन्न संस्कृति तकनीकों का प्रस्ताव किया गया है, मुख्य रूप से पारंपरिक स्थैतिक प्लेटों 6,7,8 या घूर्णन बोतलों (रोलर संस्कृतियों) 5,9,10 में भ्रूण को संवर्धित करके। ये प्लेटफ़ॉर्म सामान्य भ्रूण अस्तित्व के लिए अत्यधिक अक्षम होने और छोटी अवधि तक सीमित होने के बावजूद, आरोपण 11,12 के बाद स्तनधारी विकास पर ज्ञान का विस्तार करने में सहायक साबित हुए। भ्रूण ने संस्कृति दीक्षा के बाद 24-48 घंटे की शुरुआत में विकासात्मक मंदता और रूपात्मक विसंगतियों को प्रदर्शित करना शुरू कर दिया।

यह अध्ययन पूर्व गर्भाशय भ्रूण संस्कृति प्रणाली की स्थापना के लिए एक विस्तृत विवरण प्रदान करता है जो प्रीगैस्ट्रुलेशन से उन्नत ऑर्गेनोजेनेसिस चरणों तक निरंतर विकास की अनुमति देता है, जो पोस्टइम्प्लांटेशन विकास के छह दिनों तक होता है। यह पेपर बेहतर रोलर संस्कृति प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो ई 7.5 भ्रूण (तंत्रिका प्लेट और हेडफोल्ड-स्टेज) के विकास का समर्थन करता है जब तक कि हिंद अंग गठन चरण (~ E11) और स्थिर प्लेटों और रोलर संस्कृति प्लेटफार्मों पर संस्कृति के संयोजन से E5.5 / E6.5 से विस्तारित संस्कृति।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों को Weizmann Institute of Science के पशु संरक्षण दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था और प्रासंगिक Weizmann Institute IACUC (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2) द्वारा अनुमोदित किया गया था। स्वस्थ गर्भवती महिलाओं को अपनी गर्भनाल से रक्त एकत्र करने के लिए अपनी सूचित सहमति देने के लिए कहा गया था, जैसा कि रामबाम मेडिकल सेंटर हेलसिंकी समिति (#RMB-0452-15) द्वारा अनुमोदित किया गया था। स्वस्थ वयस्कों को वीज़मैन इंस्टीट्यूट ऑफ साइंस हेलसिंकी समिति (# 1566-3) के दिशानिर्देशों के अनुसार रक्त एकत्र करने के लिए उनकी सूचित सहमति के लिए कहा गया था।

1. मीडिया की तैयारी

  1. फिनोल लाल और एल-ग्लूटामाइन के बिना Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) के 500 मिलीलीटर का उपयोग करके विच्छेदन माध्यम तैयार करें, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के 5 एमएल के साथ पूरक, और 0.22 μm फिल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें।
    नोट: विच्छेदन माध्यम को 1 महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  2. भ्रूण माध्यम के 25% के साथ-साथ 50% चूहे के सीरम और 25% मानव गर्भनाल रक्त सीरम (एचसीएस) या मानव वयस्क रक्त सीरम (एचबीएस) का उपयोग करके जैविक हुड के अंदर पूर्व गर्भाशय भ्रूण संस्कृति माध्यम (EUCM) को ताजा रूप से तैयार करें।
  3. भ्रूण माध्यम तैयार करने के लिए, 5 मिलीलीटर ग्लूटामाइन, एचईपीईएस के 5 एमएल, और फिनोल लाल और एल-ग्लूटामाइन के बिना डीएमईएम के 500 एमएल में पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के 5 एमएल जोड़ें। 10-15 एमएल ऐलीकोट तैयार करें और उन्हें दो महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: यदि किसी भी संदूषण का अनुभव हो रहा है तो एंटीबायोटिक एकाग्रता को दोगुना करें।
  4. गर्मी 30-45 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर चूहे के सीरम को निष्क्रिय करें और 0.22 μm polyvinylidene difluoride फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें। निष्क्रियता के एक ही दिन पर संस्कृति के लिए सीरम का उपयोग करें। एचसीएस या एचबीएस को पिघलाएं और प्रयोगों के लिए तुरंत इसका उपयोग करें।
    नोट: वाणिज्यिक चूहा सीरम सुसंगत परिणाम प्रदान करता है (स्पष्ट भिन्नता के बिना कम से कम 4 लॉट का परीक्षण किया गया था)। वैकल्पिक रूप से, उच्च गुणवत्ता वाले चूहे के सीरम को इन-हाउस प्राप्त किया जा सकता है जैसा कि पहले वर्णित किया गया था8,14। यदि एचसीएस उपलब्ध नहीं है, तो इसे इन-हाउस-एकत्रित एचबीएस के साथ बदलें। चूहे के सीरम, एचसीएस और एचबीएस को एक बार फिर से तैयार किया जा सकता है और एक अलग दिन पर उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है। Thaw और ताजा thawed सीरम की एक बड़ी मात्रा के साथ refrozen सीरम गठबंधन और यह refreeze नहीं है.

2. मानव गर्भनाल रक्त सीरम और मानव वयस्क रक्त सीरम का संग्रह

  1. एचसीएस को अलग करने के लिए, अनुसूचित सीज़ेरियन प्रसव के दिन स्वस्थ गर्भवती महिलाओं से गर्भनाल रक्त एकत्र करें।
    1. गर्भनाल को डबल-क्लैंप 5-7 सेमी umbilicus से और शिशु के प्रसव के तुरंत बाद clamps के बीच transact.
    2. मैन्युअल रूप से एक बड़े बोर 14 जी सुई और एक 50 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करके रक्त को सीधे नाभि शिरा से खींचें, जबकि प्लेसेंटा हेमोलिसिस के किसी भी निशान से बचने के लिए सीटू में रहता है।
      नोट: शिशु को सर्जरी के क्षेत्र से हटाने के बाद रक्त एकत्र करें, और नैदानिक परीक्षणों के लिए नाभि रक्त खींचा गया है।
  2. एकत्र किए गए रक्त को 5 एमएल प्रोकोगुलेंट बाँझ परीक्षण ट्यूबों तक वितरित करें और तुरंत उन्हें पूर्ण जमावट की अनुमति देने के लिए 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 2,500 × ग्राम पर coagulated परीक्षण ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें।
  3. हेमोलिसिस (गुलाबी-लाल सीरम) के लक्षण दिखाने वाली ट्यूबों को छोड़ दें। एक 5 mL पिपेट का उपयोग कर सीरम (पीला रंग) ले लीजिए और एक 0.22 μm फिल्टर के माध्यम से इसे फ़िल्टर. 45 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सीरम को तुरंत हीट-निष्क्रिय करें।
  4. निष्क्रिय सीरम के 1-1.5 मिलीलीटर ऐलीकोट तैयार करें और उन्हें छह महीने तक के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। यदि आवश्यक हो, तो सूखी बर्फ का उपयोग करके -70 डिग्री सेल्सियस पर जहाज करें।
  5. वयस्क मानव रक्त सीरम संग्रह के लिए, स्वस्थ वयस्कों से रक्त खींचें और गर्भनाल रक्त सीरम के लिए वर्णित एक ही प्रोटोकॉल का पालन करते हुए सीरम को तुरंत अलग करें। एचबीएस को छह महीने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी-निष्क्रिय और फ़िल्टर किए गए ऐलीकोट के रूप में स्टोर करें।
    नोट: मानव गर्भनाल सीरम और वयस्क मानव सीरम ताजा इन-हाउस तैयार किए गए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सीरम के लिए बेहतर परिणाम दिए। स्वस्थ महिलाओं से एचसीएस एकत्र करें, 18 वर्ष से अधिक उम्र और 40 वर्ष से कम उम्र के सीज़ेरियन सेक्शन डिलीवरी के लिए निर्धारित। योनि जन्म देने वाली महिलाओं और किसी भी पुरानी बीमारी या सक्रिय चिकित्सा स्थितियों वाली महिलाओं को बाहर रखें, जिसमें गर्भावधि मधुमेह या उच्च रक्तचाप शामिल हैं।

