Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Ex Utero Kweek van muizenembryo's van pregastrulatie tot geavanceerde organogenese

Published: October 19, 2021 doi: 10.3791/63160
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Genetics, Weizmann Institute of Science

Summary

Een verbeterd platform voor de kweek van hele embryo's maakt een continue en robuuste ex utero-ontwikkeling van postimplantatiemuismyo's gedurende maximaal zes dagen mogelijk, van pregastrulatiestadia tot gevorderde organogenese. In dit protocol beschrijven we de standaardprocedure voor succesvolle embryokweek met behulp van statische platen en roterende flessystemen.

Abstract

Postimplantatie embryokweekmethoden van zoogdieren zijn over het algemeen inefficiënt en beperkt tot korte perioden na dissectie uit de baarmoeder. Er zijn onlangs platforms ontwikkeld voor zeer robuuste en langdurige ex utero-kweek van muizenembryo's vanaf ei-cilinderstadia tot gevorderde organogenese. Deze platforms maken een geschikte en getrouwe ontwikkeling van pregastruerende embryo's (E5.5) mogelijk tot het stadium van de vorming van de achterpoten (E11). Late gastrulatende embryo's (E7.5) worden in deze omgevingen gekweekt in roterende flessen, terwijl uitgebreide kweek uit pregastrulatiestadia (E5.5 of E6.5) een combinatie van statische en roterende flesculturen vereist. Bovendien zijn gevoelige regulatie van O2 - en CO2-concentratie , gasdruk, glucosespiegels en het gebruik van een specifiek ex utero kweekmedium van cruciaal belang voor een goede embryo-ontwikkeling. Hier wordt een gedetailleerd stap-voor-stap protocol voor uitgebreide ex utero muis embryokweek gegeven. Het vermogen om normale muizenembryo's ex utero te laten groeien van gastrulatie tot organogenese is een waardevol hulpmiddel voor het karakteriseren van het effect van verschillende experimentele verstoringen tijdens de embryonale ontwikkeling.

Introduction

Intra-uteriene ontwikkeling van het zoogdierembryo heeft de studie van de vroege stadia van postimplantatieontwikkeling beperkt1,2. De ontoegankelijkheid van het zich ontwikkelende embryo belemmert het begrip van belangrijke ontwikkelingsprocessen die plaatsvinden nadat het embryo zich in de baarmoeder heeft geïmplanteerd, zoals de vaststelling van het dierlijke lichaamsplan, specificatie van de kiemlagen of de vorming van weefsels en organen. Bovendien maakt de zeer kleine omvang van het vroege postimplanteerde embryo het moeilijk om te observeren door intravitale beeldvorming in utero vóór E103. Het onvermogen om levende embryo's in deze stadia te observeren en te manipuleren heeft de studie van vroege postimplantatie-embryogenese beperkt tot momentopnamen tijdens de ontwikkeling.

Protocollen voor in vitro kweek van pre-implantatie zoogdierembryo's zijn goed ingeburgerd, betrouwbaar en worden regelmatig gebruikt4. Niettemin hadden pogingen om ex utero-kweeksystemen op te zetten die in staat zijn een goede postimplantatie-embryogroei bij zoogdieren te ondersteunen, beperkt succes5. Al meer dan een eeuw wordt een verscheidenheid aan kweektechnieken voorgesteld, voornamelijk door het kweken van de embryo's in conventionele statische platen6,7,8 of roterende flessen (rolculturen)5,9,10. Deze platforms bleken nuttig bij het uitbreiden van de kennis over de ontwikkeling van zoogdieren na implantatie11,12, ondanks het feit dat ze zeer inefficiënt waren voor normale embryooverleving en beperkt waren tot korte perioden. De embryo's begonnen al 24-48 uur na kweekinitiatie ontwikkelingsachterstand en morfologische anomalieën te vertonen.

Deze studie geeft een gedetailleerde beschrijving voor het opzetten van het ex utero embryokweeksysteem dat een continue ontwikkeling mogelijk maakt van pregastrulatie tot gevorderde organogenesestadia gedurende maximaal zes dagen postimplantatieontwikkeling13. Dit artikel beschrijft het verbeterde rollerkweekprotocol dat de groei van E7.5-embryo's (neurale plaat en headfold-stage) ondersteunt tot het vormingsstadium van de achterpoten (~ E11) en de uitgebreide kweek van E5.5 / E6.5 door cultuur te combineren op statische platen en rolkweekplatforms.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de Animal Protection Guidelines van weizmann Institute of Science en goedgekeurd door het relevante Weizmann Institute IACUC (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). Gezonde zwangere vrouwen werd gevraagd om hun geïnformeerde toestemming te geven om bloed uit hun navelstreng te verzamelen, zoals goedgekeurd door het Rambam Medical Center Helsinki Committee (#RMB-0452-15). Gezonde volwassenen werd gevraagd om hun geïnformeerde toestemming om bloed te laten verzamelen volgens de richtlijnen van het Weizmann Institute of Science Helsinki Committee (# 1566-3).

