Summary
Le protocole décrit une méthode pour l’étude de la viscoélasticité de la matrice extracellulaire et de sa dépendance à la composition protéique ou aux facteurs environnementaux. Le système matriciel ciblé est la zonule de souris. La performance de la méthode est démontrée en comparant le comportement viscoélastique des fibres zonulaires de type sauvage avec celles dépourvues de glycoprotéine-1 associée aux microfibrilles.
Abstract
L’élasticité est essentielle à la fonction des tissus tels que les vaisseaux sanguins, les muscles et les poumons. Cette propriété est dérivée principalement de la matrice extracellulaire (ECM), le maillage protéique qui lie les cellules et les tissus ensemble. Comment les propriétés élastiques d’un réseau ECM sont liées à sa composition, et si les propriétés de relaxation de l’ECM jouent un rôle physiologique, sont des questions qui n’ont pas encore été pleinement abordées. Une partie du défi réside dans l’architecture complexe de la plupart des systèmes ECM et la difficulté d’isoler les composants ECM sans compromettre leur structure. Une exception est la zonule, un système ECM trouvé dans l’œil des vertébrés. La zonule comprend des fibres de centaines à des milliers de micromètres de longueur qui couvrent l’espace sans cellule entre la lentille et la paroi oculaire. Dans ce rapport, nous décrivons une technique mécanique qui tire parti de la structure hautement organisée de la zonule pour quantifier ses propriétés viscoélastiques et déterminer la contribution des composants protéiques individuels. La méthode implique la dissection d’un œil fixe pour exposer la lentille et la zonule et utilise une technique de traction qui étire les fibres zonulaires de manière égale pendant que leur tension est surveillée. La technique est relativement peu coûteuse mais suffisamment sensible pour détecter des altérations des propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires chez des souris dépourvues de protéines zonulaires spécifiques ou avec le vieillissement. Bien que la méthode présentée ici soit conçue principalement pour étudier le développement oculaire et la maladie, elle pourrait également servir de modèle expérimental pour explorer des questions plus larges concernant les propriétés viscoélastiques des ECM élastiques et le rôle de facteurs externes tels que la concentration ionique, la température et les interactions avec les molécules de signalisation.
Introduction
L’œil d’un vertébré contient une lentille optique vivante qui aide à focaliser les images sur la rétine1. La lentille est suspendue sur l’axe optique par un système de fibres délicates orientées radialement, comme illustré à la figure 1A. À une extrémité, les fibres se fixent à l’équateur de la lentille et, à l’autre, à la surface du corps ciliaire. Leurs longueurs s’étendent sur des distances allant de 150 μm chez la souris à 1 mm chez l’homme. Collectivement, ces fibres sont connues sous le nom de zonule de Zinn2, la zonule ciliaire, ou simplement la zonule. Les traumatismes oculaires, les maladies et certains troubles génétiques peuvent affecter l’intégrité des fibres zonulaires3, entraînant leur échec éventuel et une perte de vision qui l’accompagne. Chez la souris, les fibres ont un noyau composé principalement de la protéine fibrilline-2, entourée d’un manteau riche en fibrilline-14. Bien que les fibres zonulaires soient uniques à l’œil, elles présentent de nombreuses similitudes avec les fibres ECM à base d’élastine trouvées ailleurs dans le corps. Ces dernières sont recouvertes d’un manteau de fibrilline-15 et ont des dimensions similaires à celles des fibres zonulaires6. D’autres protéines, telles que les protéines de liaison β (LTBPs) et la glycoprotéine 1 associée aux microfibrilles (MAGP-1), se trouvent en association avec les deux types de fibres7,8,9,10,11. Le module élastique des fibres zonulaires est compris entre 0,18 et 1,50 MPa12,13,14,15,16, comparable à celui des fibres à base d’élastine (0,3-1,2 MPa)17. Ces similitudes architecturales et mécaniques nous amènent à croire que tout aperçu des rôles des protéines associées aux zonules peut aider à élucider leurs rôles dans d’autres fibres élastiques ECM.
L’objectif principal du développement de la méthode décrite ici est de mieux comprendre le rôle de protéines zonulaires spécifiques dans la progression de la maladie oculaire héréditaire. L’approche générale consiste à comparer les propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires chez les souris de type sauvage avec celles des souris porteuses de mutations ciblées dans les gènes codant pour les protéines zonulaires. Bien que plusieurs méthodes aient été utilisées précédemment pour mesurer les propriétés élasto-mécaniques des fibres zonulaires, toutes ont été conçues pour les yeux d’animaux beaucoup plus grands12,13,14,15,16. En tant que tels modèles, ils ne sont pas génétiquement traitables; nous avons cherché à développer une méthode expérimentale mieux adaptée aux petits et délicats yeux des souris.
