Microdissection et dissociation de l’oviducte murin : identification de segment individuel et isolement unicellulaire

Summary

Une méthode de microdissection de l’oviducte de souris qui permet la collecte des segments individuels tout en maintenant l’intégrité de l’ARN est présentée. En outre, une procédure de dissociation des cellules oviductales non enzymatiques est décrite. Les méthodes sont appropriées pour l’analyse ultérieure des gènes et des protéines des segments oviductaux fonctionnellement différents et des cellules oviductales dissociées.

Abstract

Les systèmes de modèles murins sont inégalés pour l’analyse des processus pathologiques en raison de leur manipulabilité génétique et du faible coût des traitements expérimentaux. Cependant, en raison de leur petite taille corporelle, certaines structures, telles que l’oviducte d’un diamètre de 200 à 400 μm, se sont avérées relativement difficiles à étudier, sauf par immunohistochimie. Récemment, des études immunohistochimiques ont révélé des différences plus complexes dans les segments d’oviductes que ce qui était reconnu auparavant; ainsi, l’oviducte est divisé en quatre segments fonctionnels avec des rapports différents de sept types de cellules épithéliales distinctes. Les différentes origines embryologiques et les ratios des types de cellules épithéliales rendent probablement les quatre régions fonctionnelles différentiellement sensibles à la maladie. Par exemple, les lésions précurseurs des carcinomes intraépithéliaux séreux proviennent de l’infundibulum dans les modèles murins et de la région fimbriale correspondante dans la trompe de Fallope humaine. Le protocole décrit ici détaille une méthode de microdissection pour subdiviser l’oviducte de manière à produire une quantité et une pureté suffisantes d’ARN nécessaires à l’analyse en aval, telles que la TRANSCRIPTION inverse-PCR quantitative (RT-qPCR) et le séquençage de l’ARN (RNAseq). On décrit également une méthode de dissociation tissulaire principalement non enzymatique appropriée pour la cytométrie en flux ou l’analyse RNAseq unicellulaire de cellules oviductales entièrement différenciées. Les méthodes décrites faciliteront la poursuite des recherches utilisant l’oviducte murin dans le domaine de la reproduction, de la fertilité, du cancer et de l’immunologie.

Introduction

L’oviducte murin a une fonction et une morphologie similaires à celles de la trompe de Fallope ^humaine1. Les deux sont constitués d’un épithélium cilié pseudostratifié, composé de deux cellules résidentes épithéliales décrites historiquement: les cellules ciliées et les cellules sécrétoires1,2. L’oviducte a trois segments classiquement reconnus: l’infundibulum, l’ampoule et l’isthme. Dans une étude récente, Harwalkar et al. ³ a étudié la morphologie des oviductes et l’expression des gènes conduisant à l’expansion de la catégorisation des cellules épithéliales résidentes à sept populations distinctes. En outre, ils ont établi la jonction ampullaire-isthme comme un segment distinct de l’oviducte3. La méthode décrite ici, qui se concentre sur l’infundibulum, l’ampoule et l’isthme, pourrait facilement être étendue pour inclure également la jonction ampullaire-isthmique2,3. La région infundibulaire contient l’ostium, ou ouverture de l’oviducte, et comprend la région fimbriale ainsi que la tige proximale. En se déplaçant vers l’utérus, vient ensuite l’ampoule, puis l’isthme. Les cellules ciliées sont les plus importantes à l’extrémité distale de la région, proximales de l’ovaire ou infundibulum, tandis que les cellules sécrétoires sont plus importantes à l’extrémité proximale ou au segment de l’isthme1. Contrairement à la trompe de Fallope humaine, l’oviducte murin est une structure enroulée soutenue par le mésoalpinx, une extension du large ligament ^{péritoine1,4}. De plus, l’oviducte de souris est enfermé dans un sac de bourse qui augmente la probabilité de transfert d’ovocytes dans l’oviducte4. L’ampoule est identifiée comme le lieu de fécondation, à partir duquel les embryons en développement passent dans l’isthme avant d’entrer dans l’utérus5. Les segments tubaires ont un diamètre de 200 à 400 μm et les régions ampullaires et isthmes plus longues mesurent environ 0,5 à 1,0 cm ^{de longueur4}. Les distédes d’oviductes pendant le cycle œstral et l’ampoule et l’infundibulum sont plus dissemblables que l’isthme1.