1. Mediavoorbereiding

  1. Bereid het dissectiemedium met 500 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) zonder fenolrood en L-glutamine, aangevuld met 10% foetaal runderserum, 5 ml penicilline / streptomycine en filtersteriliseren met behulp van een filter van 0,22 μm.
    OPMERKING: Houd het dissectiemedium maximaal 1 maand op 4 °C.
  2. Bereid ex utero embryo kweekmedium (EUCM) elke dag vers in een biologische kap met behulp van 25% embryonaal medium plus 50% rattenserum en 25% humaan navelstrengbloedserum (HCS) of menselijk volwassen bloedserum (HBS).
  3. Om embryonaal medium te bereiden, voegt u 5 ml glutamine, 5 ml HEPES en 5 ml penicilline / streptomycine toe aan 500 ml DMEM zonder fenolrood en L-glutamine. Bereid 10-15 ml aliquots en bewaar ze bij 4 °C gedurende maximaal twee maanden.
    OPMERKING: Verdubbel de antibioticaconcentratie als u een besmetting ervaart.
  4. Inactiveer het rattenserum bij 56 °C gedurende 30-45 minuten en filtreer door een polyvinylideendifluoridefilter van 0,22 μm. Gebruik het serum voor kweek op dezelfde dag van inactivatie. Ontdooi HCS of HBS en gebruik het onmiddellijk voor experimenten.
    OPMERKING: Commercieel rattenserum geeft consistente resultaten (minimaal 4 partijen werden getest zonder duidelijke variatie). Als alternatief kan in eigen huis een hoogwaardig rattenserum worden verkregen, zoals eerder beschreven8,14. Als HCS niet beschikbaar is, vervang het dan door in eigen beheer ingezameld HBS. Rattenserum, HCS en HBS kunnen eenmaal worden ingevroren en op -20 °C worden bewaard voor gebruik op een andere dag. Ontdooi en combineer het opnieuw ingevroren serum met een groter volume vers ontdooide serum en vries het niet opnieuw in.

2. Inzameling van menselijk navelstrengbloedserum en menselijk volwassen bloedserum

  1. Om HCS te isoleren, verzamelt u navelstrengbloed van gezonde zwangere vrouwen op de dag van de geplande keizersnede.
    1. Klem de navelstreng dubbel op 5-7 cm van de navelstreng en transect tussen de klemmen onmiddellijk na de bevalling van het kind.
    2. Trek handmatig bloed af met behulp van een naald met een grote boring van 14 G en een spuit van 50 ml rechtstreeks uit de navelstrengader terwijl de placenta ter plaatse blijft om sporen van hemolyse te voorkomen.
      OPMERKING: Verzamel bloed nadat het kind uit het operatiegebied is verwijderd en navelstrengbloed is afgenomen voor klinische tests.
  2. Doseer het verzamelde bloed tot 5 ml procoagulant steriele reageerbuizen en breng ze onmiddellijk over naar 4 °C gedurende 15 minuten om volledige coagulatie mogelijk te maken. Centrifugeer de gecoaguleerde reageerbuizen bij 2.500 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  3. Gooi buisjes weg die tekenen van hemolyse vertonen (roze-rood serum). Verzamel het serum (geelkleur) met een pipet van 5 ml en filter het door een filter van 0,22 μm. Inactiveer het serum onmiddellijk in een waterbad van 56 °C gedurende 45 minuten.
  4. Bereid 1-1,5 ml aliquots van het geïnactiveerde serum en bewaar ze bij -80 °C gedurende maximaal zes maanden. Verzend indien nodig bij -70 °C met droogijs.
  5. Voor de afname van menselijk bloedserum voor volwassenen, bloed afnemen van gezonde volwassenen en onmiddellijk serum isoleren volgens hetzelfde protocol dat wordt beschreven voor navelstrengbloedserum. Bewaar het HBS als warmte-geïnactiveerde en gefilterde aliquots bij -80 °C gedurende maximaal zes maanden.
    OPMERKING: Humaan navelstrengserum en volwassen menselijk serum dat vers in eigen huis werd bereid, gaven superieure resultaten ten opzichte van in de handel verkrijgbaar serum. Verzamel HCS van gezonde vrouwen, ouder dan 18 jaar en jonger dan 40 jaar gepland voor een keizersnede. Sluit vrouwen uit die vaginaal zijn bevallen en vrouwen met een chronische ziekte of actieve medische aandoeningen, waaronder zwangerschapsdiabetes of hypertensie.

3. Ex utero roller kweek van embryo's van E7.5 tot E11

  1. Opzetten van de rollercultuur incubator en gasregelaar
    1. Kweek E7.5 of meer geavanceerde embryo's met behulp van het rollerkweekincubatorsysteem. Zet de rotator en de verwarmingseenheid gedurende ten minste 1 uur vóór de dissecties van het embryo bij 37 °C aan. Voeg geautoclaveerd water toe aan de gasinlaatfles en de uitlaattestbuis.
      OPMERKING: Plaats een thermometer naast de roterende trommel en controleer regelmatig de stabiliteit van de temperatuur in de incubator. Open de incubator zo snel mogelijk, omdat een langere openingstijd de temperatuur zal verhogen en de ontwikkeling van het embryo zal beïnvloeden. Voeg indien nodig meer geautoclaveerd water toe aan de gasinlaatfles en de uitlaattestbuis om ze tijdens het kweken tot een minimum van halve capaciteit te houden. Bescherm de embryo's in de incubator tegen licht door de incubator te bedekken met een doek.
    2. Schakel de gasregelaarmodule in door op de hoofdschakelaar te drukken en schakel vervolgens de zuurstof-/stikstof- en CO2-regelaars in (figuur 1A). Stel de zuurstof- en CO2-waarden in op 5% met behulp van de respectievelijke controllers. Open de gasregelaar en stel de gasdruk in op ~ 6,5-7 pond per vierkante inch (psi) door de spanningsschakelaar in de druktransmitter te verplaatsen (figuur 1B). Bevestig de gasdrukwaarde met behulp van een digitale manometer.
    3. Bewaak de gasstroom door de snelheid te controleren van de bellen die zijn gemaakt in de met water gevulde reageerbuis die is toegewezen in de precisie-incubator. Stel de juiste bellensnelheid in door de gasstroomklep op het deksel van de waterfles te sluiten/openen. Zorg ervoor dat de gasstroom de vorming van bellen mogelijk maakt met een snelheid van 2-4 bellen per seconde of stel de bellenstroom in op het eerste punt waar borrelen uitkomt op de met water gevulde uitlaatbuis.
    4. Vul de kweekflessen met 2 ml kweekmedium en sluit ze aan op de uitgeholde roterende trommel voor voorafgaande controle gedurende 1 uur. Gebruik de uitgeholde siliconen bungs om de flessen aan de trommel af te sluiten. Houd de lege ruimtes in de roterende trommel afgesloten met behulp van de massieve bungs.
      OPMERKING: De afwezigheid van bellen in de uitlaatbuis (er komt geen gas door het systeem) of een uitzonderlijk hoge gasstroom kan de ontwikkeling van het embryo beïnvloeden. In het geval van een gebrek aan bellenstroom naar de uitlaattestbuis, controleert u of alle siliconen bungs correct in de roterende trommel zijn geplaatst en het systeem afdichten, en controleert u of de waterfles goed is gesloten en alle slangen correct zijn aangesloten. Een gebrek aan bubbels die in de waterfles komen, kan wijzen op een storing in de gasregelaar.
  2. Dissectie van muizenembryo's van zwangere muizen
    1. Stel het dissectiemedium in een incubator vooraf in bij 37 °C en 5% CO2 gedurende minimaal 1 uur. Laat het deksel iets open om gasuitwisseling mogelijk te maken.
    2. Offer het zwangere vrouwtje op door cervicale dislocatie, reinig de buik van het vrouwtje met 70% ethanol en knip de huid en buikwand met een schaar. Lokaliseer het ene uiteinde van de baarmoeder en snijd op de kruising tussen de eierstok en de baarmoeder. Snijd vervolgens langs de baarmoeder tot het andere uiteinde en breng het over naar een petrischaaltje van 100 mm gevuld met dulbecco's fosfaatbuffered zoutoplossing (DPBS) op kamertemperatuur.
      OPMERKING: Het gebruik van niet-hormoongeprimeerde, natuurlijk gepaarde vrouwtjes wordt aanbevolen.
    3. Was de conceptussen snel in DPBS en snijd ze in paren om de behandeling van embryo's te vergemakkelijken. Verplaats alle paar conceptuses naar vooraf uitgebalanceerd dissectiemedium in een petrischaaltje van 60 mm en snijd ze in afzonderlijke conceptussen.
    4. Verwijder de baarmoederwand van de conceptuses door het baarmoederweefsel te scheuren met behulp van een grove tang. Gebruik een fijne microchirurgische tang om de punt van de peervormige decidua te snijden. Plaats de tang naast het embryo evenwijdig aan zijn lange as en open de tang om de decidua in tweeën te splitsen.
    5. Laat ten slotte de intacte ectoplacentale kegel aan de eicilinder vastzitten door het embryo uit de decidua te grijpen en de pariëtale dooierzak van het embryo af te pellen met een fijne tang.
      OPMERKING: Om te voorkomen dat het embryo wordt aangetast, voert u dissecties uit op een microscoop die is uitgerust met een verwarmingsplaat bij 37 °C binnen maximaal 30-40 minuten. Ontleed één nest embryo's tegelijk.
    6. Breng de embryo's onmiddellijk na de dissectie over op een nieuwe plaat gevuld met een gebalanceerd dissectiemedium met behulp van een glazen Pasteur-pipet om te voorkomen dat de embryo's aan het weefselafval blijven plakken.
    7. Selecteer die embryo's in het neurale plaat / vroege hoofdplooistadium die geen schade in de epiblast vertonen en breng 5-6 embryo's per fles over naar de vooraf uitgebalanceerde glazen kweekflessen.
      OPMERKING: Om de glazen Pasteur pipet te bereiden, snijdt u de opening van de pipet op een voldoende grootte om de embryo's te passen met behulp van een glassnijder en bewaart u deze in ethanol om besmetting te voorkomen. Was de glazen pipet met PBS voordat u embryo's terugbrengt. Wanneer u de embryo's overbrengt naar de kweekfles, moet u ervoor zorgen dat u zo min mogelijk volume van het dissectiemedium meeneemt om te voorkomen dat de EUCM verdunt.
    8. Plaats de flessen in het roterende kweeksysteem bij 37 °C, in een atmosfeer van 5% O2 en 5% CO2.
    9. Verwijder elke dag van de kweek de flessen één voor één uit de couveuse om de ontwikkeling van het embryo onder een stereomicroscoop te evalueren. Zorg ervoor dat u het lege gat in de trommel sluit met een stevige bung bij het verwijderen van een fles. Snijd de punt van een steriele plastic Pasteur-pipet op maat van het embryo en verplaats de embryo's naar een petrischaal om observatie te vergemakkelijken. Zorg ervoor dat de embryo's altijd bedekt zijn met medium.
      OPMERKING: Minimaliseer de tijd dat de embryo's zich buiten de couveuse bevinden om schadelijke effecten in de embryo's als gevolg van een afname van de lichaamstemperatuur te voorkomen. Behandel de embryo's zorgvuldig om scheuren van de bloedvaten van de dooierzak te voorkomen, wat de overleving van het embryo beïnvloedt.
    10. Breng op kweekdag 1 (equivalent aan E8.5) groepen van 3 embryo's over in een nieuwe fles met 2 ml verse en vooraf uitgebalanceerde EUCM met extra 3 mg / ml D-glucose en een gasmengsel van 13% O2, 5% CO2.
    11. Breng na 48 uur (equivalent aan E9,5) groepen van twee embryo's over in een nieuwe fles met vers voorverwarmde EUCM plus 3,5 mg/ml glucose in een gasatmosfeer van 18% O2 en 5% CO2.
    12. Verplaats bij 72 uur cultuur (equivalent aan E10,5) elk embryo naar een individuele fles met 1,5-2 ml vers medium aangevuld met 4 mg / ml glucose en een gastoevoer van 21% O2 en 5% CO2.
      OPMERKING: Embryo's bereiken hun maximale groei rond middernacht van kweekdag 4.
    13. Gebruik een fijne tang om de dooierzak en amnion te verwijderen en maak de navelstreng los voor een goede observatie van de embryomorfologie. Schakel de gasregelmodule en precisie-incubator uit.
      OPMERKING: Pre-inspecteur van het kweekmedium gedurende 1 uur door incubatie in een glazen fles in de rolkweek met een adequate gasatmosfeer volgens het embryostadium. Reinig de kweekflessen en alle incubatorglaswerk na elk gebruik door drie wasbeurten uit te voeren met stromend gedestilleerd water gevolgd door een nachtelijke wasbeurt ondergedompeld in 70% ethanol. Drie keer opnieuw wassen met stromend gedestilleerd water, de flessen een nacht laten drogen en steriliseren met een autoclaaf. Autoclaaf de siliconenpluggen ook regelmatig. Reinig alle dissectiegereedschappen grondig met 70% ethanol en steriliseer ze droog.

4. Uitgebreide embryokweek van E5.5/E6.5 tot E11

  1. Kweek pregastrulatie (E5.5) en vroege gastrulatie (E6.5) embryo's tot het vroege somietstadium (E8.5) in statische platen.
  2. Stel het dissectiemedium gedurende 1 uur vooraf uit in een incubator met 5% CO2 bij 37 °C.
    OPMERKING: Om gasuitwisseling mogelijk te maken, sluit u het deksel van de buis niet volledig.
  3. Bereid de kweekplaten door aan elke put 250 μL vers bereide EUCM toe te voegen. Plaats de platen in een CO2-incubator bij 37 °C voor voorafgaande controle.
    OPMERKING: Hoewel 8-well platen zeer geschikt zijn voor embryogroei, kan kweek in elke andere plaat worden gedaan door het volume van het medium aan te passen aan de grootte van de plaat.
  4. Ontleed eicilinderembryo's uit de baarmoeder volgens de techniek beschreven voor E7.5. Verwijder de pariëtale dooierzak van het embryo en laat de intacte ectoplacentale kegel aan de eicilinder bevestigd.
  5. Breng individuele embryo's terug in elke put van de 8-putplaat met behulp van een micropipette en plaats de plaat in de couveuse met 5% CO2 bij 37 °C.
  6. Stel de embryo's onder een stereomicroscoop voor en selecteer voor kweek alleen die met een goed gevormde vruchtwaterholte, zonder duidelijke schade en zonder het membraan van de Reichert.
    OPMERKING: Gebruik 20 μL pipetpunten om E5.5 embryo's over te brengen en 200 μL tips om E6.5 embryo's terug te brengen. In het geval van culturen vanaf E6.5 kan HCS worden vervangen door vers verzameld HBS.
  7. Verwijder de helft van het medium en voeg na 24 uur kweek 250 μL vers bereide voorverwarmde EUCM toe, zodat de embryo's altijd in het kweekmedium worden ondergedompeld. In het geval van culturen vanaf E5,5, verwijdert u na twee dagen kweek (equivalent aan E7,5) 200 μL en voegt u 250 μL nieuwe EUCM toe.
    OPMERKING: Tijdens statische kweek kunnen embryo's zich aan de plaat hechten (voornamelijk bij gebruik van plastic platen), wat de ontwikkeling van het embryo ernstig in gevaar zal brengen. Hechting van het embryo aan de plaat komt vaker voor op de eerste dag van het kweken van E5.5-embryo's. Om aanhechting te voorkomen, duwt u de embryo's voorzichtig weg van het plaatoppervlak met behulp van een fijne, steriele tang. Controleer of alleen de ectoplacentale kegel aan het oppervlak van de plaat blijft kleven.
  8. Breng de embryo's in het vroege somietstadium over in de rolkweek (4-7 somites; na drie dagen kweek voor embryo's geëxplanteerd in E5,5 en twee dagen voor culturen begonnen bij E6,5), volgens dezelfde indicaties die eerder zijn beschreven voor embryo's in het E8,5-stadium.
    OPMERKING: Het overbrengen van de embryo's naar de rollercultuur in somietstadia die anders zijn dan hierboven aangegeven, resulteert in het falen van de verdere ontwikkeling. In tegenstelling tot E7.5 ex utero-culturen is het mogelijk om de embryo's in een constante atmosfeer van 21% zuurstof en 5% CO2 te houden, wat een iets hogere efficiëntie van embryo-ontwikkeling oplevert dan atmosferen met dynamische zuurstofconcentratie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De beschreven rolkweekomstandigheden voor E7,5-embryo's (late gastrulatiefase) ondersteunen een constante en normale embryogroei met een gemiddelde efficiëntie van bijna 75% na 4 kweekdagen (figuur 2 en tabel 1). De efficiëntie van de embryo-ontwikkeling kan variëren tussen verschillende genetische achtergronden van muizen, maar is consistent robuust (figuur 2C). Suppletie met HBS in plaats van HCS levert een efficiëntie op van ~68% na 4 dagen ex utero cultuur, afhankelijk van de genetische achtergrond van de muizen (figuur 2D en tabel 2). De ex utero ontwikkelde embryo's recapituleren een goede ontwikkeling tot ongeveer het 44-somite stadium. Daarna vertonen de embryo's embryonale afwijkingen als gevolg van de afwezigheid van de allantoïsche placenta, wat resulteert in onvoldoende oxygenatie en voedingsstoffentoevoer gezien de toegenomen lichaamsgrootte in dit stadium.

De ontwikkeling van E6,5-embryo's (early-streak) in statische platen wordt correct samengevat met een efficiëntie van >90% tot het vroege somietstadium E8.5, met behulp van EUCM met zowel HCS als HBS (figuur 3, tabel 3 en tabel 4) (zie 8,13 voor een gedetailleerde beschrijving van embryostadiëring tussen E5.5 en E8.5). Ex uterocultuur van gastrulatie tot geavanceerde organogenese door het combineren van culturen op statische platen gevolgd door de rollercultuur in een constante zuurstofatmosfeer van 21% geeft een geschatte efficiëntie van een goede ontwikkeling van 55% en 26% tot het 44-somietstadium, met behulp van respectievelijk HCS en HBS (figuur 3A, tabel 3 en tabel 4). Er is een vertraging van 1-2 somietparen in deze embryo's in vergelijking met embryo's die in de baarmoeder zijn ontwikkeld. De grootste daling in efficiëntie treedt op bij de overgang van E8.5 naar E9.5 als gevolg van falen van axiale draaiing en sluiting van de neurale buis.

Culturen vanaf E5.5 pregastruerende embryo's vertonen een efficiëntie van de juiste ontwikkeling tot het vroege somite stadium (E8.5) van ongeveer 46%, en bijna 17% van de embryo's zal een goede ontwikkeling voltooien na zes dagen kweek na te zijn overgebracht naar de rollercultuur (figuur 4 en tabel 5). Uitgebreide ex utero-kweek verlengt de ontwikkelingsachterstand in de embryo's, waarbij embryo's die op E5.5 worden geëxplanteerd een vertraging van 2-4 paar somites vertonen in vergelijking met in vivo embryo's. Niettemin verlopen morfogenese en weefselontwikkeling goed tot ongeveer het 42-somietstadium.

De meest voorkomende defecten in de embryo's voor culturen geïnitieerd uit E7.5, E6.5 en E5.5 zijn geïllustreerd in figuur 5A-C. Op het moment van dissectie moeten embryo's met zelfs kleine schade aan de epiblast of het extra-embryonale gebied, evenals embryo's die het membraan van de Reichert behouden, worden weggegooid. Evenzo zullen vroege embryo's niet goed groeien (zie figuur 5B voor dode embryo's) of ernstige ontwikkelingsachterstanden vertonen (zie figuur 5B voor een vertraagd embryo). Aanhechting van de embryonale epiblast aan het oppervlak van de plaat zal de ontwikkeling beïnvloeden, afhankelijk van de positie en de mate van aanhechting. Aanhechting van een deel van de epiblast of het hele embryo zal het falen van de verdere ontwikkeling veroorzaken (zie figuur 5B voor een bijgevoegd embryo).

De belangrijkste afwijkingen die worden waargenomen in het percentage defecte embryo's in E8,5 (vroege somietfase) zijn de ontwikkeling van het achterste gebied buiten de dooierzak of defecten in de groei van de neurale plooien (figuur 5A,B). In het geval van culturen die zijn gestart bij E5.5, is een vaak waargenomen ontwikkelingsdefect de aanwezigheid van een kleine, onderontwikkelde epiblast (figuur 5C). Op het moment dat overeenkomt met E9.5, vertegenwoordigen defecten in de sluiting van de neurale plooien, falen van axiale draaiing of een tekort aan hersengroei de meest waargenomen afwijkingen (figuur 5). De meest waargenomen ontwikkelingsdefecten bij E10,5/E11 zijn afwijkingen in het hoofdgebied, verstoring van de normale bloedcirculatie in de dooierzak en pericardiale effusie (figuur 5). Scheuring van een hoofdbloedvat en bloeduitstroom kunnen de daaropvolgende dood van het embryo veroorzaken. Met name kan een goede groei van het embryo zelf worden bereikt, zelfs als er geen duidelijke dooierzakcirculatie is. Embryo's die in cultuur worden gehouden voorbij het stadium dat overeenkomt met E11 vertonen lichaamskrimp en sterven na enkele uren als gevolg van een gebrek aan goede weefseloxygenatie.

