Summary
يصف البروتوكول طريقة لدراسة مرونة لزوجة المصفوفة خارج الخلية واعتمادها على تكوين البروتين أو العوامل البيئية. نظام المصفوفة المستهدف هو منطقة الماوس. يتم إثبات أداء هذه الطريقة من خلال مقارنة السلوك اللزج المرن للألياف المناطقية من النوع البري مع تلك التي تفتقر إلى البروتين السكري المرتبط بالألياف الدقيقة -1.
Abstract
المرونة ضرورية لوظيفة الأنسجة مثل الأوعية الدموية والعضلات والرئتين. هذه الخاصية مشتقة في الغالب من المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، وهي شبكة البروتين التي تربط الخلايا والأنسجة معا. كيف ترتبط الخصائص المرنة لشبكة ECM بتكوينها ، وما إذا كانت خصائص الاسترخاء في ECM تلعب دورا فسيولوجيا ، هي أسئلة لم تتم معالجتها بالكامل بعد. يكمن جزء من التحدي في البنية المعقدة لمعظم أنظمة إدارة المحتوى المؤسسي وصعوبة عزل مكونات إدارة المحتوى المؤسسي دون المساس بهيكلها. أحد الاستثناءات هو zonule ، وهو نظام ECM موجود في عين الفقاريات. تتكون المنطقة من ألياف طولها مئات إلى آلاف الميكرومترات التي تمتد عبر المساحة الخالية من الخلايا بين العدسة وجدار العين. في هذا التقرير ، نصف تقنية ميكانيكية تستفيد من البنية عالية التنظيم للمنطقة لتحديد خصائصها المرنة اللزجة وتحديد مساهمة مكونات البروتين الفردية. تتضمن هذه الطريقة تشريح عين ثابتة لفضح العدسة والمنطقة وتستخدم تقنية السحب التي تمتد الألياف المناطقية بالتساوي أثناء مراقبة توترها. هذه التقنية غير مكلفة نسبيا ولكنها حساسة بما يكفي للكشف عن التغيرات في الخصائص اللزجة المرنة للألياف المناطقية في الفئران التي تفتقر إلى بروتينات إقليمية محددة أو مع الشيخوخة. على الرغم من أن الطريقة المعروضة هنا مصممة في المقام الأول لدراسة تطور العين ومرضها ، إلا أنها يمكن أن تكون أيضا نموذجا تجريبيا لاستكشاف أسئلة أوسع نطاقا تتعلق بالخصائص اللزجة المرنة ل ECM المرنة ودور العوامل الخارجية مثل التركيز الأيوني ودرجة الحرارة والتفاعلات مع جزيئات الإشارة.
Introduction
تحتوي عين الفقاريات على عدسة بصرية حية تساعد على تركيز الصور على شبكية العين1. يتم تعليق العدسة على المحور البصري بواسطة نظام من الألياف الدقيقة ذات التوجه الشعاعي ، كما هو موضح في الشكل 1A. في أحد الطرفين ، ترتبط الألياف بخط الاستواء للعدسة ، وفي الطرف الآخر ، بسطح الجسم الهدبي. تمتد أطوالها لمسافات تتراوح من 150 ميكرومتر في الفئران إلى 1 مم في البشر. بشكل جماعي ، تعرف هذه الألياف باسم zonule of Zinn2 ، أو المنطقة الهدبية ، أو ببساطة zonule. يمكن أن تؤثر صدمة العين والمرض وبعض الاضطرابات الوراثية على سلامة الألياف المناطقية3، مما يؤدي إلى فشلها في نهاية المطاف وما يصاحبها من فقدان للرؤية. في الفئران ، تحتوي الألياف على نواة تتكون في الغالب من بروتين الفيبريلين -2 ، وتحيط بها عباءة غنية بالفيبريلين-14. على الرغم من أن الألياف المناطقية فريدة من نوعها للعين ، إلا أنها تحمل العديد من أوجه التشابه مع ألياف ECM القائمة على الإيلاستين الموجودة في أماكن أخرى من الجسم. هذه الأخيرة مغطاة بعباءة فيبريلين-15 ولها أبعاد مماثلة للألياف المناطقية6. تم العثور على بروتينات أخرى ، مثل البروتينات المرتبطة بعامل النمو الكامن β (LTBPs) والبروتين السكري المرتبط بالألياف الدقيقة -1 (MAGP-1) ، بالاقتران مع كلا النوعين من الألياف 7،8،9،10،11. يتراوح معامل المرونة للألياف المناطقية بين 0.18-1.50 MPa12,13,14,15,16 ، مقارنة بالألياف القائمة على الإيلاستين (0.3-1.2 ميجا باسكال)17. تقودنا أوجه التشابه المعمارية والميكانيكية هذه إلى الاعتقاد بأن أي نظرة ثاقبة لأدوار البروتينات المرتبطة بالمناطق قد تساعد في توضيح أدوارها في الألياف المرنة الأخرى ECM.
الغرض الرئيسي من تطوير الطريقة الموصوفة هنا هو اكتساب نظرة ثاقبة حول دور بروتينات منطقة محددة في تطور أمراض العين الموروثة. النهج العام هو مقارنة الخصائص اللزجة المرنة للألياف المناطقية في الفئران من النوع البري مع تلك الخاصة بالفئران التي تحمل طفرات مستهدفة في الجينات التي تشفر البروتينات المناطقية. في حين تم استخدام العديد من الطرق سابقا لقياس الخصائص الميكانيكية المطاطية للألياف المناطقية ، فقد تم تصميمها جميعا لعيون الحيوانات الأكبر بكثير12،13،14،15،16. على هذا النحو النماذج ليست قابلة للجر وراثيا. سعينا إلى تطوير طريقة تجريبية أكثر ملاءمة للعيون الصغيرة والحساسة للفئران.
الطريقة التي طورناها لتقييم المرونة اللزجة للألياف المناطقية للفئران هي تقنية نشير إليها باسم فحص السحب 4,18 ، والذي يتم تلخيصه بصريا في الشكل 1. ويرد أدناه وصف مفصل لطريقة السحب وتحليل النتائج. نبدأ بوصف بناء الجهاز ، بما في ذلك الأجزاء المطبوعة ثلاثية الأبعاد (3D) المستخدمة في المشروع. بعد ذلك ، نقوم بتفصيل البروتوكول المستخدم للحصول على العيون وإعدادها للتجربة. أخيرا ، نقدم إرشادات خطوة بخطوة حول كيفية الحصول على بيانات لتحديد الخصائص اللزجة المرنة للألياف المناطقية. في قسم النتائج التمثيلية ، نشارك البيانات غير المنشورة سابقا التي تم الحصول عليها بطريقتنا حول الخصائص اللزجة المرنة للألياف المناطقية من الفئران التي تفتقر إلى MAGP-119 بالإضافة إلى مجموعة التحكم التي تم الحصول عليها من الحيوانات البرية المتطابقة مع العمر. وأخيرا ، نختتم بملاحظات عامة حول مزايا وقيود الطريقة ، واقتراحات للتجارب المحتملة التي قد توضح كيف تؤثر العوامل البيئية والكيميائية الحيوية على الخصائص اللزجة المرنة لألياف ECM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة الدراسات الحيوانية بجامعة واشنطن والتزمت ببيان ARVO لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية.
1. تصنيع الأجزاء المتخصصة وبناء الأجهزة
- تصنيع الأجزاء المتخصصة
- تصنيع المسبار. امسك شعرية زجاجية بزاوية كما هو موضح في اللوحة اليسرى من الشكل 2A. ضع لهبا من ولاعة السجائر على بعد حوالي 2 سم من أحد طرفيها واحتفظ بها هناك حتى تنحني النهاية بمقدار 90 درجة ، كما هو موضح في اللوحة اليمنى من الشكل 2A.
- نموذج تصنيع المنصة. باستخدام برنامج الرسم ثلاثي الأبعاد ، قم بتصميم منصة بقياس 30 × 30 × 5 مم وتحتوي على مسافات بادئة نصف كروية قطرها 2.0 و 2.5 و 3.0 مم ، كما هو موضح في الشكل 2B.
- تصنيع حامل التحقيق. باستخدام برنامج الرسم ثلاثي الأبعاد ، قم بتصميم حامل يحمل المسبار الشعري وإرفاقه بجهاز micromanipulator (انظر الشكل 2C).
ملاحظة: يتوفر نموذج ملف 3D لتصنيع المنصة وتصنيع حامل التحقيق بتنسيق STL عند الطلب من المؤلف المقابل. - تجميع عدسة سلبية. ضع عدسة أسطوانية سالبة (-75 مم في البعد البؤري وحوالي 50 مم في الارتفاع والطول) كما هو موضح في الشكل 1C والشكل 1D لتصحيح التشوه الناجم عن إضافة السائل إلى طبق Petri (إضافة السائل يشوه رؤية العين المشوهة عند تصويرها من الجانب).
- قم بلصق العدسة السالبة على إحدى القواعد ذات المشقوقين (انظر الشكل 2D لتحديد موضع العدسة على القاعدة).
- قم بتجميع الأجزاء المتبقية كما هو موضح في الشكل 2D.
- اضبط ارتفاع المنشور بحيث تحوم العدسة بالكاد فوق المقياس وشد المسمار في حامل العمود.
- بناء الأجهزة
- قم بتثبيت برنامج التسجيل المزود بالمقياس وبرنامج كاميرا المجهر وتطبيق وحدة التحكم في الميكرومتر الآلية على جهاز كمبيوتر.
- قم بتوصيل الميكرومتر المزود بمحرك بوحدة تحكم المحرك المؤازرة والأخير بالكمبيوتر. ابدأ تشغيل تطبيق وحدة التحكم في المحرك وقم بتحرير إعدادات المحرك.
ملاحظة: تم اختيار إعدادات المحرك ، المدرجة أدناه ، بعد تجارب أولية كشفت أن الضغوط ارتخت على مقياس زمني يتراوح بين 10 و 20 ثانية. وبناء على هذا التحديد، اخترنا السرعة والتسارع اللذين سمحا للمحرك بإكمال إزاحة 50 ميكرومتر في وقت أصغر من وقت الاسترخاء، ولكن ليس قصيرا جدا لتجنب هز العينة. هنا اخترنا وقت الإزاحة من حوالي 5-10 ثانية. - اضبط السرعة القصوى على 0.01 مم/ث والتسارع على 0.005 مم/ث2.
- قم بتثبيت الكاميرا في مجهر الفحص واختبر برنامج تصوير الكاميرا.
- ضع الميزان على مساحة المقعد المخصصة للجهاز.
- قم بلصق منصة مطبوعة ثلاثية الأبعاد (من الخطوة 1.1.2) إلى طبق بتري وأضف خرزة زجاجية 2-3 مم إلى أحد الآبار. ضع طبق بتري على الميزان بحيث تقع الخرزة بالقرب من وسط المقلاة.
- استبدل الميكرومتر اليدوي من الميكرومانيبولتر بالمحرك الآلي.
- المسمار اثنين من مسامير 4-40 في حامل التحقيق. قم بتوصيل حامل المسبار بالمتلاعب كما هو موضح في الشكل 1C.
- قم بإعداد مسبار كما هو موضح في الشكل 2A ، وضعه داخل حامل المسبار مع توجيه الجزء المنحني لأسفل ، وشد البراغي.
- ضع المتلاعب الدقيق على الطاولة بحيث يكون طرف المسبار فوق الخرزة على المنصة. قم بتثبيت المتلاعب الدقيق على الطاولة لمنع الحركة العرضية أثناء التجربة.
- ضع المجهر الجانبي على الطاولة بحيث تكون الخرزة في مركز مجال رؤيتها وفي بؤرة التركيز.
2. إعداد العينات والحصول على البيانات
- تثبيت العين وتشريحها
- الحفاظ على الفئران البرية والحيوانات الخالية من Magp1 على خلفية C57 / BL6J متطابقة. القتل الرحيم للفئران البالغة من العمر 1 شهر أو 1 سنة عن طريق استنشاق CO2 .
- قم بإزالة العينين باستخدام ملقط ناعم وثبت الكرات الأرضية المتناثرة عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها بنسبة 4٪ من محلول ملحي بارافورمالدهيد / فوسفات (PBS ، درجة الحموضة 7.4). الحفاظ على ضغط إيجابي من 15-20 مم زئبق في العين أثناء عملية التثبيت ، كما هو موضح 6.
ملاحظة: تجرى التجارب على ذكور الفئران، للسيطرة على الاختلافات المحتملة المتعلقة بالجنس في حجم الكرة الأرضية. يضمن الضغط الإيجابي بقاء الكرة الأرضية منتفخة ، مما يحافظ على الفجوة بين العدسة وجدار العين الممتد بواسطة الألياف المناطقية. - اغسل العينين لمدة 10 دقائق في PBS. باستخدام مقص جراحي للعيون والعمل تحت المجهر المجسم، قم بعمل شق كامل السماكة في جدار العين بالقرب من رأس العصب البصري.
- قم بتمديد القطع إلى الأمام إلى خط الاستواء ، ثم حول المحيط الاستوائي للعين. احرص على تجنيب العمليات الهدبية الحساسة والألياف المناطقية المرتبطة بها.
- قم بإزالة الجزء الخلفي من الكرة الأرضية، مع تعريض السطح الخلفي للعدسة.
- استخدم الملقط لإزالة العين المشوهة من المحلول العازل ووضعها على مسح جاف للمهمة مع توجيه القرنية لأسفل. اسحب القرنية برفق على سطح المسح لتجفيفها.
- أضف 3 ميكرولتر من الغراء الفوري إلى آبار المنصة التي ستستوعب العين في طبق بتري.
- ضع الطبق على طبق المسرح من المجهر المجسم بحيث يكون البئر مع الغراء في الأفق.
- انقل العين من المسح إلى حافة البئر التي تحتوي على الغراء. بعد ذلك ، اسحب العين بعناية إلى البئر واضبط اتجاهها بسرعة بحيث يكون الجزء الخلفي من العدسة في الأعلى.
- جفف الجانب المكشوف من العدسة عن طريق نفخها بلطف بزاوية منديل جاف.
- ضع رباطا من الغراء الفوري على قاع طبق بتري 50 مم وقم بإسمنت المنصة عليه.
- قياس الاستجابة اللزجة المرنة المناطقية
- قم بتشغيل المقياس ، وابدأ تشغيل برنامج تسجيل المقياس وبرنامج الكاميرا. تأكد من أن برنامج التسجيل يمكنه الحصول على البيانات لمدة 30 دقيقة ، حيث يمكن أن تستمر بعض التجارب لفترة طويلة.
- قم بتشغيل وحدة تحكم المحرك المؤازرة وابدأ تشغيل تطبيق وحدة التحكم على الكمبيوتر. تأكد من تعيين وحدة التحكم للتحرك بزيادات 50 ميكرومتر باستخدام معلمات الحركة المشابهة لتلك الموضحة في الملاحظة في الخطوة 1.2.2.
- قم بإنشاء انحناء 90 درجة في قضيب شعري كما هو موضح في الخطوة 1.1.1.
- انزلق الشعيرات الدموية المنحنية في حامل المسبار الشعري وشد مسامير التأمين.
ملاحظة: لتقليل جفاف العينة، نوصي بإكمال الخطوات من 1 إلى 4 قبل تشريح العين أو أثناءه. - أضف حبة صغيرة (~ 1 مم) من الغراء المعالج للأشعة فوق البنفسجية إلى طرف الشعيرات الدموية.
- باستخدام التعديلات اليدوية على المتلاعب ، حرك طرف المسبار الشعري بحيث يكون مباشرة فوق مركز العدسة. تحقق مما إذا كان الجزء السفلي من غراء الأشعة فوق البنفسجية يظهر في الوسط فوق الجزء العلوي من العدسة عند النظر إليه من الأمام (عن طريق الفحص البصري) والجانب (من خلال كاميرا المجهر).
- أثناء النظر من خلال الكاميرا، اخفض طرف المسبار حتى يتلامس الغراء فوق البنفسجي مع العدسة ويغطي ثلث إلى نصف سطحها العلوي.
- استخدم مصدر ضوء منخفض الكثافة (~ 1 mW) ، اتجاهي ، قريب من الرؤية للأشعة فوق البنفسجية (380-400 نانومتر) لعلاج الغراء.
ملاحظة: هذه المواصفات كافية لعلاج الغراء في بضع ثوان مع تقليل إمكانية تحفيز الترابط المتقاطع للبروتين. مصادر الأشعة فوق البنفسجية المزودة بأقلام الغراء التجارية للأشعة فوق البنفسجية تلبي هذه المواصفات. - أضف محلول PBS إلى الطبق حتى يتم تغطية العين بالسائل على عمق لا يقل عن 2 مم.
- ضع العدسة الأسطوانية أمام مجهر الفحص وأقرب ما يمكن إلى طبق بتري دون لمسه.
- ابدأ تشغيل برنامج التسجيل وبرنامج مؤقت في وقت واحد. التقط صورة للعين / المسبار باستخدام الكاميرا.
- بعد 60 ثانية ، ابدأ إزاحة 50 ميكرومتر أخرى ، وبعد ذلك كل 60 ثانية حتى تكتمل التجربة ، أي حتى يتم كسر جميع الألياف. لاحظ أن الإشارة لن تعود إلى مستويات خط الأساس بسبب تبخر المخزن المؤقت أثناء التجربة. تصحيح الانجراف الناتج عن ذلك في القراءات أثناء تحليل البيانات، كما هو موضح في الخطوة 2.2.14.
- عند الانتهاء من التشغيل، احفظ بيانات تسجيل المقياس وقم بتصديرها إلى تنسيق متوافق مع جدول البيانات، على سبيل المثال، تنسيق .csv. احفظ صور العدسة التي تم جمعها أثناء التشغيل.
- استيراد البيانات إلى جدول بيانات. استخدم قراءة المقياس الأولى والأخيرة لاستيعاب الانجراف في قراءة الخلفية بمرور الوقت بسبب التبخر (انظر الشكل 3). اطرح القراءة المستوفاة من القراءة في كل نقطة زمنية.
ملاحظة: في حالة استخدام جدول بيانات، يمكن إجراء الاستيفاء تلقائيا عن طريق إدخال الصيغة = B2 - $B$2 + ($B$2 - @INDIRECT("B"&COUNTA(B:B))))/(COUNTA(B:B)-2) * A2 في الخلية الموجودة على يسار قراءة المقياس الأول، ثم تحريك المؤشر إلى الزاوية السفلية اليمنى من الخلية وسحبه لأسفل إلى آخر قيمة بيانات. تفترض الصيغة أن البيانات منظمة في عمود مع ظهور أول نقطة بيانات في الخلية B2. إذا رغبت في ذلك ، يمكن تحليل البيانات التي تمت معالجتها في الخطوة 2.2.14 باستخدام النموذج اللزج المرن شبه المرن الذي طوره أحد المؤلفين المشاركين ، الدكتور ماثيو رايلي 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
توفر تقنية السحب الموصوفة هنا نهجا مباشرا لتحديد الخصائص اللزجة المرنة للألياف المناطقية في الفئران. باختصار ، يتم الحفاظ على عين الفأر أولا عن طريق حقن مثبت عند الضغط الفسيولوجي داخل العين. يحافظ هذا النهج على التضخم الطبيعي للعين ويحافظ على الألياف مشدودة مسبقا بشكل صحيح (اعتبر التثبيت مقبولا بعد أن أثبتت التجارب الأولية أنه لم يغير مرونة أو قوة الألياف بشكل كبير). ثم تتم إزالة الجزء الخلفي من عين الفأر عن طريق تشريح لفضح العدسة والألياف المناطقية التي تعلقها. يتم تثبيت الجزء الأمامي من العين على منصة ووضعه داخل طبق بتري الذي يقع على مقياس رقمي. بعد ذلك ، يتم تثبيت الشعيرات الدموية الزجاجية المتصلة بجهاز المعالجة الدقيقة على السطح الخلفي للعدسة. ثم يتم رفع العدسة بزيادات 50 ميكرومتر بينما يتم تسجيل القوة على المقياس. يوفر انخفاض الوزن الظاهري للتحضير معلومات حول القوى التي تمدد الألياف. يتبع كل إزاحة فترة توازن تستمر حوالي 1 دقيقة لمراقبة أي استرخاء للإجهاد الناجم عن الإزاحة. وأخيرا، يتم تحليل النتائج باستخدام نموذج لزج مرن شبه خطي مصمم خصيصا لهندسة الألياف المناطقية للفأر واتجاه السحب للفحص4.
يتم عرض البيانات اللزجة المرنة النموذجية التي تم الحصول عليها باستخدام طريقتنا في الشكل 3. يبدو المنحنى مقلوبا (سالبا) لأن قوة الرفع على العدسة تقلل من وزن مجموعة الطبق / المنصة / العين على الميزان بمقدار مكافئ. تتضمن الاستجابة طفرات قوة لحظية خلال كل من الإزاحة الرأسية للعدسة البالغة 50 ميكرومتر ، تليها مرحلة استرخاء مع عمر يبلغ 10 ثوان. وقد لوحظ استرخاء مماثل للإجهاد بالنسبة للألياف الحيوانية البقرية12. يزداد حجم القوى الفورية والمسترخية مع كل خطوة تصل إلى حوالي 1000 ثانية (~ 800 ميكرومتر من الإزاحة الكلية) ثم تبدأ في الانخفاض مع بدء الألياف في الفشل. يكتمل فشل Zonule بالنقطة الزمنية 1500 ثانية (~ 1.25 مم إجمالي الإزاحة). لاحظ أنه بسبب تبخر المخزن المؤقت أثناء التجربة ، لا يعود المنحنى إلى القراءة الأولية بعد تحرير العدسة من العين.
يتناقض الشكل 4 مع الاستجابات التي تم الحصول عليها لفأر Magp-1 بالضربة القاضية (المنحنى الأحمر) من النوع البري المطابق للعمر (المنحنى الأزرق). تم تصحيح هذه المنحنيات للتبخر ، مقلوبة ، ويتم الآن التعبير عن القياسات الخام للكتلة (انظر الشكل 3) كقوة (بوحدات mN). تشبه الاستجابة اللزجة المرنة الأولية للمنطقة المستنفدة Magp-1 (الوقت 0-600 s) إلى حد كبير استجابة النوع البري ، مما يشير إلى أن الخصائص اللزجة المرنة للمنطقة لم تتغير بشكل كبير بسبب عدم وجود Magp-1. ومع ذلك ، يبدو أن الألياف تتمزق بتوتر أقل بكثير مقارنة بنظيراتها من النوع البري.
لتوضيح موثوقية الطريقة ، جمعنا بيانات من متعددة حول أقصى قوة لحظية مطبقة على العينين قبل تمزق أليافها. وتظهر النتائج في الشكل 5. تظهر البيانات الخاصة بالفئران البالغة من العمر 1 شهرا قيما صغيرة جدا للخطأ القياسي للمتوسط (SEM) على الرغم من العدد المنخفض نسبيا من العينات المستخدمة (n = 5 أو 6) ، مما يشير إلى قابلية عالية للتكرار. تشير النتائج إلى أن قوة الألياف تختلف اختلافا كبيرا بين النوعين الوراثيين (قيمة p = 2.4 × 10-6). تشير النتائج غير الموضحة في الأرقام أيضا إلى أن هناك زيادة طفيفة ولكنها ذات دلالة إحصائية في قوة كسر القوة مع تقدم العمر للحيوانات من النوع البري (قيمة p = 0.024).
يمكن لطريقة السحب أيضا توليد تقديرات كمية للمعلمات المرنة اللزجة التي تفسر الاختلافات الملحوظة في الاستجابات الزمنية. يلخص الجدول 1 المعلمات الأكثر ملاءمة لبيانات MAGP-1 الخاصة بنا، والتي تم الحصول عليها باستخدام نموذج لزج مرن شبه خطي موصوف سابقا4. تظهر النتائج أن كلا من حذف MAGP-1 والشيخوخة يمكن أن يكون لهما تأثيرات كبيرة للغاية على بعض الخواص الميكانيكية للألياف المناطقية.
الشكل 1: ملخص مرئي لطريقة السحب. (أ) منظر مقطعي عرضي لعين فقارية يظهر العدسة والألياف المناطقية التي تعلقها. (ب) نهج عام لتحديد السلوك اللزج المرن في الألياف المناطقية عن طريق إزاحة العدسة لأعلى (بعيدا عن القرنية). (ج) منظر فعلي لعين تشريحية ملتصقة بمنصة مع سحب عدستها لأعلى بواسطة مسبار زجاجي متصل بجهاز مناور دقيق. (د) التخطيط التخطيطي للجهاز بأكمله. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تصنيع أجزاء مختلفة . (أ) تصنيع المسبار الزجاجي. يتم تثبيت الشعيرات الدموية الزجاجية بزاوية ويتم تطبيق اللهب في بقعة تبعد حوالي 2 سم عن أحد طرفيها. في غضون بضع ثوان ، تبدأ نهاية الشعيرات الدموية في السقوط. تتم إزالة اللهب عندما يتم ثني نهاية الشعيرات الدموية عند حوالي 90 درجة. (ب) تصنيع منصة العين. يتم تصنيع الجزء باستخدام طابعة الطباعة الحجرية المجسمة 3D (SLA). يبلغ قياسه 30 × 30 × 5 مم ويحتوي على ثلاث مسافات بادئة نصف كروية بأقطار 2.0 و 2.5 و 3.0 مم يتم لصق عيون تشريحية من مختلف الأحجام. (ج) تصنيع حامل التحقيق. تم تصنيع هذا الجزء أيضا باستخدام طابعة SLA 3D. يتكون من قضيبين متعامدين قطرهما 7.3 مم. يحتوي القضيب السفلي على تجويف 1.5 مم وثقبين 2.5 مم من خلال فتحات على السطح الخارجي لاستيعاب البراغي المعدنية التي تثبت المسبار الشعري في مكانه. (د) تجميع العدسة السلبية. تحتوي الصور التي تم التقاطها بواسطة المجهر الجانبي على تشوه استجماتي بسبب انحناء طبق بتري والمحلول العازل. تم تصميم مجموعة العدسات للتعويض عن التشويه، مما يسمح للمجهر الجانبي بالتقاط الصور بتركيز بؤري حاد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: البيانات الخام النموذجية التي تم الحصول عليها باستخدام الفحص. تم تسجيل الرسم البياني الموضح باستخدام برنامج تسجيل يسجل البيانات من مقياس رقمي بدقة 0.01 جم. تعكس الحافة اليسرى للرسم البياني (الوقت 0) وزن العينة بدون قوة رفع. يصور المحور y الكتلة في g. ثم يتم رفع العدسة في خطوات 50 ميكرومتر حتى يتم كسر جميع الألياف المناطقية ويستند طبق بتري مرة أخرى بالكامل على المقياس. لاحظ أن القراءة النهائية تتم إزاحتها عن القراءة الأولية. ويرجع الإزاحة إلى التبخر التدريجي للحل المخزن المؤقت أثناء سير التجربة ويمكن حسابها أثناء تحليل البيانات، على النحو المبين في الخطوة 2-2-14. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: منحنيات إزاحة القوة المناطقية التمثيلية للفئران من النوع البري والفئران الناقصة MAGP-1. يقارن الرسم البياني الاستجابة المرنة اللزجة التي تم الحصول عليها بعد الإزاحة المنفصلة للعدسة بعيدا عن موضع توازنها. تتعقب استجابة العين من فأر MAGP-1 بالضربة القاضية (KO) استجابة من النوع البري المطابق للعمر حتى النقطة التي تنكسر فيها الألياف الموجودة في الماوس بالضربة القاضية قبل الأوان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: قوى كسر الألياف المناطقية التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة السحب ل MAGP-1 KO مقابل الفئران من النوع البري وفي عمرين. تستند جميع القياسات المعروضة إلى n = 5 أو 6 عيون ، مع أشرطة خطأ تمثل الخطأ القياسي للمتوسط (SEM). الاختصارات: WT = النوع البري; KO = MAGP-1 بالضربة القاضية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| النمط الوراثي / العمر | G0 (باسكال) | G∞ (باسكال) | Ʈ (ثانية) | σ ( باسكال) | |
| WT 1 شهر | دني | 2.34E+05 | 9.33E+04 | 16.3 | 9.61E+05 |
| اس دي | 2.83E+04 | 2.94E+04 | 3.4 | 1.25E+05 | |
| 95٪ Cl | 5.55E+04 | 5.76E+04 | 6.7 | 2.45E+05 | |
| KO 1 شهر | دني | 2.73E+05 | 6.74E+04 | 17.6 | 4.44E+05 |
| اس دي | 6.30E+04 | 2.06E+04 | 3.8 | 7.85E+04 | |
| 95٪ Cl | 1.23E+05 | 4.03E+04 | 7.5 | 1.54E+05 | |
| قيم p | 0.25 | 0.12 | 0.58 | 0.000022 | |
| WT 1 سنة | دني | 1.98E+05 | 7.42E+04 | 17 | 1.41E+06 |
| اس دي | 1.17E+05 | 2.39E+04 | 9.1 | 2.44E+05 | |
| 95٪ Cl | 2.29E+05 | 4.69E+04 | 17.9 | 4.79E+05 | |
| KO 1 سنة | دني | 1.70E+04 | 2.46E+04 | 12.9 | 5.05E+05 |
| اس دي | 9.06E+03 | 8.04E+03 | 7.4 | 1.48E+05 | |
| 95٪ Cl | 1.78E+04 | 1.58E+04 | 14.4 | 2.91E+05 | |
| قيم p | 0.0063 | 0.001 | 0.41 | 0.000014 | |
| قيم p، العمر | WT | 0.46 | 0.23 | 0.85 | 0.002 |
| كو | 0.0007 | 0.0068 | 0.26 | 0.44 | |
الجدول 1: الخصائص اللزجة المرنة التي تم الحصول عليها باستخدام نموذج اللزوجة المرنة شبه الخطية (QLV). تم تحليل عمليات مسح البيانات مثل تلك الموضحة في الشكل 4 باستخدام نموذج QLV الذي تم تطويره خصيصا لفحص السحب ومنطقة الماوس. يتم عرض أفضل المعلمات ملاءمة للصلابة الفورية (G0) والتوازن (G∞) ، وثابت وقت الاسترخاء (τ) ، وقوة الشد النهائية (σ f). الاختصارات: SD = الانحراف المعياري; CI = فاصل الثقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ال zonule هو نظام ECM غير عادي حيث يتم ترتيب الألياف بشكل متماثل ويمكن التلاعب بها بشكل متطابق عن طريق إزاحة عدسة العين على طول المحور البصري. يمكن أيضا الوصول إلى الفضاء بسهولة دون انقطاع خلوي ، مما يسمح بدراسة الألياف في بيئة قريبة من حالتها الأصلية. تستفيد تقنية السحب من عرض ECM هذا للتعامل مع الألياف الحساسة من الفئران ، وهو نظام قابل للسحب وراثيا ، وتحديد خصائصها الميكانيكية بدقة. وقد سمح لنا ذلك بفحص مساهمة بروتينات ECM الرئيسية (fibrillin-118 و LTBP-24 و MAGP-1 المذكورة هنا) في الخصائص الميكانيكية الحيوية للألياف الإقليمية. كشف تحليلنا للفئران التي تعاني من نقص الفيبريلين-1 أن الألياف المناطقية التي تفتقر إلى الفيبريلين-1 تضعف مع تقدم العمر وتتمزق في نهاية المطاف، مما يؤدي إلى إزاحة العدسة داخل العين (في البشر، وهي حالة تعرف باسم ectopia lentis). ومن الجدير بالذكر أن خلع العدسة هو أيضا أمر شائع الحدوث في المرضى الذين يعانون من متلازمة مارفان ، وهو مرض ناجم عن طفرات في جين FBN1 20. وبالتالي ، فإن فحص السحب يوفر فرصة لنمذجة جوانب مرض النسيج الضام البشري في الفئران. في الفئران التي تفتقر إلى LTPB-2 (وهو بروتين يعتقد أنه يشارك في نشأة الألياف الدقيقة) ، تمكنا من إثبات أن الألياف المناطقية تم إنتاجها في غياب هذا البروتين ، ولكنها تمزقت عند ضغوط أقل بكثير وتفككت في النهاية مع تقدم العمر4. تشير هذه النتائج إلى أن LTBP-2 يساهم في طول عمر الألياف بدلا من توليفها. في الدراسة الحالية ، قررنا أن الألياف التي تعاني من نقص MAGP-1 لها خصائص مرنة لزجة مماثلة للألياف من النوع البري ولكنها تتمزق عند ضغوط أقل ، مع عدم وجود علامة على مزيد من التدهور المرتبط بالعمر. سيكون هذا متسقا مع نموذج تكون فيه الألياف التي تفتقر إلى MAGP-1 أضعف في جوهرها بمجرد تطورها.
نلاحظ أن قوة الشد النهائية المدرجة في الجدول 1 تقدر على افتراض أن الألياف تنكسر في مكان ما في منتصف المدى. ومع ذلك ، لا يمكننا استبعاد احتمال أن يكون فشل الألياف ناتجا عن الانفصال عن نقاط التثبيت على سطح العدسة أو الجسم الهدبي. إذا كان هذا هو الحال ، فقد تكون قوة شد الكسر للألياف أعلى من القيم المدرجة في الجدول 1. وستكون هناك حاجة إلى تحليل مجهري للتمييز بين هذه الاحتمالات. مثل هذا التحليل أبعد ما يكون عن التافه لأن الألياف المعنية رقيقة جدا (~ 0.5-0.6 ميكرومتر في العرض) ومطابقة تقريبا للمؤشر مع الماء ، مما يجعلها غير مرئية بشكل أساسي. وفي غياب هذه المعلومات الإضافية، لا يسعنا إلا أن نذكر أن قوة الشد النهائية المدرجة في الجدول 1 تمثل حدودها الدنيا. سيكون من المثير للاهتمام أيضا ، من حيث المبدأ ، التحقق مما إذا كانت قياسات القوة تختلف اعتمادا على الاتجاه الذي يتم فيه سحب العدسة. ومع ذلك ، في الممارسة العملية ، يتطلب سحب العدسة من الجانب الأمامي إزالة القزحية دون إتلاف الألياف المناطقية الموجودة تحتها مباشرة. هذا التشريح الدقيق يتجاوز ما يمكننا تحقيقه حاليا بعين الماوس.
البساطة النسبية للطريقة والقابلية العالية للتكرار لنتائجها هي صفات مرغوبة للدراسات المقارنة للخصائص الميكانيكية ECM. بالإضافة إلى ذلك ، كما هو موضح هنا ، من الممكن أيضا استخدام مقايسة السحب للحصول على قيم مطلقة للمعلمات المرنة اللزجة عن طريق افتراض نموذج مرن لزج وتركيب منحنيات الوقت له. على سبيل المثال، باستخدام نموذج قياسي شبه خطي للمرونة اللزجة (QLV)، تمكنا من استخراج قيم للصلابة الفورية (G0) والتوازن (G∞)، وثابت وقت الاسترخاء (τ)، وقوة الشد النهائية (σ f) للألياف المناطقية من الفئران البرية، وكذلك تلك التي تفتقر إلى LTBP-24 أو MAGP-1. تتراوح قيم G0 و G∞ التي تم الحصول عليها للحيوانات البرية في كلتا الدراستين من 6.7 × 104 باسكال إلى 2.3 × 105 باسكال ، وهو نطاق يمكن مقارنته على نطاق واسع بتلك الموجودة في الألياف الأكبر حجما المشتقة من المناطق البشرية والبقرية والخنازير (1.8 × 105-1.5 × 106 باسكال) 12,13 ، 14,15,16. يشير هذا الاتفاق بين الأنواع إلى أن هذه ميزات عالمية لهذه الألياف ، ويمنحنا الثقة في أنه يمكن استخراج معلمات مرنة لزجة ذات مغزى بطريقتنا.
تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة للحصول على استجابات مرنة لزجة عالية الجودة في توجيه العين المشوهة الملصقة على المنصة (الخطوة 2.1.9). لا يبدو أن الإمالة الطفيفة (أقل من 10 درجات) تؤثر على النتائج بشكل كبير. يمكن للتجارب التي يتم إجراؤها خارج هذا الحد أن تولد منحنيات بأشكال تنحرف عن تلك الموضحة في الشكل 4. على سبيل المثال ، قد تمتلك بعض هذه المنحنيات قمتين عريضتين بدلا من واحدة.
من الناحية المثالية ، كان من الممكن تنفيذ الإجراء الموضح في هذه الورقة دون تثبيت العينين ، مما يحد من قدرتنا على تقييم المعلمات اللزجة المرنة الحقيقية للألياف المناطقية الطازجة. ومع ذلك ، بعد أن أظهرت تجاربنا الأولية عدم وجود فرق كبير بين العينات الثابتة شبه الفورمالديهايد والعينات الجديدة ، قررنا اعتماد التثبيت لأنه يوفر العديد من المزايا. وكما هو مبين في البروتوكول، فإن استخدام الأنسجة الثابتة يساعد على الحفاظ على الامتداد الأصلي للألياف لتجارب السحب. بالإضافة إلى ذلك ، وجدنا أن التثبيت عزز زيادة التصاق الغراء بالأشعة فوق البنفسجية بكبسولة العين ، مما يقلل من فرص انفصال المسبار عن العدسة أثناء إجراء السحب ، كما هو شائع مع العينات الجديدة (يمكن التعرف بسهولة على انفصال المسبار كعودة مفاجئة للقوة إلى مستوى خط الأساس). كما منع التثبيت التواء جدار العين في اتجاه السحب. على الرغم من هذا القيد ، توفر طريقتنا نهجا قويا لتحديد المساهمة النسبية لمكونات البروتين في الخصائص اللزجة المرنة للألياف الإقليمية.
على الرغم من أن عملنا حتى الآن قد ركز على مساهمة بروتينات محددة ، إلا أنه يمكن بسهولة تكييف الطريقة لدراسة تأثير العوامل الخارجية للألياف على خصائصها الميكانيكية. وتشمل هذه العوامل درجة الحرارة ودرجة الحموضة وتركيز الكالسيوم ووجود أو عدم وجود إنزيمات متقاطعة. يمكن تحقيق قياسات عالية الدقة باستخدام طريقتنا في الوضع التفاضلي ، أي عن طريق الشد المسبق للألياف المناطقية بإجهاد / إجهاد أولي ، ثم قراءة الفرق في التوتر الذي ينتج عند تغيير الظروف الخارجية. قد تؤثر بعض هذه التدخلات على مرونة الأنسجة المحيطة بالمنطقة وبالتالي تنتج تغييرات في التوتر تتنافس مع تلك المتولدة في المنطقة. ستكون هناك حاجة إلى قياسات التحكم مع الأنسجة المعزولة لتقييم مدى صلتها بالتجارب المقترحة. نتوقع أن تكون هذه الآثار ضئيلة ، استنادا إلى الملاحظات مع الكاميرا الجانبية التي تظهر أن الأنسجة المتجاورة تتصرف كمواد شديدة الصلابة لا تخضع أساسا لأي تشوه حتى عندما تكون الألياف المناطقية ممتدة بالكامل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل NIH R01 EY029130 (S.B.) و P30 EY002687 (S.B.) ، R01 HL53325 ومؤسسة Ines Mandl Research Foundation (R.P.M.) ، ومؤسسة Marfan ، ومنحة غير مقيدة لقسم طب العيون والعلوم البصرية في جامعة واشنطن من البحث لمنع العمى. كما حصل ج. ر. على منحة من جامعة العلوم الصحية والصيدلة لدعم هذا المشروع.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4-20 hex screws 3/4 inch long | Thorlabs | SH25S075 | |
| 1/4-20 nut | Hardware store | ||
| 3D SLA printer | Anycubic | Photon | |
| 4-40 screws 3/8 inch long, 2 | Hardware store | ||
| Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament | WPI | 1B120-3 | |
| Cyanoacrylate (super) glue | Loctite | ||
| Digital Scale accurate to 0.01 g | Vernier | OHAUS Scout 220 | |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet | |
| Gas cigarette lighter | |||
| Inspection/dissection microscope | Amscope | SKU: SM-4NTP | Working distance ~ 15 cm |
| Micromanipulator, Economy 4-axis | WPI | Kite-L | |
| Motorized micrometer | Thorlabs | Z812B | |
| Negative cylindrical lens | Thorlabs | LK1431L1 | -75 mm focal length |
| Petri dishes, 50 mm | |||
| Post holder, 3 inches | Thorlabs | PH3 | |
| Post, 4 inches | Thorlabs | TR4 | |
| Scale logging software | Vernier | LoggePro | |
| Servo motor controller | Thorlabs | KDC101 | |
| Servo motor controller software | Thorlabs | APT | |
| Slotted base, 1 | Thorlabs | BA1S | |
| Slotted bases, 2 | Thorlabs | BA2 | |
| Stand for micromanipular | WPI | M-10 | |
| USB-camera for microscope | Amscope | SKU: MD500 | |
| UV activated glue with UV source | Amazon |
References
- Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: structural determinants of eye lens transparency. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
- Bassnett, S.
- Dureau, P.
- Shi, Y., et al. Latent-transforming growth factor beta-binding protein-2 (LTBP-2) is required for longevity but not for development of zonular fibers. Matrix Biology. 95, 15-31 (2021).
- Ushiki, T. Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint. Archives of Histology and Cytology. 65 (2), 109-126 (2002).
- Bassnett, S. A method for preserving and visualizing the three-dimensional structure of the mouse zonule. Experimental Eye Research. 185, 107685 (2019).
- Todorovic, V., Rifkin, D. B. LTBPs, more than just an escort service. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (2), 410-418 (2012).
- Mecham, R. P., Gibson, M. A. The microfibril-associated glycoproteins (MAGPs) and the microfibrillar niche. Matrix Biology. 47, 13-33 (2015).
- Hubmacher, D., Reinhardt, D. P., Plesec, T., Schenke-Layland, K., Apte, S. S. Human eye development is characterized by coordinated expression of fibrillin isoforms. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (12), 7934-7944 (2014).
- Inoue, T., et al. Latent TGF-β binding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5672-5682 (2014).
- De Maria, A., Wilmarth, P. A., David, L. L., Bassnett, S. Proteomic analysis of the bovine and human ciliary zonule. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 573-585 (2017).
- Wright, D. M., Duance, V. C., Wess, T. J., Kielty, C. M., Purslow, P. P. The supramolecular organization of fibrillin-rich microfibrils determines the mechanical properties of bovine zonular filaments. Journal of Experimental Biology. 202 (21), 3011-3020 (1999).
- Bocskai, Z. I., Sandor, G. L., Kiss, Z., Bojtar, I., Nagy, Z. Z. Evaluation of the mechanical behaviour and estimation of the elastic properties of porcine zonular fibres. Journal of Biomechanics. 47 (13), 3264-3271 (2014).
- Fisher, R. F.
- Michael, R., et al. Elastic properties of human lens zonules as a function of age in presbyopes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (10), 6109-6114 (2012).
- van Alphen, G. W., Graebel, W. P.
- Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
- Jones, W., Rodriguez, J., Bassnett, S. Targeted deletion of fibrillin-1 in the mouse eye results in ectopia lentis and other ocular phenotypes associated with Marfan syndrome. Disease Models & Mechanisms. 12 (1), 037283 (2019).
- Weinbaum, J. S., et al. Deficiency in microfibril-associated glycoprotein-1 leads to complex phenotypes in multiple organ systems. Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25533-25543 (2008).
- Comeglio, P., Evans, A. L., Brice, G., Cooling, R. J., Child, A. H. Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus. British Journal of Ophthalmology. 86 (12), 1359-1362 (2002).