La prolifération excessive des cellules, en particulier des cellules sécrétoires, caractérise les lésions précurseurs des tumeurs séreuses présentes dans la cavité ^pelvienne6. Ces lésions intraépithéliales séreuses précurseurs apparaissent dans l’épithélium de l’oviducte uniquement dans la région fimbriale; on ne sait pas pourquoi la formation de lésions est limitée à cette région où normalement le type de cellule prédominant est cilié, et non sécrétoire2,7,8. La régionalité en termes de fonction physiologique normale, ainsi que l’intérêt accru pour l’origine oviductale du cancer de l’ovaire9,10,11,12,13, soulignent l’importance d’une évaluation séparée des segments d’oviductes.

La méthode décrite ici détaille la collecte de segments oviductaux distincts pour des analyses ultérieures en aval de l’expression et de la fonction des gènes spécifiques à un segment des cellules dissociées. Traditionnellement, de nombreux tissus sont traités pour l’extraction de l’ARN entier en suivant soit la méthode du phénol: chloroforme ou une méthode d’extraction complète sur colonne; cependant, nous avons constaté que la qualité de l’ARN était maintenue tout en produisant un rendement suffisant avec la méthode de combinaison décrite. En utilisant cette méthode, de très petits segments fonctionnels de l’oviducte peuvent être traités pour des analyses en aval plutôt que d’étudier l’oviducte dans son ensemble, ce qui peut masquer des résultats représentatifs des différents ^segments14.

Les cellules oviductales murines dissociées ont rarement été étudiées par cytométrie en flux, probablement en raison de la limitation du rendement cellulaire de ce tissu. Une approche pour surmonter ce problème a été de dissocier les cellules, de les cultiver en culture, puis de stimuler la re-différenciation in vitro pour obtenir des nombres de cellules appropriés pour l’analyse cellulaire en aval15,16,17,18. Une limite à cette approche est le temps ex vivo et le microenvironnement altéré en culture, qui modifient probablement l’expression des gènes. On suppose également que la redifférection morphologique a la même signature transcriptionnelle et protéomique que celle présente chez l’animal intact. La méthode de dissociation actuelle a été conçue pour obtenir le plus grand nombre de cellules épithéliales dans une population de cellules oviductales hétérogènes tout en maintenant la différenciation unicellulaire. De plus, l’approche principalement non enzymatique limite probablement la perte de protéines de surface cellulaire.

Protocol

Toutes les manipulations et procédures de manipulation et d’utilisation des animaux ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Californie à Riverside et étaient conformes aux directives de l’American Association for Laboratory Animal Care, du département de l’Agriculture des États-Unis et des National Institutes of Health. La méthode décrite utilisait des souris femelles adultes C57BL/6. Tous les animaux ont été euthanasiés par décapitation avant la récolte des tissus.

REMARQUE: Un aperçu du protocole, qui utilise un colorant bleu pour aider à la dissection efficace et au débobinage de l’oviducte, est illustré dans la première figure (Figure 1).

Figure 1 : Vue d’ensemble de la méthode de microdissection. (A) Le panneau de gauche montre la structure intacte d’où la plupart des coussinets adipeux ovariens et des restes de tissu conjonctif entourant l’oviducte ont été retirés. Après cela, l’ajout de bleu de toluidine aide à distinguer les bobines de l’oviducte (panneau du milieu). Le panneau de droite montre les structures après l’ablation de l’ovaire. (B) Un oviducte non enroulé avec des tours internes pour déterminer où chaque segment commence et se termine. (C) Caricature de la segmentation utilisée (non dessinée à l’échelle). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Préparation de la surface de dissection

1. Apposez un morceau de cire dentaire sur une boîte de Petri avec de l’adhésif et laissez-le sécher (Figure 2A). Désinfectez le plat avec 70% d’éthanol. La surface est prête pour la dissection.