Figure 1
Figuur 1: Gas- en drukregelsysteem aangepast aan een rolkweekincubator. (A) Bovenaanzicht van de gasregelmodule die op de rolkweekincubator is aangesloten. N2 en CO2 komen in de gasregelaar om een nauwkeurige regeling van de zuurstof/CO2-concentraties en gasdruk mogelijk te maken. De gassen worden naar de mengkast geleid, waarin ze worden gemengd door een centrifugaalblower en in de incubator worden geïnjecteerd door een pomp die positieve druk genereert. Het gas stroomt door de inlaat in een waterfles en later naar de verzegelde flessen. (B) Interne configuratie van de elektronische module voor gas- en drukregeling. De spanningswaarde die op de druktransmitter is ingesteld, regelt de druk die wordt gegenereerd door de pomp in de gasmengbox (5-6 V om een druk van 6-7 psi te bereiken in dit specifieke model). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Ex utero kweekplatform ondersteunt de groei van E7.5 embryo's tot gevorderde organogenese. (A) Diagram met het E7.5 ex utero embryo kweekprotocol. (B) Representatieve beelden in het heldere veld van groepen gekweekte embryo's die zich gedurende 4 dagen ex utero ontwikkelen, van late gastrulatie (E7.5) tot het 44-somietstadium (E11). De typische variatie in somite aantal dat elke 24 uur wordt beoordeeld, is geïndiceerd. Schaalstaven = 500 μm. (C, D) Percentage normaal ontwikkelde embryo's na 1-4 dagen kweek vanaf E7,5 gedeeld door ouderstammen van muizen en serumsuppletie (C, menselijk navelstrengbloedserum; D, menselijk bloedserum voor volwassenen). Paneel A is gewijzigd van 13. Afkortingen: EUCM = ex utero embryo kweekmedium; HCS = menselijk navelstrengbloedserum; HBS = menselijk volwassen bloedserum. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3. Uitgebreid ex utero kweekprotocol voor het kweken van E6.5 vroeg-gastrulatende muizenembryo's tot late organogenese. (A) Schematische illustratie van het uitgebreide ex uterocultuurprotocol waarbij statische platen en roterende flessensystemen worden gecombineerd. (B) Helderveldopnamen van embryo's die ex utero zijn gekweekt gedurende vijf dagen van E6.5 tot het 44-somietstadium. De typische variatie in somite aantal dat elke 24 uur wordt beoordeeld, is geïndiceerd. Schaalbalken = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Continue ex utero kweek van pregastrulatiemuismyo's van E5.5 tot late organogenesestadia. (A) Schematische weergave van de ex uterocultuur het protocol voor E5.5 embryo's. B) Representatieve beelden in het heldere veld van embryo's die ex utero zijn gekweekt gedurende zes dagen van E5.5 tot het stadium van 42 somiet. De typische variatie in somite aantal dat elke 24 uur wordt beoordeeld, is geïndiceerd. Schaalbalken = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Representatieve ontwikkelingsstoornissen waargenomen bij ex utero gekweekte embryo's. (A-C) Bright-field microscopiebeelden van abnormale muizenembryo's die ex utero zijn gekweekt vanaf E7.5 (A), E6.5 (B) of E5.5 (C). Op elke afbeelding staat een algemene beschrijving van het defect. Schaalbalken = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Efficiëntie van een goede ontwikkeling van embryo's geïsoleerd op E7,5 dagen na coitum. De embryo's werden ex utero gedurende 4 dagen gekweekt in EUCM (25% Human Umbilical Cord Blood Serum). [-] geeft culturen aan die niet worden voortgezet vanwege experimentele vereisten. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Efficiëntie van de juiste ontwikkeling van embryo's geïsoleerd bij E7.5, gedurende 4 dagen ex utero gekweekt , waarbij menselijk navelstrengbloedserum wordt vervangen door vers geïsoleerd menselijk volwassen bloedserum. [-] geeft culturen aan die niet worden voortgezet vanwege experimentele vereisten. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Efficiëntie van de juiste ontwikkeling van embryo's (B6D2F1/ICR) geïsoleerd bij E6.5 en gedurende 5 dagen ex utero gekweekt met EUCM (25% Human Umbilical Cord Blood Serum). De ex utero-kweek werd gedurende twee dagen in statische cultuur gedaan (21% O2), gevolgd door drie dagen in roterende flessen bij 21% O2. [-] geeft culturen aan die niet worden voortgezet vanwege experimentele vereisten. Afkorting: NA = niet verworven. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4: Efficiëntie van de juiste ontwikkeling van embryo's (B6D2F1/ICR) geïsoleerd bij E6.5 en gedurende 5 dagen ex utero gekweekt met EUCM (ter vervanging van human umbilical cord blood serum door vers geïsoleerd menselijk volwassen bloedserum). De embryo's werden ontwikkeld in statische cultuur gedurende twee dagen (21% O2), gevolgd door drie dagen in roterende flessen bij 21% O2. [-] geeft culturen aan die niet worden voortgezet vanwege experimentele vereisten. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 5: Efficiëntie van de juiste ontwikkeling van embryo's (B6D2F1/ICR) geïsoleerd bij E5.5 en gedurende 6 dagen ex utero gekweekt met EUCM (25% Human Umbilical Cord Blood Serum). De embryo's werden ontwikkeld in statische cultuur gedurende drie dagen (21% O2) gevolgd door drie dagen in roterende flessen bij 21% O2. [-] geeft culturen aan die niet worden voortgezet vanwege experimentele vereisten. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het hierin gepresenteerde kweekprotocol kan een goede en continue ontwikkeling van muizenembryo ex utero gedurende maximaal zes dagen ondersteunen, van E5.5 tot E11. Voorheen konden embryo's in deze ontwikkelingsstadia zich normaal in cultuur slechts gedurende korte perioden (tot 48 uur) ontwikkelen15. De koppeling van de gasregelmodule aan de rolkweekincubator voor nauwkeurige controle van de zuurstofconcentratie en hyperbare gasdruk is van cruciaal belang voor de juiste muizenembryocultuur die hierin wordt beschreven. Het verhogen van de gasdruk tot 7 psi verbetert de zuurstofdiffusie, waardoor embryo-ontwikkeling tot E11 mogelijk is in een atmosfeer van maximaal 21% O2 / 5% CO2, in tegenstelling tot de eerder gebruikte omstandigheden van 95% O216, die op de lange termijn schadelijk kunnen zijn voor het embryo. Verder is bekend dat zuurstofconcentratie een cruciale rol speelt bij de embryonale ontwikkeling, aangezien vroege postimplantatie-embryogenese plaatsvindt onder hypoxische omstandigheden17. Dienovereenkomstig vereist de succesvolle kweek van laat-gastrulatende embryo's een initiële 5% O2-atmosfeer, met een dynamische toename van de zuurstofconcentratie naarmate het embryo groeit. Opmerkelijk is dat het kweken van pre/early-gastruating embryo's in statische kweek met 5% O2 de efficiëntie van een goede embryo-ontwikkeling drastisch verminderde in vergelijking met 21% O2, en ze konden zich niet verder ontwikkelen tot E9.5. Dit laatste kan worden verklaard door de langzamere snelheid van nutriënten- en zuurstofdiffusie door de embryonale weefsels in de statische cultuur in vergelijking met de cultuur in roterende flessen1,10.

Bovendien biedt het hoge gehalte aan bloedserum van ratten en menselijke navelstrengbloedserum consistentere resultaten voor het kweken van vroege postimplanteerde embryo's dan media aangevuld met alleen rattenserum13,18. Belangrijk is dat het serum dat wordt gebruikt voor embryocultuur moet worden bereid uit vers geëxtraheerd bloed. Hoewel hoogwaardig rattenserum voor hele embryocultuur in de handel verkrijgbaar is, moet menselijk serum in eigen huis worden geïsoleerd. Suppletie met menselijk navelstrengbloedserum kan worden vervangen door serum geïsoleerd uit menselijk volwassen bloed, dat breed toegankelijk is en nog steeds zorgt voor consistente en efficiënte embryogroei.

Een succesvolle en efficiënte embryo-ontwikkeling ex utero is ook sterk afhankelijk van nauwkeurige embryo-isolatie. Eerst moet de dissectieprocedure worden uitgevoerd in dissectiemedium dat is opgewarmd bij 37 °C en moeten de ontleedde embryo's binnen 30 minuten in de kweekflessen/-platen worden overgebracht. Ten tweede is nauwkeurige embryo-isolatie van de decidua en verwijdering van het membraan van de Reichert zonder de epiblast te beschadigen de sleutel tot het verkrijgen van een hoge efficiëntie van de embryo-ontwikkeling. Ten derde mogen alleen embryo's in het juiste stadium worden geselecteerd voor kweek, omdat vroege/vertraagde embryo's niet goed zullen groeien.

Het hanteren van de embryo's tijdens de terugplaatsing is een ander essentieel punt tijdens de ex utero-kweek , voornamelijk na de ontwikkeling van de embryonale dooierzak. Embryo's moeten zorgvuldig worden overgebracht omdat schade aan de bloedvaten van de dooierzak een goede ontwikkeling kan beïnvloeden. Over het algemeen geldt dat hoe langer de periode van embryocultuur, hoe lager de efficiëntie van de normale embryo-ontwikkeling, d.w.z. embryo's die op E7.5 worden geëxplanteerd, zich met een hogere efficiëntie zullen ontwikkelen dan die geëxplanteerd op E6.5 of E5.5. Bovendien is de aanwezigheid van antibiotica in het medium van fundamenteel belang om besmetting te voorkomen als een dissectiemicroscoop die in een biologische kap is toegewezen, niet beschikbaar is.

Het kan niet worden uitgesloten dat andere platforms, drukniveaus of omstandigheden vergelijkbare of verbeterde resultaten mogelijk maken als de resultaten die met het huidige protocol worden verkregen. Verdere optimalisatie van de in deze studie beschreven aandoeningen is nodig om een efficiëntie van embryo-ontwikkeling te bereiken die gelijk is aan die waargenomen door intra-uteriene ontwikkeling. Bovendien zou de toekomstige ontwikkeling van een gedefinieerd serumvrij medium kunnen helpen bij het definiëren van de specifieke metabole en chemische behoeften tijdens de ontwikkeling van embryo's bij zoogdieren en de batch-to-batch serumvariabiliteit verminderen. De behoefte aan constante menging van voedingsstoffen en gassen na E8.5 met behulp van de roterende flessencultuur in de huidige instellingen beperkt de beeldvormingsmogelijkheden op lange termijn tijdens organogenesestadia. Toekomstige ontwikkeling van microfluïdische apparaten die gas- en nutriëntenmengsels in statische cultuur mogelijk maken in combinatie met microscopie-opstellingen, kan deze uitdaging helpen overwinnen.

Embryo's die ex utero zijn gekweekt, kunnen experimenteel worden gemanipuleerd en in cultuur worden gehouden tot gevorderde organogenesestadia buiten de baarmoeder. We hebben eerder het vermogen aangetoond om diverse verstoringen te introduceren bij het ontwikkelen van embryo's, zoals genetische manipulatie door elektroporatie of lentivirale infectie, live beeldvorming, celtransplantatie en teratogene studies13. Uiteindelijk kan dit platform helpen bij het blootleggen van cellotspecificatie en orgaanvormingsmechanismen bij zoogdieren door real-time experimenten in levende muizenembryo's mogelijk te maken voor maximaal zes dagen van vroege postimplantatieontwikkeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

J.H.H. is adviseur van Biological Industries Ltd. en heeft een octrooiaanvraag ingediend met betrekking tot de hierin beschreven rol- en statische cultuuromstandigheden (ingediend door J.H.H. en het Weizmann Institute of Science). Andere auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door Pascal en Ilana Mantoux; Europese Onderzoeksraad (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Flight Attendant Medical Research Council (FAMRI); Israel Cancer Research Fund (ICRF) hoogleraarschap, BSF, Helen en Martin Kimmel Institute for Stem Cell Research, Helen en Martin Kimmel Award for Innovative Investigation; Israel Science Foundation (ISF), Minerva, het Sherman Institute for Medicinal Chemistry, Nella en Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, David and Fela Shapell Family Center for Genetic Disorders Research, Kekst Family Institute for Medical Genetics, Dr. Beth Rom-Rymer Stem Cell Research Fund, Edmond de Rothschild Foundations, Zantker Charitable Foundation, Estate of Zvia Zeroni.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm pore size filter (250 mL) JetBiofil FCA-206-250
0.22 µm pore size syringe PVDF filter Millipore SLGV033RS
8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat iBidi 80827/80826
Bottle with adaptor cap for gas inlet Arad Technologies
Bungs (Hole) B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering BTC 06 Used to seal the bottles to the drum
Bungs (Solid) B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering BTC 07 Used to seal the rotating drum
Culture bottles B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering BTC 03/BTC 04 Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04
D(+)-glucose Monohydrate J.T. Baker
Diamond knife Fine Science Tools 10100-30/45
Digital Pressure Gauge Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd BX-DPG80
DMEM GIBCO 11880
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Biological industries 02-020-1A
Fetal Bovine Serum Biological industries 04-013-1A
Gas regulation module Arad Technologies HannaLab1
Glutamax GIBCO 35050061 glutamine
Graefe forceps Fine Science Tools 11052-10
HEPES GIBCO 15630056
Microsurgical forceps (Dumont #5, #55) Fine Science Tools 11255-20
Pasteur pipettes (glass) Hilgenberg 3150102
Pasteur pipettes (plastic) Alexred SO P12201
Penicillin/Streptomycin Biological industries 03-031-1B
Petri Dishes (60 mm and 100 mm) Falcon 351007/351029
Precision incubator system B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering BTC01 BTC01 model with gas bubbler kit
Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL) Greiner Bio-One #456005
Rat whole embryo culture serum ENVIGO Bioproducts B-4520
Stereoscopic microscope equipped with heating plate Nikon SMZ18
Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration Pic Solution
Surgical scissors Fine Science Tools 14094-11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. New, D. A. Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).
  2. Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan. Mechanisms of Development. 68 (1-2), 3-25 (1997).
  3. Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
  4. White, M. D., et al. Long-lived binding of Sox2 to DNA predicts cell fate in the four-cell mouse embryo. Cell. 165 (1), 75-87 (2016).
  5. Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
  6. Nicholas, J. S., Rudnick, D. The development of rat embryos in tissue culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 20 (12), 656-658 (1934).
  7. New, D. A., Stein, K. F. Cultivation of mouse embryos in vitro. Nature. 199, 297-299 (1963).
  8. Rivera-Pérez, J. A., Jones, V., Tam, P. P. L. Culture of whole mouse embryos at early postimplantation to organogenesis stages: developmental staging and methods. Methods in Enzymology. 476, 185-203 (2010).
  9. New, D. A. T., Coppola, P. T., Terry, S. Culture of explanted rat embryos in rotating tubes. Journal of Reproduction and Fertility. 35 (1), 135-138 (1973).
  10. Cockroft, D. L. A comparative and historical review of culture methods for vertebrates. International Journal of Developmental Biology. 41 (12), 127-137 (1997).
  11. Parameswaran, M., Tam, P. P. L. Regionalisation of cell fate and morphogenetic movement of the mesoderm during mouse gastrulation. Developmental Genetics. 17 (1), 16-28 (1995).
  12. Beddington, R. S. Induction of a second neural axis by the mouse node. Development. 120 (3), 613-620 (1994).
  13. Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
  14. Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51969 (2014).
  15. Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Isolation, culture and manipulation of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 149-193 (2014).
  16. Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Development, Growth and Differentiation. 50 (6), 485-497 (2008).
  17. Mathieu, J., Ruohola-Baker, H. Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency. Development. 144 (4), 541-551 (2017).
  18. Sturm, K., Tam, P. P. L. Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives. Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).

Tags

Ontwikkelingsbiologie Nummer 176 Muizenembryo Ex Utero-cultuur Gastrulatie Organogenese Embryogenese Ontwikkeling van zoogdieren
<em>Ex Utero</em> Kweek van muizenembryo's van pregastrulatie tot geavanceerde organogenese
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aguilera-Castrejon, A., Hanna, J. H. … More

Aguilera-Castrejon, A., Hanna, J. H. Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis. J. Vis. Exp. (176), e63160, doi:10.3791/63160 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter