Summary
Protokollet beskriver en metod för studier av extracellulär matris viskoelasticitet och dess beroende av protein sammansättning eller miljöfaktorer. Matrissystemet som är riktat är muszonuleet. Metodens prestanda demonstreras genom att jämföra viskoelastiskt beteende hos vilda zonulära fibrer med de som saknar mikrofibril-associerade glykoprotein-1.
Abstract
Elasticitet är viktigt för funktionen av vävnader som blodkärl, muskler och lungor. Den här egenskapen härleds främst från den extracellulära matrisen (ECM), proteinmaskverket som binder samman celler och vävnader. Hur de elastiska egenskaperna hos ett ECM-nät relaterar till dess sammansättning, och huruvida ECM:s avslappningsegenskaper spelar en fysiologisk roll, är frågor som ännu inte har behandlats fullt ut. En del av utmaningen ligger i den komplexa arkitekturen i de flesta ECM-system och svårigheten att isolera ECM-komponenter utan att kompromissa med deras struktur. Ett undantag är zonule, ett ECM-system som finns i ryggradsdjurens öga. Zonule består av fibrer hundratals till tusentals mikrometer i längd som sträcker sig över det cellfria utrymmet mellan linsen och ögonväggen. I denna rapport beskriver vi en mekanisk teknik som drar nytta av den välorganiserade strukturen i zonule för att kvantifiera dess viskoelastiska egenskaper och för att bestämma bidraget från enskilda proteinkomponenter. Metoden innebär dissekering av ett fast öga för att exponera linsen och zonule och använder en pull-up-teknik som sträcker zonfibrerna lika medan deras spänning övervakas. Tekniken är relativt billig men känslig nog att upptäcka förändringar i viskoelastiska egenskaper hos zonulära fibrer hos möss som saknar specifika zonulära proteiner eller med åldrande. Även om metoden som presenteras här är främst utformad för att studera okulär utveckling och sjukdom, kan den också fungera som en experimentell modell för att utforska bredare frågor om de viskoelastiska egenskaperna hos elastiska ECM och rollen av yttre faktorer som jonisk koncentration, temperatur och interaktioner med signalmolekyler.
Introduction
Ett ryggradsdjurs öga innehåller en levande optisk lins som hjälper till att fokusera bilder på näthinnan1. Linsen är upphängd på den optiska axeln av ett system av känsliga, radiellt orienterade fibrer, vilket illustreras i figur 1A. I ena änden fäster fibrerna på linsvatorn och i den andra på ytan av ciliarykroppen. Deras längder sträcker sig från 150 μm hos möss till 1 mm hos människor. Tillsammans är dessa fibrer kända som Zonule av Zinn2, ciliary zonule, eller helt enkelt zonule. Okulär trauma, sjukdom och vissa genetiska störningar kan påverka integriteten hos zonulära fibrer3, vilket resulterar i deras eventuella misslyckande och åtföljande förlust av syn. Hos möss har fibrerna en kärna som till största delen består av proteinet fibrillin-2, omgiven av en mantel rik på fibrillin-14. Även om zonulära fibrer är unika för ögat, bär de många likheter med elastinbaserade ECM-fibrer som finns någon annanstans i kroppen. De senare är täckta av en fibrillin-1 mantel5 och har liknande dimensioner som zonulära fibrer6. Andra proteiner, såsom latent-transformerande tillväxtfaktor β-bindande proteiner (LTBC) och mikrofibril-associerade glykoprotein-1 (MAGP-1), finns i samband med båda typerna av fibrer7,8,9,10,11. Den elastiska modulen av zonulära fibrer ligger i intervallet 0,18-1,50 MPa12,13,14,15,16, jämförbar med den för elastinbaserade fibrer (0,3-1,2 MPa)17. Dessa arkitektoniska och mekaniska likheter leder oss att tro att någon insikt i rollerna för zonule-associerade proteiner kan hjälpa till att klargöra deras roller i andra ECM elastiska fibrer.
Huvudsyftet med att utveckla den metod som beskrivs här är att få insikter om specifika zonulära proteiners roll i utvecklingen av ärftlig ögonsjukdom. Det allmänna tillvägagångssättet är att jämföra de viskoelastiska egenskaperna hos zonulära fibrer i vilda möss med möss som bär riktade mutationer i gener som kodar zonulära proteiner. Medan flera metoder tidigare har använts för att mäta de elastomekaniska egenskaperna hos zonulära fibrer, var alla utformade för ögonen på mycket större djur12,13,14,15,16. Som sådana modeller är inte genetiskt dragbara; vi försökte utveckla en experimentell metod som var bättre lämpad för mössens små och känsliga ögon.
Metoden vi utvecklade för att bedöma viskoelasticiteten hos muszonulära fibrer är en teknik som vi hänvisar till som pull-up assay4,18, som sammanfattas visuellt i figur 1. Nedan följer en detaljerad beskrivning av pull-up-metoden och analysen av resultaten. Vi börjar med att beskriva konstruktionen av apparaten, inklusive de tredimensionella (3D)-utskrivna delarna som används i projektet. Därefter beskriver vi protokollet som används för att få och förbereda ögonen för experimentet. Slutligen ger vi steg-för-steg-instruktioner om hur man får data för bestämning av de viskoelastiska egenskaperna hos zonulära fibrer. I avsnittet Representativa resultat delar vi tidigare opublicerade data som erhållits med vår metod om de viskoelastiska egenskaperna hos zonulära fibrer från möss som saknar MAGP-119 samt en kontrolluppsättning som erhållits från åldersmatchade vilda djur. Slutligen avslutar vi med allmänna anmärkningar om metodens fördelar och begränsningar och förslag på potentiella experiment som kan belysa hur miljömässiga och biokemiska faktorer påverkar ECM-fibrernas viskoelastiska egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök godkändes av Washington University Animal Studies Committee och följde ARVO-uttalandet för användning av djur i oftalmisk och visionsforskning.
1. Tillverkning av specialiserade delar och konstruktion av apparater
- Tillverkning av specialiserade delar
- Sondtillverkning. Håll en glaskapillär i en vinkel som visas i den vänstra panelen i figur 2A. Placera en låga från en cigarettändare ca 2 cm från ena änden och håll den där tills änden böjs med 90°, som visas i den högra panelen i figur 2A.
- Prov plattform tillverkning. Använd 3D-ritprogramvara och designa en plattform som mäter 30 x 30 x 5 mm och som innehåller halvklotformade indrag på 2,0, 2,5 och 3,0 mm i diameter, enligt figur 2B.
- Sondhållare tillverkning. Använd 3D-ritprogramvaran och designa ett fäste som håller kapillärsonden och fäst den på en mikromanipulator (se figur 2C).
OBS: Ett exempel på 3D-fil för plattformstillverkning och sondhållaretillverkning i STL-format är tillgänglig på begäran från motsvarande författare. - Negativ linsmontering. Placera en negativ cylindrisk lins (-75 mm i brännvidd och cirka 50 mm i höjd och längd) enligt figur 1C och figur 1D för att korrigera den förvrängning som orsakas av tillsats av vätska till Petri-skålen (tillsats av vätska förvränger sikten på det dissekerade ögat när det avbildas från sidan).
- Limma fast den negativa linsen på en av de två slitsformade baserna (se figur 2D för placering av objektivet på basen).
- Montera de återstående delarna enligt figur 2D.
- Justera höjden på stolpen så att objektivet knappt svävar över vågen och drar åt skruven i efterhållaren.
- Konstruktion av apparater
- Installera på en dator det loggningsprogram som medföljer skalan, mikroskopkameraprogramvaran och den motoriserade mikrometerstyrenhetsapplikationen.
- Anslut den motoriserade mikrometern till servomotorstyrenheten och den senare till datorn. Starta motorstyrenhetsprogrammet och redigera motorinställningarna.
OBS: Motorinställningarna, som listas nedan, valdes efter preliminära experiment som visade att stressen slappnade av på en tidsskala på 10-20 s. Baserat på denna bestämning valde vi en hastighet och acceleration som gjorde det möjligt för motorn att slutföra en 50 μm deplacement på en tid mindre än avslappningstiden, men inte för kort för att undvika att skaka provet. Här valde vi en förskjutningstid på ca 5-10 s. - Ställ in maxhastigheten på 0,01 mm/s och accelerationen till 0,005 mm/s2.
- Installera kameran i inspektionsmikroskopet och testa kamerans bildprogramvara.
- Placera vågen på bänkutrymmet som ägnas åt apparaten.
- Limma en 3D-utskriven plattform (från steg 1.1.2) till en Petri-skål och tillsätt en 2-3 mm glaspärla till en av brunnarna. Placera Petri-skålen på skalan så att pärlan ligger nära mitten av pannan.
- Byt ut den manuella mikrometern från mikromanipulatorn mot den motoriserade.
- Skruva fast de två 4-40 skruvarna i sondens hållare. Fäst sondens hållare på manipulatorn enligt figur 1C.
- Förbered en sond enligt figur 2A, placera den inuti sondens hållare med den böjda delen vänd nedåt och dra åt skruvarna.
- Placera mikromanipulatorn på bordet så att sondens spets är över pärlan på plattformen. Fäst mikromanipulatorn på bordet för att förhindra oavsiktlig rörelse under experimentet.
- Placera sidomikroskopet på bordet så att pärlan är i mitten av sitt synfält och i fokus.
2. Provberedning och datainsamling
- Ögonfixering och dissekering
- Underhåll möss av vildtyp och Magp1-null-djur på samma C57/BL6J-bakgrund. Avliva 1 månad gamla eller 1-åriga möss genom CO2 inandning.
- Ta bort ögonen med fina tångar och fixera de indelade jordglober vid 4 °C över natten i 4% paraformaldehyd/fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7.4). Håll ett positivt tryck på 15-20 mmHg i ögat under fixeringsprocessen, enligt beskrivningen6.
OBS: Experiment utförs på hanmöss, för att kontrollera för eventuella könsrelaterade skillnader i storleken på okulär jordgloben. Det positiva trycket säkerställer att jordgloben förblir uppblåst, vilket bevarar gapet mellan linsen och ögonväggen som spänns av zonfibrerna. - Tvätta ögonen i 10 min i PBS. Använd oftalmisk kirurgisk sax och arbeta under ett stereomikroskop, gör ett fulltjocklekssnitt i ögats vägg nära det optiska nervhuvudet.
- Förläng snittet framåt till ekvatorn och sedan runt ögats ekvatorialomkrets. Var noga med att skona de känsliga ciliary processerna och tillhörande zonulära fibrer.
- Ta bort baksidan av jordgloben och exponera linsens bakre yta.
- Använd tången för att ta bort ett dissekerat öga från buffertlösningen och placera det på en torr uppgiftsservett med hornhinnan vänd nedåt. Dra försiktigt hornhinnan över ytan av våtservetten för att torka den.
- Tillsätt 3 μL snabblim till plattformsbrunnarna som rymmer ögat i Petri-skålen.
- Placera skålen på stereomikroscopets scenplatta så att brunnen med limet är i sikte.
- Överför ögat från våtservetten till kanten av brunnen som innehåller lim. Dra sedan försiktigt ögat i brunnen och justera snabbt dess orientering så att linsens baksida är överst.
- Torka den exponerade sidan av linsen genom att försiktigt blotta den med hörnet av en torrservett.
- Applicera en klick snabblim på botten av en 50 mm Petri-skål och cementera plattformen på den.
- Mätning av zonulärt viskoelastiskt svar
- Slå på skalan, starta skalloggningsprogrammet och kameraprogramvaran. Se till att loggningsprogrammet kan hämta data i 30 minuter, eftersom vissa försök kan pågå så länge.
- Slå på servomotorstyrenheten och starta styrenheten på datorn. Kontrollera att styrenheten är inställd på att röra sig i steg om 50 μm med rörelseparametrar som liknar dem som anges i NOT I steg 1.2.2.
- Skapa en 90° böjning i en kapillärstång enligt beskrivningen i steg 1.1.1.
- För in den böjda kapillären i kapillärsondhållaren och dra åt fästskruvarna.
OBS: För att minimera provdehydrering rekommenderar vi att steg 1-4 slutförs före eller under ögon dissekering. - Tillsätt en liten (~ 1 mm) pärla av UV-härdande lim på kapillärspetsen.
- Använd de manuella justeringarna på manipulatorn och flytta kapillärsondens spets så att den är direkt över linsens mitt. Kontrollera om den nedre delen av UV-limmet verkar centrerat över linsens ovansida när det ses framifrån (genom visuell inspektion) och sidan (genom mikroskopkameran).
- När du tittar genom kameran sänker du sondens spets tills UV-limmet kommer i kontakt med objektivet och täcker en tredjedel till hälften av dess övre yta.
- Använd en lågintensiv (~ 1 mW), riktad, nästan synlig UV (380-400 nm) ljuskälla för att bota limet.
OBS: Dessa specifikationer räcker för att härda limet på några sekunder samtidigt som risken för att inducera proteinkorslänkning minimeras. UV-ljuskällorna som levereras med kommersiella UV-limpennor uppfyller dessa specifikationer. - Tillsätt PBS-lösningen till skålen tills ögat är täckt av vätska till ett djup av minst 2 mm.
- Placera den cylindriska linsen framför inspektionsmikroskopet och så nära Petri-skålen som möjligt utan att röra den.
- Starta samtidigt loggningsprogrammet och ett timerprogram. Ta en bild av ögat/sonden med kameran.
- Efter 60 s, initiera ytterligare 50 μm deplacement, och därefter var 60: e s tills experimentet är klart, dvs. tills alla fibrer har brutits. Observera att signalen inte återgår till bas linjenivåer på grund av buffertavdunstning under experimentet. Korrigera den efterföljande avvikelsen i avläsningarna under dataanalysen, vilket exemplifieras i steg 2.2.14.
- När du har slutfört en körning sparar du skalloggningsdata och exporterar dem till ett format som är kompatibelt med kalkylbladet, t.ex. ett .csv format. Spara linsbilderna som samlades in under körningen.
- Importera data till ett kalkylblad. Använd den första och sista skalavläsningen för att interpolera avdriften i bakgrundsavläsningen över tid på grund av avdunstning (se figur 3). Subtrahera den interpolerade avläsningen från avläsningen vid varje tidpunkt.
OBS: Om interpolationen används automatiskt genom att ange formeln = B2 - $B$2 + ($B$2 - @INDIRECT("B"&COUNTA(B:B)))/(COUNTA(B:B)-2) * A2 i cellen till höger om den första skalavläsningen, sedan flytta markören till cellens högra nedre hörn och dra den ner till det sista datavärdet. Formeln förutsätter att data är ordnade i en kolumn med den första datapunkten i cell B2. Om så önskas kan de data som bearbetas i steg 2.2.14 analyseras med den kvasielastiska viskoelastiska modellen som utvecklats av en av medförfattarna, Dr. Matthew Riley4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pull-up tekniken som beskrivs här ger ett enkelt tillvägagångssätt för att bestämma viskoelastiska egenskaper hos zonulära fibrer hos möss. Kort sagt bevaras musögat först genom injektion av ett fixativ vid fysiologiskt intraokulärt tryck. Detta tillvägagångssätt upprätthåller den naturliga inflationen i ögat och håller fibrerna ordentligt förspänningade (fixering ansågs acceptabelt efter preliminära experiment visade att det inte förändrade fibrernas elasticitet eller styrka avsevärt). Baksidan av musögat avlägsnas sedan genom dissekering för att exponera linsen och zonfibrerna som suspenderar den. Ögats framsida fästs på en plattform och placeras inuti en Petri-maträtt som vilar på en digital skala. Därefter cementeras en glaskapillär fäst vid en mikromanipulator på linsens bakre yta. Linsen höjs sedan i steg om 50 μm medan kraften på skalan registreras. En minskning av preparatets uppenbara vikt ger information om de krafter som sträcker fibrerna. Varje förskjutning följs av en jämviktsperiod som varar ca 1 min för att observera eventuell avslappning av stressen som orsakas av förskjutningen. Slutligen analyseras resultaten med hjälp av en kvasi-linjär viskoelastisk modell utformad speciellt för geometrin hos muszonulära fibrer och riktningen för dragningen för analysen4.
Typiska viskoelastiska data som erhållits med vår metod visas i figur 3. Kurvan verkar inverterad (negativ) eftersom lyftkraften på objektivet minskar vikten på skålen/plattformen/ögonenheten på vågen med motsvarande mängd. Svaret inkluderar momentana krafttoppar under var och en av linsens vertikala 50 μm-förskjutningar, följt av en avslappningsfas med en livslängd i 10 s. En liknande stress avslappning har observerats för nötkreatur zonulära fibrer12. Storleken på de momentana och avslappnade krafterna ökar för varje steg upp till ca 1000 s (~ 800 μm total deplacement) och börjar sedan falla när fibrer börjar misslyckas. Zonulefelet är slutfört med 1 500 s-tidspunkten (~1,25 mm total deplacement). Observera att på grund av avdunstning av buffert under experimentet återgår kurvan inte till den första avläsningen efter att linsen har befriats från ögat.
Figur 4 kontrasterar svaren för en Magp-1 knockoutmus (röd kurva) och ett åldersmatchat vildtypsdjur (blå kurva). Dessa kurvor har korrigerats för avdunstning, inverterats, och de råa mätningarna av massa (se figur 3) uttrycks nu som kraft (med enheter av mN). Det första viskoelastiska svaret från Magp-1-utarmade zonule (tid 0-600 s) liknar nära den av vildtyp, vilket tyder på att de viskoelastiska egenskaperna hos zonule inte väsentligt ändrades av frånvaron av Magp-1. Fibrerna verkar dock brista vid en mycket lägre spänning jämfört med deras vilda motsvarigheter.
För att illustrera metodens tillförlitlighet samlade vi in data från flera djur om den maximala momentana kraften som appliceras på ögonen innan deras fibrer sprack. Resultaten visas i figur 5. Data för 1 månad gamla möss uppvisar mycket små värden för standardfelet för medelvärdet (SEM) trots det relativt låga antalet prover som används (n = 5 eller 6), vilket tyder på hög reproducerbarhet. Resultaten indikerar att fibrernas styrka skiljer sig avsevärt mellan de två genotyperna (p-värde = 2,4 x 10-6). Resultaten som inte visas i siffrorna tyder också på att det finns en subtil men statistiskt signifikant ökning av brottkraftstyrkan med åldern för vilda djur (p-värde = 0,024).
Pull-up-metoden kan också generera kvantitativa uppskattningar av de viskoelastiska parametrar som tar hänsyn till de observerade variationerna i tidsmässiga svar. Tabell 1 sammanfattar de bästa parametrarna för våra MAGP-1-data, erhållna med en kvasi-linjär viskoelastisk modell som beskrivits tidigare4. Resultaten visar att både MAGP-1 borttagning och åldrande kan ha mycket betydande inverkan på några av de mekaniska egenskaperna hos zonulära fibrer.
Bild 1: En visuell sammanfattning av pull-up-metoden. (A) Tvärsnittsvy av ett ryggradsdjursöga som visar linsen och de zonfibrer som suspenderar den. (B) Ett allmänt tillvägagångssätt för att bestämma viskoelastiskt beteende i zonulära fibrer genom att förskjuta linsen uppåt (bort från hornhinnan). C) Faktisk vy av ett dissekerat öga som limmats på en plattform med linsen som dras uppåt av en glassond fäst vid en mikromanipulator. D) Schematisk för hela apparaten. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Tillverkning av olika delar. (A) Tillverkning av glassonden. En glaskapillär hålls i vinkel och en flamma appliceras på en plats ungefär 2 cm från ena änden. Inom några sekunder börjar slutet av kapillären falla. Lågan avlägsnas när kapillärens ände böjs vid ca 90°. (B) Tillverkning av ögonplattformen. Delen är tillverkad med en 3D-stereolitografiskrivare (SLA). Den mäter 30 x 30 x 5 mm och innehåller tre halvklotformad fördjupning med 2,0, 2,5 och 3,0 mm diametrar i vilka dissekerade ögon av olika storlekar limmas. C) Tillverkning av sondhållare. Denna del tillverkades också med en 3D SLA-skrivare. Den består av två ortogonala stavar med diametern 7,3 mm. Den nedre stången innehåller ett 1,5 mm borrhål och två 2,5 mm genom hål på ytterytan för att rymma metallskruvar som säkrar kapillärsonden på plats. (D) Negativ linsmontering. Bilder som tagits av sidomikroskopet innehåller en astigmatisk förvrängning på grund av petriskålens krökning och buffertlösningen. Linsenheten är utformad för att kompensera för förvrängningen, vilket gör att sidomikroskopet kan fånga bilder i skarpt fokus. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Typiska rådata som erhålls med analysen. Diagrammet som visas registrerades med loggningsprogram som registrerar data från en digital skala med en noggrannhet på 0,01 g. Diagrammets vänstra kant (tid 0) återspeglar provets vikt utan lyftkraft. Y-axeln avbildar massa i g. Linsen lyfts sedan i 50 μm steg tills alla zonulära fibrer bryts och Petri-skålen återigen vilar helt på skalan. Observera att slutavläsningen kompenseras från den första avläsningen. Förskjutningen beror på gradvis avdunstning av buffertlösningen under experimentets gång och kan redovisas under dataanalysen, enligt steg 2.2.14. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Representativa zonindelningsförskjutningskurvor för möss av vildtyp och FUP-1. Diagrammet jämför det viskoelastiska svaret som erhålls efter diskreta förskjutningar av linsen bort från dess jämviktsposition. Svaret från ett öga från en MAGP-1 knockout (KO) mus spårar det hos ett åldersmatchat vildtypsdjur fram till den punkt där fibrerna i knockoutmusen bryts i förtid. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Zonulära fiberbrytningskrafter som erhållits med pull-up-metoden för MAGP-1 KO jämfört med möss av vildtyp och i två åldrar. Alla mätningar som visas är baserade på n = 5 eller 6 ögon, med felstaplar som representerar medelvärdets standardfel (SEM). Förkortningar: WT = wild-type; KO = MAGP-1 knockout. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Genotyp/ålder | G0 (Pa) | G∞ (Pappa) | (sek) | σ f (Pa) | |
| WT 1 månad | BETYDA | 2.34E+05 | 9.33E+04 | 16.3 | 9.61E+05 |
| SD | 2.83E+04 | 2.94E+04 | 3.4 | 1.25E+05 | |
| 95% Cl | 5.55E+04 | 5.76E+04 | 6.7 | 2.45E+05 | |
| KO 1 månad | BETYDA | 2.73E+05 | 6.74E+04 | 17.6 | 4.44E+05 |
| SD | 6.30E+04 | 2.06E+04 | 3.8 | 7.85E+04 | |
| 95% Cl | 1.23E+05 | 4.03E+04 | 7.5 | 1.54E+05 | |
| p värden | 0.25 | 0.12 | 0.58 | 0.000022 | |
| WT 1 år | BETYDA | 1.98E+05 | 7.42E+04 | 17 | 1.41E+06 |
| SD | 1.17E+05 | 2.39E+04 | 9.1 | 2.44E+05 | |
| 95% Cl | 2.29E+05 | 4.69E+04 | 17.9 | 4.79E+05 | |
| KO 1 år | BETYDA | 1.70E+04 | 2.46E+04 | 12.9 | 5.05E+05 |
| SD | 9.06E+03 | 8.04E+03 | 7.4 | 1.48E+05 | |
| 95% Cl | 1.78E+04 | 1.58E+04 | 14.4 | 2.91E+05 | |
| p värden | 0.0063 | 0.001 | 0.41 | 0.000014 | |
| p värden, ålder | WT | 0.46 | 0.23 | 0.85 | 0.002 |
| KO | 0.0007 | 0.0068 | 0.26 | 0.44 | |
Tabell 1: Viskoelastiska egenskaper erhållna med en kvasi-linjär viskoelastisk (QLV) modell. Dataskanningar som de som visas i figur 4 analyserades med en QLV-modell utvecklad speciellt för pull-up-analysen och muszonule. Bäst lämpade parametrar för momentana (G0) och jämvikt (G∞) styvheterna, avslappningstiden konstant (τ) och den ultimata draghållfastheten (σ f) visas. Förkortningar: SD = standardavvikelse; CI = konfidensintervall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zonule är ett ovanligt ECM-system där fibrer är ordnade symmetriskt och kan manipuleras identiskt genom att förskjuta ögonlinsen längs den optiska axeln. Utrymmet kan också lätt nås utan cellulära störningar, vilket gör att fibrerna kan studeras i en miljö nära deras ursprungliga tillstånd. Pull-up tekniken drar nytta av denna ECM presentation för att manipulera de känsliga fibrerna från möss, ett genetiskt dragbart system, och exakt kvantifiera deras mekaniska egenskaper. Detta har gjort det möjligt för oss att undersöka bidraget från viktiga ECM-proteiner (fibrillin-118, LTBP-24 och MAGP-1 rapporteras här) till de biomekaniska egenskaperna hos zonulära fibrer. Vår analys av fibrillin-1-bristfälliga möss visade att zonulära fibrer som saknar fibrillin-1 försvagas med åldern och så småningom bristning, vilket leder till förskjutning av linsen i ögat (hos människor, ett tillstånd som kallas ectopia lentis). Signifikant är linsförskjutning också en vanlig förekomst hos patienter med Marfans syndrom, en sjukdom som orsakas av mutationer i FBN1 genen20. Således erbjuder pull-up-analysen en möjlighet att modellera aspekter av mänsklig bindvävssjukdom hos möss. Hos möss som saknar LTPB-2 (ett protein som tros vara involverat i uppkomsten av mikrofibriller) kunde vi visa att zonulära fibrer producerades i avsaknad av det proteinet, men sprack vid betydligt lägre påfrestningar och så småningom upplöstes med ålder4. Dessa resultat tyder på att LTBP-2 bidrar till livslängden av fibrer snarare än deras syntes. I den aktuella studien fastställde vi att MAGP-1-bristfälliga fibrer hade liknande viskoelastiska egenskaper som vilda fibrer men spruckit vid lägre påfrestningar, utan några tecken på ytterligare åldersrelaterad nedbrytning. Detta skulle vara förenligt med en modell där fibrer som saknar MAGP-1 i sig är svagare så snart de utvecklas.
Vi noterar att de ultimata dragstyrkorna som anges i tabell 1 uppskattas under antagandet att fibrerna bryts någonstans mitt i perioden. Vi kan dock inte utesluta möjligheten att fiberfel beror på avlossning från förankringspunkter på linsytan eller ciliarykroppen. Om så var fallet kan fiberns frakturhållfasthet vara högre än de värden som anges i tabell 1. Mikroskopisk analys kommer att krävas för att skilja mellan dessa möjligheter. En sådan analys är långt ifrån trivial eftersom de inblandade fibrerna är mycket tunna (~ 0,5-0,6 μm i bredd) och nästan indexmatchade till vatten, vilket gör dem i huvudsak osynliga. I avsaknad av denna ytterligare information kan vi bara ange att de ultimata dragstyrkorna i tabell 1 representerar deras lägre gränser. Det skulle också vara intressant att i princip kontrollera om kraftmätningarna skiljer sig beroende på vilken riktning linsen dras. I praktiken skulle dock dra linsen från den främre sidan kräva att iris tas bort utan att skada zonulära fibrer som ligger omedelbart under. Sådan exakt dissekering är bortom vad vi för närvarande kan uppnå med musöga.
Metodens relativa enkelhet och den höga reproducerbarheten av dess resultat är önskvärda egenskaper för jämförande studier av ECM mekaniska egenskaper. Dessutom, som visas här, är det också möjligt att använda pull-up-analysen för att erhålla absoluta värden av viskoelastiska parametrar genom att anta en viskoelastisk modell och anpassa tidskurvorna till den. Till exempel, med hjälp av en standard kvasi-linjär viskoelastisk (QLV) modell, kunde vi extrahera värden för momentana (G0) och jämvikt (G∞) styvhet, avslappningstiden konstant (τ) och den ultimata draghållfastheten (σ f) av zonulära fibrer från vilda möss, liksom de som saknar LTBP-24 eller MAGP-1. De G0- och G∞värden som erhållits för vilda djur i båda studierna varierar från 6,7 x 104 Pa till 2,3 x 105 Pa, ett intervall som i stort sett kan jämföras med dem som finns i mycket större fibrer som härrör från zonindelningar av människor, nötkreatur och svin (1,8 x 105-1,5 x 106 Pa)12,13, 14,15,16. Detta avtal mellan arter tyder på att dessa är universella egenskaper hos dessa fibrer, och ger oss förtroende för att meningsfulla viskoelastiska parametrar kan extraheras med vår metod.
Ett viktigt steg för att få viskoelastiska svar av hög kvalitet är orienteringen av det dissekerade ögat som limmas fast vid plattformen (steg 2.1.9). Mindre lutning (mindre än 10°) verkar inte påverka resultaten nämnvärt. Experiment som utförs utanför denna gräns kan generera kurvor med former som avviker från de som visas i figur 4. Vissa av dessa kurvor kan till exempel ha två breda toppar i stället för en.
Helst skulle förfarandet som beskrivs i detta dokument ha utförts utan fixering av ögonen, vilket begränsar vår förmåga att bedöma de sanna viskoelastiska parametrarna för färska zonulära fibrer. Men efter att våra preliminära experiment inte visade någon signifikant skillnad mellan paraformaldehyd-fasta och färska prover, bestämde vi oss för att anta fixering eftersom det gav flera fördelar. Som det anspelar på i protokollet bidrar användningen av fasta vävnader till att bevara den inhemska sträckan av fibrerna för pull-up-experimenten. Dessutom fann vi att fixering främjade större vidhäftning av UV-limmet till ögonkapseln, vilket minskar risken för att sonden lossnar från linsen under pull-up-åtgärden, vilket ofta upplevs med färska prover (sondavlossning kan lätt kännas igen som en plötslig återgång av kraften till en baslinjenivå). Fixeringen förhindrade också buckling av ögonväggen i dragriktningen. Trots denna begränsning ger vår metod ett robust tillvägagångssätt för att bestämma proteinkomponenternas relativa bidrag till de viskoelastiska egenskaperna hos zonulära fibrer.
Även om vårt arbete hittills har fokuserat på bidraget från specifika proteiner, kan metoden lätt anpassas för att studera effekten av faktorer utanför fibrerna på deras mekaniska egenskaper. Sådana faktorer inkluderar temperatur, pH, kalciumkoncentration och närvaro eller frånvaro av korslänkande enzymer. Högprecisionsmätningar skulle kunna uppnås med vår metod i differentialläge, det vill säga genom att förspänninga zonfibrerna med en initial stress/stam och sedan avläsa skillnaden i spänning som uppstår när yttre förhållanden ändras. Vissa av dessa ingrepp kan tänkas påverka elasticiteten hos vävnaderna som omger zonule och därmed producera förändringar i spänning som konkurrerar med de som genereras i zonule. Kontrollmätningar med isolerade vävnader skulle behövas för att bedöma deras relevans för de föreslagna experimenten. Vi förväntar oss att sådana effekter kan vara försumbara, baserat på observationer med sidokameran som visar att sammanhängande vävnader beter sig som mycket styva material som i huvudsak inte genomgår någon deformation även när zonulära fibrer är helt sträckta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH R01 EY029130 (S.B.) och P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 och Ines Mandl Research Foundation (R.P.M.), Marfan Foundation och ett obegränsat anslag till institutionen för oftalmologi och visuella vetenskaper vid Washington University från Forskning till förhindra blindhet. J.R. fick också ett stipendium från University of Health Sciences and Pharmacy till stöd för detta projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4-20 hex screws 3/4 inch long | Thorlabs | SH25S075 | |
| 1/4-20 nut | Hardware store | ||
| 3D SLA printer | Anycubic | Photon | |
| 4-40 screws 3/8 inch long, 2 | Hardware store | ||
| Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament | WPI | 1B120-3 | |
| Cyanoacrylate (super) glue | Loctite | ||
| Digital Scale accurate to 0.01 g | Vernier | OHAUS Scout 220 | |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet | |
| Gas cigarette lighter | |||
| Inspection/dissection microscope | Amscope | SKU: SM-4NTP | Working distance ~ 15 cm |
| Micromanipulator, Economy 4-axis | WPI | Kite-L | |
| Motorized micrometer | Thorlabs | Z812B | |
| Negative cylindrical lens | Thorlabs | LK1431L1 | -75 mm focal length |
| Petri dishes, 50 mm | |||
| Post holder, 3 inches | Thorlabs | PH3 | |
| Post, 4 inches | Thorlabs | TR4 | |
| Scale logging software | Vernier | LoggePro | |
| Servo motor controller | Thorlabs | KDC101 | |
| Servo motor controller software | Thorlabs | APT | |
| Slotted base, 1 | Thorlabs | BA1S | |
| Slotted bases, 2 | Thorlabs | BA2 | |
| Stand for micromanipular | WPI | M-10 | |
| USB-camera for microscope | Amscope | SKU: MD500 | |
| UV activated glue with UV source | Amazon |
References
- Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: structural determinants of eye lens transparency. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
- Bassnett, S.
- Dureau, P.
- Shi, Y., et al. Latent-transforming growth factor beta-binding protein-2 (LTBP-2) is required for longevity but not for development of zonular fibers. Matrix Biology. 95, 15-31 (2021).
- Ushiki, T. Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint. Archives of Histology and Cytology. 65 (2), 109-126 (2002).
- Bassnett, S. A method for preserving and visualizing the three-dimensional structure of the mouse zonule. Experimental Eye Research. 185, 107685 (2019).
- Todorovic, V., Rifkin, D. B. LTBPs, more than just an escort service. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (2), 410-418 (2012).
- Mecham, R. P., Gibson, M. A. The microfibril-associated glycoproteins (MAGPs) and the microfibrillar niche. Matrix Biology. 47, 13-33 (2015).
- Hubmacher, D., Reinhardt, D. P., Plesec, T., Schenke-Layland, K., Apte, S. S. Human eye development is characterized by coordinated expression of fibrillin isoforms. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (12), 7934-7944 (2014).
- Inoue, T., et al. Latent TGF-β binding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5672-5682 (2014).
- De Maria, A., Wilmarth, P. A., David, L. L., Bassnett, S. Proteomic analysis of the bovine and human ciliary zonule. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 573-585 (2017).
- Wright, D. M., Duance, V. C., Wess, T. J., Kielty, C. M., Purslow, P. P. The supramolecular organization of fibrillin-rich microfibrils determines the mechanical properties of bovine zonular filaments. Journal of Experimental Biology. 202 (21), 3011-3020 (1999).
- Bocskai, Z. I., Sandor, G. L., Kiss, Z., Bojtar, I., Nagy, Z. Z. Evaluation of the mechanical behaviour and estimation of the elastic properties of porcine zonular fibres. Journal of Biomechanics. 47 (13), 3264-3271 (2014).
- Fisher, R. F.
- Michael, R., et al. Elastic properties of human lens zonules as a function of age in presbyopes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (10), 6109-6114 (2012).
- van Alphen, G. W., Graebel, W. P.
- Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
- Jones, W., Rodriguez, J., Bassnett, S. Targeted deletion of fibrillin-1 in the mouse eye results in ectopia lentis and other ocular phenotypes associated with Marfan syndrome. Disease Models & Mechanisms. 12 (1), 037283 (2019).
- Weinbaum, J. S., et al. Deficiency in microfibril-associated glycoprotein-1 leads to complex phenotypes in multiple organ systems. Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25533-25543 (2008).
- Comeglio, P., Evans, A. L., Brice, G., Cooling, R. J., Child, A. H. Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus. British Journal of Ophthalmology. 86 (12), 1359-1362 (2002).
