Summary
Het protocol beschrijft een methode voor de studie van extracellulaire matrix visco-elasticiteit en de afhankelijkheid ervan van eiwitsamenstelling of omgevingsfactoren. Het beoogde matrixsysteem is de muiszone. De prestaties van de methode worden aangetoond door het visco-elastische gedrag van wild-type zonulaire vezels te vergelijken met die zonder microfibril-geassocieerd glycoproteïne-1.
Abstract
Elasticiteit is essentieel voor de functie van weefsels zoals bloedvaten, spieren en longen. Deze eigenschap is grotendeels afgeleid van de extracellulaire matrix (ECM), het eiwitnetwerk dat cellen en weefsels aan elkaar bindt. Hoe de elastische eigenschappen van een ECM-netwerk zich verhouden tot de samenstelling ervan, en of de relaxatie-eigenschappen van de ECM een fysiologische rol spelen, zijn vragen die nog volledig moeten worden aangepakt. Een deel van de uitdaging ligt in de complexe architectuur van de meeste ECM-systemen en de moeilijkheid om ECM-componenten te isoleren zonder hun structuur in gevaar te brengen. Een uitzondering is de zonule, een ECM-systeem dat voorkomt in het oog van gewervelde dieren. De zone bestaat uit vezels van honderden tot duizenden micrometers die de celvrije ruimte tussen de lens en de oogwand overspannen. In dit rapport beschrijven we een mechanische techniek die gebruik maakt van de sterk georganiseerde structuur van de zone om de visco-elastische eigenschappen te kwantificeren en de bijdrage van individuele eiwitcomponenten te bepalen. De methode omvat dissectie van een vast oog om de lens en de zonulus te belichten en maakt gebruik van een pull-up-techniek die de zonulaire vezels gelijk rekt terwijl hun spanning wordt bewaakt. De techniek is relatief goedkoop maar gevoelig genoeg om veranderingen in visco-elastische eigenschappen van zonulaire vezels te detecteren bij muizen zonder specifieke zonulaire eiwitten of met veroudering. Hoewel de hier gepresenteerde methode voornamelijk is ontworpen voor het bestuderen van oculaire ontwikkeling en ziekte, zou het ook kunnen dienen als een experimenteel model voor het verkennen van bredere vragen met betrekking tot de visco-elastische eigenschappen van elastische ECM's en de rol van externe factoren zoals ionische concentratie, temperatuur en interacties met signaalmoleculen.
Introduction
Het oog van een gewerveld dier bevat een levende optische lens die helpt bij het scherpstellen van beelden op het netvlies1. De lens wordt opgehangen aan de optische as door een systeem van delicate, radiaal georiënteerde vezels, zoals geïllustreerd in figuur 1A. Aan het ene uiteinde hechten de vezels zich aan de evenaar van de lens en aan het andere uiteinde aan het oppervlak van het ciliaire lichaam. Hun lengtes overspannen afstanden variërend van 150 μm bij muizen tot 1 mm bij mensen. Gezamenlijk staan deze vezels bekend als de zonule van Zinn2, de ciliaire zonule of gewoon de zonule. Oculair trauma, ziekte en bepaalde genetische aandoeningen kunnen de integriteit van de zonulaire vezels3 beïnvloeden, wat resulteert in hun uiteindelijke falen en gepaard gaand verlies van gezichtsvermogen. Bij muizen hebben de vezels een kern die voornamelijk bestaat uit het eiwit fibrilline-2, omgeven door een mantel rijk aan fibrilline-14. Hoewel zonulaire vezels uniek zijn voor het oog, vertonen ze veel overeenkomsten met op elastine gebaseerde ECM-vezels die elders in het lichaam worden aangetroffen. De laatste zijn bedekt met een fibrilline-1 mantel5 en hebben vergelijkbare afmetingen als zonulaire vezels6. Andere eiwitten, zoals latent-transformerende groeifactor β-bindende eiwitten (LTBPs) en microfibril-geassocieerd glycoproteïne-1 (MOP-1), worden gevonden in combinatie met beide soorten vezels7,8,9,10,11. De elastische modulus van zonulaire vezels ligt in het bereik van 0,18-1,50 MPa12,13,14,15,16, vergelijkbaar met die van op elastine gebaseerde vezels (0,3-1,2 MPa)17. Deze architecturale en mechanische overeenkomsten doen ons geloven dat elk inzicht in de rollen van zonulus-geassocieerde eiwitten kan helpen hun rol in andere ECM-elastische vezels op te helderen.
Het belangrijkste doel van het ontwikkelen van de hier beschreven methode is om inzicht te krijgen in de rol van specifieke zonulaire eiwitten in de progressie van erfelijke oogziekten. De algemene benadering is om de visco-elastische eigenschappen van zonulaire vezels in wild-type muizen te vergelijken met die van muizen met gerichte mutaties in genen die coderen voor zonulaire eiwitten. Hoewel verschillende methoden eerder zijn gebruikt om de elasto-mechanische eigenschappen van zonulaire vezels te meten, zijn ze allemaal ontworpen voor de ogen van veel grotere dieren12,13,14,15,16. Als zodanig zijn modellen niet genetisch handelbaar; we probeerden een experimentele methode te ontwikkelen die beter geschikt was voor de kleine en delicate ogen van muizen.
De methode die we hebben ontwikkeld voor het beoordelen van de visco-elasticiteit van zoneulaire vezels bij muizen is een techniek die we de pull-up assay4,18 noemen, die visueel wordt samengevat in figuur 1. Hieronder vindt u een gedetailleerde beschrijving van de pull-upmethode en de analyse van de resultaten. We beginnen met het beschrijven van de constructie van het apparaat, inclusief de driedimensionale (3D) geprinte onderdelen die in het project worden gebruikt. Vervolgens beschrijven we het protocol dat wordt gebruikt voor het verkrijgen en voorbereiden van de ogen voor het experiment. Ten slotte geven we stapsgewijze instructies over het verkrijgen van gegevens voor de bepaling van de visco-elastische eigenschappen van zonulaire vezels. In de sectie Representatieve resultaten delen we eerder niet-gepubliceerde gegevens die zijn verkregen met onze methode over de visco-elastische eigenschappen van zoneuze vezels van muizen zonder MOP-119, evenals een controleset die is verkregen van leeftijdsgematchte wilde dieren. Ten slotte sluiten we af met algemene opmerkingen over de voordelen en beperkingen van de methode en suggesties voor mogelijke experimenten die kunnen verduidelijken hoe omgevings- en biochemische factoren de visco-elastische eigenschappen van ECM-vezels beïnvloeden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Washington University Animal Studies Committee en hielden zich aan de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visionair onderzoek.
1. Fabricage van gespecialiseerde onderdelen en constructie van apparaten
- Fabricage van gespecialiseerde onderdelen
- Sonde fabricage. Houd een glazen capillair onder een hoek zoals weergegeven in het linkerdeelvenster van figuur 2A. Plaats een vlam van een sigarettenaansteker op ongeveer 2 cm van het ene uiteinde en houd deze daar totdat het uiteinde 90° buigt, zoals weergegeven in het rechterpaneel van figuur 2A.
- Fabricage van voorbeeldplatforms. Ontwerp met behulp van 3D-tekensoftware een platform met een diameter van 30 x 30 x 5 mm met hemisferische inkepingen van 2,0, 2,5 en 3,0 mm, zoals weergegeven in figuur 2B.
- Fabricage van sondehouders. Ontwerp met behulp van de 3D-tekensoftware een houder die de capillaire sonde vasthoudt en bevestig deze aan een micromanipulator (zie figuur 2C).
OPMERKING: Een voorbeeld 3D-bestand voor platformfabricage en sondehouderfabricage in STL-formaat is op aanvraag verkrijgbaar bij de corresponderende auteur. - Negatieve lensassemblage. Plaats een negatieve cilindrische lens (-75 mm in brandpuntsafstand en ongeveer 50 mm in hoogte en lengte) zoals weergegeven in figuur 1C en figuur 1D om de vervorming te corrigeren die wordt veroorzaakt door de toevoeging van vloeistof aan de petrischaal (toevoeging van vloeistof vervormt het zicht van het ontlede oog wanneer het vanaf de zijkant wordt afgebeeld).
- Lijm de negatieve lens op een van de 2-sleufs bases (zie figuur 2D voor de positionering van de lens op de basis).
- Monteer de overige onderdelen zoals weergegeven in figuur 2D.
- Stel de hoogte van de paal zo in dat de lens nauwelijks over de schaal zweeft en draai de schroef in de posthouder vast.
- Constructie van apparaten
- Installeer op een computer het logboekregistratieprogramma dat bij de weegschaal, de microscoopcamerasoftware en de gemotoriseerde micrometercontrollertoepassing wordt geleverd.
- Sluit de gemotoriseerde micrometer aan op de servomotorcontroller en de laatste op de computer. Start de motorcontrollertoepassing en bewerk de motorinstellingen.
OPMERKING: De motorinstellingen, die hieronder worden vermeld, werden gekozen na voorbereidende experimenten waaruit bleek dat spanningen ontspanden op een tijdschaal van 10-20 s. Op basis van deze bepaling selecteerden we een snelheid en versnelling waarmee de motor een verplaatsing van 50 μm kon voltooien in een tijd die kleiner was dan de ontspanningstijd, maar niet te kort om te voorkomen dat het monster schokte. Hier kozen we voor een verplaatsingstijd van ongeveer 5-10 s. - Stel de maximale snelheid in op 0,01 mm/s en de versnelling op 0,005 mm/s2.
- Installeer de camera in de inspectiemicroscoop en test de camerabeeldbewerkingssoftware.
- Plaats de weegschaal op de bankruimte die aan het apparaat is gewijd.
- Lijm een 3D-geprint platform (vanaf stap 1.1.2) op een petrischaaltje en voeg een glazen kraal van 2-3 mm toe aan een van de putjes. Plaats de petrischaal op de weegschaal zodat de kraal zich in het midden van de pan bevindt.
- Vervang de handmatige micrometer van de micromanipulator door de gemotoriseerde.
- Schroef de twee 4-40 schroeven in de sondehouder. Bevestig de sondehouder aan de manipulator zoals aangegeven in figuur 1C.
- Bereid een sonde voor zoals geïllustreerd in figuur 2A, plaats deze in de sondehouder met het gebogen gedeelte naar beneden gericht en draai de schroeven vast.
- Plaats de micromanipulator zo op tafel dat de punt van de sonde zich boven de kraal op het platform bevindt. Bevestig de micromanipulator aan de tafel om onbedoelde beweging tijdens het experiment te voorkomen.
- Plaats de zijmicroscoop op de tafel zodat de kraal zich in het midden van het gezichtsveld bevindt en scherp is.
2. Monstervoorbereiding en gegevensverzameling
- Oogfixatie en dissectie
- Onderhoud wild-type muizen en Magp1-null dieren op een identieke C57 / BL6J achtergrond. Euthanaseer muizen van 1 maand of 1 jaar oud door CO2-inademing.
- Verwijder de ogen met een fijne tang en fixeer de geucleeerde bollen 's nachts op 4 °C in 4% paraformaldehyde/fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4). Handhaaf een positieve druk van 15-20 mmHg in het oog tijdens het fixatieproces, zoals beschreven6.
OPMERKING: Experimenten worden uitgevoerd op mannelijke muizen, om te controleren op mogelijke geslachtsgerelateerde verschillen in de grootte van de oculaire bol. De positieve druk zorgt ervoor dat de wereldbol opgeblazen blijft, waardoor de opening tussen de lens en de wand van het oog overspannen door de zonulaire vezels behouden blijft. - Was de ogen gedurende 10 minuten in PBS. Maak met behulp van een oogheelkundige chirurgische schaar en werkend onder een stereomicroscoop een incisie van volledige dikte in de oogwand in de buurt van de oogzenuwkop.
- Strek de snede naar voren naar de evenaar en vervolgens rond de equatoriale omtrek van het oog. Zorg ervoor dat u de delicate ciliaire processen en bijbehorende zonulaire vezels spaart.
- Verwijder de achterkant van de wereldbol en belicht het achterste oppervlak van de lens.
- Gebruik de tang om een ontleed oog uit de bufferoplossing te verwijderen en plaats het op een droogtaakdoekje met het hoornvlies naar beneden gericht. Sleep het hoornvlies voorzichtig over het oppervlak van het doekje om het te drogen.
- Voeg 3 μL instantlijm toe aan de platformputten die het oog in de petrischaal plaatsen.
- Plaats de schaal op de podiumplaat van de stereomicroscoop zodat de put met de lijm in zicht is.
- Breng het oog over van het doekje naar de rand van de put die lijm bevat. Sleep het oog vervolgens voorzichtig in de put en pas snel de oriëntatie aan zodat de achterkant van de lens boven is.
- Droog de belichte kant van de lens door deze voorzichtig te deppen met de hoek van een droog doekje.
- Breng een klodder instantlijm aan op de bodem van een petrischaaltje van 50 mm en cementeer het platform erop.
- Meting van de zonulaire visco-elastische respons
- Schakel de weegschaal in, start het schaalregistratieprogramma en de camerasoftware. Zorg ervoor dat het logboekprogramma gedurende 30 minuten gegevens kan verzamelen, omdat sommige proeven zo lang kunnen duren.
- Schakel de servomotorcontroller in en start de controllertoepassing op de computer. Zorg ervoor dat de controller is ingesteld om in stappen van 50 μm te bewegen met behulp van bewegingsparameters die vergelijkbaar zijn met die beschreven in de OPMERKING in stap 1.2.2.
- Maak een 90° bocht in een capillaire staaf zoals beschreven in stap 1.1.1.
- Schuif het gebogen capillair in de capillaire sondehouder en draai de bevestigingsschroeven vast.
OPMERKING: Om uitdroging van monsters te minimaliseren, raden we aan dat stap 1-4 vóór of tijdens de oogdissectie wordt voltooid. - Voeg een kleine (~ 1 mm) kraal uv-uithardende lijm toe aan de punt van het capillair.
- Gebruik de handmatige aanpassingen op de manipulator om de punt van de capillaire sonde zo te bewegen dat deze direct over het midden van de lens ligt. Controleer of het onderste deel van de UV-lijm gecentreerd over de bovenkant van de lens lijkt wanneer het van voren (door visuele inspectie) en de zijkant (door de microscoopcamera) wordt bekeken.
- Terwijl u door de camera kijkt, laat u de punt van de sonde zakken totdat de UV-lijm contact maakt met de lens en een derde tot de helft van het bovenoppervlak bedekt.
- Gebruik een gerichte, bijna zichtbare UV-lichtbron met lage intensiteit (~ 1 mW) om de lijm uit te harden.
OPMERKING: Deze specificaties volstaan om de lijm in een paar seconden uit te harden en tegelijkertijd het potentieel voor het induceren van eiwitverknoping te minimaliseren. De UV-lichtbronnen die bij commerciële UV-lijmpennen worden geleverd, voldoen aan deze specificaties. - Voeg PBS-oplossing toe aan de schaal totdat het oog bedekt is met vloeistof tot een diepte van ten minste 2 mm.
- Plaats de cilindrische lens voor de inspectiemicroscoop en zo dicht mogelijk bij de petrischaal zonder deze aan te raken.
- Start tegelijkertijd het logboekprogramma en een timerprogramma. Maak een foto van het oog/de sonde met behulp van de camera.
- Na 60 s, start nog eens 50 μm verplaatsing, en daarna elke 60 s totdat het experiment is voltooid, d.w.z. totdat alle vezels zijn gebroken. Merk op dat het signaal niet terugkeert naar het basisniveau als gevolg van bufferverdamping tijdens het experiment. Corrigeer de daaruit voortvloeiende afwijking in de metingen tijdens de gegevensanalyse, zoals geïllustreerd in stap 2.2.14.
- Sla na voltooiing van een run de schaalregistratiegegevens op en exporteer deze naar een indeling die compatibel is met de spreadsheet, bijvoorbeeld een .csv indeling. Sla de lensfoto's op die tijdens de run zijn verzameld.
- Importeer gegevens in een spreadsheet. Gebruik de eerste en de laatste schaalaflezing om de afwijking in de achtergrondmeting in de loop van de tijd als gevolg van verdamping te interpoleren (zie figuur 3). Trek de geïnterpoleerde meting af van de meting op elk tijdstip.
OPMERKING: Als u een spreadsheet gebruikt, kan de interpolatie automatisch worden uitgevoerd door de formule in te voeren = B2 - $B $ 2 + ($B $ 2 - @INDIRECT ("B"&COUNTA(B:B)))/(COUNTA(B:B)-2) * A2 in de cel rechts van de eerste schaallezing, vervolgens de cursor naar de rechterbenedenhoek van de cel te verplaatsen en naar de laatste gegevenswaarde te slepen. De formule gaat ervan uit dat de gegevens zijn georganiseerd in een kolom met het eerste gegevenspunt in cel B2. Indien gewenst kunnen de gegevens die in stap 2.2.14 worden verwerkt, worden geanalyseerd met het quasi-elastische visco-elastische model dat is ontwikkeld door een van de co-auteurs, Dr. Matthew Riley4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hier beschreven pull-up techniek biedt een eenvoudige benadering voor het bepalen van visco-elastische eigenschappen van zonulaire vezels bij muizen. Kortom, het muizenoog wordt eerst bewaard door injectie van een fixatief bij fysiologische intraoculaire druk. Deze aanpak handhaaft de natuurlijke inflatie van het oog en houdt de vezels goed voorgespannen (fixatie werd aanvaardbaar geacht nadat voorlopige experimenten aantoonden dat het de elasticiteit of sterkte van de vezels niet significant veranderde). De achterkant van het muisoog wordt vervolgens verwijderd door dissectie om de lens en de zonulaire vezels die het ophangen bloot te leggen. De voorkant van het oog wordt bevestigd aan een platform en geplaatst in een petrischaal die op een digitale weegschaal rust. Vervolgens wordt een glazen capillair bevestigd aan een micromanipulator gecementeerd op het achterste oppervlak van de lens. De lens wordt vervolgens in stappen van 50 μm verhoogd terwijl de kracht op de schaal wordt geregistreerd. Een vermindering van het schijnbare gewicht van het preparaat geeft informatie over de krachten die de vezels uitrekken. Elke verplaatsing wordt gevolgd door een evenwichtsperiode van ongeveer 1 minuut om eventuele ontspanning van de stress veroorzaakt door de verplaatsing te observeren. Ten slotte worden de resultaten geanalyseerd met behulp van een quasi-lineair visco-elastisch model dat speciaal is ontworpen voor de geometrie van de zoneuze vezels van de muis en de richting van de pull-in voor de assay4.
Typische visco-elastische gegevens verkregen met onze methode zijn weergegeven in figuur 3. De curve lijkt omgekeerd (negatief) omdat de liftkracht op de lens het gewicht van de schotel/ platform / oogassemblage op de schaal met een equivalente hoeveelheid vermindert. De respons omvat momentane krachtpieken tijdens elk van de 50 μm verticale verplaatsingen van de lens, gevolgd door een ontspanningsfase met een levensduur in de orde van 10 s. Een vergelijkbare stressontspanning is waargenomen voor runderzoneulaire vezels12. De grootte van de ogenblikkelijke en ontspannen krachten neemt toe met elke stap tot ongeveer 1000 s (~ 800 μm totale verplaatsing) en begint dan te dalen als vezels beginnen te falen. Zonule-uitval is voltooid door het tijdspunt van 1.500 s (~ 1,25 mm totale verplaatsing). Merk op dat als gevolg van de verdamping van buffer in de loop van het experiment, de curve niet terugkeert naar de eerste meting nadat de lens is bevrijd van het oog.
Figuur 4 contrasteert de reacties die zijn verkregen voor een Magp-1 knock-out muis (rode curve) en een leeftijd-matched wild-type dier (blauwe curve). Deze curven zijn gecorrigeerd voor verdamping, omgekeerd, en de ruwe metingen van massa (zie figuur 3) worden nu uitgedrukt als kracht (met eenheden van mN). De initiële visco-elastische respons van de Magp-1-uitgeputte zone (tijd 0-600 s) lijkt sterk op die van het wildtype, wat suggereert dat de visco-elastische eigenschappen van de zonule niet significant werden veranderd door de afwezigheid van Magp-1. De vezels lijken echter te scheuren met een veel lagere spanning in vergelijking met hun wilde tegenhangers.
Om de betrouwbaarheid van de methode te illustreren, verzamelden we gegevens van meerdere dieren over de maximale momentane kracht die op de ogen werd uitgeoefend voordat hun vezels scheurden. De resultaten zijn weergegeven in figuur 5. De gegevens voor muizen van 1 maand oud vertonen zeer kleine waarden voor de standaardfout van het gemiddelde (SEM), ondanks het relatief lage aantal gebruikte monsters (n = 5 of 6), wat wijst op een hoge reproduceerbaarheid. De resultaten geven aan dat de sterkte van de vezels aanzienlijk verschilt tussen de twee genotypen (p-waarde = 2,4 x 10-6). Resultaten die niet in de cijfers worden weergegeven, suggereren ook dat er een subtiele maar statistisch significante toename is in breekkrachtsterkte met de leeftijd voor wilde dieren (p-waarde = 0,024).
De pull-up methode kan ook kwantitatieve schattingen van de visco-elastische parameters genereren die rekening houden met de waargenomen variaties in temporele responsen. Tabel 1 geeft een overzicht van de parameters die het best passen bij onze MOP-1-gegevens, verkregen met een quasi-lineair visco-elastisch model dat eerder is beschreven4. De resultaten tonen aan dat zowel MOP-1-deletie als veroudering zeer significante gevolgen kunnen hebben voor sommige van de mechanische eigenschappen van zonulaire vezels.
Figuur 1: Een visuele samenvatting van de pull-up methode. (A) Dwarsdoorsnede van een gewerveld oog met de lens en de zonulaire vezels die het ophangen. (B) Een algemene benadering voor het bepalen van visco-elastisch gedrag in zoneuze vezels door de lens naar boven te verplaatsen (weg van het hoornvlies). (C) Werkelijke weergave van een ontleed oog dat op een platform is gelijmd en waarvan de lens naar boven wordt getrokken door een glazen sonde die aan een micromanipulator is bevestigd. D) Schema van het gehele apparaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Fabricage van verschillende onderdelen. (A) Fabricage van de glazen sonde. Een glazen capillair wordt onder een hoek gehouden en een vlam wordt aangebracht op een plek op ongeveer 2 cm van het ene uiteinde. Binnen een paar seconden begint het einde van het capillair te vallen. De vlam wordt verwijderd wanneer het uiteinde van het capillair ongeveer 90° wordt gebogen. (B) Fabricage van het oogplatform. Het onderdeel is vervaardigd met een 3D stereolithografie (SLA) printer. Het meet 30 x 30 x 5 mm en bevat drie hemisferische inkepingen met diameters van 2,0, 2,5 en 3,0 mm waarin ontleedde ogen van verschillende groottes zijn gelijmd. (C) Vervaardiging van sondehouder. Ook dit onderdeel is vervaardigd met een 3D SLA printer. Het bestaat uit twee orthogonale staven met een diameter van 7,3 mm. De onderste stang bevat een boring van 1,5 mm en twee gaten van 2,5 mm op het buitenoppervlak voor metalen schroeven die de capillaire sonde op zijn plaats houden. (D) Negatieve lensassemblage. Beelden vastgelegd door de zijmicroscoop bevatten een astigmatische vervorming als gevolg van de kromming van de petrischaal en de bufferoplossing. De lensassemblage is ontworpen om de vervorming te compenseren, waardoor de zijmicroscoop beelden scherp kan maken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Typische ruwe gegevens verkregen met de test. De getoonde grafiek werd opgenomen met logsoftware die gegevens van een digitale weegschaal registreert met een nauwkeurigheid van 0,01 g. De linkerrand van de grafiek (tijd 0) geeft het gewicht van het monster weer zonder hefkracht. De y-as geeft massa in g weer. De lens wordt vervolgens in stappen van 50 μm opgetild totdat alle zonulaire vezels zijn gebroken en de petrischaal weer volledig op de schaal rust. Merk op dat de eindwaarde wordt verschoven van de eerste lezing. De offset is het gevolg van geleidelijke verdamping van de bufferoplossing in de loop van het experiment en kan worden verantwoord tijdens de gegevensanalyse, zoals beschreven in stap 2.2.14. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve zonulaire krachtverplaatsingscurven voor wildtype en MOP-1-deficiënte muizen. De grafiek vergelijkt de visco-elastische respons verkregen na discrete verplaatsingen van de lens weg van zijn evenwichtspositie. De reactie van een oog van een MOP-1 knock-out (KO) muis volgt die van een leeftijd-gematcht wild-type dier tot het punt waarop de vezels in de knock-out muis voortijdig breken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Zonulaire vezelbreekkrachten verkregen met de pull-up methode voor MOP-1 KO versus wild-type muizen en op twee leeftijden. Alle getoonde metingen zijn gebaseerd op n = 5 of 6 ogen, waarbij foutbalken de standaardfout van het gemiddelde (SEM) vertegenwoordigen. Afkortingen: WT = wild-type; KO = MOP-1 knock-out . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Genotype/leeftijd | G0 (Pa) | G∞ (Pa) | Ʈ (sec) | σ f (Pa) | |
| WT 1 maand | BEDOELEN | 2,34e+05 | 9,33E+04 | 16.3 | 9,61E+05 |
| SD | 2,83E+04 | 2,94E+04 | 3.4 | 1,25E+05 | |
| 95% cl | 5,55E+04 | 5,76E+04 | 6.7 | 2,45E+05 | |
| KO 1 maand | BEDOELEN | 2,73E+05 | 6,74E+04 | 17.6 | 4,44E+05 |
| SD | 6,30E+04 | 2,06e+04 | 3.8 | 7,85E+04 | |
| 95% cl | 1,23e+05 | 4,03E+04 | 7.5 | 1,54E+05 | |
| p waarden | 0.25 | 0.12 | 0.58 | 0.000022 | |
| WT 1 jaar | BEDOELEN | 1,98E+05 | 7,42E+04 | 17 | 1,41E+06 |
| SD | 1,17E+05 | 2,39E+04 | 9.1 | 2,44e+05 | |
| 95% cl | 2,29E+05 | 4,69E+04 | 17.9 | 4,79e+05 | |
| KO 1 jaar | BEDOELEN | 1,70E+04 | 2,46e+04 | 12.9 | 5,05E+05 |
| SD | 9,06E+03 | 8,04E+03 | 7.4 | 1,48E+05 | |
| 95% cl | 1,78e+04 | 1,58e+04 | 14.4 | 2,91E+05 | |
| p waarden | 0.0063 | 0.001 | 0.41 | 0.000014 | |
| p waarden, leeftijd | WT | 0.46 | 0.23 | 0.85 | 0.002 |
| KO | 0.0007 | 0.0068 | 0.26 | 0.44 | |
Tabel 1: Visco-elastische eigenschappen verkregen met een quasi-lineair visco-elastisch (QLV) model. Gegevensscans zoals die in figuur 4 werden geanalyseerd met een QLV-model dat speciaal is ontwikkeld voor de pull-up assay en de muiszone. De best passende parameters voor de momentane (G0) en evenwichtsstijfheid (G∞), de relaxatietijdconstante (τ) en de uiteindelijke treksterkte (σ f) worden weergegeven. Afkortingen: SD = standaarddeviatie; BI = betrouwbaarheidsinterval.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De zonule is een ongewoon ECM-systeem waarbij vezels symmetrisch zijn gerangschikt en identiek kunnen worden gemanipuleerd door de ooglens langs de optische as te verplaatsen. De ruimte is ook gemakkelijk toegankelijk zonder cellulaire verstoring, waardoor de vezels kunnen worden bestudeerd in een omgeving dicht bij hun oorspronkelijke staat. De pull-up techniek maakt gebruik van deze ECM-presentatie om de delicate vezels van muizen, een genetisch handelbaar systeem, te manipuleren en hun mechanische eigenschappen nauwkeurig te kwantificeren. Dit heeft ons in staat gesteld om de bijdrage van belangrijke ECM-eiwitten (fibrilline-118, LTBP-24 en MOP-1 die hier worden gerapporteerd) aan de biomechanische eigenschappen van de zonulaire vezels te onderzoeken. Onze analyse van fibrilline-1-deficiënte muizen onthulde dat zonulaire vezels zonder fibrilline-1 verzwakken met de leeftijd en uiteindelijk scheuren, wat leidt tot de verplaatsing van de lens in het oog (bij mensen, een aandoening die bekend staat als ectopia lentis). Het is veelbetekenend dat lensdislocatie ook vaak voorkomt bij patiënten met het syndroom van Marfan, een ziekte die wordt veroorzaakt door mutaties in het FBN1-gen20. De pull-up assay biedt dus de mogelijkheid om aspecten van menselijke bindweefselziekte bij muizen te modelleren. Bij muizen zonder LTPB-2 (een eiwit waarvan wordt gedacht dat het betrokken is bij het ontstaan van microfibrillen), konden we aantonen dat zonulaire vezels werden geproduceerd in afwezigheid van dat eiwit, maar scheurden bij aanzienlijk lagere spanningen en uiteindelijk uiteenvielen met de leeftijd4. Deze resultaten suggereren dat LTBP-2 bijdraagt aan de levensduur van de vezels in plaats van hun synthese. In de huidige studie hebben we vastgesteld dat MOP-1-deficiënte vezels vergelijkbare visco-elastische eigenschappen hadden als wild-type vezels, maar scheurden bij lagere spanningen, zonder tekenen van verdere leeftijdsgerelateerde afbraak. Dit zou consistent zijn met een model waarin vezels zonder MOP-1 intrinsiek zwakker zijn zodra ze zich ontwikkelen.
We merken op dat de uiteindelijke treksterktes in tabel 1 worden geschat in de veronderstelling dat de vezels ergens halverwege de overspanning breken. We kunnen echter niet uitsluiten dat vezelfalen te wijten is aan loslating van verankeringspunten op het lensoppervlak of het ciliaire lichaam. Als dit het geval zou zijn, zou de breuktreksterkte van de vezel hoger kunnen zijn dan de waarden in tabel 1. Microscopische analyse zal nodig zijn om onderscheid te maken tussen deze mogelijkheden. Een dergelijke analyse is verre van triviaal omdat de betrokken vezels erg dun zijn (~ 0,5-0,6 μm breed) en bijna zijn afgestemd op water, waardoor ze in wezen onzichtbaar zijn. Bij gebrek aan deze aanvullende informatie kunnen we alleen maar stellen dat de uiteindelijke treksterktes in tabel 1 hun ondergrenzen vertegenwoordigen. Ook zou het in principe interessant zijn om te controleren of de krachtmetingen verschillen afhankelijk van in welke richting de lens wordt getrokken. In de praktijk zou het echter nodig zijn om de lens van de voorste kant te trekken, de iris te verwijderen zonder de zoneuze vezels die er direct onder liggen te beschadigen. Zo'n precieze dissectie gaat verder dan wat we momenteel met het muisoog kunnen bereiken.
De relatieve eenvoud van de methode en de hoge reproduceerbaarheid van de resultaten zijn wenselijke kwaliteiten voor vergelijkende studies van ECM mechanische eigenschappen. Bovendien, zoals hier aangetoond, is het ook mogelijk om de pull-up assay te gebruiken om absolute waarden van visco-elastische parameters te verkrijgen door een visco-elastisch model aan te nemen en de tijdcurven daarop aan te passen. Met behulp van een standaard quasi-lineair visco-elastisch (QLV) model konden we bijvoorbeeld waarden extraheren voor momentane (G0) en evenwichts(G∞) stijfheid, de relaxatietijdconstante (τ) en de ultieme treksterkte (σ f) van zoneuze vezels van wildtype muizen, evenals die zonder LTBP-24 of MOP-1. De G0- en G∞waarden die in beide onderzoeken voor wilde dieren zijn verkregen, variëren van 6,7 x 104 Pa tot 2,3 x 105 Pa, een bereik dat in grote lijnen vergelijkbaar is met die in veel grotere vezels afkomstig van menselijke, runder- en varkenszones (1,8 x 105-1,5 x 106 Pa)12,13, 14,15,16. Deze overeenkomst tussen soorten suggereert dat dit universele kenmerken van deze vezels zijn en geeft ons het vertrouwen dat zinvolle visco-elastische parameters kunnen worden geëxtraheerd met onze methode.
Een cruciale stap voor het verkrijgen van hoogwaardige visco-elastische reacties is de oriëntatie van het ontlede oog dat op het platform is gelijmd (stap 2.1.9). Kleine kanteling (minder dan 10°) lijkt de resultaten niet significant te beïnvloeden. Experimenten die buiten deze limiet worden uitgevoerd, kunnen curven genereren met vormen die afwijken van de vormen in figuur 4. Sommige van die curves kunnen bijvoorbeeld twee brede pieken hebben in plaats van één.
Idealiter zou de procedure die in dit artikel wordt beschreven, zijn uitgevoerd zonder fixatie van de ogen, wat ons vermogen beperkt om de echte visco-elastische parameters van verse zonulaire vezels te beoordelen. Nadat onze voorlopige experimenten echter geen significant verschil lieten zien tussen de paraformaldehyde-gefixeerde en verse monsters, besloten we fixatie toe te passen omdat het verschillende voordelen bood. Zoals vermeld in het protocol, helpt het gebruik van vaste weefsels om het inheemse stuk van de vezels te behouden voor de pull-up experimenten. Bovendien ontdekten we dat fixatie een grotere hechting van de UV-lijm aan de oogcapsule bevorderde, waardoor de kans kleiner werd dat de sonde zich losmaakte van de lens tijdens de pull-up actie, zoals vaak wordt ervaren met verse monsters (sondeloslating kan gemakkelijk worden herkend als een plotselinge terugkeer van de kracht naar een basislijnniveau). De fixatie voorkwam ook knikken van de oogwand in de richting van de trek. Ondanks deze beperking biedt onze methode een robuuste aanpak voor het bepalen van de relatieve bijdrage van eiwitcomponenten aan de visco-elastische eigenschappen van de zonulaire vezels.
Hoewel ons werk tot nu toe zich heeft gericht op de bijdrage van specifieke eiwitten, kan de methode gemakkelijk worden aangepast om het effect van factoren buiten de vezels op hun mechanische eigenschappen te bestuderen. Dergelijke factoren omvatten temperatuur, pH, calciumconcentratie en de aan- of afwezigheid van cross-linking enzymen. Zeer nauwkeurige metingen kunnen worden bereikt met behulp van onze methode in differentiële modus, d.w.z. door de zonulaire vezels voor te spannen met een initiële spanning / spanning en vervolgens het spanningsverschil te lezen dat volgt wanneer externe omstandigheden worden gewijzigd. Sommige van deze ingrepen kunnen mogelijk de elasticiteit van de weefsels die de zonering omringen beïnvloeden en dus veranderingen in spanning veroorzaken die concurreren met die gegenereerd in de zone. Controlemetingen met geïsoleerde weefsels zouden nodig zijn om hun relevantie voor de voorgestelde experimenten te beoordelen. We verwachten dat dergelijke effecten verwaarloosbaar kunnen zijn, op basis van observaties met de zijcamera waaruit blijkt dat aaneengesloten weefsels zich gedragen als zeer stijve materialen die in wezen geen vervorming ondergaan, zelfs wanneer de zoneuze vezels volledig zijn uitgerekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH R01 EY029130 (S.B.) en P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 en de Ines Mandl Research Foundation (R.P.M.), de Marfan Foundation, en een onbeperkte subsidie aan de afdeling Oogheelkunde en Visuele Wetenschappen aan de Washington University van Research to Prevent Blindness. J.R. ontving ook een beurs van de University of Health Sciences and Pharmacy ter ondersteuning van dit project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4-20 hex screws 3/4 inch long | Thorlabs | SH25S075 | |
| 1/4-20 nut | Hardware store | ||
| 3D SLA printer | Anycubic | Photon | |
| 4-40 screws 3/8 inch long, 2 | Hardware store | ||
| Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament | WPI | 1B120-3 | |
| Cyanoacrylate (super) glue | Loctite | ||
| Digital Scale accurate to 0.01 g | Vernier | OHAUS Scout 220 | |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet | |
| Gas cigarette lighter | |||
| Inspection/dissection microscope | Amscope | SKU: SM-4NTP | Working distance ~ 15 cm |
| Micromanipulator, Economy 4-axis | WPI | Kite-L | |
| Motorized micrometer | Thorlabs | Z812B | |
| Negative cylindrical lens | Thorlabs | LK1431L1 | -75 mm focal length |
| Petri dishes, 50 mm | |||
| Post holder, 3 inches | Thorlabs | PH3 | |
| Post, 4 inches | Thorlabs | TR4 | |
| Scale logging software | Vernier | LoggePro | |
| Servo motor controller | Thorlabs | KDC101 | |
| Servo motor controller software | Thorlabs | APT | |
| Slotted base, 1 | Thorlabs | BA1S | |
| Slotted bases, 2 | Thorlabs | BA2 | |
| Stand for micromanipular | WPI | M-10 | |
| USB-camera for microscope | Amscope | SKU: MD500 | |
| UV activated glue with UV source | Amazon |
References
- Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: structural determinants of eye lens transparency. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
- Bassnett, S.
- Dureau, P.
- Shi, Y., et al. Latent-transforming growth factor beta-binding protein-2 (LTBP-2) is required for longevity but not for development of zonular fibers. Matrix Biology. 95, 15-31 (2021).
- Ushiki, T. Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint. Archives of Histology and Cytology. 65 (2), 109-126 (2002).
- Bassnett, S. A method for preserving and visualizing the three-dimensional structure of the mouse zonule. Experimental Eye Research. 185, 107685 (2019).
- Todorovic, V., Rifkin, D. B. LTBPs, more than just an escort service. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (2), 410-418 (2012).
- Mecham, R. P., Gibson, M. A. The microfibril-associated glycoproteins (MAGPs) and the microfibrillar niche. Matrix Biology. 47, 13-33 (2015).
- Hubmacher, D., Reinhardt, D. P., Plesec, T., Schenke-Layland, K., Apte, S. S. Human eye development is characterized by coordinated expression of fibrillin isoforms. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (12), 7934-7944 (2014).
- Inoue, T., et al. Latent TGF-β binding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5672-5682 (2014).
- De Maria, A., Wilmarth, P. A., David, L. L., Bassnett, S. Proteomic analysis of the bovine and human ciliary zonule. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 573-585 (2017).
- Wright, D. M., Duance, V. C., Wess, T. J., Kielty, C. M., Purslow, P. P. The supramolecular organization of fibrillin-rich microfibrils determines the mechanical properties of bovine zonular filaments. Journal of Experimental Biology. 202 (21), 3011-3020 (1999).
- Bocskai, Z. I., Sandor, G. L., Kiss, Z., Bojtar, I., Nagy, Z. Z. Evaluation of the mechanical behaviour and estimation of the elastic properties of porcine zonular fibres. Journal of Biomechanics. 47 (13), 3264-3271 (2014).
- Fisher, R. F.
- Michael, R., et al. Elastic properties of human lens zonules as a function of age in presbyopes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (10), 6109-6114 (2012).
- van Alphen, G. W., Graebel, W. P.
- Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
- Jones, W., Rodriguez, J., Bassnett, S. Targeted deletion of fibrillin-1 in the mouse eye results in ectopia lentis and other ocular phenotypes associated with Marfan syndrome. Disease Models & Mechanisms. 12 (1), 037283 (2019).
- Weinbaum, J. S., et al. Deficiency in microfibril-associated glycoprotein-1 leads to complex phenotypes in multiple organ systems. Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25533-25543 (2008).
- Comeglio, P., Evans, A. L., Brice, G., Cooling, R. J., Child, A. H. Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus. British Journal of Ophthalmology. 86 (12), 1359-1362 (2002).
