Summary
פלטפורמה משופרת לתרבות העוברים המלאים מאפשרת פיתוח רחם אקס רציף וחזק של עוברי עכבר לאחר ההשתלה עד שישה ימים, משלבי טרום ההדבקה ועד לאורגנוגנזה מתקדמת. בפרוטוקול זה, אנו מפרטים את ההליך הסטנדרטי לתרבות עוברית מוצלחת באמצעות לוחות סטטיים ומערכות בקבוק מסתובבות.
Abstract
שיטות התרבות של היונקים לאחר ההשתלה היו בדרך כלל לא יעילות ומוגבלות לתקופות קצרות לאחר ניתוח הרחם. פלטפורמות פותחו לאחרונה עבור תרבות רחם לשעבר חזקה וממושכת מאוד של עוברי עכבר משלבי גליל ביצה עד organogenesis מתקדם. פלטפורמות אלה מאפשרות פיתוח מתאים ונאמן של עוברים טרום-כבידה (E5.5) עד לשלב היווצרות הגפיים האחוריות (E11). עוברים גסטריים מאוחרים (E7.5) גדלים בבקבוקים מסתובבים בהגדרות אלה, בעוד שתרבות מורחבת משלבי טרום-סטרולציה (E5.5 או E6.5) דורשת שילוב של תרביות בקבוקים סטטיות ומסתובבות. בנוסף, רגולציה רגישה של ריכוז O2 ופחמן דו חמצני, לחץ גז, רמות גלוקוז, ושימוש במדיום תרבית הרחם לשעבר ספציפי הם קריטיים להתפתחות העובר הנכון. כאן, פרוטוקול מפורט צעד אחר צעד עבור תרבות עובר עכבר הרחם לשעבר מורחב מסופק. היכולת לגדל עוברי עכבר רגילים לשעבר הרחם מן gastrulation כדי organogenesis מייצג כלי בעל ערך לאפיון ההשפעה של הפרעות ניסיוניות שונות במהלך התפתחות עוברית.
Introduction
ההתפתחות התוך רחמית של העובר היונקים הגבילה את המחקר של השלבים המוקדמים של התפתחות לאחר ההשתלה1,2. חוסר הנגישות של העובר המתפתח מעכב את ההבנה של תהליכים התפתחותיים מרכזיים המתרחשים לאחר השתלות העובר לרחם, כגון הקמת תוכנית גוף בעלי החיים, מפרט שכבות הנבט, או היווצרות רקמות ואיברים. יתר על כן, הגודל הקטן מאוד של העובר שלאחר ההשתלה המוקדמת מקשה על התבוננות על ידי הדמיה תוך-ויטמית ברחם לפני E103. חוסר היכולת להתבונן ולתפעל עוברים חיים בשלבים אלה הגבילה את המחקר של עוברי לאחר ההשתלה המוקדמים לתמונות במהלך ההתפתחות.
פרוטוקולים לתרבות הפריה חוץ גופית של עוברים יונקים טרום ההשתלה מבוססים היטב, אמינים, ומנוצלים באופן קבוע4. אף על פי כן, הניסיונות להקים מערכות תרבות הרחם לשעבר המסוגלות לתמוך בצמיחה נכונה של העובר לאחר ההשתלה היונקים נחלו הצלחה מוגבלת5. מגוון טכניקות תרבות הוצעו במשך למעלה ממאה שנה, בעיקר על ידי פולחן העוברים בלוחות סטטיים קונבנציונליים6,7,8 או בקבוקים מסתובבים (תרביות רולר)5,9,10. פלטפורמות אלה הוכיחו את עצמן כמועילות בהרחבת הידע על התפתחות היונקים לאחר ההשתלה 11,12, למרות היותן מאוד לא יעילות להישרדות העובר הרגילה ומוגבלות לתקופות קצרות. העוברים החלו להציג פיגור התפתחותי וחריגות מורפולוגיות כבר 24-48 שעות לאחר חניכת התרבות.
מחקר זה מספק תיאור מפורט להקמת מערכת תרבות העובר ברחם לשעבר המאפשרת התפתחות רציפה משלב טרום-אסטרולציה לשלבי אורגנוגנזה מתקדמים במשך עד שישה ימים של התפתחות לאחר ההשתלה13. מאמר זה מתאר את פרוטוקול תרבות הרולר המשופר התומך בצמיחה של עוברים E7.5 (לוח עצבי ושלב כיסוי הראש) עד שלב היווצרות הגפיים האחוריות (~ E11) ואת התרבות המורחבת מ- E5.5/ E6.5 על ידי שילוב תרבות על לוחות סטטיים ופלטפורמות תרבות רולר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו על פי הנחיות ההגנה על בעלי חיים של מכון ויצמן למדע ואושרו על ידי מכון ויצמן הרלוונטי IACUC (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). נשים הרות ובריאות התבקשו לתת את הסכמתן מדעת לאיסוף דם מחבל הטבור שלהן, כפי שאושר על ידי ועדת הלסינקי של המרכז הרפואי רמב"ם (#RMB-0452-15). מבוגרים בריאים התבקשו לקבל את הסכמתם מדעת לאיסוף דם בהתאם להנחיות ועדת הלסינקי של מכון ויצמן למדע (#1566-3).