2. Macrodissection de l’ovaire, de l’oviducte et de l’utérus

1. Immobiliser la boîte de Petri contenant la cire dentaire sur une plate-forme froide de votre choix (p. ex., un sac de glace maintenu à -20 °C avant utilisation) sous un microscope à dissection lorsqu’elle est prête à être dissection (figure 2A).
2. Désinfectez la surface ventrale de l’animal avec de l’éthanol à 70%. Ouvrez la cavité abdominale et pelvienne avec des ciseaux de dissection stériles et déplacez le tractus gastro-intestinal d’un côté pour localiser l’utérus bihornal dorsal. Suivez chaque corne utérine rostralement pour localiser chaque oviducte et ovaire enveloppé dans le coussinet adipeux utérin, situé juste en dessous du rein (Figure 2B, C).
3. Excisez les deux oviductes latéraux avec les ovaires et une partie de la corne utérine distale encore attachée à l’aide de ciseaux à dissection. Couper chaque corne utérine latérale avec environ 1 à 2 cm de la corne encore attachée à l’oviducte enroulé et à l’ovaire (figure 2D). Immergez immédiatement le tissu dans 2 mL de milieu de dissection à froid (voir Tableau des matériaux).

Figure 2 : Macrodissection de l’ovaire et configuration de la dissection. L’oviducte est situé dorsalement dans la cavité pelvienne à la base du rein dans le coussinet adipeux ovarien (B). Localisez la bifurcation utérine dans la cavité pelvienne (C) et suivez la corne utérine latérale pour localiser le continuum utérus-oviducte-ovaire (B). Enlevez ces structures en coupant à travers une corne utérine et une dissection grossière. Placer sur la plate-forme de dissection (A) et apposer la partie utérine sur la cire dentaire avec une aiguille (A et D). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

REMARQUE: Laissez suffisamment de corne utérine intacte et attachée à l’oviducte pour permettre l’apposition sur la plate-forme de dissection (Figure 2D).

4. Apposez le tissu utérin à la cire dentaire à l’aide d’une aiguille stérile de 25 G pour fixer le tissu en vue de la dissection (figure 2A, D et figure 3A). En travaillant au microscope à dissection, nettoyez et disséquez le coussinet adipeux ovarien et le tissu conjonctif pour permettre une visualisation claire de l’oviducte (Figure 3B).

Figure 3 : Microdissection d’oviductes étape par étape. Après l’élimination des restes de graisse et de tissu conjonctif (A, B), ajoutez du bleu de toluidine au tissu (C), puis lavez-les pour faciliter la visualisation et le retrait ultérieur de l’ovaire et le débobinage du tube (D-H). L’infundibulum se trouve à côté de l’isthme proximal et de la jonction utérine-tubaire (UTJ). Tirez légèrement l’extrémité distale tout en coupant au mésoalpinx pour dérouler et révéler les tours endogènes de l’oviducte (H) pour s’orienter pour une segmentation appropriée. Figure Barre d’échelle A-C = 500 μm, barre d’échelle D-H = 400 μm (I) Dessin animé des différents segments (non dessiné à l’échelle). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5. À l’aide d’une seringue de 1 mL, distribuer et incuber l’oviducte fixé à l’utérus dans 1-2 gouttes de solution stérile de colorant bleu de toluidine à 1% pendant 30 s-1 min. Rincer à froid la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco et retirer tout le liquide (Figure 3C).
6. Tirez légèrement l’ovaire de l’oviducte enroulé et coupez la membrane de la bourse et le ligament large pour retirer l’ovaire de l’oviducte sans compromettre le tissu tubaire (Figure 3D, E).
   REMARQUE: L’ovaire n’est pas attaché à l’oviducte mais enfermé dans la membrane de la bourse avec l’oviducte (Figure 2D) et relié au côté latéral de l’utérus par le ligament large.

