Summary
프로토콜은 세포외 매트릭스 점성 및 단백질 조성 또는 환경 요인에 대한 의존성 연구를 위한 방법을 설명합니다. 대상 매트릭스 시스템은 마우스 구역입니다. 이 방법의 성능은 야생식 구역 섬유의 점탄성 거동을 미세피브릴 관련 당단백질-1이 부족한 것과 비교하여 입증된다.
Abstract
탄력은 혈관, 근육 및 폐와 같은 조직의 기능에 필수적입니다. 이 성질은 세포와 조직을 함께 결합하는 단백질 메쉬워크인 세포외 매트릭스(ECM)에서 주로 유래된다. ECM 네트워크의 탄성 특성이 그 구성과 어떻게 관련이 있는지, 그리고 ECM의 이완 특성이 생리적 역할을 하는지 여부는 아직 완전히 해결되지 않은 질문입니다. 과제의 일부는 대부분의 ECM 시스템의 복잡한 아키텍처와 구조를 손상시키지 않으면서 ECM 구성 요소를 분리하는 데 어려움을 가지는 것입니다. 한 가지 예외는 척추 동물의 눈에서 발견되는 ECM 시스템인 조눌(zonule)입니다. 구역은 렌즈와 안벽 사이의 세포 없는 공간에 걸쳐 길이가 수백에서 수천 마이크로미터의 섬유를 포함한다. 이 보고서에서는 구역의 고도로 조직된 구조를 활용하여 점성탄성 특성을 정량화하고 개별 단백질 성분의 기여를 결정하는 기계 기술을 설명합니다. 이 방법은 렌즈와 구역을 노출하기 위해 고정 된 눈의 해부를 포함하고 장력을 모니터링하는 동안 구역 섬유를 동등하게 뻗어당기는 풀업 기술을 사용합니다. 이 기술은 상대적으로 저렴하지만 특정 구역 단백질이 부족하거나 노화가 있는 마우스의 구역 섬유의 점탄성 특성의 변화를 감지할 만큼 민감합니다. 여기에 제시된 방법은 주로 안구 발달 과 질병을 연구하기 위해 설계되었지만, 탄성 ECM의 점탄성 특성및 이온 농도, 온도 및 신호 분자와의 상호 작용과 같은 외부 요인의 역할에 관한 광범위한 질문을 탐구하기위한 실험 모델역할을 할 수 있습니다.
Introduction
척추 동물의 눈에는 망막1에 이미지를 집중하는 데 도움이되는 살아있는 광학 렌즈가 포함되어 있습니다. 도 1A에 도시된 바와 같이, 렌즈는 섬세하고 복사 지향적인 섬유 시스템에 의해 광축에 매달려 있습니다. 한쪽 끝에서 섬유는 렌즈 적도에 부착하고 다른 쪽은 주모 체의 표면에 부착합니다. 그들의 길이는 마우스에 있는 150 μm에서 인간에 있는 1 mm에 구역 수색하는 거리입니다. 전체적으로, 이 섬유는 Zinn2의 구역, 섬모 구역 또는 단순히 구역으로 알려져 있습니다. 안구 외상, 질병 및 특정 유전 질환은 구역 섬유3의 무결성에 영향을 미칠 수 있으며, 이로 인해 최종 실패와 시력 상실이 발생할 수 있습니다. 마우스에서 섬유는 피브릴린-14가 풍부한 맨틀에 둘러싸여 주로 단백질 피브릴린-2로 구성된 코어를 가지고 있다. 구역 섬유는 눈에 고유하지만 신체의 다른 곳에서 발견되는 엘라스틴 기반 ECM 섬유와 많은 유사점을 지니고 있습니다. 후자는 피브릴린-1 맨틀5로 덮여 있으며 구역 섬유6과 유사한 치수를 가지고 있습니다. 잠복 변환 성장 인자 β 결합 단백질 (LTBPs) 및 마이크로 피브릴 관련 당단백질-1 (MAGP-1)와 같은 다른 단백질은 두 가지 유형의 섬유7,8,9,10,11과 관련하여 발견됩니다. 구역 섬유의 탄성 계수는 엘라스틴 기반 섬유(0.3-1.2 MPa)17과 비교할 수 있는 0.18-1.50 MPa12,13,14,15,16의 범위에 있다. 이러한 건축 및 기계적 유사성은 구역 관련 단백질의 역할에 대한 통찰력이 다른 ECM 탄성 섬유에서 자신의 역할을 해명하는 데 도움이 될 수 있다고 믿게 합니다.
여기서 설명된 방법을 개발하는 주요 목적은 상속된 눈 질환의 진행에 특정 구역 단백질의 역할에 대한 통찰력을 얻는 것입니다. 일반적인 접근은 구역 단백질을 코딩하는 유전자에 있는 표적으로 한 돌연변이를 운반하는 마우스의 그것과 야생 형 마우스에 있는 구역 섬유의 점성탄성 속성을 비교하는 것입니다. 이전에는 구역 섬유의 엘라스토-기계적 특성을 측정하기 위해 여러 가지 방법이 사용되었지만, 모두 훨씬 더 큰 동물의 눈을 위해 설계되었습니다12,13,14,15,16. 이러한 모델은 유전적으로 유전적으로 유전적으로 견딜 수 없습니다. 우리는 마우스의 작고 섬세한 눈에 더 적합한 실험 방법을 개발하기 위해 노력했습니다.
마우스 구역 섬유의 점성을 평가하기 위해 개발한 방법은 도 1에서 시각적으로 요약되는 풀업 분석4,18로 지칭하는 기술입니다. 풀업 방법과 결과의 분석에 대한 자세한 설명은 아래에 제공됩니다. 우리는 프로젝트에 사용되는 3차원 (3D) 인쇄 부품을 포함하여 장치의 건설을 설명하는 것으로 시작합니다. 다음으로, 실험을 위해 눈을 얻고 준비하는 데 사용되는 프로토콜을 자세히 설명합니다. 마지막으로, 구역 섬유의 점탄성 특성 판정을 위한 데이터를 얻는 방법에 대한 단계별 지침을 제공합니다. 대표 결과 섹션에서는 MAGP-119가 부족한 마우스로부터 구역 섬유의 점탄성 특성과 연령일치 야생형 동물로부터 얻은 대조군 세트에 대해 이전에 공개되지 않은 데이터를 공유합니다. 마지막으로, 우리는 방법의 장점과 한계에 대한 일반적인 발언과 환경 및 생화학 적 요인이 ECM 섬유의 점탄성 특성에 미치는 영향을 설명 할 수있는 잠재적 인 실험에 대한 제안으로 결론을 내립니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 워싱턴 대학 동물 연구 위원회에 의해 승인되고 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용을위한 ARVO 성명서를 준수했다.
1. 특수 부품 의 제조 및 장치의 건설
- 특수 부품의 제조
- 프로브 제작. 도 2A의 왼쪽 패널에 도시된 바와 같이 유리 모세관을 비스듬히 잡습니다. 한쪽 끝에서 약 2cm 의 담배 라이터에서 불꽃을 놓고 그림 2A의 오른쪽 패널에 표시된 것처럼 끝이 90 °까지 구부러질 때까지 거기에 보관하십시오.
- 샘플 플랫폼 제작. 3D 드로잉 소프트웨어를 사용하여 도 2B와 같이 30 x 30 x 5mm의 반구형 들여쓰기를 포함하는 플랫폼을 설계합니다.
- 프로브 홀더 제작. 3D 도면 소프트웨어를 사용하여 모세관 프로브를 보유하는 마운트를 설계하여 미세 조작기에 부착합니다( 그림 2C 참조).
참고: STL 형식으로 플랫폼 제작 및 프로브 홀더 제작을 위한 샘플 3D 파일을 해당 작성자의 요청에 따라 사용할 수 있습니다. - 네거티브 렌즈 조립. 피규어 접시에 유체를 첨가하여 발생하는 왜곡을 보정하기 위해 도 1C 및 도 1D 에 도시된 바와 같이 음의 원통형 렌즈(-75mm 의 초점 길이 및 높이 및 길이약 50mm)를 배치하여 페트리 접시에 유체를 첨가하여 발생하는 왜곡을 교정합니다(유체 첨가는 측면에서 이미지화될 때 해부된 눈의 시야를 왜곡합니다).
- 음의 렌즈를 2슬롯베이스 중 하나에 접착합니다(베이스에 렌즈를 배치하기 위한 그림 2D 참조).
- 그림 2D와 같이 나머지 부품을 어셈블합니다.
- 포스트의 높이를 조정하여 렌즈가 겨우 스케일 위로 마우스를 가져가서 포스트 홀더의 나사를 조입니다.
- 장치 건설
- 컴퓨터에 설치스케일, 현미경 카메라 소프트웨어 및 전동 마이크로미터 컨트롤러 응용 프로그램과 함께 제공되는 로깅 프로그램이 제공됩니다.
- 전동 마이크로미터를 서보 모터 컨트롤러와 후자를 컴퓨터에 연결합니다. 모터 컨트롤러 응용 프로그램을 시작하고 모터 설정을 편집합니다.
참고: 아래에 나열된 모터 설정은 10-20s의 시간 척도에서 완화된 스트레스를 나타내는 예비 실험에 따라 선택되었습니다. 이러한 결정에 따라 모터가 릴렉스 타임보다 작은 시간에 50 μm 변위를 완료할 수 있지만 시료를 충격하지 않도록 너무 짧지 않은 속도와 가속을 선택했습니다. 여기에서 우리는 약 5-10 s의 변위 시간을 선택했습니다. - 최대 속도를 0.01mm/s로 설정하고 가속을 0.005 mm/s2로 설정합니다.
- 검사 현미경에 카메라를 설치하고 카메라 이미징 소프트웨어를 테스트합니다.
- 장치에 전념 벤치 공간에 규모를 배치합니다.
- 3D 프린팅 플랫폼(1.1.2단계부터 페트리 접시)에 접착제를 붙이고 우물 중 하나에 2-3mm 유리 구슬을 추가합니다. 페트리 접시를 축척으로 배치하여 비드가 팬 중앙 근처에 위치합니다.
- 마이크로 조작기에서 수동 마이크로미터를 전동 마이크로미터로 바꿉시다.
- 두 개의 4-40 나사를 프로브 홀더에 나사로 고정합니다. 도 1C에 표시된 대로 프로브 홀더를 조작기에 부착합니다.
- 도 2A에 도시된 바와 같이 프로브를 준비하고 구부러진 부분을 아래쪽으로 프로브 홀더 내부에 놓고 나사를 조입니다.
- 프로브의 끝이 플랫폼의 비드 위에 있도록 마이크로 조작기를 테이블에 배치합니다. 실험 중 우발적인 움직임을 방지하기 위해 미세 조작기를 테이블에 부착합니다.
- 비드가 시야의 중심에 있고 초점을 맞출 수 있도록 측면 현미경을 테이블에 배치합니다.
2. 샘플 준비 및 데이터 수집
- 눈 고정 및 해부
- 동일한 C57/BL6J 배경에서 야생형 마우스와 Magp1-null 동물을 유지관리합니다. CO2 흡입에 의하여 1 개월 또는 1 세 마우스를 안락사시.
- 미세한 집게로 눈을 제거하고 4% 파라포름알데히드/인산염 완충식식염(PBS, pH 7.4)에서 하룻밤 사이에 4°C에서 에클레아드 글로브를 고정한다. 설명된 바와 같이 고정 과정에서 눈에 15-20 mmHg의 양압을 유지한다6.
참고: 실험은 안구 지구의 크기에 있는 가능한 성 관련 다름을 통제하기 위하여, 남성 마우스에 실시됩니다. 양압은 전 세계가 팽창하여 렌즈와 눈벽 사이의 간격을 보존하여 구역 섬유에 의해 간 틈새를 유지합니다. - PBS에서 10 분 동안 눈을 씻으시면 됩니다. 안과 외과 가위를 사용하고 스테레오 현미경으로 작업하면 시신경 헤드 근처의 눈 벽에 전체 두께 절개를합니다.
- 적도에 앞으로 절단을 확장 한 다음 눈의 적도 둘레 주위에. 섬세한 섬광 공정과 관련 구역 섬유를 절약하십시오.
- 렌즈의 후방 표면을 노출하여 지구 뒷면을 제거합니다.
- 집게를 사용하여 버퍼 용액에서 해부된 눈을 제거하고 각막이 아래로 향하도록 닦아 건조 작업 닦아 놓습니다. 각막을 닦은 표면 위로 부드럽게 드래그하여 건조시합니다.
- 페트리 접시의 눈을 수용할 수 있는 플랫폼 웰에 인스턴트 접착제 3μL을 추가합니다.
- 접착제와 잘 볼 수 있도록 스테레오 현미경의 무대 접시에 접시를 배치합니다.
- 접착제가 들어 있는 우물 의 가장자리로 닦아 눈을 옮기. 그런 다음 조심스럽게 눈을 우물로 드래그하고 렌즈 뒷면이 가장 위쪽이되도록 방향을 빠르게 조정합니다.
- 렌즈의 노출된 면을 마른 물티슈의 모서리로 부드럽게 블롯하여 건조시.
- 50mm 페트리 접시 의 바닥에 인스턴트 접착제의 dab을 적용하고 그것에 플랫폼을 시멘트.
- 구역 점탄성 반응 측정
- 스케일을 켜고 스케일 로깅 프로그램 및 카메라 소프트웨어를 시작합니다. 일부 시험이 오래 지속될 수 있기 때문에 로깅 프로그램이 30분 동안 데이터를 수집할 수 있는지 확인합니다.
- 서보 모터 컨트롤러를 켜고 컴퓨터에서 컨트롤러 응용 프로그램을 시작합니다. 컨트롤러가 1.2.2 단계에서 NOTE에 설명된 것과 유사한 모션 매개 변수를 사용하여 50 μm 단위로 이동하도록 설정되어 있는지 확인합니다.
- 1.1.1 단계에서 설명한 대로 모세관 막대에 90° 굽힘을 만듭니다.
- 구부러진 모세관을 모세관 프로브 홀더에 넣고 고정 나사를 조입니다.
참고: 시료 탈수를 최소화하려면 눈 해부 전 또는 도중 1-4단계를 완료하는 것이 좋습니다. - 모세관 끝에 UV 경화 접착제의 작은 (~ 1mm) 구슬을 추가합니다.
- 조작기의 수동 조정을 사용하여 모세관 프로브의 끝을 움직여 렌즈 중앙에 직접 있습니다. 전면(육안 검사)과 측면(현미경 카메라를 통해)에서 볼 때 UV 접착제의 바닥 부분이 렌즈 상단을 중심으로 나타나는지 확인합니다.
- 카메라를 들여다보는 동안 UV 접착제가 렌즈와 접촉하고 상부 표면의 3분의 1에서 1/절반을 커버할 때까지 프로브 팁을 낮춥춥다.
- 저강도(~1mW), 방향성, 가시형 UV(380-400 nm) 광원을 사용하여 접착제를 치료한다.
참고: 이러한 사양은 단백질 교차 연결을 유도하는 가능성을 최소화하면서 몇 초 만에 접착제를 치료하는 것으로 충분합니다. 상업용 UV 접착제 펜과 함께 제공되는 UV 광원은 이러한 사양을 충족합니다. - 눈이 적어도 2mm의 깊이에 액체에 의해 덮여 될 때까지 접시에 PBS 솔루션을 추가합니다.
- 원통형 렌즈를 검사 현미경 앞에 놓고 페트리 접시에 가능한 한 가깝게 만지지 않습니다.
- 동시에 로깅 프로그램과 타이머 프로그램을 시작합니다. 카메라를 사용하여 눈 /프로브의 사진을 찍습니다.
- 60s 후, 또 다른 50 μm 변위를 시작하고, 그 후 모든 섬유가 파손 될 때까지, 즉 실험이 완료 될 때까지 60 s마다 시작하십시오. 실험 중 버퍼 증발로 인해 신호가 기준선 수준으로 돌아오지 않습니다. 2.2.14 단계에서 예시된 대로 데이터 분석 중 판독값의 후속 드리프트를 수정합니다.
- 실행이 완료되면 스케일 로깅 데이터를 저장하고 스프레드시트(예: .csv 형식)와 호환되는 형식으로 내보냅니다. 실행 중에 수집 된 렌즈 사진을 저장합니다.
- 데이터를 스프레드시트로 가져옵니다. 증발로 인해 시간이 지남에 따라 판독된 백그라운드에서 드리프트를 보간하려면 첫 번째 및 마지막 축척 판독값을 사용합니다( 그림 3 참조). 각 시점에서 판독값에서 보간 된 판독값을 뺍니다.
참고: 스프레드시트를 사용하는 경우, 보간은 수식 = B2 - $B $2 + ($B $2 - @INDIRECT ("B"&COUNTA (B:B))/(COUNTA(B:B)-2) * 셀의 A2를 첫 번째 스케일 판독의 오른쪽에 입력한 다음 커서를 마지막 데이터 로 이동하여 자동으로 수행 할 수 있습니다. 수식은 데이터가 셀 B2에 나타나는 첫 번째 데이터 포인트가 있는 열에서 구성된다고 가정합니다. 원하는 경우, 2.2.14 단계에서 처리된 데이터는 공동 저자 인 매튜 라일리4 박사가 개발한 준 탄성 점탄성 모델로 분석될 수 있다.
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Representative Results
여기에 설명된 풀업 기술은 마우스에서 구역 섬유의 점탄성 특성을 결정하기 위한 간단한 접근법을 제공한다. 간단히 말해서, 마우스 눈은 먼저 생리 내혈압에 고정의 주입에 의해 보존된다. 이러한 접근법은 눈의 자연적인 인플레이션을 유지하고 섬유를 적절하게 미리 장력하게 유지합니다(예비 실험 후 고정이 섬유의 탄력이나 강도를 크게 변경하지 않았다는 것을 입증한 후에 허용된다고 간주되었습니다). 마우스 눈의 뒷면은 그것을 중단 렌즈와 구역 섬유를 노출하기 위해 해부에 의해 제거됩니다. 눈의 전면은 플랫폼에 부착되어 디지털 스케일에 달려 있는 페트리 접시 안에 놓입니다. 다음으로, 마이크로 조작기에 부착된 유리 모세관은 렌즈의 후방 표면에 시멘트된다. 렌즈는 50 μm 단위로 상승한 다음 스케일의 힘이 기록됩니다. 준비의 명백한 무게의 감소는 섬유를 스트레칭 힘에 대한 정보를 제공합니다. 각 변위는 변위에 의해 유도된 응력의 어떤 이완을 관찰하기 위하여 대략 1 분 지속되는 평형 기간에 선행됩니다. 마지막으로, 결과는 마우스 구역 섬유의 형상및 분석4에 대한 당김 방향을 위해 특별히 설계된 준선형 점성탄성 모델을 사용하여 분석된다.
당사의 방법으로 얻은 일반적인 점탄성 데이터는 도 3에 나와 있습니다. 렌즈의 리프트 힘이 배율의 접시/플랫폼/눈 어셈블리의 무게를 동등한 양으로 감소시키기 때문에 곡선이 반전(negative)으로 나타납니다. 응답에는 렌즈의 50 μm 수직 변위 각각 동안 순간적인 힘 스파이크가 포함되며, 10s의 순서로 수명이 있는 이완 단계가 뒤따릅니다. 소 구역 섬유12에 대해 유사한 스트레스 이완이 관찰되었습니다. 순간적이고 편안한 힘의 크기는 각 단계마다 약 1000s(~800μm 총 변위)까지 증가한 다음 섬유가 고장나기 시작하면 떨어지기 시작합니다. 구역 고장은 1,500의 시간 지점(~1.25mm 총 변위)에 의해 완료됩니다. 실험 과정에서 버퍼의 증발로 인해 렌즈가 눈에서 풀려난 후 곡선이 초기 판독값으로 돌아오지 않습니다.
도 4 는 매그프-1 녹아웃 마우스(빨간색 곡선)와 연령일치 야생형 동물(파란색 곡선)에 대해 얻은 반응을 대조한다. 이러한 곡선은 증발, 반전 및 질량의 원시 측정( 그림 3 참조)을 위해 수정되었으며 이제 힘(mN 단위)으로 표현됩니다. Magp-1-고갈 된 구역(시간 0-600 s)의 초기 점탄성 반응은 야생 형과 유사하며, 이는 구역의 점탄성 특성이 Magp-1의 부재로 인해 크게 변경되지 않았음을 시사합니다. 그러나 섬유는 야생 형에 비해 훨씬 낮은 장력으로 파열되는 것처럼 보입니다.
이 방법의 신뢰성을 설명하기 위해 섬유가 파열되기 전에 눈에 적용되는 최대 즉각적인 힘에 여러 동물의 데이터를 수집했습니다. 결과는 그림 5에 표시됩니다. 1개월 된 마우스에 대한 데이터는 상대적으로 낮은 수의 샘플(n = 5 또는 6)에도 불구하고 평균(SEM)의 표준 오차에 대해 매우 작은 값을 나타내며, 높은 재현성을 시사한다. 결과는 섬유의 강도가 두 유전자형(p-값 = 2.4 x 10-6) 사이에서 크게 다르다는 것을 나타낸다. 수치에 나타나지 않은 결과는 또한 야생 형 동물의 나이를 가진 파괴 힘 강도에 미묘하지만 통계적으로 유의한 증가가 있음을 시사한다 (p-값 = 0.024).
풀업 방법은 또한 시간적 반응에서 관찰된 변동을 차지하는 점성탄성 파라미터의 정량적 추정치를 생성할 수 있다. 표 1 은 이전에 설명한 준선형 점성탄성 모델로 얻은 MAGP-1 데이터에 가장 적합한 매개 변수를 요약합니다4. 그 결과 MAGP-1 삭제와 노화 모두 구역 섬유의 일부 기계적 특성에 매우 큰 영향을 미칠 수 있음을 보여줍니다.
그림 1: 풀업 메서드의 시각적 요약입니다. (A) 그것을 중단하는 렌즈 및 구역 섬유를 보여주는 척추 동물 눈의 단면 보기. (b) 렌즈를 위쪽으로 변위로 변위로 하여 구역 섬유에서 점탄성 거동을 결정하기 위한 일반적인 접근법(각막에서 멀리). (C) 렌즈가 마이크로 조작기에 부착된 유리 프로브에 의해 위쪽으로 당겨지는 플랫폼에 접착된 해부된 눈의 실제 보기. (D) 전체 장치의 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 다양한 부품의 제조. (A) 유리 프로브의 제조. 유리 모세관은 비스듬히 유지되고 한쪽 끝에서 약 2cm 떨어진 곳에 불꽃이 가해질 수 있습니다. 몇 초 안에 모세관의 끝이 떨어지기 시작합니다. 모세관의 끝이 약 90°에서 구부러지면 불꽃이 제거됩니다. (B) 눈 플랫폼의 제조. 부품은 3D 스테레오리소그래피(SLA) 프린터로 제작되었습니다. 30 x 30 x 5mm를 측정하며 2.0, 2.5 및 3.0mm 직경의 3개의 반구형 들여쓰기가 포함되어 있어 다양한 크기의 해부된 눈이 붙어 있습니다. (C) 프로브 홀더의 제조. 이 부품은 3D SLA 프린터로 제작되었습니다. 그것은 두 개의 직교, 7.3mm 직경 의 막대로 구성되어 있습니다. 하부 로드에는 1.5mm 보어와 외부 표면의 구멍을 통해 2.5mm의 2.5mm가 들어 있으며, 모세관 프로브를 고정하는 금속 나사를 수용할 수 있습니다. (D) 네거티브 렌즈 조립. 측면 현미경에 의해 포착된 이미지는 페트리 접시및 완충액의 곡률로 인한 난소 왜곡을 포함합니다. 렌즈 어셈블리는 왜곡을 보정하도록 설계되어 측면 현미경이 이미지를 날카로운 초점으로 캡처할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 분석으로 얻은 일반적인 원시 데이터. 표시된 그래프는 0.01 g 정확도로 디지털 스케일의 데이터를 기록하는 로깅 소프트웨어와 함께 기록되었습니다. 그래프의 왼쪽 가장자리(시간 0)는 리프팅 힘 없이 샘플의 무게를 반영합니다. y축은 g의 질량을 묘사합니다. 그런 다음 모든 구역 섬유가 파손되고 페트리 접시가 다시 스케일에 완전히 놓일 때까지 렌즈를 50 μm 단계로 들어 올려올 수 있습니다. 끝 판독값은 초기 판독값에서 오프셋됩니다. 오프셋은 실험 과정에서 버퍼 솔루션의 점진적 증발에 기인하며 2.2.14 단계에 설명된 바와 같이 데이터 분석 중에 설명할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 야생형 및 MAGP-1-결핍 마우스를 위한 대표적인 구역 힘 변위 곡선. 그래프는 렌즈의 이산 변위 후 얻은 점탄성 반응을 평형 위치에서 멀리 떨어진 곳에 비교합니다. MAGP-1 녹아웃 (KO) 마우스의 눈의 반응은 녹아웃 마우스의 섬유가 조기에 파손되는 지점까지 연령과 일치하는 야생 형 동물의 것을 추적합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 매그P-1 KO용 풀업 방법으로 얻은 구역 섬유 파괴력 대 야생형 마우스 및 2세. 표시된 모든 측정은 n = 5 또는 6 눈을 기반으로 하며 평균(SEM)의 표준 오차를 나타내는 오류 막대가 있습니다. 약어 : WT = 야생 유형; KO = MAGP-1 녹아웃. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 유전자형/나이 | G0 (Pa) | G∞ (Pa) | Ʈ (초) | σ프 (Pa) | |
| WT 1개월 | 의미하다 | 2.34E+05 | 9.33E+04 | 16.3 | 9.61E+05 |
| SD | 2.83E+04 | 2.94E+04 | 3.4 | 1.25E+05 | |
| 95% Cl | 5.55E+04 | 5.76E+04 | 6.7 | 2.45E+05 | |
| KO 1개월 | 의미하다 | 2.73E+05 | 6.74E+04 | 17.6 | 4.44E+05 |
| SD | 6.30E+04 | 2.06E+04 | 3.8 | 7.85E+04 | |
| 95% Cl | 1.23E+05 | 4.03E+04 | 7.5 | 1.54E+05 | |
| p 값 | 0.25 | 0.12 | 0.58 | 0.000022 | |
| WT 1년 | 의미하다 | 1.98E+05 | 7.42E+04 | 17 | 1.41E+06 |
| SD | 1.17E+05 | 2.39E+04 | 9.1 | 2.44E+05 | |
| 95% Cl | 2.29E+05 | 4.69E+04 | 17.9 | 4.79E+05 | |
| KO 1년 | 의미하다 | 1.70E+04 | 2.46E+04 | 12.9 | 5.05E+05 |
| SD | 9.06E+03 | 8.04E+03 | 7.4 | 1.48E+05 | |
| 95% Cl | 1.78E+04 | 1.58E+04 | 14.4 | 2.91E+05 | |
| p 값 | 0.0063 | 0.001 | 0.41 | 0.000014 | |
| p 값, 연령 | WT | 0.46 | 0.23 | 0.85 | 0.002 |
| 코 | 0.0007 | 0.0068 | 0.26 | 0.44 | |
표 1: 준선형 점성탄성(QLV) 모델로 얻은 점탄성 특성. 도 4 에 나타난 것과 같은 데이터 스캔은 풀업 분석기 및 마우스 구역을 위해 특별히 개발된 QLV 모델로 분석되었다. 즉각적인(G0) 및 평형(G∞) 강성에 가장 적합한 파라미터, 이완 시간 상수(θ), 및 궁극의 인장 강도(σ f)가 표시됩니다. 약어: SD = 표준 편차; CI = 신뢰 구간.
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Discussion
구역은 섬유가 대칭으로 배열되고 광학 축을 따라 눈 렌즈를 대체하여 동일하게 조작 할 수있는 특이한 ECM 시스템입니다. 공간은 또한 세포 중단 없이 쉽게 접근할 수 있고, 섬유는 그들의 네이티브 상태에 가까운 환경에서 공부될 수 있습니다. 풀업 기법은 이 ECM 프레젠테이션을 활용하여 유전적으로 방인하는 마우스의 섬세한 섬유를 조작하고 기계적 특성을 정확하게 정량화합니다. 이를 통해 우리는 주요 ECM 단백질(fibrillin-118, LTBP-24 및 MAGP-1)의 기여도를 구역 섬유의 생체 역학적 특성에 대해 검토할 수 있게 되었습니다. 피브릴린-1-결핍 마우스의 우리의 분석은 피브릴린-1이 결여된 구역 섬유가 나이가 들면서 약화되고 결국 파열되어 눈 내의 렌즈 변위로 이어진다는 것을 밝혔습니다(인간에서, ectopia lentis로 알려진 조건). 크게, 렌즈 탈구는 또한 FBN1 gene20에 있는 돌연변이에 기인한 질병인 Marfan 증후군을 가진 환자에서 일반적 발생입니다. 따라서, 풀업 분석은 마우스에서 인간 결합 조직 질환의 양상을 모델링할 수 있는 기회를 제공한다. LTPB-2 (마이크로 피브릴의 기원에 관여하는 것으로 생각되는 단백질)가 부족한 마우스에서, 우리는 구역 섬유가 그 단백질의 부재에서 생성되었다는 것을 입증할 수 있었습니다, 그러나 현저하게 더 낮은 응력에서 파열하고 결국 나이로 붕괴했습니다 4. 이러한 결과는 LTBP-2가 합성보다는 섬유의 장수에 기여한다는 것을 시사합니다. 현재 연구에서, 우리는 MAGP-1-결핍 섬유야생 형 섬유와 유사한 점탄성 특성을 가지고 있지만 더 노화 와 관련된 저하의 흔적없이 낮은 응력에서 파열 결정. 이것은 MAGP-1이 부족한 섬유가 개발하자마자 본질적으로 약한 모델과 일치할 것입니다.
표 1에 나열된 궁극적인 인장 강도는 섬유가 중간 범위 어딘가에 파손된다는 가정 하에 추정됩니다. 그러나, 우리는 섬유 고장이 렌즈 표면 또는 섬모 본체의 앵커리지 지점에서 분리로 인한 가능성을 배제 할 수 없다. 이 경우 섬유의 골절 인장 강도가 표 1에 나열된 값보다 높을 수 있습니다. 현미경 분석은 이러한 가능성을 구별하기 위해 필요합니다. 이러한 분석은 관련 섬유가 매우 얇고 (너비의 ~ 0.5-0.6 μm)이며 거의 색인이 물에 일치하기 때문에 사소한 것과는 거리가 멀어 본질적으로 보이지 않습니다. 이 추가 정보가 없는 경우 표 1에 나열된 궁극적인 인장 강도가 하한을 나타낸다고만 명시할 수 있습니다. 또한 원칙적으로 렌즈를 당기는 방향에 따라 힘 측정이 다른지 확인하는 것도 흥미로할 것입니다. 그러나 실제로 는 전방 측에서 렌즈를 당기려면 바로 아래에 누워있는 구역 섬유를 손상시키지 않고 홍채를 제거해야합니다. 이러한 정확한 해부는 우리가 현재 마우스 눈으로 달성 할 수있는 것을 넘어.
방법의 상대적 단순성 및 결과의 높은 재현성은 ECM 기계적 특성의 비교 연구를 위한 바람직한 자질입니다. 또한, 여기서 입증된 바와 같이, 당김 분석체를 사용하여 점성탄성 모델을 가정하고 시간 곡선을 피팅하여 점탄성 파라미터의 절대 값을 얻을 수도 있다. 예를 들어, 표준 준선형 점성탄성(QLV) 모델을 사용하여, 우리는 야생형 마우스에서 나오는 즉각적인(G0) 및 평형(G∞) 강성, 이완 시간 상수(θ), 및 야생형 마우스의 구역 섬유의 궁극성 인장 강도(σ f)뿐만 아니라 LTBP-24 또는 MAGP-1이 부족한 모델들을 위한 값을 추출할 수 있었습니다. 두 연구에서 야생 형 동물을 위해 얻은 G0 및 G∞ 값은 인간, 소 및 돼지 zonules (1.8 x 105-1.5 x 106 Pa)에서 파생 된 훨씬 더 큰 섬유에서 발견되는 것과 광범위하게 유사한 범위인 6.7 x 104 Pa에서 2.3 x 105 Pa까지 다양합니다. 14,15,16. 종 간의 이 계약은 이러한 섬유의 보편적 인 특징임을 시사하며 의미있는 점탄성 매개 변수가 우리의 방법으로 추출 될 수 있다는 확신을 줍니다.
품질 점탄성 반응을 얻기 위한 중요한 단계는 플랫폼에 붙어 있는 해부된 눈의 방향입니다(단계 2.1.9). 사소한 기울기(10°미만)는 결과에 크게 영향을 미치지 않습니다. 이 제한 외부에서 수행된 실험은 그림 4에 표시된 것과 다른 셰이프가 있는 곡선을 생성할 수 있습니다. 예를 들어 이러한 곡선 중 일부는 하나 대신 두 개의 넓은 피크를 보유할 수 있습니다.
이상적으로, 이 논문에 설명된 절차는 눈을 고정하지 않고 수행되었을 것이며, 이는 신선한 구역 섬유의 진정한 점탄성 파라미터를 평가하는 우리의 능력을 제한합니다. 그러나, 우리의 예비 실험이 paraformaldehyde 고정 및 신선한 견본 사이 유의한 차이를 보여주지 않은 후에, 우리는 몇몇 이점을 주어 주므로 고정을 채택하기로 결정했습니다. 프로토콜에서 언급했듯이 고정 조직의 사용은 풀업 실험을 위해 섬유의 기본 스트레칭을 보존하는 데 도움이됩니다. 또한, 우리는 고정이 눈 캡슐에 UV 접착제의 더 큰 접착을 촉진 것을 발견, 따라서 접이식 작업 동안 렌즈에서 분리 프로브의 가능성을 감소, 일반적으로 신선한 샘플과 경험으로 (프로브 분리는 쉽게 기준 선도 수준으로 힘의 갑작스런 반환으로 인식 될 수있다). 고정은 또한 당김 방향으로 안벽의 좌굴을 방지. 이러한 제한에도 불구하고, 당사의 방법은 단백질 성분이 구역 섬유의 점탄성 특성에 대한 상대적 기여를 결정하는 강력한 접근법을 제공합니다.
현재까지 우리의 연구는 특정 단백질의 기여에 초점을 맞추고 있지만, 방법은 쉽게 자신의 기계적 특성에 섬유 외부 요인의 효과를 연구하기 위해 적응 할 수있다. 이러한 요인은 온도, pH, 칼슘 농도, 및 교차 연결 효소의 존재 또는 부재를 포함한다. 고정밀 측정은 차등 모드에서 당사의 방법을 사용하여 달성될 수 있습니다, 즉, 초기 응력/변형으로 구역 섬유를 미리 장력한 다음 외부 조건이 변경될 때 이어지는 장력의 차이를 읽음으로써 달성될 수 있습니다. 이러한 개입 중 일부는 구역을 둘러싸고 있는 조직의 탄력성에 영향을 미치고 따라서 구역에서 생성된 것과 경쟁하는 긴장의 변화를 생성할 수 있습니다. 제안된 실험과의 관련성을 평가하기 위해서는 격리된 조직을 통한 제어 측정이 필요합니다. 우리는 이러한 효과 무시할 수 있습니다 기대, 부수적인 조직 구역 섬유가 완전히 뻗어 있는 경우에 본질적으로 변형을 겪지 않는 매우 뻣뻣한 재료로 행동 하는 것을 보여주는 측면 카메라와 관찰에 따라.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH R01 EY01 EY029130 (S.B)과 P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 및 Ines Mandl 연구 재단 (R.P.M.), 마르판 재단, 워싱턴 대학의 안과 및 시각 과학 학과에 대한 무제한 보조금에 의해 지원되었습니다. J.R.은 또한 이 프로젝트를 지원하기 위해 건강 과학 및 약학 대학에서 보조금을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4-20 hex screws 3/4 inch long | Thorlabs | SH25S075 | |
| 1/4-20 nut | Hardware store | ||
| 3D SLA printer | Anycubic | Photon | |
| 4-40 screws 3/8 inch long, 2 | Hardware store | ||
| Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament | WPI | 1B120-3 | |
| Cyanoacrylate (super) glue | Loctite | ||
| Digital Scale accurate to 0.01 g | Vernier | OHAUS Scout 220 | |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet | |
| Gas cigarette lighter | |||
| Inspection/dissection microscope | Amscope | SKU: SM-4NTP | Working distance ~ 15 cm |
| Micromanipulator, Economy 4-axis | WPI | Kite-L | |
| Motorized micrometer | Thorlabs | Z812B | |
| Negative cylindrical lens | Thorlabs | LK1431L1 | -75 mm focal length |
| Petri dishes, 50 mm | |||
| Post holder, 3 inches | Thorlabs | PH3 | |
| Post, 4 inches | Thorlabs | TR4 | |
| Scale logging software | Vernier | LoggePro | |
| Servo motor controller | Thorlabs | KDC101 | |
| Servo motor controller software | Thorlabs | APT | |
| Slotted base, 1 | Thorlabs | BA1S | |
| Slotted bases, 2 | Thorlabs | BA2 | |
| Stand for micromanipular | WPI | M-10 | |
| USB-camera for microscope | Amscope | SKU: MD500 | |
| UV activated glue with UV source | Amazon |
References
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