3. E7.5 से E11 करने के लिए भ्रूण के पूर्व गर्भाशय रोलर संस्कृति

  1. रोलर संस्कृति इनक्यूबेटर और गैस नियामक की स्थापना
    1. संस्कृति E7.5 या रोलर संस्कृति इनक्यूबेटर प्रणाली का उपयोग कर अधिक उन्नत भ्रूण. भ्रूण विच्छेदन से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए रोटेटर और हीटिंग यूनिट को 37 डिग्री सेल्सियस पर चालू करें। गैस इनलेट बोतल और आउटलेट टेस्ट ट्यूब में ऑटोक्लेव्ड पानी जोड़ें।
      नोट: घूर्णन ड्रम के बगल में एक थर्मामीटर रखें और अक्सर इनक्यूबेटर के अंदर तापमान की स्थिरता की जांच करें। इनक्यूबेटर को जितनी जल्दी हो सके खोलें क्योंकि लंबे समय तक खुलने का समय तापमान में वृद्धि करेगा और भ्रूण के विकास को प्रभावित करेगा। जब आवश्यक हो, तो उन्हें संस्कृति के दौरान कम से कम आधी क्षमता तक रखने के लिए गैस इनलेट बोतल और आउटलेट टेस्ट ट्यूब में अधिक ऑटोक्लेव्ड पानी जोड़ें। इनक्यूबेटर के अंदर भ्रूण को कपड़े से इन्क्यूबेटर को कवर करके प्रकाश से बचाएं।
    2. मुख्य स्विच को दबाकर और बाद में ऑक्सीजन / नाइट्रोजन और सीओ 2 नियंत्रकों (चित्रा 1 ए) को चालू करके गैस नियामक मॉड्यूल को चालू करें। संबंधित नियंत्रकों का उपयोग करके ऑक्सीजन और CO2 मानों को 5% पर सेट करें। गैस नियामक खोलें और दबाव ट्रांसमीटर (चित्रा 1 बी) में वोल्टेज स्विच को स्थानांतरित करके गैस के दबाव को ~ 6.5-7 पाउंड प्रति वर्ग इंच (पीएसआई) पर सेट करें। एक डिजिटल दबाव गेज का उपयोग कर गैस दबाव मूल्य की पुष्टि करें।
    3. सटीक इनक्यूबेटर के अंदर आवंटित आउटलेट पानी से भरे टेस्ट ट्यूब के अंदर बनाए गए बुलबुले की दर की जांच करके गैस प्रवाह की निगरानी करें। पानी की बोतल के ढक्कन पर गैस प्रवाह वाल्व को बंद / खोलकर उचित बुलबुला दर निर्धारित करें। सुनिश्चित करें कि गैस का प्रवाह प्रति सेकंड 2-4 बुलबुले की दर से बुलबुले के गठन की अनुमति देता है या पहले बिंदु पर बुलबुला प्रवाह सेट करता है जहां बुदबुदाते पानी से भरे आउटलेट ट्यूब में बाहर आता है।
    4. संस्कृति माध्यम के 2 मिलीलीटर के साथ संस्कृति की बोतलों को भरें और उन्हें 1 घंटे के लिए पूर्व-संतुलन के लिए खोखले घूर्णन ड्रम में प्लग करें। ड्रम के लिए बोतलों को सील करने के लिए खोखले सिलिकॉन बंग का उपयोग करें। ठोस bungs का उपयोग कर घूर्णन ड्रम में खाली स्थानों को सील रखें।
      नोट: आउटलेट ट्यूब में बुलबुले की अनुपस्थिति (सिस्टम के माध्यम से आने वाली कोई गैस नहीं) या एक असाधारण उच्च गैस प्रवाह भ्रूण विकास को प्रभावित कर सकता है। आउटलेट टेस्ट ट्यूब में बुलबुले के प्रवाह की कमी के मामले में, जांचें कि सभी सिलिकॉन बंग ठीक से घूर्णन ड्रम में तैनात हैं और सिस्टम को सील कर रहे हैं, और जांचें कि पानी की बोतल ठीक से बंद हो गई है और सभी टयूबिंग सही ढंग से जुड़ी हुई है। पानी की बोतल में बुदबुदाने की कमी गैस नियामक में खराबी का संकेत दे सकती है।
  2. गर्भवती चूहों से माउस भ्रूण का विच्छेदन
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर के अंदर विच्छेदन माध्यम को पूर्व-संतुलित करें और कम से कम 1 घंटे के लिए 5% CO2 । गैस विनिमय की अनुमति देने के लिए ढक्कन को थोड़ा खुला छोड़ दें।
    2. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा गर्भवती महिला का बलिदान करें, 70% इथेनॉल के साथ महिला के पेट को साफ करें, और कैंची के साथ त्वचा और पेट की दीवार को काट दें। गर्भाशय के एक छोर का पता लगाएं और अंडाशय और गर्भाशय के बीच चौराहे पर काटें। इसके बाद, दूसरे छोर तक गर्भाशय के साथ काटें और इसे कमरे के तापमान से भरे 100 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें Dulbecco के फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (DPBS)।
      नोट: गैर-हार्मोन-प्राइमेड, स्वाभाविक रूप से संभोग वाली महिलाओं के उपयोग की सिफारिश की जाती है।
    3. जल्दी से DPBS में अवधारणाओं के उपयोग को धो लें और भ्रूण हैंडलिंग की सुविधा के लिए जोड़े में कटौती करें। एक 60 मिमी पेट्री पकवान में preequilibrated विच्छेदन माध्यम के लिए conceptuses के सभी जोड़े ले जाएँ और व्यक्तिगत अवधारणाओं में कटौती.
    4. सकल संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करके गर्भाशय के ऊतकों को फाड़कर अवधारणाओं की गर्भाशय की दीवार को हटा दें। नाशपाती के आकार के decidua की नोक को काटने के लिए ठीक microsurgical संदंश का उपयोग करें। भ्रूण के बगल में संदंश को इसकी लंबी धुरी के समानांतर डालें, और डेसिडुआ को आधे हिस्सों में विभाजित करने के लिए संदंश खोलें।
    5. अंत में, डिसिडुआ से भ्रूण को पकड़कर और ठीक संदंश का उपयोग करके भ्रूण से पार्श्विका जर्दी थैली को छीलकर अंडे के सिलेंडर से जुड़े बरकरार एक्टोप्लासेंटल शंकु को छोड़ दें।
      नोट: भ्रूण को प्रभावित करने से बचने के लिए, अधिकतम 30-40 मिनट के भीतर 37 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग प्लेट से लैस माइक्रोस्कोप पर विच्छेदन करें। एक समय में भ्रूण के एक कूड़े को विच्छेदित करें।
    6. विच्छेदन के तुरंत बाद, भ्रूण को ऊतक मलबे से चिपकने से रोकने के लिए एक ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके संतुलित विच्छेदन माध्यम से भरी एक नई प्लेट में भ्रूण को स्थानांतरित करें।
    7. तंत्रिका प्लेट / प्रारंभिक सिर गुना चरण में उन भ्रूणों का चयन करें जो एपिब्लास्ट में कोई नुकसान नहीं दिखाते हैं और प्रति बोतल 5-6 भ्रूण को पूर्व-संतुलित ग्लास संस्कृति की बोतलों में स्थानांतरित करते हैं।
      नोट: ग्लास पाश्चर पिपेट तैयार करने के लिए, ग्लास कटर का उपयोग करके भ्रूण को फिट करने के लिए पर्याप्त आकार में पिपेट के उद्घाटन को काटें, और संदूषण से बचने के लिए इसे इथेनॉल में रखें। भ्रूण को स्थानांतरित करने से पहले पीबीएस के साथ ग्लास पिपेट को धोएं। संस्कृति की बोतल में भ्रूण को स्थानांतरित करते समय, EUCM को पतला करने से बचने के लिए विच्छेदन माध्यम की जितनी कम मात्रा में संभव हो उतना कम मात्रा में ले जाना सुनिश्चित करें।
    8. 5% O2 और 5% CO2 के वातावरण में, 37 °C पर घूर्णन संस्कृति प्रणाली में बोतलों को रखें।
    9. संस्कृति के प्रत्येक दिन, एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण के विकास का मूल्यांकन करने के लिए इनक्यूबेटर से एक-एक करके बोतलों को हटा दें। एक बोतल को हटाते समय एक ठोस बुंग के साथ ड्रम में खाली छेद को बंद करना सुनिश्चित करें। भ्रूण के आकार को फिट करने के लिए एक बाँझ प्लास्टिक पाश्चर पिपेट की नोक काटें और अवलोकन की सुविधा के लिए भ्रूण को पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि भ्रूण हमेशा माध्यम से कवर किए जाते हैं।
      नोट: शरीर के तापमान में कमी के कारण भ्रूण में हानिकारक प्रभावों से बचने के लिए उस समय को कम करें जिसके लिए भ्रूण इनक्यूबेटर के बाहर हैं। जर्दी थैली रक्त वाहिकाओं के टूटने से बचने के लिए भ्रूण को ध्यान से संभालें, भ्रूण के अस्तित्व को प्रभावित करते हैं।
    10. संस्कृति दिवस 1 (E8.5 के बराबर) में, 3 भ्रूण के समूहों को एक नई बोतल में स्थानांतरित किया जाता है, जिसमें 2 मिलीलीटर ताजा और पूर्व-संतुलित EUCM होता है जिसमें डी-ग्लूकोज के अतिरिक्त 3 मिलीग्राम / एमएल और 13% O2, 5% CO2 का गैस मिश्रण होता है।
    11. 48 घंटे (E9.5 के बराबर) के बाद, दो भ्रूणों के समूहों को 18% O2 और 5% CO2 के गैस वातावरण में ताजा प्रीहीटेड EUCM प्लस 3.5 mg / mL ग्लूकोज के साथ एक नई बोतल में स्थानांतरित करें।
    12. संस्कृति के 72 घंटे (E10.5 के बराबर) पर, प्रत्येक भ्रूण को एक व्यक्तिगत बोतल में ले जाएं जिसमें 1.5-2 मिलीलीटर ताजा माध्यम होता है, जिसमें 4 मिलीग्राम / एमएल ग्लूकोज और 21% O2 और 5% CO2 की गैस की आपूर्ति होती है।
      नोट: भ्रूण संस्कृति दिन 4 की आधी रात के बारे में अपने अधिकतम विकास तक पहुंचते हैं।
    13. जर्दी थैली और एमनियन को हटाने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें, और भ्रूण आकृति विज्ञान के उचित अवलोकन के लिए गर्भनाल को अलग करें। गैस विनियमन मॉड्यूल और सटीक इनक्यूबेटर को बंद कर दें।
      नोट: भ्रूण चरण के अनुसार पर्याप्त गैस वातावरण के साथ रोलर संस्कृति में एक कांच की बोतल के अंदर इनक्यूबेशन द्वारा 1 घंटे के लिए संस्कृति माध्यम को पूर्व-संतुलित करें। 70% इथेनॉल में डूबे हुए रात भर धोने के बाद चलने वाले आसुत पानी के साथ तीन धोने का प्रदर्शन करके हर उपयोग के बाद संस्कृति की बोतलों और सभी इनक्यूबेटर ग्लासवेयर को साफ करें। आसुत पानी के साथ तीन बार फिर से धोएं, बोतलों को रात भर सूखने दें, और आटोक्लेव द्वारा निष्फल करें। इसी तरह, सिलिकॉन प्लग को नियमित रूप से आटोक्लेव करें। 70% इथेनॉल के साथ सभी विच्छेदन उपकरणों को अच्छी तरह से साफ करें और उन्हें सूखा-निष्फल करें।

4. E5.5/E6.5 से E11 तक विस्तारित भ्रूण संस्कृति

  1. संस्कृति pregastrulation (E5.5) और प्रारंभिक gastrulation (E6.5) स्थिर प्लेटों में प्रारंभिक somite चरण (E8.5) तक भ्रूण.
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% CO2 के साथ एक इनक्यूबेटर में 1 h के लिए विच्छेदन माध्यम को पूर्व-संतुलित करें।
    नोट: गैस विनिमय की अनुमति देने के लिए, ट्यूब के ढक्कन को पूरी तरह से बंद न करें।
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से ताजा तैयार EUCM के 250 μL जोड़कर संस्कृति प्लेटों को तैयार करें। प्री-संतुलन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सीओ 2 इनक्यूबेटर के अंदर प्लेटों को रखें।
    नोट: हालांकि 8-अच्छी तरह से प्लेटें भ्रूण के विकास के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं, प्लेट के आकार के अनुसार माध्यम की मात्रा को समायोजित करके किसी भी अन्य प्लेट में संस्कृति की जा सकती है।
  4. E7.5 के लिए वर्णित तकनीक के बाद गर्भाशय से बाहर अंडे सिलेंडर भ्रूण विच्छेदन। भ्रूण की पार्श्विका जर्दी थैली को हटा दें और अंडे के सिलेंडर से जुड़े अक्षुण्ण एक्टोप्लासेंटल शंकु को छोड़ दें।
  5. एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके 8-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में अलग-अलग भ्रूण को स्थानांतरित करें और प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के साथ इनक्यूबेटर के अंदर रखें।
  6. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण की छवि और संस्कृति के लिए केवल उन लोगों का चयन करें जो एक अच्छी तरह से गठित एमनियोटिक गुहा के साथ हैं, जिसमें कोई स्पष्ट क्षति नहीं है और रीचर्ट की झिल्ली के बिना।
    नोट: E6.5 भ्रूण को स्थानांतरित करने के लिए E5.5 भ्रूण और 200 μL युक्तियों को स्थानांतरित करने के लिए 20 μL पिपेट युक्तियों का उपयोग करें। E6.5 से शुरू होने वाली संस्कृतियों के मामले में, एचसीएस को ताजा एकत्र किए गए एचबीएस द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
  7. माध्यम के आधे निकालें और संस्कृति के 24 घंटे के बाद ताजा तैयार prewarmed EUCM के 250 μL जोड़ें, यह सुनिश्चित करते हुए कि भ्रूण हमेशा संस्कृति माध्यम में डूबे हुए हैं। E5.5 से शुरू होने वाली संस्कृतियों के मामले में, दो दिनों की संस्कृति (E7.5 के बराबर) के बाद, 200 μL को हटा दें और नए EUCM के 250 μL जोड़ें।
    नोट: स्थैतिक संस्कृति के दौरान, भ्रूण प्लेट से जुड़ सकते हैं (मुख्य रूप से प्लास्टिक प्लेटों का उपयोग करते समय), जो भ्रूण के विकास से गंभीर रूप से समझौता करेगा। प्लेट के लिए भ्रूण का लगाव E5.5 भ्रूण को संवर्धित करने के पहले दिन अधिक बार होता है। अनुलग्नक को रोकने के लिए, ठीक, बाँझ संदंश का उपयोग करके भ्रूण को प्लेट की सतह से दूर धकेलें। सत्यापित करें कि केवल एक्टोप्लासेंटल शंकु प्लेट की सतह से जुड़ा रहता है।
  8. प्रारंभिक सोमाइट चरण (4-7 सोमाइट्स) पर रोलर संस्कृति में भ्रूण को स्थानांतरित करें; E5.5 पर निकाले गए भ्रूण के लिए संस्कृति के तीन दिनों के बाद और E6.5 पर शुरू हुई संस्कृतियों के लिए दो दिन, E8.5 चरण भ्रूण के लिए पहले वर्णित समान संकेतों का पालन करते हुए।
    नोट: भ्रूण को सोमाइट चरणों में रोलर संस्कृति में स्थानांतरित करना, जो आगे के विकास की विफलता में उपरोक्त संकेतों से अलग है। E7.5 पूर्व गर्भाशय संस्कृतियों के विपरीत, 21% ऑक्सीजन और 5% CO2 के स्थिर वातावरण में भ्रूण को बनाए रखना संभव है, जो गतिशील ऑक्सीजन एकाग्रता वाले वातावरण की तुलना में भ्रूण के विकास की थोड़ी अधिक दक्षता प्रदान करता है।

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Representative Results

E7.5 भ्रूण (देर से gastrulation चरण) के लिए वर्णित रोलर संस्कृति की स्थिति 4 संस्कृति दिनों के बाद 75% के करीब औसत दक्षता के साथ निरंतर और सामान्य भ्रूण विकास का समर्थन करती है (चित्रा 2 और तालिका 1)। भ्रूण विकास की दक्षता विभिन्न माउस आनुवंशिक पृष्ठभूमि में भिन्न हो सकती है, लेकिन लगातार मजबूत है (चित्रा 2 सी)। एचसीएस के बजाय एचबीएस के साथ पूरकता चूहों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि (चित्रा 2 डी और तालिका 2) के आधार पर, पूर्व गर्भाशय संस्कृति के 4 दिनों के बाद ~ 68% की दक्षता उत्पन्न करती है। भ्रूण ने लगभग 44-सोमाइट चरण तक पूर्व गर्भाशय को पुन: प्राप्त किया, उचित विकास किया। इसके बाद, भ्रूण एलेंटोइक प्लेसेंटा की अनुपस्थिति के कारण भ्रूण असामान्यताओं को प्रस्तुत करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप इस स्तर पर शरीर के आकार में वृद्धि को देखते हुए अपर्याप्त ऑक्सीकरण और पोषक तत्वों की आपूर्ति होती है।

स्थैतिक प्लेटों में E6.5 भ्रूण (प्रारंभिक-लकीर) का विकास सही ढंग से >90% की दक्षता के साथ प्रारंभिक सोमाइट-चरण E8.5 तक, एचसीएस और एचबीएस (चित्रा 3, तालिका 3, और तालिका 4) दोनों के साथ EUCM का उपयोग करके सही ढंग से recapitulated है (E5.5 से E8.5 के बीच भ्रूण मंचन के विस्तृत विवरण के लिए 8,13 देखें)। स्थिर प्लेटों पर संस्कृतियों के संयोजन से गैस्ट्रुलेशन से उन्नत ऑर्गेनोजेनेसिस के लिए पूर्व गर्भाशय संस्कृति के बाद स्थिर प्लेटों पर संस्कृतियों के संयोजन के बाद एक निरंतर 21% ऑक्सीजन वातावरण में रोलर संस्कृति के बाद 44-सोमाइट चरण को 55% और 26% के उचित विकास की अनुमानित दक्षता प्रदान करती है, क्रमशः एचसीएस और एचबीएस का उपयोग करके (चित्रा 3 ए, तालिका 3, और तालिका 4)। गर्भाशय में विकसित भ्रूण की तुलना में इन भ्रूणों में 1-2 सोमाइट जोड़े की देरी होती है। दक्षता में सबसे बड़ी गिरावट अक्षीय मोड़ की विफलता और तंत्रिका ट्यूब के बंद होने के कारण E8.5 से E9.5 तक संक्रमण पर होती है।

E5.5 pregastrulating भ्रूण से शुरू होने वाली संस्कृतियां लगभग 46% के प्रारंभिक-सोमाइट चरण (E8.5) के लिए उचित विकास की दक्षता दिखाती हैं, और लगभग 17% भ्रूण रोलर संस्कृति (चित्रा 4 और तालिका 5) में स्थानांतरित होने के बाद संस्कृति के छह दिनों के बाद उचित विकास पूरा करेंगे। विस्तारित पूर्व गर्भाशय संस्कृति भ्रूण में विकास ता्मक देरी को लम्बा खींचती है, जिसमें E5.5 पर निकाले गए भ्रूण ों में विवो भ्रूण की तुलना में सोमाइट्स के 2-4 जोड़े की देरी दिखाई देती है। फिर भी, मॉर्फोजेनेसिस और ऊतक विकास लगभग 42-सोमाइट चरण तक ठीक से आगे बढ़ते हैं।

E7.5, E6.5, और E5.5 से शुरू की गई संस्कृतियों के लिए भ्रूण में देखे गए सबसे आम दोषों को चित्र 5A-C में उदाहरण दिया गया है। विच्छेदन के समय, एपिब्लास्ट या एक्स्ट्राम्ब्रियोनिक क्षेत्र को भी मामूली क्षति वाले भ्रूण, साथ ही साथ रीचर्ट की झिल्ली को बनाए रखने वाले भ्रूण को छोड़ दिया जाना चाहिए। इसी तरह, प्रारंभिक भ्रूण ठीक से विकसित नहीं होंगे (मृत भ्रूण के लिए चित्रा 5 बी देखें) या गंभीर विकासात्मक देरी प्रदर्शित करें (एक विलंबित भ्रूण के लिए चित्रा 5 बी देखें)। प्लेट की सतह के लिए भ्रूण एपिब्लास्ट का लगाव अनुलग्नक की स्थिति और ग्रेड के आधार पर विकास को प्रभावित करेगा। एपिब्लास्ट या पूरे भ्रूण के एक हिस्से का लगाव आगे के विकास की विफलता का कारण बनेगा (एक संलग्न भ्रूण के लिए चित्रा 5 बी देखें)।

E8.5 (प्रारंभिक सोमाइट चरण) पर दोषपूर्ण भ्रूण के प्रतिशत में देखी गई मुख्य असामान्यताएं जर्दी थैली के बाहर पीछे के क्षेत्र का विकास या तंत्रिका सिलवटों के विकास में दोष हैं (चित्रा 5 ए, बी)। E5.5 पर शुरू की गई संस्कृतियों के मामले में, अक्सर मनाया जाने वाला विकासात्मक दोष एक छोटे, अविकसित एपिब्लास्ट (चित्रा 5 C) की उपस्थिति है। E9.5 के बराबर समय में, तंत्रिका सिलवटों के बंद होने में दोष, अक्षीय मोड़ की विफलता, या मस्तिष्क के विकास में कमी सबसे अधिक देखी जाने वाली असामान्यताओं का प्रतिनिधित्व करती है (चित्रा 5)। E10.5/E11 पर सबसे अधिक बार देखे जाने वाले विकासात्मक दोष सिर क्षेत्र में विसंगतियां, जर्दी थैली में सामान्य रक्त परिसंचरण का व्यवधान, और पेरिकार्डियल बहाव (चित्रा 5) हैं। एक मुख्य रक्त वाहिका का टूटना और रक्त बहिर्वाह भ्रूण की बाद में मृत्यु का कारण बन सकता है। विशेष रूप से, भ्रूण की उचित वृद्धि स्पष्ट जर्दी थैली परिसंचरण की अनुपस्थिति में भी पहुंच सकती है। E11 के बराबर चरण से परे संस्कृति में रखे गए भ्रूण उचित ऊतक ऑक्सीकरण की कमी के कारण कुछ घंटों के बाद शरीर के सिकुड़न और मृत्यु का प्रदर्शन करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: गैस और दबाव विनियमन प्रणाली एक रोलर संस्कृति इनक्यूबेटर के लिए अनुकूलित है। (ए) रोलर संस्कृति इनक्यूबेटर से जुड़े गैस विनियमन मॉड्यूल का शीर्ष दृश्य। N2 और CO2 ऑक्सीजन / सीओ 2 सांद्रता और गैस दबाव के सटीक नियंत्रण की अनुमति देने के लिए गैस नियामक में प्रवेश करते हैं। गैसों को मिश्रण बॉक्स की ओर निर्देशित किया जाता है, जिसमें उन्हें एक केन्द्रापसारक ब्लोअर द्वारा मिश्रित किया जाता है और एक पंप द्वारा इनक्यूबेटर में इंजेक्ट किया जाता है जो सकारात्मक दबाव उत्पन्न करता है। गैस इनलेट के माध्यम से पानी की बोतल में और बाद में सील बोतलों में बहती है। (बी) गैस और दबाव विनियमन के लिए इलेक्ट्रॉनिक मॉड्यूल का आंतरिक विन्यास। दबाव ट्रांसमीटर पर सेट वोल्टेज मूल्य गैस मिश्रण बॉक्स के अंदर पंप द्वारा उत्पन्न दबाव को नियंत्रित करता है (इस विशिष्ट मॉडल में 6-7 पीएसआई के दबाव को प्राप्त करने के लिए 5-6 वी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पूर्व गर्भाशय संस्कृति मंच उन्नत organogenesis तक E7.5 भ्रूण के विकास का समर्थन करता है। (ए) ई 7.5 पूर्व गर्भाशय भ्रूण संस्कृति प्रोटोकॉल को दर्शाने वाला आरेख। (बी) 4 दिनों में पूर्व गर्भाशय विकसित करने वाले सुसंस्कृत भ्रूण के समूहों की प्रतिनिधि उज्ज्वल-क्षेत्र छवियां, देर से गैस्ट्रुलेशन (E7.5) से 44-सोमाइट चरण (E11) तक। हर 24 घंटे में मूल्यांकन की गई सोमाइट संख्या में विशिष्ट भिन्नता को इंगित किया गया है। स्केल बार = 500 μm. (C, D) E7.5 से शुरू होने वाली संस्कृति के 1-4 दिनों में सामान्य रूप से विकसित भ्रूण का प्रतिशत माउस माता-पिता के उपभेदों और सीरम पूरकता (सी, मानव गर्भनाल रक्त सीरम) द्वारा विभाजित; डी, मानव वयस्क रक्त सीरम)। पैनल ए को 13 से संशोधित किया गया है। संक्षेप: EUCM = पूर्व गर्भाशय भ्रूण संस्कृति माध्यम; एचसीएस = मानव गर्भनाल रक्त सीरम; HBS = मानव वयस्क रक्त सीरम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. देर से organogenesis तक E6.5 जल्दी gastrulating माउस भ्रूण बढ़ते के लिए विस्तारित पूर्व गर्भाशय संस्कृति प्रोटोकॉल. (ए) स्थैतिक प्लेटों और घूर्णन बोतलों प्रणालियों के संयोजन के विस्तारित पूर्व गर्भाशय संस्कृति प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध चित्रण। (बी) भ्रूण की उज्ज्वल क्षेत्र छवियों E6.5 से 44-somite चरण के लिए पांच दिनों के लिए पूर्व गर्भाशय सुसंस्कृत. हर 24 घंटे में मूल्यांकन की गई सोमाइट संख्या में विशिष्ट भिन्नता को इंगित किया गया है। स्केल बार = 500 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: E5.5 से देर से organogenesis चरणों तक pregastrulation माउस भ्रूण की निरंतर पूर्व गर्भाशय संस्कृति। (ए) ई 5.5 भ्रूण के लिए प्रोटोकॉल पूर्व गर्भाशय संस्कृति का योजनाबद्ध चित्रण। (बी) E5.5 से 42-somite चरण तक छह दिनों के लिए सुसंस्कृत भ्रूण के प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियों को सुसंस्कृत पूर्व गर्भाशय . हर 24 घंटे में मूल्यांकन की गई सोमाइट संख्या में विशिष्ट भिन्नता को इंगित किया गया है। स्केल बार = 500 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: भ्रूण सुसंस्कृत पूर्व गर्भाशय में मनाया प्रतिनिधि विकासात्मक दोष. (A-C) असामान्य माउस भ्रूण की उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी छवियों E7.5 (ए), E6.5 (बी), या E5.5 (सी) से शुरू होने वाले पूर्व गर्भाशय उगाए गए। दोष का एक सामान्य विवरण प्रत्येक छवि पर प्रदान किया जाता है। स्केल बार = 500 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 1: E7.5 दिनों के बाद coitum पर अलग भ्रूण के उचित विकास की दक्षता। भ्रूण EUCM (25% मानव गर्भनाल रक्त सीरम) में 4 दिनों के लिए पूर्व गर्भाशय सुसंस्कृत थे। [-] इंगित करता है कि प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के कारण संस्कृतियों को जारी नहीं रखा गया है। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: E7.5 पर अलग किए गए भ्रूण के उचित विकास की दक्षता, 4 दिनों के लिए सुसंस्कृत पूर्व गर्भाशय , मानव नाभि गर्भनाल रक्त सीरम को ताजा अलग-थलग मानव वयस्क रक्त सीरम के साथ बदल दिया। [-] इंगित करता है कि प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के कारण संस्कृतियों को जारी नहीं रखा गया है। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 3: E6.5 पर अलग भ्रूण (B6D2F1 / ICR) के उचित विकास की दक्षता और EUCM (25% मानव गर्भनाल रक्त सीरम) का उपयोग करके 5 दिनों के लिए सुसंस्कृत पूर्व गर्भाशय। पूर्व गर्भाशय संस्कृति दो दिनों (21% O2) के लिए स्थिर संस्कृति में किया गया था, इसके बाद 21% O2 पर घूर्णन बोतलों में तीन दिन। [-] इंगित करता है कि प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के कारण संस्कृतियों को जारी नहीं रखा गया है। संक्षिप्त नाम: NA = अधिग्रहित नहीं है। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 4: भ्रूण (B6D2F1 / ICR) के उचित विकास की दक्षता E6.5 पर अलग-थलग और EUCM का उपयोग करके 5 दिनों के लिए सुसंस्कृत पूर्व गर्भाशय (मानव गर्भनाल रक्त सीरम को ताजा अलग-थलग मानव वयस्क रक्त सीरम के साथ प्रतिस्थापित करना)। भ्रूण को दो दिनों (21% O2) के लिए स्थैतिक संस्कृति में विकसित किया गया था, इसके बाद 21% O2 पर घूर्णन बोतलों में तीन दिन थे। [-] इंगित करता है कि प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के कारण संस्कृतियों को जारी नहीं रखा गया है। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 5: E5.5 पर अलग किए गए भ्रूण (B6D2F1 / ICR) के उचित विकास की दक्षता और EUCM (25% मानव गर्भनाल रक्त सीरम) का उपयोग करके 6 दिनों के लिए सुसंस्कृत पूर्व गर्भाशय। भ्रूण को तीन दिनों (21% O2) के लिए स्थैतिक संस्कृति में विकसित किया गया था, इसके बाद 21% O2 पर घूर्णन बोतलों में तीन दिन थे। [-] इंगित करता है कि प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के कारण संस्कृतियों को जारी नहीं रखा गया है। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां प्रस्तुत संस्कृति प्रोटोकॉल E5.5 से E11 तक छह दिनों तक उचित और निरंतर माउस भ्रूण विकास पूर्व गर्भाशय को बनाए रख सकता है। पहले, इन विकासात्मक चरणों में भ्रूण केवल छोटी अवधि (48 ज तक) 15 के लिए संस्कृति में सामान्य रूप से विकसित हो सकते थे। ऑक्सीजन एकाग्रता और हाइपरबेरिक गैस दबाव के सटीक नियंत्रण के लिए रोलर संस्कृति इनक्यूबेटर के लिए गैस विनियमन मॉड्यूल का युग्मन यहां वर्णित उचित माउस भ्रूण संस्कृति के लिए महत्वपूर्ण है। गैस के दबाव को 7 साई तक बढ़ाने से ऑक्सीजन प्रसार बढ़ जाता है, जिससे 21% O2/5% CO2 तक के वातावरण में E11 तक भ्रूण के विकास की अनुमति मिलती है, जो 95% O216 की पहले से नियोजित स्थितियों के विपरीत है, जो लंबी अवधि में भ्रूण के लिए हानिकारक हो सकता है। इसके अलावा, ऑक्सीजन एकाग्रता को भ्रूण के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है, क्योंकि प्रारंभिक पोस्टइंप्लांटेशन भ्रूणजनन हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत होता है। तदनुसार, देर से gastrulating भ्रूण की सफल संस्कृति के लिए प्रारंभिक 5% O2 वातावरण की आवश्यकता होती है, जिसमें भ्रूण बढ़ने पर ऑक्सीजन एकाग्रता में गतिशील वृद्धि होती है। उल्लेखनीय रूप से, 5% O2 पर स्थैतिक संस्कृति में पूर्व / प्रारंभिक-गैस्ट्रूलेटिंग भ्रूण को संवर्धित करने से 21% O2 की तुलना में उचित भ्रूण विकास की दक्षता में काफी कमी आई, और वे E9.5 तक आगे विकसित नहीं हो सके। उत्तरार्द्ध को घूर्णन बोतलों 1,10 में संस्कृति की तुलना में स्थैतिक संस्कृति में भ्रूण ऊतकों के माध्यम से पोषक तत्व और ऑक्सीजन प्रसार की धीमी दर से समझाया जा सकता है।

इसके अलावा, चूहे और मानव गर्भनाल रक्त सीरम की उच्च सामग्री केवल चूहे के सीरम 13,18 के साथ पूरक मीडिया की तुलना में शुरुआती पोस्टरिप्लांटेड भ्रूण को बढ़ाने के लिए अधिक सुसंगत परिणाम प्रदान करती है। महत्वपूर्ण रूप से, भ्रूण संस्कृति के लिए उपयोग किए जाने वाले सीरम को ताजा निकाले गए रक्त से तैयार किया जाना चाहिए। हालांकि पूरे भ्रूण संस्कृति के लिए उच्च गुणवत्ता वाले चूहे का सीरम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, मानव सीरम को घर में अलग किया जाना चाहिए। मानव गर्भनाल रक्त सीरम के साथ पूरकता को मानव वयस्क रक्त से अलग सीरम द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है, जो व्यापक रूप से सुलभ है और अभी भी सुसंगत और कुशल भ्रूण विकास प्रदान करता है।

सफल और कुशल भ्रूण विकास पूर्व गर्भाशय भी सटीक भ्रूण अलगाव पर अत्यधिक निर्भर है। सबसे पहले, विच्छेदन प्रक्रिया को विच्छेदन माध्यम में 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म किया जाना चाहिए, और विच्छेदित भ्रूण को 30 मिनट के भीतर संस्कृति की बोतलों / प्लेटों में स्थानांतरित किया जाना चाहिए। दूसरा, decidua से सटीक भ्रूण अलगाव और epiblast को नुकसान पहुंचाए बिना Reichert की झिल्ली को हटाने भ्रूण के विकास की उच्च दक्षता प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। तीसरा, संस्कृति के लिए पर्याप्त चरण में केवल भ्रूण का चयन किया जाना चाहिए, क्योंकि शुरुआती / विलंबित भ्रूण ठीक से विकसित नहीं होंगे।

स्थानांतरण के दौरान भ्रूण को संभालना पूर्व गर्भाशय संस्कृति के दौरान एक और आवश्यक बिंदु है, मुख्य रूप से भ्रूण जर्दी थैली के विकास के बाद। भ्रूण को सावधानीपूर्वक स्थानांतरित किया जाना चाहिए क्योंकि प्रमुख जर्दी थैली रक्त वाहिकाओं को नुकसान उचित विकास को प्रभावित कर सकता है। आम तौर पर, भ्रूण संस्कृति की अवधि जितनी लंबी होती है, सामान्य भ्रूण विकास की दक्षता उतनी ही कम होती है, यानी, E7.5 पर निकाले गए भ्रूण E6.5 या E5.5 पर निकाले गए लोगों की तुलना में उच्च दक्षता के साथ विकसित होंगे। इसके अलावा, माध्यम में एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति संदूषण को रोकने के लिए मौलिक है यदि जैविक हुड के अंदर आवंटित विच्छेदन माइक्रोस्कोप उपलब्ध नहीं है।

इस बात से इनकार नहीं किया जा सकता है कि अन्य प्लेटफ़ॉर्म, दबाव स्तर, या स्थितियां वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त परिणामों के समान या संवर्धित परिणामों को सक्षम कर सकती हैं। इस अध्ययन में वर्णित स्थितियों के आगे के अनुकूलन को भ्रूण के विकास की दक्षता तक पहुंचने के लिए आवश्यक है जो अंतर्गर्भाशयी विकास द्वारा मनाया जाता है। इसके अलावा, एक परिभाषित सीरम-मुक्त माध्यम का भविष्य का विकास स्तनधारी भ्रूण विकास के दौरान विशिष्ट चयापचय और रासायनिक आवश्यकताओं को परिभाषित करने और बैच-टू-बैच सीरम परिवर्तनशीलता को कम करने में मदद कर सकता है। वर्तमान सेटिंग्स में घूर्णन बोतलों की संस्कृति का उपयोग करके E8.5 के बाद निरंतर पोषक तत्व और गैस मिश्रण की आवश्यकता ऑर्गेनोजेनेसिस चरणों के दौरान दीर्घकालिक इमेजिंग क्षमताओं को सीमित करती है। माइक्रोस्कोपी सेटअप के लिए युग्मित स्थैतिक संस्कृति में गैस और पोषक तत्वों के मिश्रण को सक्षम करने वाले माइक्रोफ्लुइडिक्स उपकरणों के भविष्य के विकास से इस चुनौती को दूर करने में मदद मिल सकती है।

भ्रूण सुसंस्कृत पूर्व गर्भाशय प्रयोगात्मक रूप से हेरफेर किया जा सकता है और गर्भाशय के बाहर उन्नत organogenesis चरणों तक संस्कृति में रखा जा सकता है। हमने पहले भ्रूण के विकास में विभिन्न बाधाओं को पेश करने की क्षमता का प्रदर्शन किया था, जैसे कि इलेक्ट्रोपोरेशन या लेंटिवायरल संक्रमण, लाइव इमेजिंग, सेल ग्राफ्टिंग और टेराटोजेनिक अध्ययन ों द्वारा आनुवंशिक हेरफेर। आखिरकार, यह प्लेटफ़ॉर्म स्तनधारियों में सेल भाग्य विनिर्देश और अंग गठन तंत्र को उजागर करने में मदद कर सकता है, जो शुरुआती पोस्टइम्प्लांटेशन विकास के छह दिनों तक जीवित माउस भ्रूण में वास्तविक समय के प्रयोग की अनुमति देता है।

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Disclosures

J.H.H. Biological Industries Ltd के लिए एक सलाहकार है और यहां वर्णित रोलर और स्थैतिक संस्कृति की स्थितियों को कवर करने वाला एक पेटेंट आवेदन प्रस्तुत किया है (J.H.H. और Weizmann Institute of Science द्वारा दायर)। अन्य लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को पास्कल और इलाना मंटोक्स द्वारा वित्त पोषित किया गया था; यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); उड़ान परिचर चिकित्सा अनुसंधान परिषद (FAMRI); इज़राइल कैंसर रिसर्च फंड (आईसीआरएफ) प्रोफेसरशिप, बीएसएफ, हेलेन और मार्टिन किमेल इंस्टीट्यूट फॉर स्टेम सेल रिसर्च, हेलेन और मार्टिन किमेल अवार्ड फॉर इनोवेटिव इन्वेस्टिगेशन; इज़राइल साइंस फाउंडेशन (आईएसएफ), मिनर्वा, औषधीय रसायन विज्ञान के लिए शर्मन संस्थान, नेला और लियोन बेनोज़ियो न्यूरोलॉजिकल रोगों के लिए केंद्र, डेविड और फेला शेपेल फैमिली सेंटर फॉर जेनेटिक डिसऑर्डर रिसर्च, केकस्ट फैमिली इंस्टीट्यूट फॉर मेडिकल जेनेटिक्स, डॉ बेथ रोम-राइमर स्टेम सेल रिसर्च फंड, एडमंड डी रोथ्सचाइल्ड फाउंडेशन, ज़ंटकर चैरिटेबल फाउंडेशन, ज़विया ज़ीरोनी की संपत्ति।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm pore size filter (250 mL) JetBiofil FCA-206-250
0.22 µm pore size syringe PVDF filter Millipore SLGV033RS
8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat iBidi 80827/80826
Bottle with adaptor cap for gas inlet Arad Technologies
Bungs (Hole) B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering BTC 06 Used to seal the bottles to the drum
Bungs (Solid) B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering BTC 07 Used to seal the rotating drum
Culture bottles B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering BTC 03/BTC 04 Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04
D(+)-glucose Monohydrate J.T. Baker
Diamond knife Fine Science Tools 10100-30/45
Digital Pressure Gauge Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd BX-DPG80
DMEM GIBCO 11880
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Biological industries 02-020-1A
Fetal Bovine Serum Biological industries 04-013-1A
Gas regulation module Arad Technologies HannaLab1
Glutamax GIBCO 35050061 glutamine
Graefe forceps Fine Science Tools 11052-10
HEPES GIBCO 15630056
Microsurgical forceps (Dumont #5, #55) Fine Science Tools 11255-20
Pasteur pipettes (glass) Hilgenberg 3150102
Pasteur pipettes (plastic) Alexred SO P12201
Penicillin/Streptomycin Biological industries 03-031-1B
Petri Dishes (60 mm and 100 mm) Falcon 351007/351029
Precision incubator system B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering BTC01 BTC01 model with gas bubbler kit
Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL) Greiner Bio-One #456005
Rat whole embryo culture serum ENVIGO Bioproducts B-4520
Stereoscopic microscope equipped with heating plate Nikon SMZ18
Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration Pic Solution
Surgical scissors Fine Science Tools 14094-11

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 176 माउस भ्रूण पूर्व गर्भाशय संस्कृति gastrulation Organogenesis Embryogenesis स्तनधारी विकास
<em>पूर्व गर्भाशय</em> माउस भ्रूण की संस्कृति Pregastrulation से उन्नत Organogenesis करने के लिए
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Aguilera-Castrejon, A., Hanna, J. H. Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis. J. Vis. Exp. (176), e63160, doi:10.3791/63160 (2021).

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