3. Microdissection et segmentation de l’oviducte

1. Localisez l’extrémité distale et fimbriale de l’oviducte située latéralement à la jonction utérine-tubaire (UTJ). L’oviducte s’enroule sur lui-même; par conséquent, l’extrémité fimbriale peut être située latéralement à l’extrémité proximale et constitue un point de départ approprié pour s’orienter pour le débobinage de l’oviducte (figure 3F,I).
   1. Tout en tirant doucement le tube, coupez le mésosalpinx (Figure 3I) avec des micro-ciseaux à ressort pour dérouler l’oviducte (Figure 3G).
2. Une fois déroulé, coupez le tube pour produire les régions infundibulaires, ampullaires et isthmiques (Figure 3H).
   1. Après excision de l’infundibulum (extrémité fimbriale et tige proximale), exciser la région ampullaire en coupant après le deuxième tour proéminent du tube (coupé entre les tours deux et trois, d’environ 1 cm de longueur). Enfin, coupez la partie restante dans l’UTJ, qui est la région isthmique (Figure 3H).
      REMARQUE: L’oviducte ne se déroulera pas complètement dans une structure droite. Le tube maintiendra ses virages (Figure 3H)³. Sur la base des virages suivant la région ampullaire, on peut segmenter davantage le tube restant dans la jonction ampullaire-isthmique et l’isthme3. Après l’excision de l’ampoule, couper entre les virages cinq et six pour obtenir la jonction ampullaire-isthmique; le tube restant (virage six jusqu’au début de l’UTJ) est l’isthme3.
3. Enclencher immédiatement les segments de tissu disséqués par congélation dans l’azote liquide pour l’isolement de l’ARN ou fixer et traiter chaque segment pour l’intégration orientée et l’analyse immunohistologique.
   1. Ajouter 200 μL de réactif d’extraction d’ARN à froid et un mélange de billes d’homogénéisation 1:1 (voir tableau des matériaux) au tissu si vous procédez à l’extraction d’ARN (voir l’étape 5.1).

4. Dissociation des oviductes

1. Suite de l’étape 3.1.1 ci-dessus) Pour une dissociation optimale de l’épithélium, ouvrir l’oviducte dans les zones où cela est possible (c.-à-d. infundibulum et ampoule) pour exposer l’épithélium luminal (figure 4A).

Figure 4 : Dissociation des cellules d’oviducte, partie 1. Dessin animé montrant comment exposer l’épithélium distal pour une dissociation cellulaire optimale (A) et une image montrant la façon la plus simple d’utiliser le maillage de 1 ^mm2 (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. En commençant par la région fimbriale, en utilisant des pinces comme levier, fendez le tube longitudinalement avec des ciseaux en forme de ressort.

2. Hacher les parties fendues et l’oviducte restant en segments (~1-2 mm) et ajouter 5 mL de tampon de dissociation chaud et non enzymatique (voir tableau des matériaux) et incuber à 37 °C.
   1. Ressuspendez les morceaux de tissu et les cellules dissociées avec un pipetteur à bulbe toutes les 3 minutes pendant 9 à 10 minutes. Diluer le tampon de dissociation 1:1 avec un milieu de dissection à froid.
3. Prélever les cellules par centrifugation (350 x g, 3 min, 4 °C). Remettre les cellules en suspension dans 2 mL de tampon de lyse RBC pendant 2 min à température ambiante, puis diluer 1:1 avec un milieu de dissection à froid.
4. Prélever les cellules par centrifugation (350 x g, 3 min, 4 °C) et remettre en suspension dans 5 mL de solution de pronase froide.
   1. Incuber dans un milieu de digestion de la pronase et remettre en suspension les amas cellulaires avec un pipetteur à bulbe toutes les 3-5 minutes jusqu’à ce qu’une suspension à une seule cellule soit obtenue (~ 25-30 min).
      REMARQUE: Cette étape est mieux effectuée dans une plaque de culture tissulaire ou une fiole pour permettre une observation constante empêchant une surexposition inutile à la pronase.
5. Passer les cellules à travers un macro-maillage stérile (maille de 1 mm x 1 mm fixée à un tube conique avec un élastique (figure 4B)) pour enlever les morceaux de tissu non dissociés restants. Prélever les cellules par centrifugation (350 x g, 3 min, 4 °C) et les remettre en suspension dans un milieu froid approprié pour l’analyse en aval (p. ex., tampon FACS si l’on procède à la coloration pour la cytométrie en flux).

5. Extraction de l’ARN des segments oviductaux

1. Homogénéiser des échantillons congelés instantanément dans 200 μL de réactif d’extraction d’ARN dans un homogénéisateur de tissu mélangeur de billes au niveau 12 pendant deux intervalles (3 min chacun) à 4 °C à l’aide du mélange de billes en acier inoxydable.
   REMARQUE: Pour préserver l’intégrité de l’ARN, les échantillons doivent être immédiatement déplacés de l’état surgelé dans le réactif d’extraction de l’ARN et non pesés.
2. Centrifuger brièvement l’homogénat à 100-200 x g dans une centrifugeuse de table pendant environ 5 s à température ambiante pour séparer le liquide des billes. Transférer le surnageant dans un tube frais.
3. Ajouter 200 μL supplémentaires de réactif d’extraction d’ARN aux billes pour récupérer plus d’échantillons, suivi d’une centrifugation (100-200 x g, 5 s, température ambiante). Combinez les surnageants.
   REMARQUE: Utilisez une petite pointe de pipette (la plupart des embouts p200 conviennent) pour éviter le transfert de billes lors du retrait du surnageant.
4. Suivez les directives du fabricant pour séparer et précipiter l’ARN. Des échantillons représentatifs ont été précipités pendant la nuit à -20 °C avec 100 % d’isopropanol (environ 2:1 volume, isopropanol : phase aqueuse récupérée).
5. Transférer le précipité d’ARN complet avec la solution dans une colonne de spin de liaison à l’ARN et centrifuger pendant 30 s à 9 500 x g. Purifier l’ARN sur colonne conformément aux directives du fabricant, puis éluer l’ARN dans 20 μL d’eau sans nucléase. Évaluer la qualité/quantité sur un spectrophotomètre à microvolume et/ou un bioanalyseur.

Representative Results

Le protocole de dissociation décrit donne 100 000 à 120 000 cellules par souris avec mise en commun des deux oviductes. La méthode est suffisamment douce pour laisser intactes les bordures cellulaires multi-ciliées, permettant une distinction entre les cellules multi-ciliées et les cellules sécrétoires, et vérifiant que la méthode de digestion est suffisamment douce pour empêcher la dédifférenciation. Les images représentatives de l’immunofluorescence de la figure 5 montrent des amas de petites cellules après l’étape 4.2.1, fixés pendant 3 min dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % / DPBS, lavés avec de l’albumine sérique bovine (BSA) / un préadolescent salin tamponné tris (BTBST) et colorés en suspension. Brièvement, les cellules ont été perméabilisées pendant 15 minutes à température ambiante dans 0,5% de TritonX-100 / BTBST, lavées dans BTBST, trempées pour la fluorescence de fond pendant 2 h à température ambiante dans 20 mM de glycine / DPBS, lavées dans BTBST, puis bloquées pendant 1 h à température ambiante dans 5% BSA / 0,1% TritonX-100 / TBST. Les cellules ont ensuite été incubées dans l’anticorps primaire à 4 °C pendant la nuit dans BTBST (occludine anti-souris (1:2000); tubuline acétylée anti-souris de lapin (1:1000)) suivie de plusieurs lavages dans BTBST. L’anticorps secondaire a été ajouté pendant 1 h à température ambiante dans BTBST (IgG Alexa Fluor 555 anti-souris de chèvre (1:1000); IgG Alexa Fluor 488 anti-lapin de chèvre (1:1000)), lavé plusieurs fois dans BTBST, une fois dans DPBS, puis incubé dans une tache nucléaire pendant 20 min à température ambiante (1:2000, Hoescht 33342) suivi d’un lavage dans DPBS. Les cellules ont été remises en suspension dans 80 μL de milieu de montage antifade et laissées pendant la nuit dans l’obscurité avant l’imagerie (figure 5A). La figure 5B montre des cellules à la fin du protocole de dissociation. Des évaluations de la viabilité ont été effectuées tout au long du protocole, et des images représentatives sont présentées à la figure 5B-D. L’iodure de propidium a été ajouté à une dilution de 1:100 et des cellules ont été immédiatement observées sur un microscope à fluorescence composée inversée (Figure 5C, tache rouge). Les cils sont restés intacts dans des grappes de petites cellules (figure 5A) et des suspensions unicellulaires (figure 5E), de nombreuses cellules ayant encore des cils battant (Suppl. Vidéo 1).

