Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

הכנה ביולוגית וטכניקה מכנית לקביעת תכונות ויסקולסטיות של סיבים זונולריים

Published: December 16, 2021 doi: 10.3791/63171
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 2,4
1Department of Basic Sciences, University of Health Sciences and Pharmacy, 2Department of Ophthalmology & Visual Sciences, Washington University School of Medicine, 3Department of Biomedical Engineering, The Ohio State University, 4Department of Cell Biology & Physiology, Washington University School of Medicine

Summary

הפרוטוקול מתאר שיטה לחקר צמיגות מטריצה חוץ-תאית ותלותה בהרכב החלבון או בגורמים סביבתיים. מערכת המטריצה הממוקדת היא זונולה של העכבר. הביצועים של השיטה מודגמים על ידי השוואת ההתנהגות הצמיגית של סיבים זונולריים מסוג בר עם אלה חסרים מיקרופיבריל הקשורים גליקופרוטאין-1.

Abstract

גמישות חיונית לתפקוד של רקמות כגון כלי דם, שרירים וריאות. מאפיין זה נגזר בעיקר מהמטריצה החוץ-תאית (ECM), רשת החלבון המחברת תאים ורקמות יחד. כיצד המאפיינים האלסטיים של רשת ECM מתייחסים להרכב שלה, והאם תכונות ההרפיה של ECM ממלאות תפקיד פיזיולוגי, הן שאלות שטרם טופלו במלואן. חלק מהאתגר טמון בארכיטקטורה המורכבת של רוב מערכות ה- ECM והקושי לבודד רכיבי ECM מבלי להתפשר על המבנה שלהם. יוצא מן הכלל אחד הוא zonule, מערכת ECM נמצא בעין של בעלי חוליות. הזונולה כוללת סיבים באורך של מאות עד אלפי מיקרומטרים המשתרעים על פני החלל נטול התאים בין העדשה לקיר העין. בדו"ח זה, אנו מתארים טכניקה מכנית המנצלת את המבנה המאורגן ביותר של הזונול כדי לכמת את תכונותיו הוויסקולאסטיות ולקבוע את תרומתם של רכיבי חלבון בודדים. השיטה כוללת ניתוח של עין קבועה כדי לחשוף את העדשה ואת zonule ומשתמשת בטכניקת משיכה למעלה המותחת את הסיבים הזונולריים באותה מידה בזמן שהמתח שלהם מנוטר. הטכניקה זולה יחסית אך רגישה מספיק כדי לזהות שינויים בתכונות ויסקולסטיות של סיבים זונולריים בעכברים חסרי חלבונים זונולריים ספציפיים או עם הזדקנות. למרות שהשיטה המוצגת כאן מיועדת בעיקר לחקר התפתחות העין ומחלות, היא יכולה לשמש גם כמודל ניסיוני לחקר שאלות רחבות יותר לגבי התכונות הצמיגיות של ECM אלסטיים ותפקידם של גורמים חיצוניים כגון ריכוז יוני, טמפרטורה ואינטראקציות עם מולקולות איתות.

Introduction

העין של בעל חוליות מכילה עדשה אופטית חיה המסייעת למקד תמונות ברשתית1. העדשה תלויה על הציר האופטי על ידי מערכת של סיבים עדינים, רדיאליים, כפי שמודגם באיור 1A. בקצה אחד, הסיבים מתחברים לקו המשווה של העדשה, ובקצה השני, אל פני השטח של הגוף הסילארי. האורכים שלהם משתרעים על פני מרחקים הנעים בין 150 מיקרומטר בעכברים ל 1 מ"מ בבני אדם. באופן קולקטיבי, סיבים אלה ידועים בשם zonule של Zinn2, zonule ciliary, או פשוט zonule. טראומה עינית, מחלות והפרעות גנטיות מסוימות יכולות להשפיע על שלמות הסיבים הזונולריים3, וכתוצאה מכך כישלונם הסופי ואובדן הראייה הנלווה אליהם. בעכברים, הסיבים יש ליבה המורכבת בעיקר של פיברילין חלבון-2, מוקף מעטפת עשירה פיברילין-14. למרות סיבים זונולריים ייחודיים לעין, הם נושאים קווי דמיון רבים סיבי ECM מבוססי אלסטין שנמצאו במקומות אחרים בגוף. אלה האחרונים מכוסים על ידי פיברילין-1 מעטפת5 ויש להם ממדים דומים סיבים זונולריים6. חלבונים אחרים, כגון פקטורי גדילה β חלבון מחייב β (LTBPs) וגליקופרוטאין-1 הקשור למיקרופיבריל (MAGP-1), נמצאים בשיתוף עם שני סוגי הסיבים7,8,9,10,111 הקשורים למיקרופיבריל. מודולוס אלסטי של סיבים זונולריים הוא בטווח של 0.18-1.50 MPa12,13,14,15,16, דומה לזה של סיבים מבוססי אלסטין (0.3-1.2 MPa)17. קווי דמיון ארכיטקטוניים ומכאניים אלה מובילים אותנו להאמין כי כל תובנה לגבי התפקידים של חלבונים הקשורים לזונולה עשויה לעזור להבהיר את תפקידם בסיבים אלסטיים אחרים של ECM.

המטרה העיקרית של פיתוח השיטה המתוארת כאן היא לקבל תובנות על התפקיד של חלבונים זונולריים ספציפיים בהתקדמות של מחלת עיניים תורשתית. הגישה הכללית היא להשוות את המאפיינים הוויסקואלסטיים של סיבים זונולריים בעכברים מסוג בר עם אלה של עכברים הנושאים מוטציות ממוקדות בגנים המקודדים חלבונים זונולריים. בעוד מספר שיטות שימשו בעבר כדי למדוד את המאפיינים האלסטו-מכניים של סיבים זונולריים, כולם תוכננו לעיניים של בעלי חיים גדולים בהרבה12,13,14,15,16. כמו מודלים כאלה אינם ניתנים למתיחה גנטית; ביקשנו לפתח שיטה ניסיונית שמתאימה יותר לעיניים הקטנות והעדינות של העכברים.

השיטה שפיתחנו להערכת הצמיגות של הסיבים הזונוריים של העכבר היא טכניקה שאנו מכנים "בדיקת משיכה למעלה4,18", המסוכמת חזותית באיור 1. תיאור מפורט של שיטת המשיכה למעלה וניתוח התוצאות מסופק להלן. אנו מתחילים בתיאור בניית המנגנון, כולל החלקים המודפסים התלת מימדיים (3D) המשמשים בפרויקט. לאחר מכן, אנו מפרטים את הפרוטוקול המשמש להשגת והכנת העיניים לניסוי. לבסוף, אנו מספקים הוראות שלב אחר שלב כיצד להשיג נתונים לקביעת המאפיינים הצמיגיים של סיבים זונולריים. בסעיף תוצאות מייצגות, אנו משתפים נתונים שלא פורסמו בעבר שהושגו בשיטה שלנו על התכונות הצמיגיות של סיבים זונולריים מעכברים חסרי MAGP-119, כמו גם ערכת בקרה המתקבלת מחיות בר תואמות גיל. לבסוף, אנו מסיימים עם הערות כלליות על היתרונות והמגבלות של השיטה, והצעות לניסויים פוטנציאליים שעשויים להבהיר כיצד גורמים סביבתיים וביוכימיים משפיעים על המאפיינים הוויסקואלסטיים של סיבי ECM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לחקר בעלי חיים באוניברסיטת וושינגטון ודבקו בהצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וחזון.

1. ייצור חלקים מיוחדים ובניית מנגנון

  1. ייצור של חלקים מיוחדים
    1. ייצור בדיקה. החזיקו נימי זכוכית בזווית כפי שמוצג בחלונית השמאלית של איור 2A. הניחו להבה ממצית סיגריה כ-2 ס"מ מקצה אחד ושמרו עליה שם עד שהסוף יתכופף ב-90°, כפי שמוצג בחלונית הימנית של איור 2A.
    2. ייצור פלטפורמה לדוגמה. באמצעות תוכנת ציור תלת-ממדית, תכננו פלטפורמה בגודל 30 x 30 x 5 מ"מ ומכילה חריצים חצי כדוריים בקוטר 2.0, 2.5 ו-3.0 מ"מ, כפי שמוצג באיור 2B.
    3. ייצור מחזיק בדיקה. באמצעות תוכנת הציור התלת-ממדית, תכננו תושבה המכילה את הגשושית הנימית וחברו אותה למיקרו-מניפולטור (ראו איור 2C).
      הערה: קובץ 3D לדוגמה לייצור פלטפורמה וייצור מחזיק בדיקה בפורמט STL זמין על פי בקשה מהמחבר המתאים.
    4. הרכבת עדשה שלילית. הניחו עדשה גלילית שלילית (75 מ"מ באורך מוקד וכ-50 מ"מ גובה ואורך) כפי שמוצג באיור 1C ובאיור 1D כדי לתקן את העיוות שנגרם על ידי הוספת נוזל לצלחת פטרי (תוספת נוזל מעוותת את מבט העין המנותחת כאשר היא מדמה מהצד).
    5. הדבק את העדשה השלילית לאחד מהבסיסים עם שני המחורצים (ראו איור 2D למיקום העדשה בבסיס).
    6. הרכיבו את החלקים הנותרים כפי שמוצג באיור 2D.
    7. התאם את גובה העמוד כך שהעדשה בקושי מרחפת מעל הסולם ומהדק את הבורג במחזיק הדואר.
  2. בניית מנגנון
    1. התקן במחשב את תוכנית הרישום שסופקה עם קנה המידה, את תוכנת מצלמת המיקרוסקופ ואת יישום בקר המיקרומטר הממונע.
    2. חבר את המיקרומטר הממונע לבקר מנוע הסרוו ואחרון למחשב. הפעל את יישום בקר המנוע וערוך את הגדרות המנוע.
      הערה: הגדרות המנוע, המפורטות להלן, נבחרו לאחר ניסויים ראשוניים שגילו כי הלחצים נרגעו בסולם זמן של 10-20 שניות. בהתבסס על קביעה זו, בחרנו מהירות ותאוצה שאפשרו למנוע להשלים תזוזה של 50 מיקרומטר בזמן קטן יותר מזמן ההרפיה, אך לא קצר מדי כדי למנוע טלטלה במדגם. כאן בחרנו זמן עקירה של כ 5-10 שניות.
    3. הגדר את המהירות המרבית ל- 0.01 מ"מ / s ואת התאוצה ל- 0.005 מ"מ / s2.
    4. התקן את המצלמה במיקרוסקופ הבדיקה ובדוק את תוכנת הדמיית המצלמה.
    5. מניחים את קנה המידה על שטח הספסל המוקדש למנגנון.
    6. הדבק פלטפורמה בהדפסה תלת-ממדית (משלב 1.1.2) לצלחת פטרי והוסף חרוז זכוכית 2-3 מ"מ לאחת הבארות. מניחים את צלחת פטרי על הסולם, כך החרוז ממוקם ליד מרכז המחבת.
    7. החלף את המיקרומטר הידני מהמיקרו-מניפולטור במנוע.
    8. בורג שני ברגי 4-40 למחזיק הבדיקה. צרפו את מחזיק הבדיקה למניפולטור כפי שמוצג באיור 1C.
    9. הכינו בדיקה כפי שמודגם באיור 2A, הניחו אותה בתוך מחזיק הגשושית כשהחלק הכפוף פונה כלפי מטה והדקו את הברגים.
    10. מקם את המיקרו-מניפולטור על השולחן כך שקצה הגשוש יהיה מעל החרוז על הרציף. הצמד את המיקרו-מניפולטור לשולחן כדי למנוע תנועה מקרית במהלך הניסוי.
    11. מקם את המיקרוסקופ הצדדי על השולחן כך שהחרוז נמצא במרכז שדה הראייה שלו ובמיקוד.

2. הכנה לדוגמה ורכישת נתונים

  1. קיבוע עיניים וחיתוך
    1. שמור על עכברים פראיים ובעלי חיים מסוג Magp1-null על רקע C57/BL6J זהה. המתת חסד לעכברים בני חודש או בן שנה משאיפת CO2 .
    2. הסר את העיניים עם מלקחיים עדינים ולתקן את גלובוסים enucleated ב 4 °C (60 °F5000med לילה ב 4% paraformaldehyde / תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS, pH 7.4). לשמור על לחץ חיובי של 15-20 מ"מ כספית בעין במהלך תהליך הקיבעון, כמתואר6.
      הערה: ניסויים נערכים על עכברים זכרים, כדי לשלוט על הבדלים אפשריים הקשורים למין בגודל של כדור העין. הלחץ החיובי מבטיח כי כדור הארץ נשאר מנופח, שמירה על הפער בין העדשה לבין הקיר של העין המשתרעת על ידי סיבים זונולריים.
    3. לשטוף את העיניים במשך 10 דקות PBS. באמצעות מספריים כירורגיים עיניים ועבודה תחת סטריאומיקרוסקופ, לעשות חתך בעובי מלא בדופן העין ליד ראש עצב הראייה.
    4. להרחיב את החתך קדימה לקו המשווה, ולאחר מכן סביב היקף קו המשווה של העין. הקפד לחסוך את התהליכים ciliary עדין סיבים זונולריים הקשורים.
    5. הסר את החלק האחורי של הגלובוס, חשיפת המשטח האחורי של העדשה.
    6. השתמש במלקחיים כדי להסיר עין ניתחה מתמיסת החיץ והנח אותה על מגבון משימה יבשה כשהקרנית פונה כלפי מטה. גרור בעדינות את הקרנית מעל פני השטח של המגבון כדי לייבש אותו.
    7. הוסף 3 μL של דבק מיידי לבארות הפלטפורמה שיתאימו את העין בצלחת פטרי.
    8. מניחים את המנה על צלחת הבמה של סטריאומיקרוסקופ, כך הבאר עם הדבק הוא בתצוגה.
    9. מעבירים את העין מהנגב לקצה הבאר המכילה דבק. לאחר מכן, בזהירות לגרור את העין לתוך הבאר במהירות להתאים את הכיוון שלה, כך האחורי של העדשה הוא העליון ביותר.
    10. ייבשו את הצד החשוף של העדשה על ידי הכתמתה בעדינות בפינת המגבון היבש.
    11. החל טיפה של דבק מיידי לתחתית צלחת פטרי 50 מ"מ ומלט את הפלטפורמה אליו.
  2. מדידה של תגובה ויסקולסטית זונורית
    1. הפעל את קנה המידה, הפעל את תוכנית רישום קנה המידה ואת תוכנת המצלמה. ודא שתוכנית הרישום יכולה לרכוש נתונים למשך 30 דקות, מכיוון שניסיונות מסוימים יכולים להימשך זמן רב כל כך.
    2. הפעל את בקר מנוע הסרוו והפעל את יישום הבקר במחשב. ודא שהבקר מוגדר לנוע במרווחים של 50 מיקרומטר באמצעות פרמטרי תנועה דומים לאלה המתוארים בהערה בשלב 1.2.2.
    3. צור עיקול של 90° במוט נימי כמתואר בשלב 1.1.1.
    4. החלק את הנימים המכופפים לתוך מחזיק הבדיקה הנימית והידק את הברגים המאבטחים.
      הערה: כדי למזער התייבשות מדגם, אנו ממליצים כי שלבים 1-4 יושלמו לפני, או במהלך, ניתוח עיניים.
    5. הוסף חרוז קטן (~ 1 מ"מ) של דבק לריפוי UV לקצה הנימים.
    6. באמצעות התאמות ידניות על המניפולטור, להזיז את קצה הבדיקה נימי, כך שהוא ישירות מעל מרכז העדשה. בדוק אם החלק התחתון של דבק UV מופיע ממורכז מעל החלק העליון של העדשה כאשר הוא נצפה מקדימה (על ידי בדיקה חזותית) ומהצד (דרך מצלמת המיקרוסקופ).
    7. תוך כדי התבוננות במצלמה, הורידו את קצה הגשוש עד שדבק ה-UV ייצור קשר עם העדשה ויכסה שליש עד מחצית מהמשטח העליון שלה.
    8. השתמש בעוצמה נמוכה (~ 1 mW), כיווני, כמעט גלוי UV (380-400 ננומטר) מקור אור כדי לרפא את הדבק.
      הערה: מפרטים אלה מספיקים כדי לרפא את הדבק תוך מספר שניות תוך מזעור הפוטנציאל לגרימת קישור צולב חלבונים. מקורות אור UV המסופקים עם עטי דבק UV מסחריים עומדים במפרטים אלה.
    9. מוסיפים פתרון PBS לצלחת עד שהעין מכוסה בנוזל לעומק של 2 מ"מ לפחות.
    10. מניחים את העדשה הגלילית מול מיקרוסקופ הבדיקה וקרוב ככל האפשר לצלחת פטרי מבלי לגעת בה.
    11. הפעל בו-זמנית את תוכנית הרישום ואת תוכנית שעון העצר. צלם תמונה של העין / בדיקה באמצעות המצלמה.
    12. לאחר 60 שניות, ליזום עוד 50 מיקרומטר תזוזה, ולאחר מכן כל 60 s עד הניסוי הושלם, כלומר, עד כל הסיבים נשברו. שים לב שהאות לא יחזור לרמות בסיסיות עקב אידוי מאגר במהלך הניסוי. תקן את הסחף הבא בקריאה במהלך ניתוח הנתונים, כפי שהודגם בשלב 2.2.14.
    13. עם השלמת ריצה, שמור את נתוני רישום קנה המידה וייצא אותם לתבנית התואמת לגיליון האלקטרוני, לדוגמה, תבנית .csv. שמור את תמונות העדשה שנאספו במהלך הריצה.
    14. יבא נתונים לגיליון אלקטרוני. השתמש בקריאה הראשונה והאחרונה בקנה מידה כדי לתמצת את הסחף בקריאה ברקע לאורך זמן עקב אידוי (ראו איור 3). הפחת את הקריאה המתובלת מהקריאה בכל נקודת זמן.
      הערה: אם אתה משתמש בגיליון אלקטרוני, ניתן לבצע את האינטרפולציה באופן אוטומטי על-ידי הזנת הנוסחה = B2 - $B$2 + ($B$2 - @INDIRECT("B"&COUNTA(B:B))))/(COUNTA(B:B)-2) * A2 בתא מימין לקריאת קנה המידה הראשון, ולאחר מכן הזזת הסמן לפינה הימנית-נמוכה יותר של התא וגרירתו כלפי מטה לערך הנתונים האחרון. הנוסחה מניחה שהנתונים מאורגנים בעמודה כאשר נקודת הנתונים הראשונה מופיעה בתא B2. אם תרצה, הנתונים המעובדים בשלב 2.2.14 עשויים להיות מנותחים עם מודל ויסקולסטי מעין אלסטי שפותח על ידי אחד המחברים השותפים, ד"ר מתיו ריילי4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

טכניקת המשיכה למעלה המתוארת כאן מספקת גישה פשוטה לקביעת תכונות ויסקולאסטיות של סיבים זונולריים בעכברים. בקצרה, עין העכבר נשמרת לראשונה על ידי הזרקת קבוע בלחץ תוך עיני פיזיולוגי. גישה זו שומרת על האינפלציה הטבעית של העין ושומרת על הסיבים כראוי מראש מתוחים (קיבעון נחשב מקובל לאחר ניסויים ראשוניים הוכיחו שזה לא שינה את האלסטיות או הכוח של הסיבים באופן משמעותי). החלק האחורי של עין העכבר מוסר לאחר מכן על ידי ביתור כדי לחשוף את העדשה ואת הסיבים הזונגולריים להשעות אותו. חזית העין מודבקת לפלטפורמה ומונחת בתוך צלחת פטרי הנשענת בקנה מידה דיגיטלי. לאחר מכן, נימי זכוכית המחוברים למיקרו-מניפולטור מוצמדים למשטח האחורי של העדשה. העדשה מורמת במרווחים של 50 מיקרומטר בזמן שהכוח בסולם נרשם. ירידה במשקל לכאורה של ההכנה מספקת מידע על הכוחות המותחים את הסיבים. כל תזוזה מלווה בתקופת שיווי משקל שנמשכת כדקה אחת כדי לצפות בכל הרפיה של הלחץ הנגרמת על ידי העקירה. לבסוף, התוצאות מנותחות באמצעות מודל ויסקולאסטי מעין ליניארי שתוכנן במיוחד עבור הגיאומטריה של הסיבים הזונולריים של העכבר ואת כיוון המשיכה עבור assay4.

נתונים ויסקוואלסטיים אופייניים המתקבלים בשיטה שלנו מוצגים באיור 3. העקומה נראית הפוכה (שלילית) מכיוון שכוח ההרמה בעדשה מפחית את משקל הרכבת המנה/פלטפורמה/העין בסולם בכמות שווה ערך. התגובה כוללת קוצי כוח מיידיים במהלך כל אחד מהתזוזות האנכיות של 50 מיקרומטר של העדשה, ואחריו שלב הרפיה עם חיים שלמים בסדר גודל של 10 שניות. הרפיה מתח דומה נצפתה עבור סיבים זונולריים בקר12. הגודל של הכוחות המיידיים והרגועים גדל עם כל צעד עד כ 1000 s (~ 800 מיקרומטר עקירה כוללת) ולאחר מכן מתחיל לרדת כמו סיבים מתחילים להיכשל. כישלון Zonule הושלם על ידי נקודת הזמן של 1,500 s (~ 1.25 מ"מ תנועה כוללת). שים לב כי בשל אידוי של חיץ במהלך הניסוי, העקומה אינה חוזרת לקריאה הראשונית לאחר שהעדשה משוחררת מהעין.

איור 4 מנוגד לתגובות המתקבלות עבור עכבר נוקאאוט Magp-1 (עקומה אדומה) וחיה פראית תואמת גיל (עקומה כחולה). עקומות אלה תוקנו לצורך אידוי, היפוך, והמדידות הגולמיות של המסה (ראו איור 3) מתבטאות כעת ככוח (עם יחידות של mN). התגובה הוויסקולסטית הראשונית של הזונולה המדולדלת Magp-1 (זמן 0-600 s) דומה מאוד לזו של סוג הבר, דבר המצביע על כך שהתכונות הצמיגיות של הזונולה לא שונו באופן משמעותי על ידי היעדר Magp-1. עם זאת, נראה כי הסיבים נקרעים במתח נמוך בהרבה בהשוואה למקביליהם הפראיים.

כדי להמחיש את האמינות של השיטה, אספנו נתונים מבעלי חיים מרובים על הכוח המיידי המרבי המופעל על העיניים לפני שהסיבים שלהם נקרעו. התוצאות מוצגות באיור 5. הנתונים עבור עכברים בני חודש מציגים ערכים קטנים מאוד עבור השגיאה הסטנדרטית של הממוצע (SEM) למרות המספר הנמוך יחסית של דגימות המשמשות (n = 5 או 6), דבר המצביע על רבייה גבוהה. התוצאות מצביעות על כך שחוזק הסיבים שונה באופן משמעותי בין שני הגנוטיפים (p-value = 2.4 x 10-6). התוצאות שאינן מוצגות בנתונים מצביעות גם על כך שיש עלייה עדינה אך משמעותית סטטיסטית בכוח שבירה עם הגיל עבור בעלי חיים מסוג בר (p-value = 0.024).

שיטת המשיכה למעלה יכולה גם ליצור הערכות כמותיות של הפרמטרים הוויסקואלסטיים המביאים בחשבון את הווריאציות שנצפו בתגובות זמניות. טבלה 1 מסכמת את הפרמטרים המתאימים ביותר לנתוני MAGP-1 שלנו, שהתקבלו במודל ויסקולאסטי מעין ליניארי שתואר בעבר4. התוצאות מראות כי הן מחיקה MAGP-1 והזדקנות יכול להיות השפעות משמעותיות מאוד על חלק מהמאפיינים המכניים של סיבים זונולריים.

Figure 1
איור 1: סיכום חזותי של שיטת המשיכה למעלה. (א) מבט חתך של עין חוליות המציגה את העדשה ואת הסיבים הזונוריים המשעות אותה. (B) גישה כללית לקביעת התנהגות ויסקואלסטית בסיבים זונולריים על ידי הזזת העדשה כלפי מעלה (הרחק מהקרנית). (ג) מבט ממשי על עין מנותחת המודבקת על פלטפורמה כאשר עדשתה נמשכת כלפי מעלה על ידי גשושית זכוכית המחוברת למיקרו-מניפולטור. (ד) סכמטי של המנגנון כולו. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ייצור של חלקים שונים. (א) ייצור של גשושית הזכוכית. נימי זכוכית מוחזקים בזווית ולהבה מוחלת בנקודה בערך 2 ס"מ מקצה אחד. בתוך כמה שניות, סוף הנימים מתחיל ליפול. הלהבה מוסרת כאשר קצה הנימים מכופפים בכ -90 מעלות. (ב) ייצור פלטפורמת העיניים. החלק מפוברק במדפסת סטריאוליתוגרפיה תלת-ממדית (SLA). הוא מודד 30 x 30 x 5 מ"מ ומכיל שלוש חריצים חצי כדוריים עם 2.0, 2.5, ו 3.0 מ"מ קטרים שלתוכו מודבקות עיניים מנותקות בגדלים שונים. (ג) ייצור של מחזיק בדיקה. חלק זה היה גם מפוברק עם מדפסת SLA 3D. הוא מורכב משני מוטות אורתוגונליים בקוטר 7.3 מ"מ. המוט התחתון מכיל שעמום 1.5 מ"מ ושני חורים 2.5 מ"מ דרך המשטח החיצוני כדי להכיל ברגי מתכת המאבטחים את הבדיקה הנימית במקום. (ד) הרכבת עדשה שלילית. תמונות שצולמו על ידי המיקרוסקופ הצדדי מכילות עיוות אסטיגמטי בשל העקמומיות של צלחת הפטרי ופתרון החיץ. הרכבת העדשה נועדה לפצות על העיוות, ומאפשרת למיקרוסקופ הצדדי ללכוד תמונות במיקוד חד. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: נתונים גולמיים אופייניים המתקבלים עם הבדיקה. הגרף המוצג נרשם עם תוכנת רישום המתעדת נתונים בקנה מידה דיגיטלי בדיוק של 0.01 גרם. הקצה השמאלי של הגרף (זמן 0) משקף את משקל המדגם ללא כוח הרמה. ציר ה- y מתאר מסה ב- g. לאחר מכן, העדשה מורמת בשלבים של 50 מיקרומטר עד שכל הסיבים הזונולריים נשברים וצלחת הפטרי שוב מונחת במלואה על הסקאלה. שים לב שקריאת הסיום מקוזזת מהקריאה הראשונית. ההיסט נובע מאידוי הדרגתי של פתרון החיץ במהלך הניסוי וניתן להסבירו במהלך ניתוח הנתונים, כפי שמתואר בשלב 2.2.14. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: עקומות תזוזת כוח זונולריות מייצגות עבור עכברים מסוג בר ו-MAGP-1 לקויים. הגרף משווה את התגובה הוויסקולסטית המתקבלת לאחר תזוזות דיסקרטיות של העדשה הרחק ממיקום שיווי המשקל שלה. התגובה של עין מעכבר נוקאאוט MAGP-1 (KO) עוקבת אחר זו של חיית בר תואמת גיל עד לנקודה שבה הסיבים בעכבר הנוקאאוט נשברים בטרם עת. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: כוחות שבירת סיבים זונולריים שהושגו בשיטת משיכה למעלה עבור MAGP-1 KO לעומת עכברים מסוג בר ובגיל שנתיים. כל המדידות המוצגות מבוססות על n = 5 או 6 עיניים, עם קווי שגיאה המייצגים את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע (SEM). קיצורים: WT = סוג פראי; KO = נוקאאוט MAGP-1 . לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

גנוטיפ/גיל G0 (Pa) G∞ (Pa) Ʈ (sec) σ f (Pa)
WT 1 חודש התכוון 2.34E+05 9.33E+04 16.3 9.61E+05
SD 2.83E+04 2.94E+04 3.4 1.25E+05
95% Cl 5.55E+04 5.76E+04 6.7 2.45E+05
KO 1 חודש התכוון 2.73E+05 6.74E+04 17.6 4.44E+05
SD 6.30E+04 2.06E+04 3.8 7.85E+04
95% Cl 1.23E+05 4.03E+04 7.5 1.54E+05
ערכי p 0.25 0.12 0.58 0.000022
WT שנה אחת התכוון 1.98E+05 7.42E+04 17 1.41E+06
SD 1.17E+05 2.39E+04 9.1 2.44E+05
95% Cl 2.29E+05 4.69E+04 17.9 4.79E+05
KO 1-שנה התכוון 1.70E+04 2.46E+04 12.9 5.05E+05
SD 9.06E+03 8.04E+03 7.4 1.48E+05
95% Cl 1.78E+04 1.58E+04 14.4 2.91E+05
ערכי p 0.0063 0.001 0.41 0.000014
ערכי p, גיל WT 0.46 0.23 0.85 0.002
קו 0.0007 0.0068 0.26 0.44

טבלה 1: מאפיינים ויסקולסטיים שהושגו באמצעות דגם ויסקולסטי מעין ליניארי (QLV). סריקות נתונים כמו אלה המוצגות באיור 4 נותחו באמצעות מודל QLV שפותח במיוחד עבור בדיקת המשיכה למעלה והזונולה של העכבר. הפרמטרים המתאימים ביותר עבור הנוקשות המיידיות (G0) ושיווי המשקל (G∞), קבוע זמן ההרפיה (τ) ועוצמת המתיחה האולטימטיבית (σ f) מוצגים. קיצורים: SD = סטיית תקן; CI = מרווח ביטחון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הזונולה היא מערכת ECM יוצאת דופן שבה סיבים מסודרים באופן סימטרי וניתן לתמרן אותם באופן זהה על ידי הזזת עדשת העין לאורך הציר האופטי. ניתן גם לגשת בקלות לחלל ללא הפרעה תאית, מה שמאפשר ללמוד את הסיבים בסביבה הקרובה למצבם הטבעי. טכניקת המשיכה למעלה מנצלת את מצגת ECM זו כדי לתפעל את הסיבים העדינים מעכברים, מערכת הניתנת למתיחה גנטית, ולכמת במדויק את תכונותיהם המכניות. זה איפשר לנו לבחון את התרומה של חלבוני ECM מפתח (פיברילין-118, LTBP-24, ו MAGP-1 דיווח כאן) לתכונות הביומכניות של סיבים זונולריים. הניתוח שלנו של עכברים לקויים פיברילין-1-1 גילה כי סיבים זונולריים חסרים פרברילין-1 נחלשים עם הגיל ובסופו של דבר נקרעים, מה שמוביל להעתקת העדשה בתוך העין (אצל בני אדם, מצב המכונה אקטופיה לנטיס). באופן משמעותי, פריקת עדשה היא גם תופעה שכיחה בחולים עם תסמונת מרפן, מחלה הנגרמת על ידי מוטציות בגן FBN120. לכן, בדיקת משיכה למעלה מציעה הזדמנות מודל היבטים של מחלת רקמת חיבור אנושית בעכברים. בעכברים חסרים LTPB-2 (חלבון שנחשב מעורב בראשית של מיקרופיברילים), הצלחנו להוכיח כי סיבים זונולריים יוצרו בהיעדר חלבון זה, אך נקרעו בלחצים נמוכים משמעותית ובסופו של דבר התפוררו עם גיל 4. תוצאות אלה מציעות כי LTBP-2 תורם לאריכות ימים של הסיבים ולא הסינתזה שלהם. במחקר הנוכחי, קבענו כי סיבים MAGP-1-לקוי היו תכונות ויסקולאסטיות דומות לסיבים מסוג בר אבל נקרע בלחצים נמוכים יותר, ללא סימן של השפלה נוספת הקשורות לגיל. זה יהיה עקבי עם מודל שבו סיבים חסרים MAGP-1 חלשים באופן מהותי ברגע שהם מתפתחים.

נציין כי עוצמות המתיחה האולטימטיביות המפורטות בטבלה 1 מוערכות תחת ההנחה שהסיבים נשברים איפשהו באמצע הטווח. עם זאת, איננו יכולים לשלול את האפשרות כי כשל סיבים נובע ניתוק מנקודות עיגון על פני העדשה או על גוף ciliary. אם זה היה המקרה, חוזק מתיחה השבר של הסיבים יכול להיות גבוה יותר מהערכים המפורטים בטבלה 1. ניתוח מיקרוסקופי יידרש כדי להבדיל בין אפשרויות אלה. ניתוח כזה רחוק מלהיות טריוויאלי מאז הסיבים המעורבים הם דקים מאוד (~ 0.5-0.6 מיקרומטר ברוחב) וכמעט אינדקס מותאם למים, מה שהופך אותם בלתי נראים במהותם. בהיעדר מידע נוסף זה, אנו יכולים רק לציין כי עוצמות המתיחה האולטימטיביות המפורטות בטבלה 1 מייצגות את הגבולות התחתונים שלהם. זה גם יהיה מעניין, באופן עקרוני, כדי לבדוק אם מדידות הכוח שונות בהתאם לאיזה כיוון העדשה נמשכת. בפועל, עם זאת, משיכת העדשה מהצד הקדמי תדרוש הסרת הקשתית מבלי לפגוע בסיבים הזונולריים השוכבים מיד מתחת. ניתוח מדויק כזה הוא מעבר למה שאנחנו יכולים להשיג כרגע עם עין העכבר.

הפשטות היחסית של השיטה ואת רבייה גבוהה של תוצאותיה הם תכונות רצויות למחקרים השוואתיים של תכונות מכניות ECM. בנוסף, כפי שמוצג כאן, ניתן גם להשתמש בבדיקת משיכה למעלה כדי להשיג ערכים מוחלטים של פרמטרים ויסקולסטיים על ידי הנחת מודל ויסקולסטי והתאמת עקומות הזמן אליו. לדוגמה, באמצעות מודל ויסקולסטי מעין ליניארי סטנדרטי (QLV), הצלחנו לחלץ ערכים עבור נוקשות מיידית (G0) ושיווי משקל (G∞), קבוע זמן ההרפיה (τ), ואת כוח המתיחה האולטימטיבי (σ f) של סיבים זונולריים מעכברים מסוג בר, כמו גם אלה חסרים LTBP-24 או MAGP-1. ערכי G0 ו- G∞ המתקבלים עבור בעלי חיים מסוג בר בשני המחקרים משתנים בין 6.7 x 104 Pa ל-2.3 x 105 Pa, טווח דומה באופן כללי לאלה שנמצאו בסיבים גדולים בהרבה שמקורם בזנולים אנושיים, בקרים וחזיריים (1.8 x 105-1.5 x 106 Pa)12,13, 14,15,16. הסכם זה בין מינים מציע כי אלה הם מאפיינים אוניברסליים של סיבים אלה, ונותן לנו ביטחון כי פרמטרים ויסקואלסטיים משמעותיים ניתן לחלץ עם השיטה שלנו.

צעד קריטי להשגת תגובות ויסקולאסטיות איכותיות הוא כיוון העין המנותחת המודבקת לפלטפורמה (שלב 2.1.9). נראה כי הטיה קלה (פחות מ- 10°) אינה משפיעה על התוצאות באופן משמעותי. ניסויים המבוצעים מחוץ למגבלה זו יכולים ליצור עקומות עם צורות החורגות מאלה המוצגות באיור 4. לדוגמה, חלק מהעיקולים האלה עשויים להיות בעלי שתי פסגות רחבות במקום אחת.

באופן אידיאלי, ההליך המתואר במאמר זה היה מבוצע ללא קיבוע של העיניים, אשר מגביל את היכולת שלנו להעריך את הפרמטרים הצמיגיים האמיתיים של סיבים זונולריים טריים. עם זאת, לאחר שהניסויים הראשוניים שלנו לא הראו הבדל משמעותי בין הדגימות הקבועות של paraformaldehyde לבין דגימות טריות, החלטנו לאמץ קיבעון מכיוון שהוא העניק מספר יתרונות. כפי שנרמז בפרוטוקול, השימוש ברקמות קבועות מסייע לשמר את המתיחה המקורית של הסיבים לניסויי משיכה למעלה. בנוסף, מצאנו כי קיבעון קידם הידבקות גדולה יותר של דבק UV לכמוסת העין, ובכך הפחית את הסיכויים של הבדיקה להתנתק מהעדשה במהלך פעולת המשיכה למעלה, כפי שבדרך כלל מנוסה עם דגימות טריות (ניתוק בדיקה ניתן לזהות בקלות כחזרה פתאומית של הכוח לרמה בסיסית). הקיבעון גם מנע קריסה של קיר העין בכיוון המשיכה. למרות מגבלה זו, השיטה שלנו מספקת גישה איתנה לקביעת התרומה היחסית של רכיבי חלבון לתכונות הוויסקולאסטיות של הסיבים הזונולריים.

למרות שעבודתנו עד כה התמקדה בתרומתם של חלבונים ספציפיים, השיטה יכולה להיות מותאמת בקלות כדי ללמוד את ההשפעה של גורמים חיצוניים לסיבים על תכונותיהם המכניות. גורמים אלה כוללים טמפרטורה, pH, ריכוז סידן, ואת הנוכחות או היעדר אנזימים cross-linking. מדידות דיוק גבוה ניתן להשיג באמצעות השיטה שלנו במצב דיפרנציאלי, כלומר, על ידי טרום מתח הסיבים zonular עם מתח / מתח ראשוני, ולאחר מכן לקרוא את ההבדל במתח המתעורר כאשר תנאים חיצוניים משתנים. חלק מההתערבויות הללו עשויות להשפיע על גמישות הרקמות המקיפות את הזונולה ולכן מייצרות שינויים במתח המתחרים באלה הנוצרים בזונולה. יהיה צורך במדידות בקרה עם רקמות מבודדות כדי להעריך את הרלוונטיות שלהן לניסויים המוצעים. אנו מצפים כי תופעות כאלה עשויות להיות זניחות, בהתבסס על תצפיות עם המצלמה הצדדית מראה כי רקמות רציפות מתנהגות כחומרים נוקשים מאוד שעוברים למעשה שום עיוות גם כאשר הסיבים הזונולריים נמתחים במלואם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 EY029130 (S.B.) ו- P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 וקרן המחקר אינס מנדל (R.P.M.), קרן מרפן, ומענק בלתי מוגבל למחלקה לרפואת עיניים ומדעי הראייה באוניברסיטת וושינגטון ממחקר למניעת עיוורון. ג'יי.אר גם קיבל מענק מהאוניברסיטה למדעי הבריאות ובית המרקחת לתמיכה בפרויקט זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/4-20 hex screws 3/4 inch long Thorlabs SH25S075
1/4-20 nut Hardware store
3D SLA printer Anycubic Photon
4-40 screws 3/8 inch long, 2 Hardware store
Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament WPI 1B120-3
Cyanoacrylate (super) glue Loctite
Digital Scale accurate to 0.01 g Vernier OHAUS Scout 220
Excel Microsoft Spreadsheet
Gas cigarette lighter
Inspection/dissection microscope Amscope SKU: SM-4NTP Working distance ~ 15 cm
Micromanipulator, Economy 4-axis WPI Kite-L
Motorized micrometer Thorlabs Z812B
Negative cylindrical lens Thorlabs LK1431L1 -75 mm focal length
Petri dishes, 50 mm
Post holder, 3 inches Thorlabs PH3
Post, 4 inches Thorlabs TR4
Scale logging software Vernier LoggePro
Servo motor controller Thorlabs KDC101
Servo motor controller software Thorlabs APT
Slotted base, 1 Thorlabs BA1S
Slotted bases, 2 Thorlabs BA2
Stand for micromanipular WPI M-10
USB-camera for microscope Amscope SKU: MD500
UV activated glue with UV source Amazon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: structural determinants of eye lens transparency. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
  2. Bassnett, S. Zinn's zonule. Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100902 (2021).
  3. Dureau, P. Pathophysiology of zonular diseases. Current Opinion in Ophthalmology. 19 (1), 27-30 (2008).
  4. Shi, Y., et al. Latent-transforming growth factor beta-binding protein-2 (LTBP-2) is required for longevity but not for development of zonular fibers. Matrix Biology. 95, 15-31 (2021).
  5. Ushiki, T. Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint. Archives of Histology and Cytology. 65 (2), 109-126 (2002).
  6. Bassnett, S. A method for preserving and visualizing the three-dimensional structure of the mouse zonule. Experimental Eye Research. 185, 107685 (2019).
  7. Todorovic, V., Rifkin, D. B. LTBPs, more than just an escort service. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (2), 410-418 (2012).
  8. Mecham, R. P., Gibson, M. A. The microfibril-associated glycoproteins (MAGPs) and the microfibrillar niche. Matrix Biology. 47, 13-33 (2015).
  9. Hubmacher, D., Reinhardt, D. P., Plesec, T., Schenke-Layland, K., Apte, S. S. Human eye development is characterized by coordinated expression of fibrillin isoforms. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (12), 7934-7944 (2014).
  10. Inoue, T., et al. Latent TGF-β binding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5672-5682 (2014).
  11. De Maria, A., Wilmarth, P. A., David, L. L., Bassnett, S. Proteomic analysis of the bovine and human ciliary zonule. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 573-585 (2017).
  12. Wright, D. M., Duance, V. C., Wess, T. J., Kielty, C. M., Purslow, P. P. The supramolecular organization of fibrillin-rich microfibrils determines the mechanical properties of bovine zonular filaments. Journal of Experimental Biology. 202 (21), 3011-3020 (1999).
  13. Bocskai, Z. I., Sandor, G. L., Kiss, Z., Bojtar, I., Nagy, Z. Z. Evaluation of the mechanical behaviour and estimation of the elastic properties of porcine zonular fibres. Journal of Biomechanics. 47 (13), 3264-3271 (2014).
  14. Fisher, R. F. The ciliary body in accommodation. Transactions of the Ophthalmological Societies of the United Kingdom. 105, Pt 2 208-219 (1986).
  15. Michael, R., et al. Elastic properties of human lens zonules as a function of age in presbyopes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (10), 6109-6114 (2012).
  16. van Alphen, G. W., Graebel, W. P. Elasticity of tissues involved in accommodation. Vision Research. 31 (7-8), 1417-1438 (1991).
  17. Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
  18. Jones, W., Rodriguez, J., Bassnett, S. Targeted deletion of fibrillin-1 in the mouse eye results in ectopia lentis and other ocular phenotypes associated with Marfan syndrome. Disease Models & Mechanisms. 12 (1), 037283 (2019).
  19. Weinbaum, J. S., et al. Deficiency in microfibril-associated glycoprotein-1 leads to complex phenotypes in multiple organ systems. Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25533-25543 (2008).
  20. Comeglio, P., Evans, A. L., Brice, G., Cooling, R. J., Child, A. H. Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus. British Journal of Ophthalmology. 86 (12), 1359-1362 (2002).

Tags

רפואה גיליון 178 מטריצה חוץ-תאית זונולה סיבים זונולריים צמיגות גליקופרוטאין-1 הקשור למיקרופיבריל חוזק מתיחה מודולוס אלסטי הרפיה במתח דגם ויסקולסטי מעין ליניארי
הכנה ביולוגית וטכניקה מכנית לקביעת תכונות ויסקולסטיות של סיבים זונולריים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodriguez, J., Reilly, M., Mecham,… More

Rodriguez, J., Reilly, M., Mecham, R. P., Bassnett, S. Biological Preparation and Mechanical Technique for Determining Viscoelastic Properties of Zonular Fibers. J. Vis. Exp. (178), e63171, doi:10.3791/63171 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter