Summary
Een methode voor microdissectie van de eileider van de muis die het mogelijk maakt om de afzonderlijke segmenten te verzamelen met behoud van RNA-integriteit wordt gepresenteerd. Bovendien wordt een niet-enzymatische ovductale celdissociatieprocedure beschreven. De methoden zijn geschikt voor latere gen- en eiwitanalyse van de functioneel verschillende eileidersegmenten en gedissocieerde eileidercellen.
Abstract
Muismodelsystemen zijn ongeëvenaard voor de analyse van ziekteprocessen vanwege hun genetische manipuleerbaarheid en de lage kosten van experimentele behandelingen. Vanwege hun kleine lichaamsgrootte zijn sommige structuren, zoals de eileider met een diameter van 200-400 μm, echter relatief moeilijk te bestuderen gebleken, behalve door immunohistochemie. Onlangs hebben immunohistochemische studies complexere verschillen in eileidersegmenten blootgelegd dan eerder werd erkend; de eileider is dus verdeeld in vier functionele segmenten met verschillende verhoudingen van zeven verschillende epitheelceltypen. De verschillende embryologische oorsprong en verhoudingen van de epitheelceltypen maken de vier functionele regio's waarschijnlijk differentieel vatbaar voor ziekten. Voorloperlaesies van sereuze intra-epitheliale carcinomen ontstaan bijvoorbeeld uit het infundibulum in muismodellen en uit het overeenkomstige fimboriale gebied in de menselijke eileider. Het hier beschreven protocol beschrijft een methode voor microdissectie om de eileider zodanig te verdelen dat er voldoende hoeveelheid en zuiverheid van RNA ontstaat die nodig is voor downstream-analyse, zoals reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR) en RNA sequencing (RNAseq). Ook wordt een meestal niet-enzymatische weefseldissociatiemethode beschreven die geschikt is voor flowcytometrie of eencellige RNAseq-analyse van volledig gedifferentieerde eileidercellen. De beschreven methoden zullen verder onderzoek met behulp van de muizenne eileider op het gebied van voortplanting, vruchtbaarheid, kanker en immunologie vergemakkelijken.
Introduction
De eileider van de muriene lijn is qua functie en morfologie vergelijkbaar met de menselijke eileider1. Beide bestaan uit een pseudostraïstisch trilhaarepitheel, bestaande uit twee historisch beschreven epitheelbewonende cellen: trilhaarcellen en secretoire cellen1,2. De eileider heeft drie klassiek erkende segmenten: het infundibulum, de ampulla en de landengte. In een recente studie, Harwalkar et al. 3 onderzocht ovöcusmorfologie en genexpressie die leidden tot de uitbreiding van de categorisatie van residente epitheelcellen tot zeven verschillende populaties. Bovendien stelden ze de ampullaire-landengte-overgang vast als een apart segment van de eileider3. De hierin beschreven methode, die zich richt op het infundibulum, ampulla en landengte, kan gemakkelijk worden uitgebreid met de ampullaire-isthmische overgang2,3. Het infundibulaire gebied bevat het ostium, of de opening van de eileider, en omvat het fimbriale gebied en de proximale stengel. Als je naar de baarmoeder gaat, is de volgende het ampulla en dan de landengte. Trilhaarcellen zijn het meest prominent in het distale uiteinde van het gebied, proximaal aan de eierstok of infundibulum, terwijl secretoire cellen het meest prominent zijn in het proximale uiteinde of landengtesegment1. In tegenstelling tot de menselijke eileider is de eileider een opgerolde structuur die wordt ondersteund door de mesosalpinx, een uitbreiding van het brede ligament peritoneum1,4. Bovendien is de eileider van de muis ingepakt in een bursale zak die de kans op oöcytoverdracht in de eileider verhoogt4. De ampulla wordt geïdentificeerd als de locatie van bevruchting, van waaruit zich ontwikkelende embryo's in de landengte overgaan voordat ze de baarmoeder binnengaan5. Tubale segmenten hebben een diameter van 200-400 μm en de langere ampullen- en landengtegebieden zijn ongeveer 0,5-1,0 cm lang4. De eileider zwelt op tijdens de oestruscyclus en de ampulla en infundibulum zijn uitzetbaarder dan de landengte1.
Over proliferatie van cellen, vooral secretoire cellen, karakteriseren voorloperlaesies van sereuze tumoren in de bekkenholte6. Deze voorloper sereuze intra-epitheliale laesies ontstaan in het eileiderepitheel uitsluitend in het fimboriale gebied; het is onbekend waarom de vorming van laesies beperkt is tot dit gebied waar normaal gesproken het overheersende celtype wordt geciliteerd, niet secretoir2,7,8. De regionaliteit in termen van normale fysiologische functie, evenals verhoogde interesse in de eileideroorsprong van eierstokkanker9,10,11,12,13, onderstreept het belang van afzonderlijke evaluatie van de eileidersegmenten.
De hier beschreven methode beschrijft de verzameling van afzonderlijke eileidersegmenten voor daaropvolgende downstream-analyses van segmentspecifieke genexpressie en functie van gedissocieerde cellen. Traditioneel worden veel weefsels verwerkt voor hele RNA-extractie volgens de fenol: chloroform-methode of een volledige extractiemethode op de kolom; we vonden echter dat de RNA-kwaliteit behouden bleef terwijl er voldoende opbrengst werd geproduceerd met de beschreven combinatiemethode. Met behulp van deze methode kunnen zeer kleine functionele segmenten van de eileider worden verwerkt voor stroomafwaartse analyses in plaats van de eileider als geheel te onderzoeken, wat resultaten kan maskeren die representatief zijn voor de verschillende segmenten14.
Gedissocieerde muriene eileidercellen zijn zelden onderzocht door flowcytometrie, hoogstwaarschijnlijk vanwege de beperkende celopbrengst van dit weefsel. Een benadering om dit probleem te overwinnen was om cellen te dissociëren, ze in cultuur te laten groeien en vervolgens re-differentiatie in vitro te stimuleren om geschikte celnummers te verkrijgen voor downstream celanalyse15,16,17,18. Een beperking van deze benadering is de tijd ex vivo en veranderde micro-omgeving in cultuur, die beide waarschijnlijk de genexpressie veranderen. Er is ook een aanname dat morfologische redifferentiatie dezelfde transcriptionele en proteomische signatuur heeft als bij het intacte dier. De huidige dissociatiemethode is ontworpen om het hoogste aantal epitheelcellen in een heterogene eileidercelpopulatie te bereiken met behoud van eencellige differentiatie. Verder beperkt de meestal niet-enzymatische benadering waarschijnlijk het verlies van celoppervlakeiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierbehandeling en -procedures werden goedgekeurd door de University of California, Riverside institutional animal care and use committee en waren in overeenstemming met de richtlijnen van de American Association for Laboratory Animal Care, het Amerikaanse ministerie van Landbouw en de National Institutes of Health. De beschreven methode maakte gebruik van C57BL/6 volwassen, vrouwelijke muizen. Alle dieren werden geëuthanaseerd door onthoofding voorafgaand aan het oogsten van weefsel.
OPMERKING: Een overzicht van het protocol, dat een blauwe kleurstof gebruikt om te helpen bij efficiënte dissectie en ontkoppeling van de eileider, wordt weergegeven in de eerste figuur (figuur 1).
Figuur 1: Overzicht van de microdissectiemethode. (A) Linkerpaneel toont de intacte structuur waaruit het grootste deel van het ovariële vetkussen en restanten van bindweefsel rond de eileider zijn verwijderd. Hierna helpt de toevoeging van toluidineblauw de spoelen van de eileider (middelste paneel) te onderscheiden. Rechterpaneel toont structuren na het verwijderen van de eierstok. (B) Een ongecoileerde eileider met inwendige bochten om te bepalen waar elk segment begint en eindigt. (C) Cartoon van de gebruikte segmentatie (niet op schaal getekend). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
1. Voorbereiding van het dissectieoppervlak
- Bevestig met lijm een stuk tandwas op een petrischaaltje en laat het drogen (figuur 2A). Ontsmet het gerecht met 70% ethanol. Het oppervlak is klaar voor dissectie.
2. Macrodissectie van de eierstok, eileider en baarmoeder
- Immobiliseer de petrischaal met de tandwas op een koud platform naar keuze (bijvoorbeeld een ijspakking die vóór gebruik op -20 °C wordt gehouden) onder een dissectiemicroscoop wanneer deze klaar is voor dissectie (figuur 2A).
- Desinfecteer het ventrale oppervlak van het dier met 70% ethanol. Open de buik- en bekkenholte met een steriele dissectieschaar en verplaats het maagdarmkanaal naar één kant om de dorsale bihornale baarmoeder te lokaliseren. Volg elke baarmoederhoorn rostrally om elke eileider en eierstok te lokaliseren die zijn gehuld in het baarmoedervetkussen, net onder de nier (figuur 2B, C).
- Snijd beide laterale eileiders met de eierstokken en een deel van de distale baarmoederhoorn nog bevestigd met behulp van een dissectieschaar. Snijd elke laterale baarmoederhoorn af met ongeveer 1-2 cm van de hoorn nog bevestigd aan de opgerolde eileider en eierstok (figuur 2D). Dompel het weefsel onmiddellijk onder in 2 ml koud dissectiemedium (zie Materiaaltabel).
Figuur 2: Macrodissectie van de eierstok en de dissectie-opstelling. De eileider bevindt zich dorsaal in de bekkenholte aan de basis van de nier in het ovariële vetkussen (B). Lokaliseer de baarmoedersplitsing in de bekkenholte (C) en volg de laterale baarmoederhoorn om het baarmoeder-eileider-eierstokcontinuüm (B) te lokaliseren. Verwijder deze structuren door één baarmoederhoorn en grove dissectie door te snijden. Plaats op het ontleedplatform (A) en bevestig het baarmoedergedeelte met een naald (A en D) op tandwas. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
OPMERKING: Laat voldoende baarmoederhoorn intact en bevestigd aan de eileider om bevestiging aan het dissectieplatform mogelijk te maken (figuur 2D).
- Breng het baarmoederweefsel aan op de tandwas met een steriele naald van 25 G om weefsel vast te zetten voor dissectie (figuur 2A, D en figuur 3A). Werk onder de dissectiemicroscoop en reinig en ontleed het vetkussen en bindweefsel van de eierstokken om een duidelijke visualisatie van de eileider mogelijk te maken (figuur 3B).
Figuur 3: Stap voor stap eileider microdissectie. Na verwijdering van restvet en bindweefsel (A, B), voeg toluidineblauw toe aan het weefsel (C) en spoel vervolgens weg om visualisatie en daaropvolgende verwijdering van de eierstok en ontkoppeling van de buis (D-H) te vergemakkelijken. Het infundibulum is te vinden naast de proximale landengte en baarmoeder-tubale overgang (UTJ). Trek lichtjes aan het distale uiteinde tijdens het snijden bij de mesosalpinx om te ontkoppelen en onthul de endogene wendingen van de eileider (H) om te oriënteren voor de juiste segmentatie. Figuur A-C schaalbalk = 500 μm, D-H schaalbalk = 400 μm (I) Cartoon van de verschillende segmenten (niet getekend op schaal). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Gebruik een spuit van 1 ml, doseer en incubeer de eileider die op de baarmoeder is aangebracht in 1-2 druppels steriele 1% toluidineblauwe kleurstofoplossing gedurende 30 s-1 min. Spoel af met de fosfaatgebuufferde zoutoplossing (DPBS) van Dulbecco en verwijder alle vloeistof (figuur 3C).
- Trek de eierstok lichtjes uit de opgerolde eileider en snijd het bursale membraan en de brede ligament weg om de eierstok uit de eileider te verwijderen zonder het tubale weefsel in gevaar te brengen (figuur 3D, E).
OPMERKING: De eierstok is niet bevestigd aan de eileider, maar ingekapseld in het bursale membraan met de eileider (figuur 2D) en verbonden met de laterale kant van de baarmoeder via de brede ligament.
3. Microdissectie en segmentatie van de eileider
- Lokaliseer het distale, fimboriale uiteinde van de eileider die lateraal naar de baarmoeder-tubale overgang (UTJ) wordt gevonden. De eileider spoelt terug op zichzelf; vandaar dat het fimbriale uiteinde zich zijdelings naar het proximale uiteinde kan bevinden en een geschikt startpunt is om te oriënteren voor het loskoppelen van de eileider (figuur 3F,I).
- Terwijl u voorzichtig aan de buis trekt, snijdt u de mesosalpinx (figuur 3I) weg met een microschaar in veervorm om de eileider los te maken (figuur 3G).
- Eenmaal losgesneden, snijdt u de buis om de infundibulaire, ampullaire en istmische gebieden te produceren (figuur 3H).
- Na excisie van het infundibulum (fimbriaal uiteinde en proximale stengel), snijdt u het ampullaire gebied weg door te snijden na de tweede prominente draai van de buis (snede tussen bocht twee en drie, ongeveer 1 cm lang). Snijd ten slotte het resterende deel naar de UTJ, het istmische gebied (figuur 3H).
OPMERKING: De eileider zal niet volledig loskomen in een rechte structuur. De buis behoudt zijn draai (figuur 3H)3. Op basis van de volgende bochten na het ampullaire gebied kan men de resterende buis verder segmenteren in de ampullaire-isthmische overgang en de landengte3. Na ampulla-excisie, snijd tussen bocht vijf en zes om de ampullaire-isthmische overgang te verkrijgen; de resterende buis (draai zes naar het begin van de UTJ) is de landengte3.
- Na excisie van het infundibulum (fimbriaal uiteinde en proximale stengel), snijdt u het ampullaire gebied weg door te snijden na de tweede prominente draai van de buis (snede tussen bocht twee en drie, ongeveer 1 cm lang). Snijd ten slotte het resterende deel naar de UTJ, het istmische gebied (figuur 3H).
- Onmiddellijk vastgesneden weefselsegmenten in vloeibare stikstof voor RNA-isolatie of fixeren en verwerken elk segment voor georiënteerde inbedding en immunohistologische analyse.
- Voeg 200 μL koud RNA-extractiereagens en 1:1 homogenisatieparelmengsel (zie Materiaaltabel) toe aan het weefsel als u overgaat tot RNA-extractie (zie stap 5.1).
4. Eileiderdissociatie
- Vervolg van stap 3.1.1 hierboven) Voor een optimale dissociatie van het epitheel, spleet de eileider open in de gebieden waar mogelijk (d.w.z. infundibulum en ampulla) om het luminale epitheel bloot te leggen (figuur 4A).
Figuur 4: Eileiderceldissociatie, deel 1. Cartoon die laat zien hoe het distale epitheel te belichten voor optimale celdissociatie (A) en een afbeelding die de gemakkelijkste manier toont om het 1 mm2-gaas (B) te gebruiken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Beginnend bij het fimboriale gebied, met behulp van een tang als hefboom, snijdt u de buis in de lengterichting door met een veervormige schaar.
- Hak de opengespleet delen en de resterende eileider in segmenten (~ 1-2 mm groot) en voeg 5 ml warme, niet-enzymatische dissociatiebuffer toe (zie Tabel met materialen) en incubeer bij 37 °C.
- Resuspend de weefselstukken en gedissocieerde cellen met een bulb pipettor elke 3 minuten gedurende 9-10 minuten. Verdun de dissociatiebuffer 1:1 met koud dissectiemedium.
- Verzamel de cellen door centrifugeren (350 x g, 3 min, 4 °C). Resuspend de cellen in 2 ml RBC-lysisbuffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en verdun vervolgens 1:1 met koud dissectiemedium.
- Verzamel de cellen door centrifugering (350 x g, 3 min, 4 °C) en resuspend in 5 ml koude pronase-oplossing.
- Incubeer in pronase-verteringsmedium en resuspend de celklonten met een bolpipettor elke 3-5 min totdat een enkele celsuspensie is bereikt (~ 25-30 min).
OPMERKING: Deze stap kan het beste worden uitgevoerd in een weefselkweekplaat of -kolf om constante observatie mogelijk te maken en onnodige overmatige blootstelling aan pronase te voorkomen.
- Incubeer in pronase-verteringsmedium en resuspend de celklonten met een bolpipettor elke 3-5 min totdat een enkele celsuspensie is bereikt (~ 25-30 min).
- Leid de cellen door een steriel macrogaas (1 mm x 1 mm maassel dat met een elastiekje op een conische buis is aangebracht (figuur 4B)) om eventuele resterende niet-gesuscieerde weefselstukken te verwijderen. Verzamel de cellen door centrifugering (350 x g, 3 min, 4 °C) en resuspend in een koud medium dat geschikt is voor downstream-analyse (bijv. FACS-buffer als u doorgaat met kleuring voor flowcytometrie).
5. RNA-extractie van eileidersegmenten
- Homogeniseer vastgevroren monsters in 200 μL RNA-extractiereagens in een kralenvelblenderweefselhomogenisator op niveau 12 gedurende twee intervallen (elk 3 min) bij 4 °C met behulp van het roestvrijstalen kralenmengsel.
OPMERKING: Om de RNA-integriteit te behouden, moeten monsters onmiddellijk van de vastgevroren toestand naar RNA-extractiereagens worden verplaatst en niet worden gewogen. - Centrifugeer homogenaat bij 100-200 x g kort in een tafelcentrifuge gedurende ongeveer 5 s bij kamertemperatuur om de vloeistof van de kralen te scheiden. Breng het supernatant over in een verse buis.
- Voeg nog eens 200 μL RNA-extractiereagens toe aan de kralen om meer monsters te herstellen, gevolgd door centrifugering (100-200 x g, 5 s, kamertemperatuur). Combineer de supernatanten.
OPMERKING: Gebruik een kleine pipetpunt (de meeste p200-tips zijn geschikt) om te voorkomen dat de kraal wordt overgedragen bij het verwijderen van het supernatant. - Volg de richtlijnen van de fabrikant om RNA geleidelijk te scheiden en neer te slaan. Representatieve monsters werden 's nachts neergeslagen bij -20 °C met 100% isopropanol (ongeveer 2:1 volume, isopropanol: teruggewonnen waterige fase).
- Breng het volledige RNA-neerslag samen met de oplossing over naar een RNA-bindende spinkolom en centrifuge gedurende 30 s bij 9.500 x g. Zuiver het RNA op de kolom volgens de richtlijnen van de fabrikant en elueer het RNA vervolgens in 20 μL nucleasevrij water. Beoordeel de kwaliteit/kwantiteit op een microvolumespectrofotometer en/of bioanalysator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het beschreven dissociatieprotocol levert 100.000-120.000 cellen per muis op met pooling van beide eileiders. De methode is zacht genoeg om multi-ciliated celgrenzen intact te laten, waardoor een onderscheid mogelijk is tussen multi-ciliated cellen en secretoire cellen, en wordt gecontroleerd of de verteringsmethode zacht genoeg is om de-differentiatie te voorkomen. Representatieve immunofluorescentiebeelden in figuur 5 tonen kleincellige klonten na stap 4.2.1, gedurende 3 minuten gefixeerd in 4% paraformaldehyde (PFA)/DPBS, gewassen met 1% runderserumalbumine (BSA)/ Tris-gebufferde zoutoplossing-tween (BTBST) en gekleurd in suspensie. Kortom, cellen werden gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur gepermeabiliseerd in 0,5% TritonX-100 / BTBST, gewassen in BTBST, geblust voor achtergrondfluorescentie gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in 20 mM glycine / DPBS, gewassen in BTBST en vervolgens gedurende 1 uur geblokkeerd bij kamertemperatuur in 5% BSA / 0,1% TritonX-100 / TBST. Cellen werden vervolgens geïncubeerd in het primaire antilichaam bij 4 °C 's nachts in BTBST (muis anti-muis occludin (1:2000); konijn anti-muis geacetyleerde tubuline (1:1000)) gevolgd door verschillende wasbeurten in BTBST. Secundair antilichaam werd toegevoegd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in BTBST (geiten anti-muis IgG Alexa Fluor 555 (1:1000); geit anti-konijn IgG Alexa Fluor 488 (1:1000)), meerdere keren gewassen in BTBST, eenmaal in DPBS, en vervolgens geïncubeerd in nucleaire vlek gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (1:2000, Hoescht 33342) gevolgd door een wasbeurt in DPBS. Cellen werden geresuspendeerd in 80 μL antifade montagemedium en 's nachts in het donker achtergelaten voordat ze werden afgebeeld (figuur 5A). Figuur 5B toont cellen aan het einde van het dissociatieprotocol. In het hele protocol zijn levensvatbaarheidsbeoordelingen gemaakt en representatieve beelden zijn weergegeven in figuur 5B-D. Propidiumjodide werd toegevoegd bij 1:100 verdunning en cellen werden onmiddellijk waargenomen op een omgekeerde samengestelde fluorescentiemicroscoop (figuur 5C, rode vlek). Trilharen bleven intact in kleine celclusters (figuur 5A) en eencellige suspensies (figuur 5E), waarbij veel cellen nog steeds trilharen bleken te hebben (Suppl. Video 1).
Figuur 5: Eileiderceldissociatie, deel 2. Fluorescerende en fasecontrastbeelden van een celcluster positief voor occludin (rood), kernen (blauw) en geacetyleerde tubuline (groen). De ciliated apicale rand (groen in AI en AV) blijft intact gedurende het hele protocol en is bestand tegen verdere vertering tot afzonderlijke cellen (E). AI: samenvoegen, AII: rood kanaal, AIII: blauw kanaal, AIV: fasecontrast, AV: groen kanaal. Na een korte pronase incubatie zijn de meeste cellen enkelvoudig. Propidiumjodide (PI) kleuring vertoont ongeveer 93% levensvatbaarheid. (B) Helder veld, (C) rood kanaal PI positief, (D) samenvoegen. (E) inzet bij samenvoeging toont een intacte ciliated rand op een enkele gedissocieerde cel. Dergelijke cellen hadden actief kloppende trilharen (zie Suppl. Video 1). De beelden werden gemaakt met een omgekeerde samengestelde fluorescentiemicroscoop. Figuur AI-V schaalbalk = 20 μm, B-D schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het beschreven RNA-isolatieprotocol geeft voldoende opbrengst en zuiverheid die nodig is voor segmentale RT-qPCR en RNAseq. Uit de resultaten blijkt dat deze methode 800-1200 ng RNA per segment oplevert (figuur 6A), behalve voor niet-fundibulaire monsters waarbij pooling van twee dieren noodzakelijk kan zijn voor een passende opbrengst voor downstream-assays. De gepresenteerde resultaten voor infundibulum zijn samengevoegd van twee dieren, in totaal vier infundibulaire regio's (figuur 6). Dit protocol is succesvol in het bereiken van zuiver RNA, aanvankelijk geanalyseerd door microvolumespectrofotometer en verder door bioanalyzer (figuur 6B, C). Monsters hebben een absorptieverhouding van 260/280 nm tussen 1,8 en 2,0 (figuur 6B) die typerend is voor zuivere RNA-nucleotidesoorten19. Voor elk monster werden absorptieratio's (260/230 nm) genomen met een inclusiecriterium tussen 1 en 2,2, dat representatief is voor beperkte verontreiniging door isolatiereagentia (gegevens niet weergegeven)19. Bioanalyse van de monsters toonde een hoge integriteit van het RNA, met een beoordeeld RNA-integriteitsnummer (RIN) boven zeven (figuur 6C), geschikt voor downstream expressie- en sequencinganalyse20.
Figuur 6: Kwaliteitsbeoordeling van segmentaal RNA. Heel RNA werd beoordeeld op opbrengst (A) en kwaliteit (B,C) door microvolumespectrofotometer en bioanalysator. RIN: RNA-integriteitsnummer, zoals beoordeeld door de bioanalysator. Staven zijn de gemiddelde ± standaarddeviatie (SD), N = 12 monsters per segment uit twee afzonderlijke RNA-extracties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende video 1: Live cell imaging van kloppende trilharen op gedissocieerde cellen. Kloppende trilharen na pronase spijsvertering. Video's werden gemaakt op een omgekeerde samengestelde microscoop. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De drie segmenten van de eileider zijn histologisch, morfologisch en functioneel verschillend1,2,3. Het epitheel varieert sterk van het ene uiteinde van de eileider naar het andere. Trilhaarcellen domineren aan het fimbardale/infundibulaire uiteinde, terwijl secretoire cellen domineren in het istmische gebied1. Hoewel deze algemene gradiënt al enige tijd wordt erkend, heeft recent werk meer verschillen tussen de eileidersegmenten blootgelegd. Dus, terwijl trilhaarcellen minder frequent worden naar het proximale uiteinde van de buis, is er een scherpe daling van hun aantal (van ongeveer 60% naar 10% ciliatie) dat overgaat van de ampulla naar de ampullaire-isthmische overgang3. Verder zijn epitheelcelpopulaties in de proximale en distale segmenten afgeleid van ontwikkelingsonderscheidde afstammingslijnen1,2,3. Distale epitheelcellen van het infundibulum en ampulla dragen niet bij aan proximale epitheelcelpopulaties in de landengte, zoals blijkt uit het traceren van afstamming van epitheliale markers. Op embryonale dag 12,5 (E12,5) hebben eileiderepitheelcellen een duidelijke afstamming onafhankelijk van de proximale epitheelcelmarker PAX22. Deze ontdekkingen, naast de diverse celpopulatie tussen de verschillende segmenten, benadrukken verder de noodzaak om de segmenten onafhankelijk te onderzoeken. De beschreven methode beschrijft een stapsgewijs afwikkel- en segmentidentificatieprotocol volgens de drie historisch beschreven segmenten (infundibulum, ampulla en landengte). Vanwege de recente vaststelling van de ampullaire-isthmische overgang als definitief eileidersegment, werd prioriteit gegeven aan de identificatie en verzameling van de drie klassiek beschreven gebieden. De methode kan echter worden uitgebreid met een afzonderlijke verzameling van de ampullaire-isthmische overgang, zoals hierboven beschreven3.
Het gebruik van de blauwe kleurstof en de locatie van het infundibulum is een cruciale stap om de eileider op een snelle en efficiënte manier af te wikkelen. De blauwe kleurstof benadrukt het ostium en de spoelen van de buis, waardoor een snellere en efficiëntere ontroling en verzameling mogelijk is. De beginlocatie van het ostium oriënteert men op de distale (infundibulaire) en proximale (isthmische) gebieden van de eileider gedurende het uncoilen. Bovendien kan de chirurg het proximale baarmoederhoorngedeelte tijdens het losmaken op het dissectieplatform houden, beide handen gebruiken voor de delicate dissectiestappen. Eerste verwijdering van de opgerolde eileider en pogingen om deze structuur los te maken zonder de buis onbeweeglijk te maken of zonder het gebruik van de kleurstof kan gemakkelijk leiden tot verwarring over de distale en proximale uiteinden of breuk van de buis veroorzaken. Buisbreuk is gemakkelijk, dus voorzichtigheid moet worden betracht bij het loskoppelen, omdat breuk reproduceerbare segmentatie onhaalbaar maakt. Het gebruik van hoogwaardige, veervormige microschaar wordt ten zeerste aanbevolen om de beste resultaten te bereiken.