1. הכנה לתקשורת
- הכן את מדיום החיתוך באמצעות 500 מ"ל של מדיום הנשר המתוקן (DMEM) של Dulbecco ללא פנול אדום ו- L-גלוטמין, בתוספת סרום בקר עוברי 10%, 5 מ"ל של פניצילין / סטרפטומיצין, ו filterize-עיקור באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
הערה: יש לשמור על מדיום החיתוך בטמפרטורה של 4 °C (60 °F) למשך עד חודש אחד. - הכן מדיום תרבות עובר הרחם לשעבר (EUCM) טרי כל יום תרבות בתוך מכסה המנוע הביולוגי באמצעות 25% של מדיום עוברי בתוספת 50% סרום חולדה ו 25% סרום דם טבורי אנושי (HCS) או סרום דם מבוגר אנושי (HBS).
- כדי להכין מדיום עוברי, להוסיף 5 מ"ל של גלוטמין, 5 מ"ל של HEPES, ו 5 מ"ל של פניצילין / סטרפטומיצין ב 500 מ"ל של DMEM ללא פנול אדום L-גלוטמין. הכינו 10-15 מ"ל aliquots ולאחסן אותם ב 4 °C (65 °F) עד חודשיים.
הערה: הכפילו את הריכוז האנטיביוטי אם אתם חווים זיהום כלשהו. - מנטרלים בחום את סרום החולדה בטמפרטורה של 56°C למשך 30-45 דקות ומסננים דרך מסנן דיפלואוריד פוליווינילידן של 0.22 מיקרומטר. השתמש בסרום לתרבות באותו יום של איון. להפשיר HCS או HBS ולהשתמש בו מיד לניסויים.
הערה: סרום חולדות מסחרי מספק תוצאות עקביות (לפחות 4 מגרשים נבדקו ללא וריאציה ברורה). לחלופין, סרום עכברושים באיכות גבוהה ניתן להשיג בתוך הבית כפי שתואר בעבר 8,14. אם HCS אינו זמין, החלף אותו ב- HBS שנאספו בתוך הבית. סרום עכברושים, HCS ו- HBS ניתן להקפיא פעם אחת ונשמר ב -20 °C (60 °F) לשימוש ביום אחר. הפשירו ושלבו את סרום ההקפאה עם נפח גדול יותר של סרום שהופשר טרי ואל תקפיאו אותו מחדש.
2. אוסף של סרום דם טבורי אנושי וסרום דם של מבוגרים אנושיים
- כדי לבודד HCS, לאסוף דם חבל הטבור מנשים בהריון בריא ביום הלידה הקיסרית המתוכננת.
- מהדקים פעמיים את חבל הטבור 5-7 ס"מ מהטבור ועוברים בין המלחציים מיד לאחר הלידה של התינוק.
- באופן ידני להקיז דם באמצעות מחט 14 G גדול נשא ומזרק 50 מ"ל ישירות מן הווריד הטבור בעוד השליה נשארת במקום כדי למנוע כל עקבות של המוליזה.
הערה: לאסוף דם לאחר שהתינוק מוסר מתחום הניתוח, ודם טבור נמשך לבדיקות קליניות.
- לחלק את הדם שנאסף ל 5 מ"ל פרוקואורגנט מבחנות סטריליות ולהעביר אותם מיד ל 4 °C (60 °F) במשך 15 דקות כדי לאפשר קרישה מלאה. צנטריפוגה המבחנות הקרושות ב 2,500 × גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (65 °F).
- להשליך צינורות המראים סימנים של המוליזה (סרום ורוד-אדום). לאסוף את הסרום (צבע צהוב) באמצעות פיפטה 5 מ"ל ולסנן אותו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. מחממים את הסרום מיד באמבט מים בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
- הכן 1-1.5 מ"ל aliquots של סרום מומת ולאחסן אותם ב -80 °C (80 °F) עד שישה חודשים. במידת הצורך, יש לשלוח בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס באמצעות קרח יבש.
- לאיסוף סרום דם אנושי למבוגרים, יש להקיז דם ממבוגרים בריאים ולבודד מיד את הסרום בעקבות אותו פרוטוקול המתואר בסרום דם טבורי. יש לאחסן את ה-HBS כ-aliquots מושבתים בחום ומסוננים בטמפרטורה של -80°C למשך עד שישה חודשים.
הערה: סרום חבל הטבור האנושי והסרום האנושי למבוגרים שהוכן זה עתה בתוך הבית העניקו תוצאות מעולות לסרום הזמין מסחרית. לאסוף HCS מנשים בריאות, מעל גיל 18 מתחת לגיל 40 שנים מתוכנן משלוח סעיף cesarian. לא לכלול נשים שילדו בנרתיק ונשים עם כל מחלה כרונית או מצבים רפואיים פעילים, כולל סוכרת הריונית או יתר לחץ דם.
3. תרבות רולר הרחם לשעבר של עוברים מ E7.5 עד E11
- הקמת חממת תרבות הרולר ורגולטור הגז
- תרבות E7.5 או עוברים מתקדמים יותר באמצעות מערכת החממה של תרבות הרולר. הפעל את הסיבוב ואת יחידת החימום ב 37 °C (50 °F) לפחות 1 שעות לפני ניתוח העובר. מוסיפים מים משועבדים אוטומטית לבקבוק כניסת הגז ולמבחנת השקע.
הערה: הנח מדחום בסמוך לתוף המסתובב ובדוק לעתים קרובות את יציבות הטמפרטורה בתוך האינקובטור. פתח את החממה מהר ככל האפשר כמו זמן פתיחה ממושך יגדיל את הטמפרטורה ולהשפיע על התפתחות העובר. בעת הצורך, מוסיפים עוד מים משועבדים אוטומטית לבקבוק כניסת הגז ולמבחנת השקע כדי לשמור אותם למינימום של חצי קיבולת במהלך התרבות. הגן על העוברים בתוך האינקובטור מפני אור על ידי כיסוי האינקובטור בבד. - הפעל את מודול וסת הגז על-ידי לחיצה על המתג הראשי ולאחר מכן הפעלת בקרי חמצן/חנקן ופחמן דו-חמצני (איור 1A). הגדר את ערכי החמצן והפחמן הדו-חמצני ל- 5% באמצעות הבקרים המתאימים. פתחו את וסת הגז והגדירו את לחץ הגז ל-6.5-7 פאונד לאינץ' מרובע (פסאיי) על ידי הזזת מתג המתח במשדר הלחץ (איור 1B). אשר את ערך לחץ הגז באמצעות מד לחץ דיגיטלי.