Figure 5 : Dissociation des cellules d’oviducte, partie 2. Images fluorescentes et à contraste de phase d’un groupe cellulaire positif pour l’occludine (rouge), les noyaux (bleu) et la tubuline acétylée (vert). La bordure apicale ciliée (verte dans AI et AV) reste intacte tout au long du protocole et résiste à une digestion ultérieure vers des cellules individuelles (E). AI: fusion, AII: canal rouge, AIII: canal bleu, AIV: contraste de phase, AV: canal vert. Après une brève incubation de la pronase, la majorité des cellules sont uniques. La coloration à l’iodure de propidium (IP) montre une viabilité d’environ 93%. (B) Champ lumineux, (C) canal rouge PI positif, (D) fusionner. (E) l’encart sur la fusion montre une bordure ciliée intacte sur une seule cellule dissociée. Ces cellules avaient des cils battant activement (voir Suppl. Vidéo 1). Les images ont été prises sur un microscope à fluorescence composée inversée. Figure Barre d’échelle AI-V = 20 μm, barre d’échelle B-D = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Le protocole d’isolement de l’ARN décrit donne un rendement et une pureté suffisants pour la RT-qPCR segmentaire et l’ARNiq. Les résultats montrent que cette méthode donne 800-1200 ng d’ARN par segment (figure 6A), sauf pour les échantillons infundibulaires où la mise en commun de deux animaux peut être nécessaire pour un rendement approprié pour les essais en aval. Les résultats présentés pour infundibulum sont regroupés à partir de deux animaux, totalisant quatre régions infundibulaires (figure 6). Ce protocole réussit à obtenir de l’ARN pur, initialement analysé par spectrophotomètre à microvolume et ensuite par bioanalyseur (Figure 6B,C). Les échantillons ont un rapport d’absorption de 260/280 nm compris entre 1,8 et 2,0 (figure 6B) typique des espèces de nucléotides d’ARN ^pur19. Des rapports d’absorption (260/230 nm) ont été prélevés pour chaque échantillon avec un critère d’inclusion compris entre 1 et 2,2, représentatif d’une contamination limitée par les réactifs d’isolement (données non présentées)¹⁹. La bioanalyse des échantillons a montré une grande intégrité de l’ARN, avec un nombre évalué d’intégrité de l’ARN (RIN) supérieur à sept (Figure 6C), approprié pour l’analyse de l’expression et du séquençage en ^aval20.

Figure 6 : Évaluation de la qualité de l’ARN segmentaire. L’ARN entier a été évalué pour le rendement (A) et la qualité (B,C) par spectrophotomètre à microvolume et bioanalyseur. RIN : Nombre d’intégrité de l’ARN, tel qu’évalué par le bioanalyseur. Les barres sont la moyenne ±'écart-type (ET), N = 12 échantillons par segment provenant de deux extractions d’ARN distinctes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo supplémentaire 1: Imagerie cellulaire en direct des cils battus sur des cellules dissociées. Battre les cils après la digestion de la pronase. Les vidéos ont été prises sur un microscope composé inversé. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Discussion

Les trois segments de l’oviducte sont histologiquement, morphologiquement et fonctionnellement ^{distincts1,2,3}. L’épithélium varie considérablement d’une extrémité de l’oviducte à l’autre. Les cellules ciliées dominent à l’extrémité fimbriale/infundibulaire, tandis que les cellules sécrétoires dominent dans la région isthmique1. Bien que ce gradient global soit reconnu depuis un certain temps, des travaux récents ont révélé davantage de distinctions entre les segments oviductaux. Ainsi, alors que les cellules ciliées deviennent moins fréquentes vers l’extrémité proximale du tube, il y a une forte baisse de leur nombre (d’environ 60% à 10% de ciliation) passant de l’ampoule à la jonction ampullaire-isthmique3. De plus, les populations de cellules épithéliales dans les segments proximal et distal sont dérivées de lignées distinctes sur le plan du ^{développement1,2,3}. Les cellules épithéliales distales de l’infundibulum et de l’ampoule ne contribuent pas aux populations de cellules épithéliales proximales dans l’isthme, comme le montre le traçage de la lignée des marqueurs épithéliaux. Au jour embryonnaire 12,5 (E12,5), les cellules épithéliales oviductales ont une lignée distincte indépendante du marqueur cellulaire épithélial proximal, ^PAX22. Ces découvertes, en plus de la diversité de la population cellulaire entre les différents segments, soulignent davantage la nécessité d’étudier les segments de manière indépendante. La méthode décrite détaille un protocole de déroulement étape par étape et d’identification des segments selon les trois segments historiquement décrits (infundibulum, ampoule et isthme). En raison de l’établissement récent de la jonction ampullaire-isthmique en tant que segment d’oviducte définitif, la priorité a été donnée à l’identification et à la collecte des trois zones décrites classiquement. Cependant, la méthode peut être étendue pour inclure une collection séparée de la jonction ampullaire-isthmique, comme décrit ci-dessus3.

L’utilisation du colorant bleu et l’emplacement de l’infundibulum est une étape essentielle pour dérouler l’oviducte de manière rapide et efficace. Le colorant bleu met en valeur l’ostium et les bobines du tube, permettant un désenroulage et une collecte plus rapides et plus efficaces. L’emplacement initial de l’ostium oriente vers les zones distales (infundibulaires) et proximales (isthmiques) de l’oviducte tout au long du débobinage. De plus, garder la partie proximale de la corne utérine fixée à la plate-forme de dissection pendant le débobinage permet au chirurgien d’utiliser les deux mains pour les étapes de dissection délicates. L’élimination initiale de l’oviducte enroulé et les tentatives de débobinage de cette structure sans rendre le tube immobile ou sans l’utilisation du colorant peuvent facilement entraîner une confusion concernant les extrémités distales et proximales ou provoquer une rupture du tube. La rupture du tube est facile, il faut donc faire preuve de prudence lors du débobinage, car la rupture rendra la segmentation reproductible irréalisable. L’utilisation de micro-ciseaux de haute qualité en forme de ressort est fortement recommandée pour obtenir les meilleurs résultats.

L’évaluation de la signature d’expression génique dans les divers segments de l’oviducte, par exemple, pendant le cycle œstral et en réponse aux hormones et cytokines administrées, permettra très probablement de mieux comprendre comment l’oviducte change en réponse à ces stimuli. Ces données peuvent également faire la lumière sur les facteurs qui contribuent à la transformation épithéliale. Le protocole d’extraction de l’ARN a été développé ici pour obtenir la plus grande quantité et la plus haute qualité possible pour ce tissu de taille limitée et de structure tubaire résiliente. L’homogénéisation décrite, la précipitation de l’ARN et l’utilisation conjointe du phénol : les méthodes de purification du chloroforme et sur colonne se sont avérées les plus efficaces pour obtenir une qualité et une quantité appropriées d’ARN pour l’analyse en aval. Les segments oviductaux n’ont pas été pesés et des segments entiers ont été immédiatement traités pour l’homogénéisation des tissus afin d’empêcher tout réchauffement du tissu conduisant à la dégradation de l’ARN. De plus, étant donné que les petits segments tubaires nécessitent plusieurs étapes d’homogénéisation, il est essentiel de s’assurer que l’homogénéisation est effectuée à 4 °C pour préserver l’intégrité de l’échantillon. Étant donné que cette méthode est suffisante pour produire un rendement approprié pour l’analyse en aval, une application future de cette technique serait d’effectuer des ARNisses segmentaires, non rapportés auparavant, ce qui contribuerait grandement à notre compréhension de la physiologie des oviductes.