La méthode que nous avons développée pour évaluer la viscoélasticité des fibres zonulaires de souris est une technique que nous appelons le test pull-up4,18, qui est résumé visuellement dans la figure 1. Une description détaillée de la méthode pull-up et de l’analyse des résultats est fournie ci-dessous. Nous commençons par décrire la construction de l’appareil, y compris les pièces imprimées en trois dimensions (3D) utilisées dans le projet. Ensuite, nous détaillons le protocole utilisé pour obtenir et préparer les yeux pour l’expérience. Enfin, nous fournissons des instructions étape par étape sur la façon d’obtenir des données pour la détermination des propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires. Dans la section Résultats représentatifs, nous partageons des données inédites obtenues avec notre méthode sur les propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires de souris dépourvues de MAGP-119 ainsi qu’un ensemble de contrôle obtenu à partir d’animaux de type sauvage appariés selon l’âge. Enfin, nous concluons par des remarques générales sur les avantages et les limites de la méthode, et des suggestions d’expériences potentielles qui pourraient élucider comment les facteurs environnementaux et biochimiques affectent les propriétés viscoélastiques des fibres ECM.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité d’études animales de l’Université de Washington et ont adhéré à la déclaration de l’ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle.
1. Fabrication de pièces spécialisées et construction d’appareils
- Fabrication de pièces spécialisées
- Fabrication de sondes. Tenez un capillaire en verre à un angle comme illustré dans le panneau de gauche de la figure 2A. Placez une flamme d’un allume-cigare à environ 2 cm d’une extrémité et maintenez-la là jusqu’à ce que l’extrémité se plie de 90°, comme le montre le panneau de droite de la figure 2A.
- Fabrication d’échantillons de plate-forme. À l’aide d’un logiciel de dessin 3D, concevez une plate-forme mesurant 30 x 30 x 5 mm et contenant des indentations hémisphériques de 2,0, 2,5 et 3,0 mm de diamètre, comme illustré à la figure 2B.
- Fabrication du porte-sonde. À l’aide du logiciel de dessin 3D, concevez un support qui maintient la sonde capillaire et fixez-la à un micromanipulateur (voir Figure 2C).
REMARQUE: Un exemple de fichier 3D pour la fabrication de plate-forme et la fabrication de porte-sonde au format STL est disponible sur demande auprès de l’auteur correspondant. - Assemblage de lentilles négatives. Placez une lentille cylindrique négative (-75 mm de distance focale et environ 50 mm de hauteur et de longueur) comme illustré à la figure 1C et à la figure 1D pour corriger la distorsion causée par l’ajout de liquide à la boîte de Pétri (l’ajout de liquide déforme la vue de l’œil disséqué lorsqu’il est imagé de côté).
- Collez la lentille négative sur l’une des bases à 2 fentes (voir la figure 2D pour le positionnement de l’objectif sur la base).
- Assemblez les pièces restantes comme illustré à la figure 2D.
- Ajustez la hauteur du poteau de sorte que l’objectif plane à peine sur la balance et serrez la vis dans le support du poteau.
- Construction d’appareils
- Installez sur un ordinateur le programme de journalisation fourni avec la balance, le logiciel de caméra de microscope et l’application de contrôleur de micromètre motorisé.
- Connectez le micromètre motorisé au contrôleur du servomoteur et ce dernier à l’ordinateur. Démarrez l’application du contrôleur de moteur et modifiez les paramètres du moteur.
REMARQUE: Les réglages du moteur, qui sont énumérés ci-dessous, ont été choisis à la suite d’expériences préliminaires qui ont révélé que les contraintes se détendaient sur une échelle de temps de 10 à 20 s. Sur la base de cette détermination, nous avons sélectionné une vitesse et une accélération qui permettaient au moteur de réaliser un déplacement de 50 μm dans un temps inférieur au temps de relaxation, mais pas trop court pour éviter de secouer l’échantillon. Ici, nous avons choisi un temps de déplacement d’environ 5-10 s. - Réglez la vitesse maximale à 0,01 mm/s et l’accélération à 0,005 mm/s2.
- Installez la caméra dans le microscope d’inspection et testez le logiciel d’imagerie de la caméra.
- Placez la balance sur l’espace de banc consacré à l’appareil.
- Collez une plate-forme imprimée en 3D (à partir de l’étape 1.1.2) dans une boîte de Petri et ajoutez une perle de verre de 2 à 3 mm à l’un des puits. Placez la boîte de Petri sur la balance de sorte que la perle soit située près du centre de la casserole.
- Remplacez le micromètre manuel du micromanipulateur par le micromanipulateur motorisé.
- Vissez les deux vis 4-40 dans le porte-sonde. Fixez le porte-sonde au manipulateur comme illustré à la Figure 1C.
- Préparez une sonde comme illustré à la Figure 2A, placez-la à l’intérieur du porte-sonde avec la partie pliée vers le bas et serrez les vis.
- Placez le micromanipulateur sur la table de manière à ce que la pointe de la sonde soit au-dessus de la perle sur la plate-forme. Fixez le micromanipulateur à la table pour éviter tout mouvement accidentel pendant l’expérience.
- Positionnez le microscope latéral sur la table de sorte que la perle soit au centre de son champ de vision et au point.
2. Préparation des échantillons et acquisition des données
- Fixation et dissection oculaires
- Maintenir les souris de type sauvage et les animaux Magp1-null sur un fond C57/BL6J identique. Euthanasier des souris de 1 mois ou 1 an par inhalation de CO2 .
- Retirer les yeux avec une pince fine et fixer les globes énucléés à 4 °C pendant la nuit dans une solution saline tamponnée à 4 % de paraformaldéhyde/phosphate (PBS, pH 7,4). Maintenir une pression positive de 15-20 mmHg dans l’œil pendant le processus de fixation, comme décrit6.
REMARQUE: Des expériences sont menées sur des souris mâles, afin de contrôler les différences possibles liées au sexe dans la taille du globe oculaire. La pression positive assure que le globe reste gonflé, préservant l’espace entre la lentille et la paroi de l’œil enjambé par les fibres zonulaires. - Lavez les yeux pendant 10 min dans PBS. À l’aide de ciseaux chirurgicaux ophtalmiques et en travaillant sous un stéréomicroscope, faites une incision de pleine épaisseur dans la paroi de l’œil près de la tête du nerf optique.
- Étendez la coupe vers l’équateur, puis autour de la circonférence équatoriale de l’œil. Prenez soin d’épargner les processus ciliaires délicats et les fibres zonulaires associées.
- Retirez l’arrière du globe, exposant la surface postérieure de la lentille.
- Utilisez la pince pour retirer un œil disséqué de la solution tampon et placez-le sur une lingette sèche avec la cornée tournée vers le bas. Faites glisser doucement la cornée sur la surface de la lingette pour la sécher.
- Ajouter 3 μL de colle instantanée aux puits de la plate-forme qui accueilleront l’œil dans la boîte de Pétri.
- Placez le plat sur la plaque de scène du stéréomicroscope afin que le puits avec la colle soit en vue.
- Transférez l’œil de la lingette au bord du puits qui contient de la colle. Ensuite, faites glisser soigneusement l’œil dans le puits et ajustez rapidement son orientation de sorte que l’arrière de la lentille soit le plus haut.
- Séchez le côté exposé de la lentille en l’épongeant doucement avec le coin d’une lingette sèche.
- Appliquez une noisette de colle instantanée au fond d’une boîte de Petri de 50 mm et cimentez la plate-forme.
- Mesure de la réponse viscoélastique zozonulaire
- Allumez la balance, démarrez le programme d’enregistrement de la balance et le logiciel de la caméra. Assurez-vous que le programme de journalisation peut acquérir des données pendant 30 minutes, car certains essais peuvent durer aussi longtemps.
- Allumez le contrôleur du servomoteur et démarrez l’application du contrôleur sur l’ordinateur. Assurez-vous que le contrôleur est configuré pour se déplacer par incréments de 50 μm à l’aide de paramètres de mouvement similaires à ceux décrits dans la NOTE de l’étape 1.2.2.
- Créez une courbure de 90° dans une tige capillaire comme décrit à l’étape 1.1.1.
- Glissez le capillaire plié dans le porte-sonde capillaire et serrez les vis de fixation.
REMARQUE: Pour minimiser la déshydratation de l’échantillon, nous recommandons que les étapes 1 à 4 soient complétées avant ou pendant la dissection oculaire. - Ajouter une petite perle (~1 mm) de colle uvdurcissable à l’extrémité du capillaire.
- À l’aide des réglages manuels sur le manipulateur, déplacez la pointe de la sonde capillaire de sorte qu’elle soit directement au-dessus du centre de la lentille. Vérifiez si la partie inférieure de la colle UV semble centrée sur le dessus de l’objectif lorsqu’elle est vue de l’avant (par inspection visuelle) et du côté (à travers la caméra du microscope).
- En regardant à travers l’appareil photo, abaissez la pointe de la sonde jusqu’à ce que la colle UV entre en contact avec l’objectif et couvre un tiers à la moitié de sa surface supérieure.
- Utilisez une source de lumière UV (380-400 nm) de faible intensité (~ 1 mW), directionnelle et presque visible pour durcir la colle.
REMARQUE: Ces spécifications suffisent à durcir la colle en quelques secondes tout en minimisant le potentiel d’induction de la réticulation des protéines. Les sources de lumière UV fournies avec les stylos à colle UV commerciaux répondent à ces spécifications. - Ajouter la solution de PBS à la boîte jusqu’à ce que l’œil soit recouvert de liquide à une profondeur d’au moins 2 mm.
- Placez la lentille cylindrique devant le microscope d’inspection et aussi près que possible de la boîte de Pétri sans la toucher.
- Démarrez simultanément le programme de journalisation et un programme de minuterie. Prenez une photo de l’œil / de la sonde à l’aide de l’appareil photo.
- Après 60 s, initier un autre déplacement de 50 μm, puis toutes les 60 s jusqu’à ce que l’expérience soit terminée, c’est-à-dire jusqu’à ce que toutes les fibres aient été brisées. Notez que le signal ne reviendra pas aux niveaux de base en raison de l’évaporation du tampon pendant l’expérience. Corrigez la dérive qui s’ensuit dans les lectures au cours de l’analyse des données, comme illustré à l’étape 2.2.14.
- À la fin d’une exécution, enregistrez les données de journalisation de l’échelle et exportez-les dans un format compatible avec la feuille de calcul, par exemple un format .csv. Enregistrez les images de l’objectif qui ont été collectées pendant la course.
- Importer des données dans une feuille de calcul. Utilisez la première et la dernière lecture d’échelle pour interpoler la dérive de la lecture d’arrière-plan au fil du temps due à l’évaporation (voir la figure 3). Soustrayez la lecture interpolée de la lecture à chaque point temporel.
REMARQUE: Si vous utilisez une feuille de calcul, l’interpolation peut être effectuée automatiquement en entrant la formule = B2 - $B $2 + ($B $2 - @INDIRECT(« B"&COUNTA(B:B)))/(COUNTA(B:B)-2) * A2 dans la cellule à droite de la première lecture d’échelle, puis en déplaçant le curseur dans le coin inférieur droit de la cellule et en le faisant glisser vers le bas jusqu’à la dernière valeur de données. La formule suppose que les données sont organisées dans une colonne avec le premier point de données apparaissant dans la cellule B2. Si vous le souhaitez, les données traitées à l’étape 2.2.14 peuvent être analysées avec le modèle viscoélastique quasi-élastique développé par l’un des co-auteurs, le Dr Matthew Riley4.
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Representative Results
La technique de traction décrite ici fournit une approche simple pour déterminer les propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires chez la souris. En bref, l’œil de souris est d’abord préservé par injection d’un fixateur à la pression intraoculaire physiologique. Cette approche maintient le gonflage naturel de l’œil et maintient les fibres correctement pré-tendues (la fixation a été jugée acceptable après que des expériences préliminaires ont démontré qu’elle ne modifiait pas l’élasticité ou la résistance des fibres de manière significative). L’arrière de l’œil de la souris est ensuite retiré par dissection pour exposer la lentille et les fibres zonulaires qui la suspendent. L’avant de l’œil est fixé à une plate-forme et placé à l’intérieur d’une boîte de Petri qui repose sur une échelle numérique. Ensuite, un capillaire en verre attaché à un micromanipulateur est cimenté à la surface postérieure de la lentille. La lentille est ensuite soulevée par incréments de 50 μm pendant que la force sur l’échelle est enregistrée. Une réduction du poids apparent de la préparation fournit des informations sur les forces qui étirent les fibres. Chaque déplacement est suivi d’une période d’équilibrage d’environ 1 min pour observer tout relâchement du stress induit par le déplacement. Enfin, les résultats sont analysés à l’aide d’un modèle viscoélastique quasi-linéaire conçu spécifiquement pour la géométrie des fibres zonulaires de la souris et la direction de la traction pour le test4.
Les données viscoélastiques typiques obtenues avec notre méthode sont présentées à la figure 3. La courbe apparaît inversée (négative) puisque la force de portance sur la lentille réduit le poids de l’ensemble plat/plate-forme/œil sur la balance d’une quantité équivalente. La réponse comprend des pics de force instantanés lors de chacun des déplacements verticaux de 50 μm de la lentille, suivis d’une phase de relaxation d’une durée de vie de l’ordre de 10 s. Une relaxation du stress similaire a été observée pour les fibres zonulaires bovines12. L’ampleur des forces instantanées et détendues augmente à chaque pas jusqu’à environ 1000 s (~ 800 μm de déplacement total), puis commence à baisser lorsque les fibres commencent à tomber en panne. La défaillance de Zonule est terminée au point de temps de 1 500 s (~1,25 mm de déplacement total). Notez qu’en raison de l’évaporation du tampon au cours de l’expérience, la courbe ne revient pas à la lecture initiale une fois que la lentille est libérée de l’œil.
La figure 4 compare les réponses obtenues pour une souris knockout Magp-1 (courbe rouge) et un animal de type sauvage apparié selon l’âge (courbe bleue). Ces courbes ont été corrigées pour l’évaporation, inversées, et les mesures brutes de masse (voir figure 3) sont maintenant exprimées en force (avec des unités de mN). La réponse viscoélastique initiale de la zonule appauvrie en Magp-1 (temps 0-600 s) ressemble beaucoup à celle du type sauvage, suggérant que les propriétés viscoélastiques de la zonule n’ont pas été significativement modifiées par l’absence de Magp-1. Cependant, les fibres semblent se rompre à une tension beaucoup plus faible par rapport à leurs homologues de type sauvage.
Pour illustrer la fiabilité de la méthode, nous avons recueilli des données auprès de plusieurs animaux sur la force instantanée maximale appliquée aux yeux avant que leurs fibres ne se rompent. Les résultats sont présentés à la figure 5. Les données pour les souris âgées de 1 mois présentent de très faibles valeurs pour l’erreur-type de la moyenne (MEB) malgré le nombre relativement faible d’échantillons utilisés (n = 5 ou 6), suggérant une reproductibilité élevée. Les résultats indiquent que la force des fibres diffère significativement entre les deux génotypes (valeur p = 2,4 x 10-6). Les résultats non présentés dans les figures suggèrent également qu’il y a une augmentation subtile mais statistiquement significative de la force de rupture avec l’âge des animaux de type sauvage (valeur p = 0,024).
La méthode pull-up peut également générer des estimations quantitatives des paramètres viscoélastiques qui tiennent compte des variations observées dans les réponses temporelles. Le tableau 1 résume les paramètres les mieux adaptés à nos données MAGP-1, obtenues à l’aide d’un modèle viscoélastique quasi linéaire décrit précédemment4. Les résultats montrent que la délétion et le vieillissement du MAGP-1 peuvent avoir des impacts très importants sur certaines des propriétés mécaniques des fibres zonulaires.
Figure 1 : Résumé visuel de la méthode pull-up. (A) Vue en coupe transversale d’un œil de vertébré montrant la lentille et les fibres zonulaires qui le suspendent. (B) Une approche générale pour déterminer le comportement viscoélastique dans les fibres zonulaires en déplaçant le cristallin vers le haut (loin de la cornée). (C) Vue réelle d’un œil disséqué collé sur une plate-forme, sa lentille étant tirée vers le haut par une sonde en verre fixée à un micromanipulateur. (D) Schéma de l’ensemble de l’appareil. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Fabrication de diverses pièces. (A) Fabrication de la sonde en verre. Un capillaire en verre est maintenu en angle et une flamme est appliquée à un endroit à environ 2 cm d’une extrémité. En quelques secondes, l’extrémité du capillaire commence à tomber. La flamme est enlevée lorsque l’extrémité du capillaire est pliée à environ 90°. (B) Fabrication de la plate-forme oculaire. La pièce est fabriquée avec une imprimante stéréolithographique 3D (SLA). Il mesure 30 x 30 x 5 mm et contient trois indentations hémisphériques de 2,0, 2,5 et 3,0 mm de diamètre dans lesquelles sont collés des yeux disséqués de différentes tailles. (C) Fabrication du porte-sonde. Cette pièce a également été fabriquée avec une imprimante 3D SLA. Il se compose de deux tiges orthogonales de 7,3 mm de diamètre. La tige inférieure contient un alésage de 1,5 mm et deux trous traversants de 2,5 mm sur la surface extérieure pour accueillir des vis métalliques qui fixent la sonde capillaire en place. (D) Ensemble lentille négative. Les images capturées par le microscope latéral contiennent une distorsion astigmatique due à la courbure de la boîte de Pétri et à la solution tampon. L’ensemble de l’objectif est conçu pour compenser la distorsion, permettant au microscope latéral de capturer des images avec une mise au point nette. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Données brutes typiques obtenues avec le test. Le graphique illustré a été enregistré avec un logiciel de journalisation qui enregistre les données à partir d’une échelle numérique avec une précision de 0,01 g. Le bord gauche du graphique (temps 0) reflète le poids de l’échantillon sans force de levage. L’axe des y représente la masse en g. La lentille est ensuite soulevée par paliers de 50 μm jusqu’à ce que toutes les fibres zonulaires soient cassées et que la boîte de Petri repose à nouveau entièrement sur la balance. Notez que la lecture finale est décalée par rapport à la lecture initiale. Le décalage est dû à l’évaporation progressive de la solution tampon au cours de l’expérience et peut être pris en compte lors de l’analyse des données, comme indiqué à l’étape 2.2.14. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Courbes de force-déplacement zonulaire représentatives pour les souris de type sauvage et déficientes en MAGP-1. Le graphique compare la réponse viscoélastique obtenue après des déplacements discrets de la lentille loin de sa position d’équilibre. La réponse d’un œil d’une souris KNOCKOUT MAGP-1 (KO) suit celle d’un animal de type sauvage adapté à l’âge jusqu’au point où les fibres de la souris knockout se brisent prématurément. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Forces de rupture des fibres zozonulaires obtenues avec la méthode pull-up pour MAGP-1 KO par rapport aux souris de type sauvage et à deux âges. Toutes les mesures indiquées sont basées sur n = 5 ou 6 yeux, avec des barres d’erreur représentant l’erreur type de la moyenne (MEB). Abréviations: WT = wild-type; KO = MAGP-1 KNOCKOUT. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Génotype/âge | G0 (Pa) | G∞ (Pa) | Ʈ (sec) | σ f (Pa) | |
| WT 1 mois | MÉCHANT | 2.34E+05 | 9.33E+04 | 16.3 | 9,61E+05 |
| SD | 2,83E+04 | 2,94E+04 | 3.4 | 1.25E+05 | |
| 95% Cl | 5,55E+04 | 5,76E+04 | 6.7 | 2.45E+05 | |
| KO 1 mois | MÉCHANT | 2,73E+05 | 6,74E+04 | 17.6 | 4.44E+05 |
| SD | 6.30E+04 | 2.06E+04 | 3.8 | 7,85E+04 | |
| 95% Cl | 1.23E+05 | 4.03E+04 | 7.5 | 1,54E+05 | |
| valeurs p | 0.25 | 0.12 | 0.58 | 0.000022 | |
| WT 1 an | MÉCHANT | 1,98E+05 | 7.42E+04 | 17 | 1.41E+06 |
| SD | 1.17E+05 | 2.39E+04 | 9.1 | 2,44E+05 | |
| 95% Cl | 2.29E+05 | 4,69E+04 | 17.9 | 4,79E+05 | |
| KO 1 an | MÉCHANT | 1,70E+04 | 2,46E+04 | 12.9 | 5.05E+05 |
| SD | 9.06E+03 | 8.04E+03 | 7.4 | 1,48E+05 | |
| 95% Cl | 1,78E+04 | 1,58E+04 | 14.4 | 2,91E+05 | |
| valeurs p | 0.0063 | 0.001 | 0.41 | 0.000014 | |
| p valeurs, âge | WT | 0.46 | 0.23 | 0.85 | 0.002 |
| KO | 0.0007 | 0.0068 | 0.26 | 0.44 | |
Tableau 1 : Propriétés viscoélastiques obtenues avec un modèle viscoélastique quasi-linéaire (QLV). Les analyses de données comme celles illustrées à la figure 4 ont été analysées à l’aide d’un modèle QLV développé spécifiquement pour le test pull-up et la zonule de souris. Les paramètres les mieux adaptés aux rigidités instantanées (G0) et d’équilibre (G∞), à la constante de temps de relaxation (τ) et à la résistance à la traction ultime (σ f) sont affichés. Abréviations : SD = écart-type; IC = intervalle de confiance.
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Discussion
La zonule est un système ECM inhabituel où les fibres sont disposées symétriquement et peuvent être manipulées à l’identique en déplaçant la lentille oculaire le long de l’axe optique. L’espace est également facilement accessible sans perturbation cellulaire, ce qui permet d’étudier les fibres dans un environnement proche de leur état natif. La technique pull-up tire parti de cette présentation ECM pour manipuler les fibres délicates de souris, un système génétiquement traitable, et quantifier avec précision leurs propriétés mécaniques. Cela nous a permis d’examiner la contribution des protéines ECM clés (fibrilline-118, LTBP-24 et MAGP-1 rapportées ici) aux propriétés biomécaniques des fibres zonulaires. Notre analyse de souris déficientes en fibrilline-1 a révélé que les fibres zonulaires dépourvues de fibrilline-1 s’affaiblissent avec l’âge et finissent par se rompre, entraînant le déplacement du cristallin dans l’œil (chez l’homme, une condition connue sous le nom d’ectopie lentis). De manière significative, la luxation du cristallin est également fréquente chez les patients atteints du syndrome de Marfan, une maladie causée par des mutations du gène FBN120. Ainsi, le test pull-up offre l’occasion de modéliser des aspects de la maladie du tissu conjonctif humain chez la souris. Chez des souris dépourvues de LTPB-2 (une protéine que l’on pense être impliquée dans la genèse des microfibrilles), nous avons pu démontrer que les fibres zonulaires étaient produites en l’absence de cette protéine, mais se rompaient à des contraintes significativement plus faibles et finissaient par se désintégrer avec l’âge4. Ces résultats suggèrent que le LTBP-2 contribue à la longévité des fibres plutôt qu’à leur synthèse. Dans la présente étude, nous avons déterminé que les fibres déficientes en MAGP-1 avaient des propriétés viscoélastiques similaires à celles des fibres de type sauvage, mais se rompaient à des contraintes plus faibles, sans aucun signe de dégradation supplémentaire liée à l’âge. Cela serait cohérent avec un modèle dans lequel les fibres dépourvues de MAGP-1 sont intrinsèquement plus faibles dès qu’elles se développent.
Nous notons que les résistances à la traction ultimes énumérées dans le tableau 1 sont estimées en supposant que les fibres se brisent quelque part à mi-portée. Cependant, nous ne pouvons pas exclure la possibilité que la défaillance des fibres soit due au détachement des points d’ancrage sur la surface de la lentille ou le corps ciliaire. Si tel était le cas, la résistance à la traction à la rupture de la fibre pourrait être supérieure aux valeurs indiquées dans le tableau 1. Une analyse microscopique sera nécessaire pour différencier ces possibilités. Une telle analyse est loin d’être triviale puisque les fibres impliquées sont très minces (~ 0,5-0,6 μm de largeur) et presque indexées à l’eau, ce qui les rend essentiellement invisibles. En l’absence de ces informations supplémentaires, nous ne pouvons qu’affirmer que les résistances à la traction ultimes énumérées dans le tableau 1 représentent leurs limites inférieures. Il serait également intéressant, en principe, de vérifier si les mesures de force diffèrent selon la direction dans laquelle la lentille est tirée. Dans la pratique, cependant, tirer la lentille de la face antérieure nécessiterait de retirer l’iris sans endommager les fibres zonulaires situées immédiatement en dessous. Une dissection aussi précise est au-delà de ce que nous pouvons actuellement réaliser avec l’œil de souris.
La relative simplicité de la méthode et la haute reproductibilité de ses résultats sont des qualités souhaitables pour les études comparatives des propriétés mécaniques de l’ECM. De plus, comme démontré ici, il est également possible d’utiliser le test pull-up pour obtenir des valeurs absolues de paramètres viscoélastiques en supposant un modèle viscoélastique et en y ajustant les courbes temporelles. Par exemple, en utilisant un modèle viscoélastique quasi-linéaire standard (QLV), nous avons pu extraire des valeurs pour les rigidités instantanées (G0) et d’équilibre (G∞), la constante de temps de relaxation (τ) et la résistance à la traction ultime (σ f) des fibres zonulaires de souris de type sauvage, ainsi que celles dépourvues de LTBP-24 ou MAGP-1. Les valeurs G0 et G∞ obtenues pour les animaux de type sauvage dans les deux études varient de 6,7 x 104 Pa à 2,3 x 105 Pa, une gamme largement comparable à celles trouvées dans des fibres beaucoup plus grandes dérivées de zonules humaines, bovines et porcines (1,8 x 105-1,5 x 106 Pa)12,13, 14,15,16. Cet accord entre les espèces suggère qu’il s’agit de caractéristiques universelles de ces fibres et nous donne confiance que des paramètres viscoélastiques significatifs peuvent être extraits avec notre méthode.
Une étape critique pour obtenir des réponses viscoélastiques de qualité est l’orientation de l’œil disséqué collé à la plate-forme (étape 2.1.9). Une inclinaison mineure (inférieure à 10°) ne semble pas affecter les résultats de manière significative. Les expériences réalisées en dehors de cette limite peuvent générer des courbes avec des formes qui s’écartent de celles illustrées à la figure 4. Par exemple, certaines de ces courbes peuvent posséder deux larges pics au lieu d’un.
Idéalement, la procédure décrite dans cet article aurait été effectuée sans fixation des yeux, ce qui limite notre capacité à évaluer les véritables paramètres viscoélastiques des fibres zonulaires fraîches. Cependant, après que nos expériences préliminaires n’aient montré aucune différence significative entre les échantillons fixés au paraformaldéhyde et les échantillons frais, nous avons décidé d’adopter la fixation car elle offrait plusieurs avantages. Comme mentionné dans le Protocole, l’utilisation de tissus fixes aide à préserver l’étirement natif des fibres pour les expériences de traction. De plus, nous avons constaté que la fixation favorisait une plus grande adhérence de la colle UV à la capsule oculaire, réduisant ainsi les chances que la sonde se détache de la lentille pendant l’action de traction, comme cela est couramment le cas avec des échantillons frais (le détachement de la sonde peut être facilement reconnu comme un retour soudain de la force à un niveau de base). La fixation a également empêché le flambement de la paroi oculaire dans le sens de la traction. Malgré cette limitation, notre méthode fournit une approche robuste pour déterminer la contribution relative des composants protéiques aux propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires.
Bien que nos travaux à ce jour se soient concentrés sur l’apport de protéines spécifiques, la méthode pourrait facilement être adaptée pour étudier l’effet de facteurs externes aux fibres sur leurs propriétés mécaniques. Ces facteurs comprennent la température, le pH, la concentration en calcium et la présence ou l’absence d’enzymes de réticulation. Des mesures de haute précision pourraient être obtenues en utilisant notre méthode en mode différentiel, c’est-à-dire en prétensionnant les fibres zonulaires avec une contrainte / déformation initiale, puis en lisant la différence de tension qui s’ensuit lorsque les conditions extérieures sont modifiées. Certaines de ces interventions peuvent affecter l’élasticité des tissus qui entourent la zonule et donc produire des changements de tension qui rivalisent avec ceux générés dans la zonule. Des mesures de contrôle avec des tissus isolés seraient nécessaires pour évaluer leur pertinence pour les expériences proposées. Nous nous attendons à ce que de tels effets soient négligeables, sur la base d’observations avec la caméra latérale montrant que les tissus contigus se comportent comme des matériaux très rigides qui ne subissent pratiquement aucune déformation même lorsque les fibres zonulaires sont complètement étirées.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par NIH R01 EY029130 (S.B.) et P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 et la Ines Mandl Research Foundation (R.P.M.), la Fondation Marfan, et une subvention sans restriction au Département d’ophtalmologie et de sciences visuelles de l’Université de Washington de Research to Prevent Blindness. J.R. a également reçu une subvention de l’Université des sciences de la santé et de la pharmacie à l’appui de ce projet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4-20 hex screws 3/4 inch long | Thorlabs | SH25S075 | |
| 1/4-20 nut | Hardware store | ||
| 3D SLA printer | Anycubic | Photon | |
| 4-40 screws 3/8 inch long, 2 | Hardware store | ||
| Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament | WPI | 1B120-3 | |
| Cyanoacrylate (super) glue | Loctite | ||
| Digital Scale accurate to 0.01 g | Vernier | OHAUS Scout 220 | |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet | |
| Gas cigarette lighter | |||
| Inspection/dissection microscope | Amscope | SKU: SM-4NTP | Working distance ~ 15 cm |
| Micromanipulator, Economy 4-axis | WPI | Kite-L | |
| Motorized micrometer | Thorlabs | Z812B | |
| Negative cylindrical lens | Thorlabs | LK1431L1 | -75 mm focal length |
| Petri dishes, 50 mm | |||
| Post holder, 3 inches | Thorlabs | PH3 | |
| Post, 4 inches | Thorlabs | TR4 | |
| Scale logging software | Vernier | LoggePro | |
| Servo motor controller | Thorlabs | KDC101 | |
| Servo motor controller software | Thorlabs | APT | |
| Slotted base, 1 | Thorlabs | BA1S | |
| Slotted bases, 2 | Thorlabs | BA2 | |
| Stand for micromanipular | WPI | M-10 | |
| USB-camera for microscope | Amscope | SKU: MD500 | |
| UV activated glue with UV source | Amazon |
References
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