Het evalueren van de genexpressiesignatuur in de diverse segmenten van de eileider, bijvoorbeeld tijdens de oestruscyclus en in reactie op toegediende hormonen en cytokines, zal hoogstwaarschijnlijk een veel beter begrip opleveren van hoe de eileider verandert als reactie op deze stimuli. Deze gegevens kunnen ook licht werpen op welke factoren bijdragen aan epitheliale transformatie. Het RNA-extractieprotocol hierin is ontwikkeld om de hoogst mogelijke hoeveelheid en kwaliteit te verkrijgen voor dit weefsel van beperkte grootte en veerkrachtige tubale structuur. De beschreven homogenisatie, RNA-precipitatie en conjunctieel gebruik van het fenol: chloroform en on-column zuiveringsmethoden bleken het meest efficiënt te zijn in het bereiken van de juiste kwaliteit en kwantiteit van RNA voor downstream-analyse. De eileidersegmenten werden niet gewogen en hele segmenten werden onmiddellijk verwerkt voor weefselhomogenisatie om te voorkomen dat het weefsel opwarmt tot RNA-afbraak. Omdat de kleine buissegmenten meerdere homogenisatiestappen vereisen, is het bovendien van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de homogenisatie wordt uitgevoerd bij 4 °C om de integriteit van het monster te behouden. Omdat deze methode voldoende is om een geschikte opbrengst te produceren voor downstream-analyse, zou een toekomstige toepassing van deze techniek zijn om segmentale RNAseq uit te voeren, eerder niet gerapporteerd, wat sterk zou bijdragen aan ons begrip van de eileiderfysiologie.
Tijdens de ontwikkeling van het celdissociatieprotocol ontdekten we dat robuuste en/of lange enzymatische verteringen aantoonbaar verlies van trilharen veroorzaakten. We concentreerden ons daarom op de ontwikkeling en bereikten een methode die de celmorfologie bewaarde. Verbeteringen in de opbrengst van één cel, zoals hierin beschreven, zullen robuustere en onmiddellijke multiplexed analyses van de verschillende epitheliale en stromale celtypen door flowcytometrie mogelijk maken. Het gebruik van een niet-enzymatisch dissociatieprotocol gevolgd door een korte incubatie in pronase zal waarschijnlijk ook het behoud van celoppervlakantigenen verbeteren ten opzichte van dissociatiemethoden met behulp van lange of robuuste verteringsmethoden2,18. Single cell sequencing analyse vereist veel minder cellen in vergelijking met multiplexed flow cytometrie panelen2,21. Dus single cell sequencing van de drie beschreven segmenten van de eileider kan mogelijk zijn met het beschreven protocol.
Omdat de eileider niet over de gehele lengte kan worden gevijld, zou een mogelijke beperking van de huidige methode kunnen zijn dat cellen die het epitheel van de smallere landengte vormen, een verminderde blootstelling aan de dissociatiereagentia zouden hebben en daarom mogelijk niet in dezelfde verhouding als in vivo in de eindsuspensie aanwezig zijn.
Vanwege het oprollen van de eileider kan de oriëntatie voor immunohistochemische analyses van alle eiductale segmenten een uitdaging zijn3. De beschreven segmentdissectie gevolgd door georiënteerde inbedding van de eileidersegmenten maakt echter een uitgebreidere longitudinale en dwarsdoorsnede beeldanalyse mogelijk zonder dat de gehele intacte opgerolde buis serieel hoeft te worden doorsneden. Verder helpt de blauwe kleurstof die wordt gebruikt voor het losmaken, bij de juiste oriëntatie tijdens het insluiten van de kleine buissegmenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een DoD Breakthrough Award aan AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425). KCR werd gedeeltelijk ondersteund door intramurale beurzen: de Pease Cancer Pre-Doctoral Fellowship en de Mary Galvin Burden Pre-Doctoral Fellowship in Biomedical Sciences en University of California, Riverside, intramurale prijzen: de Graduate Council Fellowship Committee Dissertation Research Grant en de Graduate Division Dissertation Year Program Award. De auteurs bedanken Gillian M. Wright en Alyssa M. Kumari voor hulp bij het vroegtijdig oplossen van problemen met deze methode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB05 | Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized |
| 1.4 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB14B | Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized |
| 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS) | Gibco | 21600-010 | Cold, sterile |
| 25G needle | BD | 305122 | |
| 60 mm sterile petri dishes | Corning | 430166 | |
| 70 μm cell meshes | Fisherbrand | 22-636-548 | |
| Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit | Agilent 2100 Bioanalyzer | 5067-1513 | |
| Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | BBY24M | |
| Bioanlyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer | ||
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Cold plate/pack/surface of choice | N/A | N/A | Kept at -20 °C for dissection |
| Dental wax | Polysciences Inc. | 403 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12 | Corning | 10-090-CV | Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-015CV | |
| Fine point forceps of choice | N/A | N/A | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G712b | Immunocytochemical validation images |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21422 | Immunocytochemical validation images |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | Immunocytochemical validation images |
| Hepes | Sigma Aldrich | H-3784 | |
| Hoescht 33342 | Cell Signaling Technologies | 4082S | Immunocytochemical validation images |
| Inverted compound microscope | Keyence BZ-X700 | ||
| Mouse anti-mouse Occludin | Invitrogen | 33-1500 | Immunocytochemical validation images |
| Non-enzymatic dissociation buffer | N/A | 5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS | |
| Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm | Thomas Scientific | 1210U04 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P-6148 | Immunocytochemical validation images |
| Pen-Strep | MP Biomedicals | 10220-718 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technologies | 9071S | Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | Prepare pronase digestion medium: 0.15% pronase in DMEM/Ham's F12, sterile |
| Propidium Iodide | Roche | 11 348 639 001 | Viability validation images |
| Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin | Abcam | ab179484 | Immunocytochemical validation images |
| RBC lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74134 | Utilized for on-column purification in text |
| Spring form microdissection scissors | Roboz Surgical | RS-5610 | |
| Sterile 3 mL bulb pipettors | Globe Scientific | 137135 | |
| Toluidine blue | Alfa Aesar | J66015 | Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile |
| Tris-Buffered Saline-Tween (TBST) | N/A | N/A | Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20 |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Inc. | 3555 | Immunocytochemical validation images |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Invitrogen | 15596026 | Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines |
References
- Stewart, C. A., et al. Mouse oviduct developmemt in Mouse Development: From Oocyte to Stem Cells. Kubiak, J. Z., et al. , Springer. Berlin Heidelberg. 247-262 (2012).
- Ford, M. J., et al. Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis. Cell Reports. 36 (10), 109677 (2021).
- Harwalkar, K., et al. Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development. Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).
- Agduhr, E. Studies on the structure and development of the bursa ovarica and the tuba uterina in the mouse. Acta Zoologica. 8 (1), 1 (1927).
- Pulkkinen, M. O. Oviductal function is critical for very early human life. Annals of Medicine. 27 (3), 307-310 (1995).
- Kindelberger, D. W., et al. Intraepithelial carcinoma of the fimbria and pelvic serous carcinoma: Evidence for a causal relationship. American Journal of Surgical Pathology. 31 (2), 161-169 (2007).
- Ghosh, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. In vivo genetic cell lineage tracing reveals that oviductal secretory cells self-renew and give rise to ciliated cells. Development. 144 (17), 3031-3041 (2017).
- Lee, Y., et al. A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube. Journal of Pathology. 211 (1), 26-35 (2007).
- Kim, J., et al. High-grade serous ovarian cancer arises from fallopian tube in a mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3921-3926 (2012).
- Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).
- Sherman-Baust, C. A., et al. A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development. Journal of Pathology. 233 (3), 228-237 (2014).
- Zhai, Y. L., et al. High-grade serous carcinomas arise in the mouse oviduct via defects linked to the human disease. Journal of Pathology. 243 (1), 16-25 (2017).
- Karthikeyan, S., et al. Prolactin signaling drives tumorigenesis in human high grade serous ovarian cancer cells and in a spontaneous fallopian tube derived model. Cancer Letters. 433, 221-231 (2018).
- Shao, R., et al. Differences in prolactin receptor (PRLR) in mouse and human fallopian tubes: Evidence for multiple regulatory mechanisms controlling PRLR isoform expression in mice. Biology of Reproduction. 79 (4), 748-757 (2008).
- Alwosaibai, K., et al. PAX2 maintains the differentiation of mouse oviductal epithelium and inhibits the transition to a stem cell-like state. Oncotarget. 8 (44), 76881-76897 (2017).
- Peri, L. E., et al. A novel class of interstitial cells in the mouse and monkey female reproductive tracts. Biology of Reproduction. 92 (4), 102 (2015).
- Lõhmussaar, K., et al. Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids. Nature Communications. 11 (1), 2660 (2020).
- Chen, S., et al. An air-liquid interphase approach for modeling the early embryo-maternal contact zone. Scientific Reports. 7, 42298 (2017).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2565 (2010).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- McGlade, E. A., et al. Cell-type specific analysis of physiological action of estrogen in mouse oviducts. The FASEB Journal. 35 (5), 21563 (2021).