- נטר את זרימת הגז על ידי בדיקת קצב הבועות שנוצרו בתוך המבחנה המלאה במים בשקע שהוקצתה בתוך החממה המדויקת. הגדר את קצב הבועה הנכון על ידי סגירה / פתיחה של שסתום זרימת הגז על המכסה של בקבוק המים. ודא כי זרימת הגז מאפשרת היווצרות של בועות בקצב של 2-4 בועות לשנייה או להגדיר את זרימת הבועה בנקודה הראשונה שבה מבעבע יוצא צינור שקע מלא מים.
- מלאו את בקבוקי התרבות ב-2 מ"ל של מדיום תרבית וחברו אותם לתוף המסתובב והחלול לשיווי משקל למשך שעה אחת. השתמש בבאנגי הסיליקון החלולים כדי לאטום את הבקבוקים לתוף. שמור אטום את החללים הריקים בתוף המסתובב באמצעות bungs מוצק.
הערה: היעדר בועות בצינור השקע (אין גז מגיע דרך המערכת) או זרימת גז גבוהה במיוחד עשוי להשפיע על התפתחות העובר. במקרה של חוסר זרימת בועות למבחנת השקע, בדוק כי כל bungs סיליקון ממוקמים כראוי בתוף מסתובב ואיטום המערכת, ולבדוק כי בקבוק המים סגור כראוי וכל הצינורות מחוברים כראוי. חוסר מבעבע שנכנס לבקבוק המים עשוי להצביע על תקלה בווסת הגז.
- תרבות E7.5 או עוברים מתקדמים יותר באמצעות מערכת החממה של תרבות הרולר. הפעל את הסיבוב ואת יחידת החימום ב 37 °C (50 °F) לפחות 1 שעות לפני ניתוח העובר. מוסיפים מים משועבדים אוטומטית לבקבוק כניסת הגז ולמבחנת השקע.
- ניתוח של עוברי עכבר מעכברים בהריון
- משווה מראש את מדיום הנתיחה בתוך אינקובטור ב 37 °C (5° פרנהייט) ו 5% CO2 למינימום של 1 שעות. השאר את המכסה פתוח מעט כדי לאפשר חילופי גז.
- להקריב את הנקבה ההרה על ידי נקע צוואר הרחם, לנקות את הבטן של הנקבה עם 70% אתנול, ולחתוך את העור ואת דופן הבטן עם מספריים. אתר קצה אחד של הרחם וחתוך בצומת בין השחלה לרחם. לאחר מכן, חותכים לאורך הרחם עד לקצה השני ומעבירים אותו לצלחת פטרי 100 מ"מ מלאה בטמפרטורת החדר של תמיסת מלח חוצצת פוספט של Dulbecco (DPBS).
הערה: מומלץ להשתמש בנשים שאינן מהושראות הורמונליות, הזדווגות באופן טבעי. - לשטוף במהירות את המושגים ב- DPBS ולחתוך בזוגות כדי להקל על טיפול בעוברים. מעבירים את כל זוגות המושגים למדיום ניתוח מתואם מראש בצלחת פטרי 60 מ"מ וחותכים לתפיסות בודדות.
- הסר את דופן הרחם של המושגים על ידי קריעת רקמת הרחם באמצעות זוג מלקחיים ברוטו. השתמש מלקחיים מיקרוכירורגיים עדינים כדי לחתוך את קצה ההחלטה בצורת אגס. הכנס את המלקחיים לצד העובר במקביל לציר הארוך שלו, ופתח את המלקחיים כדי לפצל את המלקחיים לחצי.
- לבסוף, להשאיר את חרוט ectoplacental שלם מחובר גליל הביצה על ידי אחיזת העובר מן decidua וקילוף שק החלמון הקודקודי את העובר באמצעות מלקחיים עדינים.
הערה: כדי להימנע מהשפעה על העובר, בצעו ניתוחים במיקרוסקופ המצויד בלוח חימום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תוך 30-40 דקות לכל היותר. לנתח המלטה אחת של עוברים בכל פעם. - מיד לאחר הניתוח, העבירו את העוברים לצלחת חדשה מלאה במדיום ניתוח שיווי משקל באמצעות פיפטת פסטר מזכוכית כדי למנוע מהעוברים להידבק לפסולת הרקמה.
- בחר עוברים אלה בלוח העצבי / שלב קיפול הראש המוקדם מראה שום נזק באפיבלסט ולהעביר 5-6 עוברים לבקבוק לבקבוק לבקבוק לבקבוק לתרבות הזכוכית שהשתווינו מראש.
הערה: כדי להכין את פיפטה פסטר זכוכית, לחתוך את הפתיחה של פיפטה לגודל הולם כדי להתאים את העוברים באמצעות חותך זכוכית, ולשמור אותו באתנול כדי למנוע זיהום. לשטוף את פיפטה זכוכית עם PBS לפני העברת עוברים. בעת העברת העוברים לבקבוק התרבות, הקפד לשאת מעל נפח קטן ככל האפשר של מדיום הנתיחה כדי למנוע דילול EUCM. - מניחים את הבקבוקים במערכת התרבות המסתובבת ב 37 °C (5 °F), באווירה של 5% O2 ו 5% CO2.
- בכל יום של תרבות, להסיר את הבקבוקים אחד אחד מן החממה כדי להעריך את התפתחות העובר תחת סטריאומיקרוסקופ. הקפד לסגור את החור הריק בתוף עם באנג מוצק בעת הסרת בקבוק. חותכים את הקצה של פיפטה פסטר פלסטיק סטרילי כדי להתאים את גודל העובר ולהעביר את העוברים לצלחת פטרי כדי להקל על התצפית. ודא כי העוברים מכוסים תמיד על ידי בינוני.
הערה: למזער את הזמן שעבורו העוברים נמצאים מחוץ לאינקובטור כדי למנוע השפעות מזיקות בעוברים עקב ירידה בטמפרטורת הגוף. להתמודד עם העוברים בזהירות כדי למנוע קרע של כלי הדם שק החלמון, המשפיעים על הישרדות העובר. - ביום התרבות 1 (שווה ערך ל- E8.5), העבר קבוצות של 3 עוברים לבקבוק חדש עם 2 מ"ל של EUCM טרי ושוויוני מראש המכיל תוספת של 3 מ"ג / מ"ל של D-גלוקוז ותערובת גז של 13% O2, 5% CO2.
- לאחר 48 שעות (שווה ערך ל- E9.5), קבוצות העברה של שני עוברים לבקבוק חדש עם EUCM שחומם מראש בתוספת 3.5 מ"ג / מ"ל של גלוקוז באטמוספרת גז של 18% O2 ו 5% CO2.
- ב 72 שעות של תרבות (שווה ערך E10.5), להעביר כל עובר לבקבוק בודד המכיל 1.5-2 מ"ל של בינוני טרי בתוספת 4 מ"ג / מ"ל של גלוקוז ואספקת גז של 21% O2 ו 5% CO2.
הערה: עוברים מגיעים לצמיחה המקסימלית שלהם בערך בחצות של יום התרבות 4. - השתמש מלקחיים עדינים כדי להסיר את שק החלמון ואת אמניון, ולנתק את חבל הטבור לתצפית נכונה של מורפולוגיה עוברית. כבה את מודול ויסות הגז ואת האינקובטור המדויק.
הערה: יש לאזן מראש את מדיום התרבות למשך שעה אחת על ידי דגירה בתוך בקבוק זכוכית בתרבות הרולר עם אטמוספרת גז נאותה על פי שלב העובר. נקו את בקבוקי התרבות ואת כל כלי הזכוכית של החממה לאחר כל שימוש על ידי ביצוע שלוש שטיפות עם מים מזוקקים זורמים ואחריו שטיפה לילית שקועה ב -70% אתנול. לשטוף שלוש פעמים עם מים מזוקקים זורמים, לתת לבקבוקים להתייבש בן לילה, ולעקר על ידי autoclave. כמו כן, autoclave את תקעי הסיליקון באופן קבוע. יש לנקות ביסודיות את כל כלי הניתוח עם 70% אתנול ולחטא אותם ביבש.
4. תרבות העובר המורחבת מ- E5.5/ E6.5 עד E11
- טרום-אסטרציה תרבותית (E5.5) ועוברי גסטרולציה מוקדמת (E6.5) עד לשלב הסומיט המוקדם (E8.5) בלוחות סטטיים.
- ישוו מראש את מדיום החיתוך למשך שעה אחת באינקובטור עם 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
הערה: כדי לאפשר חילופי גז, אין לסגור את מכסה הצינור לחלוטין. - הכן את לוחות התרבות על ידי הוספת 250 μL של EUCM מוכן טרי לכל באר. מניחים את הצלחות בתוך אינקובטור CO2 ב 37 °C (50 °F) עבור שיווי משקל מראש.
הערה: למרות לוחות 8-well מתאימים היטב לצמיחת העובר, התרבות יכולה להיעשות בכל צלחת אחרת על ידי התאמת עוצמת הקול של המדיום בהתאם לגודל הצלחת. - לנתח עוברים גליל ביצה מתוך הרחם בעקבות הטכניקה המתוארת עבור E7.5. מוציאים את שק החלמון הקודקודי של העובר ומשאירים את חרוט האקטופלנט שלם המחובר לגליל הביצה.
- מעבירים עוברים בודדים לתוך כל באר של צלחת 8 באר באמצעות micropipette ומניחים את הצלחת בתוך האינקובטור עם 5% CO2 ב 37 °C (8 °F).
- דמיינו את העוברים תחת סטריאומיקרוסקופ ובחרו לתרבות רק לבעלי חלל מי שפיר מעוצב היטב, ללא נזק ניכר וללא קרום הרייכרט.
הערה: השתמש 20 טיפים פיפטה μL להעביר E5.5 עוברים ו 200 טיפים μL להעביר E6.5 עוברים. במקרה של תרבויות החל E6.5, HCS יכול להיות מוחלף על ידי HBS שנאסף טרי. - הסר מחצית מהמדיום והוסף 250 μL של EUCM טרי שהוכן מראש לאחר 24 שעות של תרבות, להבטיח כי העוברים תמיד שקועים במדיום התרבות. במקרה של תרבויות החל E5.5, לאחר יומיים של תרבות (שווה ערך E7.5), להסיר 200 μL ולהוסיף 250 μL של EUCM חדש.
הערה: במהלך תרבית סטטית, עוברים עשויים להיצמד לצלחת (בעיקר בעת שימוש בלוחות פלסטיק), דבר שיפגע קשות בהתפתחות העובר. חיבור העובר לצלחת הוא תכוף יותר ביום הראשון של פולחן עוברים E5.5. כדי למנוע התקשרות, בזהירות לדחוף את העוברים הרחק משטח הלוח באמצעות מלקחיים עדינים, סטריליים. ודא שרק חרוט אקטוספלטנטלי נשאר מחובר לפני השטח של הצלחת. - העבר את העוברים לתרבות הרולר בשלב הסומיטים המוקדמים (4-7 סומיטים; לאחר שלושה ימים של תרבות לעוברים שהוסברו ב- E5.5 ויומיים לתרבויות שהחלו ב- E6.5), בעקבות אותם אינדיקציות שתוארו בעבר עבור עוברי שלב E8.5.
הערה: העברת העוברים לתרבות הרולר בשלבים סומיטיים השונים מאלה שצוינו לעיל גורמת לכישלון בהתפתחות נוספת. בניגוד לתרבויות הרחם לשעבר E7.5, ניתן לשמור על העוברים באטמוספירה קבועה של 21% חמצן ו -5% CO2, ומספקים יעילות מעט גבוהה יותר של התפתחות העובר מאשר אטמוספרות עם ריכוז חמצן דינמי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תנאי תרות הרולר המתוארים עבור עוברים E7.5 (שלב גסטרולציה מאוחרת) תומכים בצמיחה קבועה ונורמלית של עוברים ביעילות ממוצעת של קרוב ל-75% לאחר 4 ימי תרבות (איור 2 ולוח 1). היעילות של התפתחות העובר עשויה להשתנות על-פני רקעים גנטיים מגוונים של עכברים, אך היא איתנה באופן עקבי (איור 2C). תוספי HBS במקום HCS מניבים יעילות של ~68% לאחר 4 ימים של תרבות הרחם לשעבר , בהתאם לרקע הגנטי של העכברים (איור 2D וטבלה 2). העוברים פיתחו רחם לשעבר recapitulate פיתוח תקין עד בערך השלב 44-somite. לאחר מכן, העוברים מציגים חריגות עובריות בשל היעדר השליה האלנטואית, וכתוצאה מכך חמצון מספיק ואספקת חומרים מזינים בהתחשב בגודל הגוף המוגדל בשלב זה.
פיתוח העוברים E6.5 (פס מוקדם) בלוחות סטטיים מסוכם כראוי ביעילות של >90% עד ל- E8.5 בשלב הסומיטים המוקדם E8.5, תוך שימוש ב- EUCM עם HCS ו- HBS (איור 3, טבלה 3 וטבלה 4) (ראה 8,13 לתיאור מפורט של היערכות העובר בין E5.5 ל- E8.5). תרבות הרחם לשעבר מ-gastrulation כדי organogenesis מתקדם על ידי שילוב תרביות על לוחות סטטיים ואחריו תרבות הרולר באטמוספרה קבועה של 21% חמצן מעניקה יעילות משוערת של התפתחות נכונה של 55% ו -26% לשלב 44-somite, באמצעות HCS ו- HBS, בהתאמה (איור 3A, טבלה 3, ולוח 4). יש עיכוב של 1-2 זוגות סומיטים בעוברים אלה בהשוואה לעוברים שפותחו ברחם. הירידה הגדולה ביותר ביעילות מתרחשת במעבר מ E8.5 ל E9.5 עקב כישלון של סיבוב צירי וסגירה של הצינור העצבי.
תרבויות החל מ- E5.5 עוברים טרום-סחיטה מראים יעילות של התפתחות נכונה לשלב המוקדם של הסומיט (E8.5) של כ -46%, וכמעט 17% מהעוברים ישלימו התפתחות נכונה לאחר שישה ימים של תרבות לאחר שהועברו לתרבות הרולר (איור 4 וטעה 5). תרבות הרחם לשעבר המורחבת מאריכה את העיכוב ההתפתחותי בעוברים, כאשר עוברים מוסברים ב- E5.5 המראים עיכוב של 2-4 זוגות של סומיטים בהשוואה לעוברים ב- vivo . עם זאת, מורפוגנזה ופיתוח רקמות להמשיך כראוי עד בערך השלב 42-somite.
הפגמים הנפוצים ביותר שנראו בעוברים לתרבויות שיוזמות מ-E7.5, E6.5 ו-E5.5 באים לידי ביטוי באיור 5A-C. בזמן הניתוח, עוברים עם נזק קל אפילו לאפיבלסט או לאזור החיצוני, כמו גם עוברים השומרים על קרום הרייכרט, יש להשליך. כמו כן, עוברים מוקדמים לא יגדלו כראוי (ראו איור 5B לעוברים מתים) או יציגו עיכובים התפתחותיים חמורים (ראו איור 5B לעובר מעוכב). התקשרות של epiblast עוברי על פני השטח של הלוח ישפיע על ההתפתחות בהתאם למיקום וציון של התקשרות. התקשרות של חלק מהאפיבלסט או של העובר כולו תגרום לכשל בהתפתחות נוספת (ראו איור 5B לעובר מצורף).
החריגות העיקריות שנצפו באחוז העוברים הפגומים ב- E8.5 (שלב סומיט מוקדם) הן התפתחות האזור האחורי מחוץ לשק החלמון או פגמים בצמיחת הקפלים העצביים (איור 5A,B). במקרה של תרבויות שהחלו ב- E5.5, פגם התפתחותי הנצפה לעתים קרובות הוא נוכחות של אפיבלסט קטן ולא מפותח (איור 5C). באותו זמן שווה ערך ל- E9.5, פגמים בסגירת הקפלים העצביים, כישלון בפנייה צירית או מחסור בצמיחת המוח מייצגים את החריגות הנפוצות ביותר (איור 5). הפגמים ההתפתחותיים הנפוצים ביותר ב-E10.5/E11 הם אנומליות באזור הראש, שיבוש זרימת הדם הנורמלית בשק החלמון ותפליטת קרום הלב (איור 5). קרע של כלי דם עיקרי אחד וזרימת דם עלולים לגרום למוות מאוחר יותר של העובר. ראוי לציין, צמיחה נכונה של העובר עצמו ניתן להגיע גם בהיעדר זרימת שק חלמון ניכר. עוברים נשמרו בתרבות מעבר לבמה המקבילה E11 הצטמקות הגוף ומוות לאחר כמה שעות עקב חוסר חמצון רקמות תקין.
איור 1: מערכת ויסות גז ולחץ המותאמת לחממה של תרבות רולר. (א) מבט עליון על מודול ויסות הגז המחובר לחממת תרבות הרולר. N2 ופחמן דו חמצני להיכנס לווסת הגז כדי לאפשר שליטה מדויקת של ריכוזי חמצן / CO2 ולחץ גז. הגזים מופנים לכיוון תיבת הערבוב, שבה הם מעורבבים על ידי מפוח צנטריפוגלי ומוזרקים לתוך האינקובטור על ידי משאבה שמייצרת לחץ חיובי. הגז זורם דרך הכניסה לתוך בקבוק מים ומאוחר יותר לבקבוקים האטומים. (ב) תצורה פנימית של המודול האלקטרוני לוויסות גז ולחץ. ערך המתח שנקבע על משדר הלחץ מווסת את הלחץ שנוצר על ידי המשאבה בתוך תיבת ערבוב הגז (5-6 V כדי להשיג לחץ של 6-7 פסאיי בדגם ספציפי זה). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: פלטפורמת תרבות הרחם לשעבר תומכת בצמיחה של עוברים E7.5 עד אורגנוגנזה מתקדמת. (A) דיאגרמה המתארת את פרוטוקול התרבות של עובר הרחם E7.5 לשעבר . (B) תמונות שדה בהירות מייצגות של קבוצות של עוברים מתורבתים המפתחים רחם לשעבר במשך 4 ימים, מ gastrulation מאוחר (E7.5) לשלב 44-somite (E11). הווריאציה האופיינית במספר somite מוערך כל 24 שעות מצוין. סרגלי קנה מידה = 500 מיקרומטר. (C, D) אחוז העוברים המפותחים בדרך כלל ב 1-4 ימים של תרבות החל E7.5 מחולק על ידי זני הורה עכבר ותוספים בסרום (C, סרום דם טבורי אנושי; D, נסיוב דם אנושי למבוגרים). לוח A שונה מ - 13. קיצורים: EUCM = מדיום תרבות עובר הרחם לשעבר; HCS = סרום דם טבורי אנושי; HBS = נסיוב דם אנושי למבוגרים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. פרוטוקול תרבות הרחם לשעבר מורחב לגידול עוברי עכבר E6.5 מוקדם gastrulating עד organogenesis מאוחר. (א) איור סכמטי של פרוטוקול תרביות הרחם לשעבר המורחב המשלב לוחות סטטיים ומערכות בקבוקים מסתובבות. (B) תמונות שדה בהיר של עוברים מתורבתים לשעבר הרחם במשך חמישה ימים מ E6.5 לשלב 44-somite. הווריאציה האופיינית במספר somite מוערך כל 24 שעות מצוין. סרגלי קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תרבות הרחם לשעבר רציפה של עוברי עכבר טרום-סטרולציה מ-E5.5 עד לשלבים מאוחרים של אורגנוגנזה. (א) תיאור סכמטי של תרבות הרחם לשעבר הפרוטוקול עבור עוברים E5.5. (ב) תמונות שדה בהירות מייצגות של עוברים מתורבתים לשעבר הרחם במשך שישה ימים מ E5.5 עד שלב 42-somite. הווריאציה האופיינית במספר somite מוערך כל 24 שעות מצוין. סרגלי קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: פגמים התפתחותיים מייצגים שנצפו ברחם לשעבר מתורבת עוברים. (א-ק) תמונות מיקרוסקופיות בשדה בהיר של עוברי עכבר לא תקינים שגדלו ברחם לשעבר החל מ- E7.5 (A), E6.5 (B) או E5.5 (C). תיאור כללי של הפגם מסופק בכל תמונה. סרגלי קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: יעילות ההתפתחות התקינה של עוברים מבודדים ב E7.5 ימים לאחר משגל. העוברים היו תרבית הרחם לשעבר במשך 4 ימים ב EUCM (25% סרום דם טבורי אנושי). [-] מציין שתרבויות לא נמשכו עקב דרישות ניסיוניות. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: יעילות של התפתחות נכונה של עוברים מבודדים ב- E7.5, רחם לשעבר מתורבת במשך 4 ימים, החלפת סרום דם טבורי אנושי עם סרום דם אנושי מבודד. [-] מציין שתרבויות לא נמשכו עקב דרישות ניסיוניות. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 3: יעילות של התפתחות נכונה של עוברים (B6D2F1/ICR) מבודדים ב- E6.5 ורחם לשעבר מתורבת במשך 5 ימים באמצעות EUCM (25% סרום דם טבורי אנושי). תרבות הרחם לשעבר נעשתה בתרבות סטטית במשך יומיים (21% O2) ואחריו שלושה ימים בבקבוקים מסתובבים ב 21% O2. [-] מציין שתרבויות לא נמשכו עקב דרישות ניסיוניות. קיצור: NA = לא נרכש. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 4: יעילות ההתפתחות התקינה של עוברים (B6D2F1/ICR) מבודדים ב- E6.5 ורחם לשעבר מתורבת למשך 5 ימים באמצעות EUCM (מחליף סרום דם טבורי אנושי בסרום דם אנושי למבוגרים מבודדים). העוברים פותחו בתרבות סטטית במשך יומיים (21% O2) ואחריו שלושה ימים בבקבוקים מסתובבים ב 21% O2. [-] מציין שתרבויות לא נמשכו עקב דרישות ניסיוניות. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 5: יעילות של התפתחות נכונה של עוברים (B6D2F1/ICR) מבודדים ב E5.5 ורחם לשעבר מתורבת במשך 6 ימים באמצעות EUCM (25% סרום דם טבורי אנושי). העוברים פותחו בתרבות סטטית במשך שלושה ימים (21% O2) ואחריו שלושה ימים בבקבוקים מסתובבים ב 21% O2. [-] מציין שתרבויות לא נמשכו עקב דרישות ניסיוניות. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול התרבות המוצג כאן יכול לקיים רחם עובר עכבר תקין ומתמשך למשך עד שישה ימים, מ- E5.5 עד E11. בעבר, עוברים בשלבים התפתחותיים אלה יכולים להתפתח כרגיל בתרבות רק לתקופות קצרות (עד 48 שעות)15. הזיווג של מודול ויסות הגז לחממת תרבות הרולר לשליטה מדויקת בריכוז החמצן ולחץ הגז ההיפרברי הוא קריטי לתרבות עוברי העכבר הנכונה המתוארת כאן. הגדלת לחץ הגז ל 7 פסאיי משפרת את פיזור החמצן, ומאפשרת פיתוח עובר עד E11 באטמוספירה של עד 21% O2/5% CO2, בניגוד לתנאים שהועסקו בעבר של 95% O216, אשר עלול להזיק לעובר בטווח הארוך. יתר על כן, ריכוז חמצן ידוע לשחק תפקיד קריטי בהתפתחות העוברית, כמו עובריות לאחר ההשתלה המוקדמת מתרחשת בתנאים היפוקסיים17. בהתאם לכך, התרבות המוצלחת של עוברים מאוחרים מחייבת אטמוספרה ראשונית של 5% O2, עם עלייה דינמית בריכוז החמצן ככל שהעובר גדל. למרבה הפלא, פולחן טרום/מוקדם gastrulating עוברים בתרבות סטטית ב 5% O2 באופן דרסטי הפחית את היעילות של התפתחות העובר הנכון לעומת 21% O2, והם לא יכלו להתפתח עוד E9.5. זה האחרון עשוי להיות מוסבר על ידי קצב איטי יותר של דיפוזיה תזונתית וחמצן דרך הרקמות העובריות בתרבות הסטטית בהשוואה לתרבות בבקבוקים מסתובבים 1,10.
יתר על כן, התוכן הגבוה של חולדה וסרום דם טבורי אנושי מספק תוצאות עקביות יותר לגידול עוברים מוקדמים לאחר ההשתלה מאשר מדיה בתוספת סרום חולדה בלבד13,18. חשוב לציין, הסרום המשמש לתרבות העובר צריך להיות מוכן מדם שחולץ טרי. למרות סרום עכברוש באיכות גבוהה לתרבות העוברים המלאים זמין מסחרית, סרום אנושי צריך להיות מבודד בתוך הבית. תוספי עם סרום דם טבורי אנושי ניתן להחליף על ידי סרום מבודד מדם מבוגר אנושי, אשר נגיש באופן נרחב ועדיין מספק צמיחה עוברית עקבית ויעילה.
פיתוח עובר מוצלח ויעיל לשעבר הרחם תלוי מאוד גם בבידוד עוברי מדויק. ראשית, הליך הניתוח צריך להתבצע בחיתוך בינוני מחומם ב 37 °C (50 °F), ואת העוברים המנותחים צריך להיות מועבר לתוך בקבוקי התרבות / צלחות בתוך 30 דקות. שנית, בידוד עוברי מדויק מההחלטה והסרת קרום הרייכרט מבלי לפגוע באפיבלסט הוא המפתח להשגת יעילות גבוהה של התפתחות העובר. שלישית, רק עוברים בשלב המתאים צריכים להיבחר לתרבות, שכן עוברים מוקדמים / מעוכבים לא יגדלו כראוי.
טיפול העוברים במהלך ההעברה הוא נקודה חיונית נוספת במהלך תרבות הרחם לשעבר , בעיקר לאחר התפתחות שק החלמון העוברי. עוברים צריכים להיות מועברים בזהירות כי נזק לכלי הדם שק חלמון גדול יכול להשפיע על התפתחות נכונה. בדרך כלל, ככל שתקופת תרבות העוברים ארוכה יותר, כך היעילות של התפתחות העוברים הרגילה נמוכה יותר, כלומר, עוברים המוסברים ב- E7.5 יתפתחו ביעילות גבוהה יותר מאלה שהוסברו ב- E6.5 או E5.5. יתר על כן, נוכחות של אנטיביוטיקה במדיום היא בסיסית כדי למנוע זיהום אם מיקרוסקופ ניתוח שהוקצה בתוך מכסה המנוע הביולוגי אינו זמין.
לא ניתן לשלול כי פלטפורמות, רמות לחץ או תנאים אחרים עשויים לאפשר תוצאות דומות או משופרות לתוצאות שהושגו עם הפרוטוקול הנוכחי. אופטימיזציה נוספת של התנאים המתוארים במחקר זה יש צורך להגיע ליעילות של התפתחות העובר שווה לזה שנצפה על ידי התפתחות תוך רחמית. יתר על כן, פיתוח עתידי של מדיום מוגדר ללא סרום יכול לעזור להגדיר את הדרישות המטבוליות והכימיות הספציפיות במהלך התפתחות העובר היונקים ולהפחית את השונות בסרום אצווה לאצווה. הצורך בשילוב מתמיד של חומרים מזינים וגזים לאחר E8.5 באמצעות תרבות הבקבוקים המסתובבים בהגדרות הנוכחיות מגביל את יכולות ההדמיה לטווח ארוך בשלבי organogenesis. פיתוח עתידי של מכשירי מיקרופלואידיקה המאפשרים תערובת גז וחומרים מזינים בתרבית סטטית בשילוב עם תצורות מיקרוסקופיה יכול לעזור להתגבר על אתגר זה.
עוברים מתורבתים לשעבר הרחם יכול להיות מניפולציה ניסיונית ונשמר בתרבות עד שלבים organogenesis מתקדמים מחוץ לרחם. הדגמנו בעבר את היכולת להציג הפרעות מגוונות בפיתוח עוברים, כגון מניפולציה גנטית על ידי אלקטרופורציה או זיהום lentiviral, הדמיה חיה, השתלת תאים, ומחקרים טרטוגניים13. בסופו של דבר, פלטפורמה זו עשויה לסייע בחשיפת מפרט גורל התאים ומנגנוני היווצרות האיברים ביונקים על ידי מתן אפשרות לניסויים בזמן אמת בעוברי עכבר חיים למשך עד שישה ימים של התפתחות מוקדמת לאחר ההשתלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
י.ח.ה. הוא יועץ לתעשיות ביולוגיות בע"מ והגיש בקשת פטנט המכסה את תנאי התרבות הרולר והסטטי המתוארים להלן (שהוגשו על ידי י.ח.ה. ומכון ויצמן למדע). מחברים אחרים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי פסקל ואילנה מנטוקס; מועצת המחקר האירופית (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); דיילת המועצה למחקר רפואי (FAMRI); הקרן הישראלית לחקר הסרטן (ICRF), BSF, מכון הלן ומרטין קימל לחקר תאי גזע, פרס הלן ומרטין קימל לחקירה חדשנית; הקרן הישראלית למדע (ISF), מינרבה, מכון שרמן לכימיה רפואית, מרכז נלה וליאון בנוזיו למחלות נוירולוגיות, מרכז משפחת דוד ופלה שפל לחקר הפרעות גנטיות, מכון משפחת קססט לגנטיקה רפואית, קרן המחקר לתאי גזע של ד"ר בית רום-רמר, קרנות אדמונד דה רוטשילד, קרן הצדקה זנטקר, אחוזת צביה זרוני.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm pore size filter (250 mL) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 µm pore size syringe PVDF filter | Millipore | SLGV033RS | |
| 8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| Bottle with adaptor cap for gas inlet | Arad Technologies | ||
| Bungs (Hole) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | Used to seal the bottles to the drum |
| Bungs (Solid) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | Used to seal the rotating drum |
| Culture bottles | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04 |
| D(+)-glucose Monohydrate | J.T. Baker | ||
| Diamond knife | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
| Digital Pressure Gauge | Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological industries | 02-020-1A | |
| Fetal Bovine Serum | Biological industries | 04-013-1A | |
| Gas regulation module | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | glutamine |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| Microsurgical forceps (Dumont #5, #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Pasteur pipettes (glass) | Hilgenberg | 3150102 | |
| Pasteur pipettes (plastic) | Alexred | SO P12201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biological industries | 03-031-1B | |
| Petri Dishes (60 mm and 100 mm) | Falcon | 351007/351029 | |
| Precision incubator system | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | BTC01 model with gas bubbler kit |
| Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| Rat whole embryo culture serum | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| Stereoscopic microscope equipped with heating plate | Nikon | SMZ18 | |
| Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration | Pic Solution | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
- New, D. A. Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan. Mechanisms of Development. 68 (1-2), 3-25 (1997).
- Huang, Q., et al.
- White, M. D., et al. Long-lived binding of Sox2 to DNA predicts cell fate in the four-cell mouse embryo. Cell. 165 (1), 75-87 (2016).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
- Nicholas, J. S., Rudnick, D. The development of rat embryos in tissue culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 20 (12), 656-658 (1934).
- New, D. A., Stein, K. F.
- Rivera-Pérez, J. A., Jones, V., Tam, P. P. L. Culture of whole mouse embryos at early postimplantation to organogenesis stages: developmental staging and methods. Methods in Enzymology. 476, 185-203 (2010).
- New, D. A. T., Coppola, P. T., Terry, S. Culture of explanted rat embryos in rotating tubes. Journal of Reproduction and Fertility. 35 (1), 135-138 (1973).
- Cockroft, D. L. A comparative and historical review of culture methods for vertebrates. International Journal of Developmental Biology. 41 (12), 127-137 (1997).
- Parameswaran, M., Tam, P. P. L. Regionalisation of cell fate and morphogenetic movement of the mesoderm during mouse gastrulation. Developmental Genetics. 17 (1), 16-28 (1995).
- Beddington, R. S. Induction of a second neural axis by the mouse node. Development. 120 (3), 613-620 (1994).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51969 (2014).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Isolation, culture and manipulation of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 149-193 (2014).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Development, Growth and Differentiation. 50 (6), 485-497 (2008).
- Mathieu, J., Ruohola-Baker, H. Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency. Development. 144 (4), 541-551 (2017).
- Sturm, K., Tam, P. P. L. Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives. Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).