Au cours du développement du protocole de dissociation cellulaire, nous avons constaté que des digestions enzymatiques robustes et / ou longues provoquaient une perte démontrable de cils. Nous nous sommes donc concentrés sur le développement et avons obtenu une méthode qui préserve la morphologie cellulaire. L’amélioration du rendement cellulaire unique, telle que décrite ici, permettra des analyses multiplexées plus robustes et immédiates des différents types de cellules épithéliales et stromales par cytométrie en flux. L’utilisation d’un protocole de dissociation non enzymatique suivi d’une courte incubation dans la pronase est également susceptible d’améliorer la préservation des antigènes de surface cellulaire par rapport aux méthodes de dissociation utilisant des méthodes de digestion longues ou ^robustes2,18. L’analyse du séquençage unicellulaire nécessite beaucoup moins de cellules que les panels de cytométrie en flux ^{multiplexés2,21}. Ainsi, le séquençage unicellulaire des trois segments décrits de l’oviducte peut être possible avec le protocole décrit.

Étant donné que l’oviducte ne peut pas être fileté sur toute sa longueur, une limitation potentielle de la méthode actuelle pourrait être que les cellules formant l’épithélium de l’isthme plus étroit auraient réduit l’exposition aux réactifs de dissociation et, par conséquent, pourraient ne pas être présentes dans la suspension finale dans la même proportion qu’in vivo.

En raison de l’enroulement de l’oviducte, l’orientation pour les analyses immunohistochimiques de tous les segments oviductaux peut être ^difficile3. Cependant, la dissection de segment décrite suivie d’une intégration orientée des segments oviductaux permet une analyse d’image longitudinale et transversale plus complète sans avoir à sectionner en série l’ensemble du tube enroulé intact. De plus, le colorant bleu utilisé pour le débobinage aide à l’orientation correcte lors de l’encastrement des petits segments tubaires.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mm Stainless steel bead mix	Next Advance	SSB05	Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized
1.4 mm Stainless steel bead mix	Next Advance	SSB14B	Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS)	Gibco	21600-010	Cold, sterile
25G needle	BD	305122
60 mm sterile petri dishes	Corning	430166
70 μm cell meshes	Fisherbrand	22-636-548
Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit	Agilent 2100 Bioanalyzer	5067-1513
Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	BBY24M
Bioanlyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906
Cold plate/pack/surface of choice	N/A	N/A	Kept at -20 °C for dissection
Dental wax	Polysciences Inc.	403
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12	Corning	10-090-CV	Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep
Fetal Bovine Serum	Corning	35-015CV
Fine point forceps of choice	N/A	N/A
Glycine	Sigma Aldrich	G712b	Immunocytochemical validation images
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21422	Immunocytochemical validation images
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001	Immunocytochemical validation images
Hepes	Sigma Aldrich	H-3784
Hoescht 33342	Cell Signaling Technologies	4082S	Immunocytochemical validation images
Inverted compound microscope	Keyence BZ-X700
Mouse anti-mouse Occludin	Invitrogen	33-1500	Immunocytochemical validation images
Non-enzymatic dissociation buffer	N/A		5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS
Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm	Thomas Scientific	1210U04
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P-6148	Immunocytochemical validation images
Pen-Strep	MP Biomedicals	10220-718
Prolong Gold Antifade Reagent	Cell Signaling Technologies	9071S	Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium
Pronase	Sigma Aldrich	10165921001	Prepare pronase digestion medium: 0.15% pronase in DMEM/Ham's F12, sterile
Propidium Iodide	Roche	11 348 639 001	Viability validation images
Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin	Abcam	ab179484	Immunocytochemical validation images
RBC lysis buffer	BD Biosciences	555899
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74134	Utilized for on-column purification in text
Spring form microdissection scissors	Roboz Surgical	RS-5610
Sterile 3 mL bulb pipettors	Globe Scientific	137135
Toluidine blue	Alfa Aesar	J66015	Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile
Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)	N/A	N/A	Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20
Triton-X-100	Mallinckrodt Inc.	3555	Immunocytochemical validation images
Trizol RNA Extraction Reagent	Invitrogen	15596026	Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines