Summary
RNA完全性を維持しながら個々のセグメントの収集を可能にするマウス卵管の微小解剖のための方法が提示される。加えて、非酵素的卵管細胞解離手順が記載されている。この方法は、機能的に異なる卵管セグメントおよび解離した卵管細胞のその後の遺伝子およびタンパク質分析に適している。
Abstract
マウスモデルシステムは、その遺伝的操作性と実験的治療の低コストのために、疾患プロセスの分析には比類のないものです。しかし、その小さな体の大きさのために、直径200〜400μmの卵管のようないくつかの構造は、免疫組織化学によってを除いて研究することが比較的困難であることが証明されている。最近、免疫組織化学的研究は、以前に認識されていたよりも卵管セグメントのより複雑な違いを明らかにした。したがって、卵管は、7つの異なる上皮細胞型の異なる比率を有する4つの機能セグメントに分割される。上皮細胞型の異なる発生学的起源および比率は、4つの機能領域を疾患に対して差次的に感受性にする可能性が高い。例えば、漿液性上皮内癌の前駆体病変は、マウスモデルにおける眼底内およびヒト卵管内の対応するフィンブリア領域から生じる。ここで説明するプロトコルは、逆転写定量PCR(RT-qPCR)やRNAシーケンシング(RNAseq)などの下流分析に必要な十分な量と純度のRNAを得られるような方法で卵管を細分化するマイクロダイセクションの方法を詳述しています。また、完全に分化した卵管細胞のフローサイトメトリーまたは単一細胞RNAseq分析に適した、ほとんどが非酵素的な組織解離法も記載されている。記載された方法は、生殖、生殖能力、癌、および免疫学の分野におけるマウス卵管を利用するさらなる研究を容易にするであろう。
Introduction
マウスの卵管は、機能と形態が人間の卵管と似ています1。どちらも擬似層状繊毛上皮からなり、歴史的に記述された2つの上皮常駐細胞、繊毛細胞と分泌細胞からなる1,2。卵管には、古典的に認識された3つのセグメント、すなわち眼底、アンプラ、地峡があります。最近の研究では、Harwalkarらが3は、卵管形態および遺伝子発現を調査し、常在上皮細胞の分類を7つの異なる集団に拡大させた。さらに、彼らは卵管の別個のセグメントとしてアンプラリー - 地峡接合部を確立した3。眼底内、アンプラ、および地峡に焦点を当てた本明細書に記載の方法は、アンプラ - 地峡接合部も含むように容易に拡張することができた2,3。眼底領域は、オスチウム、または卵管の開口部を含み、フィンブリア領域ならびに近位茎を含む。子宮に向かって移動すると、次はアンプラ、次に地峡です。繊毛化細胞は、卵巣または眼底の近位にある領域の遠位端で最も顕著であり、一方、分泌細胞は近位端または地峡セグメントで最も顕著である1。ヒトの卵管とは異なり、マウス卵管は、広い靭帯腹膜の延長であるメソサルピンクスによって支持されたコイル構造である1,4。さらに、マウス卵管は滑液包嚢に包まれており、卵母細胞が卵管に移入する可能性が高まります4。アンプラは受精の場所として同定され、発達中の胚は子宮に入る前に地峡に入る5。管状セグメントの直径は200〜400μmで、より長いアンプラリーおよび地峡領域の長さは約0.5〜1.0cmです4。卵管は発情周期の間に収縮し、アンプラと眼底は地峡よりも伸展性が高い1。
細胞、特に分泌細胞の過剰増殖は、骨盤腔内に見出される漿液性腫瘍の前駆病変を特徴付ける6。これらの前駆体漿液性上皮内病変は、卵管上皮においてのみ、フィンブリア領域においてのみ生じる。病変形成が、通常、優勢な細胞型が分泌型ではなく繊毛化されるこの領域に限定される理由は不明である2,7,8。正常な生理機能に関する地域性、ならびに卵巣癌の卵管起源に対する関心の高まり9,10,11,12,13は、卵管セグメントの別個の評価の重要性を強調する。
ここで説明する方法は、解離した細胞のセグメント特異的遺伝子発現および機能のその後の下流分析のための別個の卵管セグメントの収集を詳述する。伝統的に、多くの組織は、フェノールのいずれかに続いて全RNA抽出のために処理される:クロロホルム法またはオンカラム完全抽出法;しかし、RNAの品質は維持され、記載された併用法では十分な収率が得られていることを見出した。この方法を利用すると、卵管の非常に小さな機能セグメントを、卵管全体を調査するのではなく、下流分析のために処理することができ、異なるセグメントを表す結果をマスクすることができる14。
解離したマウス卵管細胞は、フローサイトメトリーによって調査されることはめったになく、おそらくこの組織からの細胞収量が限られているためである。この問題を克服するための1つのアプローチは、細胞を解離させ、培養中で増殖させ、次いでインビトロで再分化を刺激して、下流の細胞分析に適した細胞数を得ることであった15,16,17,18。このアプローチの限界は、培養中の時間エクスビボおよび変化した微小環境であり、どちらも遺伝子発現を変化させる可能性が高い。形態学的再分化は、無傷の動物に存在していたのと同じ転写的およびプロテオミクス的特徴を有するという仮定もある。現在の解離法は、単一細胞分化を維持しながら、異種卵管細胞集団において最多の上皮細胞数を達成するように設計した。さらに、ほとんどが非酵素的アプローチは、細胞表面タンパク質の損失を制限する可能性が高い。
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Protocol
すべての動物の取り扱いと手順は、カリフォルニア大学リバーサイド校の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認され、米国実験動物ケア協会、米国農務省、および国立衛生研究所のガイドラインに準拠していました。記載された方法は、C57BL/6成体、雌マウスを利用した。全ての動物を、組織採取前に断頭により安楽死させた。
注:青色染料を使用して卵管の効率的な解剖と巻き戻しを支援するプロトコルの概要を最初の図に示します(図1)。
図1:マイクロダイセクション法の概要。 (a)左パネルは、卵巣脂肪パッドおよび卵管を取り囲む結合組織の残骸の大部分が除去された無傷の構造を示す。この後、トルイジンブルーの添加は、卵管(中央パネル)のコイルを区別するのに役立ちます。右側のパネルは、卵巣の除去後の構造を示す。(B)各セグメントの開始位置と終了位置を決定するための内部巻線を備えたコイルなし卵管。(C)使用されたセグメンテーションの漫画(縮尺に合わせて描かれていない)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
1. 解剖面の作製
- 歯用ワックスをペトリ皿に接着剤で貼り付け、乾燥させます(図2A)。70%エタノールで皿を消毒する。表面は解剖の準備ができています。
2.卵巣、卵管、子宮のマクロ解剖
- 解剖の準備ができたら、解剖顕微鏡下で、歯科用ワックスを含むシャーレを、選択したコールドプラットフォーム(例えば、使用前に-20°Cに保たれたアイスパック)上に固定する(図2A)。
- 動物の腹側表面を70%エタノールで消毒する。滅菌解剖ハサミで腹腔と骨盤腔を開き、胃腸管を片側に移動して背側双角子宮を見つけます。各子宮角を吻側にたどって、腎臓のすぐ下にある子宮脂肪パッドに包まれた各卵管と卵巣を見つけます(図2B、C)。
- 解剖はさみを使用して、卵巣と遠位子宮角の一部がまだ取り付けられている側方卵管の両方を切除します。コイル状の卵管と卵巣にまだ取り付けられたままの角の約1〜2cmで各側方子宮角を切断する(図2D)。組織を直ちに2mLの冷間解剖培地に沈める( 材料表を参照)。
図2:卵巣のマクロ解剖と解剖のセットアップ。 卵管は、卵巣脂肪パッド(B)内の腎臓の基部にある骨盤腔内の背側に位置する。骨盤腔内の子宮分岐部(C)を見つけ、側方子宮角に沿って子宮 - 卵管 - 卵巣連続体(B)を見つける。1つの子宮角を切断し、粗い解剖によってこれらの構造を除去する。解剖台(A)の上に置き、子宮部を針(AおよびD)でデンタルワックスに貼り付ける。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
注:十分な数の子宮角をそのままにしておき、解剖台に接尾できるように卵管に取り付けてください(図2D)。
- 滅菌した25G針で子宮組織を歯科用ワックスに貼り付け、解剖用の組織を固定します(図2A、D、および図3A)。解剖顕微鏡下で作業し、卵巣脂肪パッドと結合組織をきれいにして解剖し、卵管の明確な視覚化を可能にします(図3B)。
図3:ステップバイステップの卵管マイクロダイセクション。 残存脂肪および結合組織(A,B)を除去した後、組織(C)にトルイジンブルーを加え、次いで卵巣の可視化およびその後の除去およびチューブのアンコイル化(D−H)を容易にするために洗い流す。眼底は近位地峡および子宮 - 管接合部(UTJ)のそばに見出すことができる。メソサルピンクスで切断しながら遠位端を軽く引っ張ってコイルを解き、卵管(H)の内因性ターンを明らかにして適切なセグメンテーションのために方向付けます。 図A−C スケールバー= 500μm、 D−H スケールバー= 400μm(I)様々なセグメントの漫画(スケールに描かれていない)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- 1mLシリンジを用いて、子宮に貼り付けた卵管を1〜2滴の滅菌1%トルイジンブルー色素溶液で30秒〜1分間分注し、インキュベートする。冷たいダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)ですすぎ、すべての液体を取り除きます(図3C)。
- コイル状の卵管から卵巣を軽く引き抜き、滑液包膜と広い靭帯で切り取り、卵管組織を損なうことなく卵巣を卵管から除去する(図3D、E)。
注:卵巣は卵管に取り付けられていませんが、卵管で滑液包膜に包まれ(図2D)、広い靭帯 を介して 子宮の側面に接続されています。
3. 卵管の微小解剖とセグメンテーション
- 子宮 - 管接合部(UTJ)の側方に見られる卵管の遠位、フィンブリアル端を見つける。卵管はそれ自体にコイルバックします。したがって、フィンブリアル端は近位端に対して横方向に配置することができ、卵管の巻き戻しのために方向付けるのに適切な出発点である(図3F、I)。
- チューブを静かに引っ張りながら、バネ状のマイクロハサミでメソサルピンクス(図3I)を切り取り、卵管のコイルを外します(図3G)。
- コイルが外れたら、チューブを切断して、眼底、アンプラリー、および地峡領域を生成します(図3H)。
- 眼底内(フィンブリア端および近位茎)の切除に続いて、チューブの2回目の顕著な回転の後に切断することによってアンプラリー領域を切除する(ターン2および3つの間の切断、長さ約1cm)。最後に、残りの部分を地峡領域であるUTJに切断する(図3H)。
注:卵管は、まっすぐな構造に完全に巻き戻されません。チューブはターンを維持します(図3H)3。アンプラリー領域に続く後続のターンに基づいて、残りのチューブをさらにアンプラリー - 地峡接合部および地峡3にセグメント化することができる。アンプラ切除後、ターン5と6の間で切断してアンプラ - 地峡接合部を得る。残りのチューブ(UTJの開始点まで6ターン)は地峡3です。
- 眼底内(フィンブリア端および近位茎)の切除に続いて、チューブの2回目の顕著な回転の後に切断することによってアンプラリー領域を切除する(ターン2および3つの間の切断、長さ約1cm)。最後に、残りの部分を地峡領域であるUTJに切断する(図3H)。
- RNA単離のために解剖した組織セグメントを液体窒素中で直ちにスナップ凍結するか、または配向包埋および免疫組織学的分析のために各セグメントを固定および処理する。
- RNA抽出を進める場合は、200 μLの冷RNA抽出試薬と1:1ホモジナイズビーズミックス( 材料表を参照)を組織に加えます(ステップ5.1を参照)。
4. 卵管解離
- 上記のステップ3.1.1から続く)上皮の最適な解離のために、スリットは、可能な限り領域(すなわち、眼底内およびアンプラ)に卵管を開き、管腔上皮を露出させる(図4A)。
図4:卵管細胞解離、パート1。 最適な細胞解離のために遠位上皮を露出させる方法を示す漫画(A)と、1mm2 メッシュを使用する最も簡単な方法を示す画像(B)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- 鉗子を梃子として、フィンブリアル領域から始めて、スプリング形のはさみでチューブを縦方向にスリットします。
- スリットオープン部分と残りの卵管をセグメント(約1〜2mmのサイズ)に細かく刻み、5mLの温かい非酵素解離緩衝液( 材料表を参照)を加え、37°Cでインキュベートする。
- 組織片を再懸濁し、細胞を球根ピペッターで解離させ、3分ごとに9〜10分間培養する。解離緩衝液を冷解剖培地で1:1に希釈する。
- 遠心分離(350 x g、3分、4°C)により細胞を回収する。細胞を2mLのRBC溶解緩衝液に室温で2分間再懸濁し、次いで冷解剖培地で1:1に希釈する。
- 遠心分離(350 x g、3分、4°C)によって細胞を収集し、5mLの冷たいプロナーゼ溶液に再懸濁する。
- プロナーゼ消化培地中でインキュベートし、単一の細胞懸濁液が達成されるまで(〜25〜30分)、3〜5分ごとに球根ピペッターで細胞凝集塊を再懸濁する。
注:このステップは、プロナーゼへの不必要な過剰暴露を防止する一定の観察を可能にするために、組織培養プレートまたはフラスコ内で行うのが最善である。
- プロナーゼ消化培地中でインキュベートし、単一の細胞懸濁液が達成されるまで(〜25〜30分)、3〜5分ごとに球根ピペッターで細胞凝集塊を再懸濁する。
- 滅菌マクロメッシュ(ゴムバンド付きの円錐形チューブに貼り付けた1 mm x 1 mmメッシュ(図4B))に細胞を通し、解離していない残りの組織片を除去します。遠心分離(350 x g、3分、4°C)によって細胞を収集し、下流分析に適した低温培地(例えば、フローサイトメトリーのための染色に進む場合はFACS緩衝液)に再懸濁する。
5. 卵管セグメントのRNA抽出
- ステンレスビーズミックスを使用して、レベル12のビーズブレットブレンダー組織ホモジナイザーで、4°Cで2つの間隔(それぞれ3分)の間、200μLのRNA抽出試薬中のスナップ凍結サンプルをホモジナイズします。
注: RNA の完全性を維持するには、サンプルをスナップ凍結状態から RNA 抽出試薬に直ちに移動し、計量しないでください。 - 室温で約5秒間卓上遠心分離機で100〜200 x g でホモジネートを短時間遠心分離し、ビーズから液体を分離した。上清を新鮮なチューブに移す。
- ビーズにさらに200 μLのRNA抽出試薬を加えてより多くのサンプルを回収し、遠心分離(100-200 x g、5 s 、 室温)を行った。上清を組み合わせる。
注: 上清を除去する際にビーズの持ち越しを防ぐために、小さなピペットチップ (ほとんどの p200 チップが適しています) を使用してください。 - メーカーのガイドラインに従って、RNAを相分離して沈殿させます。代表的な試料を100%イソプロパノールで-20°Cで一晩沈殿させた(約2:1容量、イソプロパノール:水相を回収)。
- 完全なRNA沈殿物を溶液とともにRNA結合スピンカラムに移し、9,500 x gで30秒間遠心分離 する。製造元のガイドラインに従ってカラム上で RNA を精製し、20 μL のヌクレアーゼフリー水で RNA を溶出します。マイクロボリューム分光光度計および/またはバイオアナライザーで品質/量を評価します。
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Representative Results
記載された解離プロトコールは、両方の卵管のプールを有するマウス当たり100,000〜120,000個の細胞を生じる。この方法は、多繊毛細胞の境界をそのまま残すのに十分なほど穏やかであり、多繊毛細胞と分泌細胞の区別を可能にし、消化法が脱分化を防ぐのに十分穏やかであることを確認する。図5の代表的な免疫蛍光画像は、ステップ4.2.1に続く小細胞凝集塊を、4%パラホルムアルデヒド(PFA)/ DPBS中で3分間固定し、1%ウシ血清アルブミン(BSA)/トリス緩衝生理食塩水トゥイーン(BTBST)で洗浄し、懸濁液で染色した。簡単に説明すると、細胞を0.5%TritonX-100/BTBST中で室温で15分間透過処理し、BTBSTで洗浄し、20mMグリシン/ DPBS中で室温で2時間バックグラウンド蛍光を消光し、BTBSTで洗浄し、次いで5%BSA/0.1%TritonX-100/TBST中で室温で1時間ブロッキングした。次いで、細胞を一次抗体中で4°Cで一晩BTBST(マウス抗マウスオクルジン(1:2000;ウサギ抗マウスアセチル化チューブリン(1:1000))中で一晩インキュベートし、続いてBTBST中で数回洗浄した。二次抗体をBTBST(ヤギ抗マウスIgG Alexa Fluor 555(1:1000);ヤギ抗ウサギIgG Alexa Fluor 488(1:1000))に室温で1時間添加し、BTBSTで数回洗浄し、DPBSで1回、次いで核染色中で室温で20分間インキュベートし(1:2000、Hoescht 33342)、続いてDPBS中で洗浄した。細胞を80 μLの退色防止マウント培地に再懸濁し、イメージング前に暗所で一晩放置した(図5A)。図5Bは、解離プロトコルの最後にある細胞を示す。生存率評価はプロトコル全体を通して行われ、代表的な画像を図5B-Dに示す。ヨウ化プロピジウムを1:100希釈で添加し、細胞を直ちに倒立化合物蛍光顕微鏡で観察した(図5C、赤色染色)。繊毛は、小細胞集塊(図5A)および単一細胞懸濁液(図5E)において無傷のままであり、多くの細胞が繊毛がまだ鼓動していることが観察された(Suppl. Video 1)。
図5:卵管細胞解離、パート2。 オクルジン(赤色)、核(青色)、およびアセチル化チューブリン(緑色)に対して陽性の細胞クラスターの蛍光および位相差画像。繊毛頂縁(AIおよびAVでは緑色)は、プロトコル全体を通して無傷のままであり、単一細胞(E)へのさらなる消化に耐える。 AI:マージ、 AII:赤チャンネル、 AIII:青チャンネル、 AIV:位相コントラスト、 AV:緑チャンネル。短いプロナーゼインキュベーションの後、細胞の大部分は単一である。ヨウ化プロピジウム(PI)染色は、約93%の生存率を示す。(B )明視野、(C)赤チャネルPI陽性、(D)マージ。(e)マージ時のはめ込みは、単一の解離した細胞上の無傷の繊毛境界を示す。このような細胞は積極的に繊毛を叩いていた( Suppl. Video 1参照)。画像は倒立化合物蛍光顕微鏡で撮影した。図 AI-V スケール バー = 20 μm、B-D スケール バー = 50 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
記載されたRNA単離プロトコルは、セグメントRT-qPCRおよびRNAseqに必要な十分な収率および純度を与える。結果は、この方法が、下流アッセイのための適切な収量のために2匹の動物からのプーリングを必要とするかもしれない眼底サンプルを除いて、セグメント当たり800〜1200ngのRNAを生じることを示している(図6A)。眼底内について提示された結果は、2匹の動物からプールされ、合計4つの眼底領域である(図6)。このプロトコルは、最初はマイクロボリューム分光光度計によって分析され、さらにバイオアナライザーによって分析される純粋なRNAを達成することに成功しています(図6B、C)。サンプルの吸収比は1.8~2.0(図6B)で、純粋なRNAヌクレオチド種に典型的な260/280nmです19。吸収比(260/230nm)は、単離試薬からの限定的な汚染を表す1〜2.2の間の包含基準で各サンプルについて採取した(データは示さず)19。サンプルをバイオアナリシスすることは、RNAの高い完全性を示し、評価されたRNA完全性数(RIN)が7つ以上(図6C)で、下流発現およびシークエンシング分析に適している20。
図6:セグメントRNAの品質評価 全RNAの収量(A)および品質(B,C)について、マイクロボリューム分光光度計およびバイオアナライザーによって評価した。RIN:バイオアナライザーによって評価されたRNA完全性数。バーは標準偏差(SD)±平均であり、2つの別個のRNA抽出からのセグメント当たりN=12サンプルである。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ1:解離した細胞上の拍動繊毛の生細胞イメージング。プロナーゼ消化後の繊毛を叩く。ビデオは倒立複合顕微鏡で撮影した。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
卵管の3つのセグメントは、組織学的、形態学的、および機能的に異なっている1,2,3。上皮は卵管の一方の端から他方の端まで大きく変化する。繊毛細胞はフィンブリア/眼底末端で優勢であり、分泌細胞は地峡領域で優勢です1。この全体的な勾配はしばらく前から認識されていましたが、最近の研究では卵管セグメント間のより多くの区別が明らかになりました。したがって、繊毛細胞はチューブの近位端に向かって頻度が低くなるが、アンプラからアンプラ - 地峡接合部に移行するそれらの数の急激な減少(約60%から10%の繊毛)がある3。さらに、近位および遠位セグメントにおける上皮細胞集団は、発生的に別個の系統に由来する1,2,3。下眼底およびアンプラの遠位上皮細胞は、上皮マーカーの系統追跡によって示されるように、地峡における近位上皮細胞集団に寄与しない。胚発生日12.5(E12.5)において、卵管上皮細胞は近位上皮細胞マーカーPAX22とは無関係に別個の系統を有する。これらの発見は、様々なセグメント間の多様な細胞集団に加えて、セグメントを独立して調査する必要性をさらに強調する。記載された方法は、歴史的に記載された3つのセグメント(眼底内、アンプラ、および地峡)に従って、段階的な巻き戻しおよびセグメント識別プロトコルを詳述する。最近、アンプラリー - 地峡接合部が決定的な卵管セグメントとして確立されたため、古典的に記述された3つの領域の同定と収集が優先された。しかしながら、この方法は、上述のように、アンプラリー−地峡接合部の別個の集合体を含むように拡張することができる3。
青色染料の使用と眼底内膜の位置は、卵管を迅速かつ効率的に巻き戻すための重要なステップです。青色の染料は、チューブのオスチウムとコイルを強調し、より迅速かつ効率的なデコイリングと収集を可能にします。オスティウムの初期位置は、卵管の遠位(眼底)および近位(地峡)領域に1つを向ける。さらに、巻き戻し中に近位子宮角部を解剖プラットフォームに貼り付けておくことで、外科医は繊細な解剖ステップに両手を使用することができます。コイル状の卵管を最初に除去し、チューブを不動にすることなく、または染料を使用せずにこの構造を解こうとすると、遠位端および近位端に関する混乱を招きやすくなり、チューブの破損を引き起こす可能性があります。チューブの破損は簡単であるため、破損により再現可能なセグメンテーションが達成できなくなるため、巻き戻し時には注意が必要です。最良の結果を得るためには、高品質のスプリングフォームマイクロハサミの使用を強くお勧めします。
卵管の多様なセグメントにおける遺伝子発現シグネチャーを評価することは、例えば、発情周期の間、および投与されたホルモンおよびサイトカインに応答して、卵管がこれらの刺激に応答してどのように変化するかについて、はるかに優れた理解をもたらす可能性が最も高い。これらのデータはまた、上皮変換に寄与する要因を明らかにするかもしれない。本明細書におけるRNA抽出プロトコールは、限られたサイズおよび弾力性のある管状構造のこの組織について可能な限り最高の量および品質を得るために開発された。記載された均質化、RNA沈殿、およびフェノールの併用使用:クロロホルムおよびオンカラム精製方法は、下流分析のためのRNAの適切な品質および量を達成する上で最も効率的であることが判明した。卵管セグメントは秤量されず、RNA分解につながる組織の温暖化を防ぐために、セグメント全体を直ちに組織均質化のために処理した。さらに、小さな管状セグメントには複数の均質化ステップが必要なため、サンプルの完全性を維持するために、均質化が4°Cで行われるようにすることが重要です。この方法は下流分析に適切な収率を生み出すのに十分であるため、この技術の将来の応用は、これまで報告されていなかったセグメントRNAseqを行うことであり、卵管生理学の理解に大きく貢献するだろう。
細胞解離プロトコールの開発中に、我々は、堅牢および/または長い酵素消化が繊毛の実証可能な喪失を引き起こすことを見出した。そこで、細胞形態を保存する方法の開発に注力し、達成しました。単一細胞収率の改善は、本明細書に記載されるように、フローサイトメトリーによる異なる上皮および間質細胞型のより堅牢で即時の多重化分析を可能にするであろう。非酵素解離プロトコールに続いてプロナーゼでの短いインキュベーションを使用することも、長くて堅牢な消化方法を利用する解離方法よりも細胞表面抗原の保存を改善する可能性が高い2,18。単一細胞シーケンシング解析では、多重化フローサイトメトリーパネルと比較して、はるかに少ない細胞しか必要としません2,21。したがって、卵管の3つの記載されたセグメントの単一細胞配列決定は、記載されたプロトコールで可能であり得る。
卵管はその全長に沿ってファイリングすることができないので、現在の方法の潜在的な制限は、より狭い地峡の上皮を形成する細胞が解離試薬への曝露を減少させ、したがって、 in vivoと同じ割合で最終懸濁液中に存在しない可能性があることである可能性がある。
卵管の巻き取りのために、すべての卵管セグメントの免疫組織化学的分析のための配向は困難な場合があります3。しかしながら、記載されたセグメント解剖に続いて卵管セグメントの配向埋め込みは、無傷のコイル状チューブ全体を通して連続的に断面化することなく、より包括的な縦方向および断面画像解析を可能にする。さらに、アンコイルに利用される青色染料は、小さな管状セグメントの埋め込み時の正しい配向を助ける。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、AMWへの国防総省ブレークスルー賞(BCRP W81XWH-14-1-0425)によって部分的に支援されました。KCRは、Pease Cancer Pre-Doctoral FellowshipとMary Galvin Burden Pre-Doctoral Fellowship in Biomedical SciencesおよびUniversity of California, Riverside、intramural awards:Graduate Council Fellowship Committee Dissertation Research Grant、Graduate Division Dissertation Year Program Awardによって部分的に支援されました。著者らは、この方法の早期トラブルシューティングにおける支援について、Gillian M. WrightとAlyssa M. Kumariに感謝する。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB05 | Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized |
| 1.4 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB14B | Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized |
| 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS) | Gibco | 21600-010 | Cold, sterile |
| 25G needle | BD | 305122 | |
| 60 mm sterile petri dishes | Corning | 430166 | |
| 70 μm cell meshes | Fisherbrand | 22-636-548 | |
| Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit | Agilent 2100 Bioanalyzer | 5067-1513 | |
| Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | BBY24M | |
| Bioanlyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer | ||
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Cold plate/pack/surface of choice | N/A | N/A | Kept at -20 °C for dissection |
| Dental wax | Polysciences Inc. | 403 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12 | Corning | 10-090-CV | Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-015CV | |
| Fine point forceps of choice | N/A | N/A | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G712b | Immunocytochemical validation images |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21422 | Immunocytochemical validation images |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | Immunocytochemical validation images |
| Hepes | Sigma Aldrich | H-3784 | |
| Hoescht 33342 | Cell Signaling Technologies | 4082S | Immunocytochemical validation images |
| Inverted compound microscope | Keyence BZ-X700 | ||
| Mouse anti-mouse Occludin | Invitrogen | 33-1500 | Immunocytochemical validation images |
| Non-enzymatic dissociation buffer | N/A | 5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS | |
| Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm | Thomas Scientific | 1210U04 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P-6148 | Immunocytochemical validation images |
| Pen-Strep | MP Biomedicals | 10220-718 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technologies | 9071S | Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | Prepare pronase digestion medium: 0.15% pronase in DMEM/Ham's F12, sterile |
| Propidium Iodide | Roche | 11 348 639 001 | Viability validation images |
| Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin | Abcam | ab179484 | Immunocytochemical validation images |
| RBC lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74134 | Utilized for on-column purification in text |
| Spring form microdissection scissors | Roboz Surgical | RS-5610 | |
| Sterile 3 mL bulb pipettors | Globe Scientific | 137135 | |
| Toluidine blue | Alfa Aesar | J66015 | Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile |
| Tris-Buffered Saline-Tween (TBST) | N/A | N/A | Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20 |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Inc. | 3555 | Immunocytochemical validation images |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Invitrogen | 15596026 | Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines |
References
- Stewart, C. A., et al. Mouse oviduct developmemt in Mouse Development: From Oocyte to Stem Cells. Kubiak, J. Z., et al. , Springer. Berlin Heidelberg. 247-262 (2012).
- Ford, M. J., et al. Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis. Cell Reports. 36 (10), 109677 (2021).
- Harwalkar, K., et al. Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development. Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).
- Agduhr, E. Studies on the structure and development of the bursa ovarica and the tuba uterina in the mouse. Acta Zoologica. 8 (1), 1 (1927).
- Pulkkinen, M. O. Oviductal function is critical for very early human life. Annals of Medicine. 27 (3), 307-310 (1995).
- Kindelberger, D. W., et al. Intraepithelial carcinoma of the fimbria and pelvic serous carcinoma: Evidence for a causal relationship. American Journal of Surgical Pathology. 31 (2), 161-169 (2007).
- Ghosh, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. In vivo genetic cell lineage tracing reveals that oviductal secretory cells self-renew and give rise to ciliated cells. Development. 144 (17), 3031-3041 (2017).
- Lee, Y., et al. A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube. Journal of Pathology. 211 (1), 26-35 (2007).
- Kim, J., et al. High-grade serous ovarian cancer arises from fallopian tube in a mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3921-3926 (2012).
- Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).
- Sherman-Baust, C. A., et al. A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development. Journal of Pathology. 233 (3), 228-237 (2014).
- Zhai, Y. L., et al. High-grade serous carcinomas arise in the mouse oviduct via defects linked to the human disease. Journal of Pathology. 243 (1), 16-25 (2017).
- Karthikeyan, S., et al. Prolactin signaling drives tumorigenesis in human high grade serous ovarian cancer cells and in a spontaneous fallopian tube derived model. Cancer Letters. 433, 221-231 (2018).
- Shao, R., et al. Differences in prolactin receptor (PRLR) in mouse and human fallopian tubes: Evidence for multiple regulatory mechanisms controlling PRLR isoform expression in mice. Biology of Reproduction. 79 (4), 748-757 (2008).
- Alwosaibai, K., et al. PAX2 maintains the differentiation of mouse oviductal epithelium and inhibits the transition to a stem cell-like state. Oncotarget. 8 (44), 76881-76897 (2017).
- Peri, L. E., et al. A novel class of interstitial cells in the mouse and monkey female reproductive tracts. Biology of Reproduction. 92 (4), 102 (2015).
- Lõhmussaar, K., et al. Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids. Nature Communications. 11 (1), 2660 (2020).
- Chen, S., et al. An air-liquid interphase approach for modeling the early embryo-maternal contact zone. Scientific Reports. 7, 42298 (2017).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2565 (2010).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- McGlade, E. A., et al. Cell-type specific analysis of physiological action of estrogen in mouse oviducts. The FASEB Journal. 35 (5), 21563 (2021).
