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Biology

用于确定未知 尖孢镰刀菌 f.sp的种族的三种接种技术的对比。 尼维姆 分离

Published: October 28, 2021 doi: 10.3791/63181
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 1, 3, 4,5, 6, 1
1Department of Plant Pathology, University of Florida, 2University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences, 3Gulf Coast Research and Education Center, University of Florida, 4Horticultural Sciences Department, University of Florida, 5Tropical Research and Education Center, University of Florida, 6Department of Horticulture, University of Georgia
* These authors contributed equally

Summary

管理西瓜枯萎病需要了解存在的病原体种族。在这里，我们描述了根浸，感染的内核播种和改良的托盘浸渍接种方法，以证明它们在致病真菌 尖孢镰刀菌 f. sp niveum （Fon）的种族分型中的功效。

Abstract

由尖孢镰刀菌 f. sp. niveum （Fon） 引起的西瓜镰刀菌枯萎病 （Citrullus lanatus） 已重新成为美国东南部，特别是佛罗里达州的主要生产制约因素。部署综合虫害管理战略，如针对特定种族的抗性品种，需要有关种植者田间病原体的多样性和种群密度的信息。尽管在开发用于鉴定病原体分离株的分子诊断工具方面取得了一些进展，但种族确定通常需要生物测定方法。

通过根浸接种，侵扰籽粒播种法和改良的托盘浸渍法（黑钻石，查尔斯顿灰，卡尔霍恩灰，植物介绍296341-FR）中的每一种进行种族分型。通过计算接种后五周的疾病发病率，为分离株分配种族名称。如果特定品种中不到33%的植物有症状，则它们被归类为抗性植物。发生率大于33%的品种为易感品种。本文介绍了三种不同的接种方法，以确定种族，根浸，侵染的内核和改良的托盘浸渍接种，其应用因实验设计而异。

Introduction

构成 尖孢镰刀菌 物种复合物（FOSC）的土生真菌是影响性的半生物养植物病原体，可导致多种作物的严重疾病和产量损失1。由 F. oxysporum f. sp. niveum （Fon） 引起的西瓜镰刀菌枯萎病在过去 几十年中在世界各地的范围、发病率和严重程度都在增加2，3.在幼苗中，镰刀菌枯萎病的症状通常类似于阻尼。在较老的植物中，叶子变成灰色，绿化和坏死。最终，植物的枯萎进展为植物完全崩溃和死亡4。直接产量损失是由于植物的症状和死亡而发生的，而间接产量损失可能是由于太阳损害造成的，由叶面冠层5的消除引起的。在 F. oxysporum 中从未观察到有性繁殖和相关生殖结构。然而，病原体产生两种类型的无性孢子，微分生孢子和大分生孢子，以及称为衣原体孢子的更大的长期生存结构，可以在土壤中存活多年6。

FOSC根据观察到的宿主范围被分类为特殊形态，通常限于一个或几个宿主物种1。虽然最近的研究表明，这种物种复合物可能是15种不同物种的复合物，但感染西瓜的特定物种目前尚不清楚7种。 F. oxysporum f. sp. niveum （Fon） 是专门感染 Citrullus lanatus 或驯化西瓜8，9 的菌株组的名称。在大多数致病性特产中的 F. oxysporum 菌株在其遗传成分和对宿主物种的毒力方面显示出一定程度的多样性。例如，一种菌株可能感染宿主的所有栽培品种，而另一种菌株可能只感染更易感的品种。为了解释这种变异，这些群体根据进化关系或共同的表型特征被非正式地分为种族。在Fon中，根据其对一组精选西瓜品种的致病性，对4个种族（0，1，2和3）进行了表征，最近发现了10个种族3。

尽管存在这种明显的多样性，但孢子或菌丝的形态在Fon种族之间无法区分，这意味着需要分子或表型测定来鉴定分离株的独特种族11。分子研究已经确定了一些遗传差异。例如，分泌在木质部（SIX）效应子中的作用已经在 F. oxysporum 中研究了多年，其中一些效应子已经位于水平基因转移过程中交换的染色体上12。例如，SIX6在Fon种族0和1中找到，但在种族213中找不到。六个效应子与 F. oxysporum f. sp . lycopersici 和 F. oxysporum f. sp. cubense的致病性有关，它们分别导致番茄和香蕉上的镰刀菌枯萎病，分别为14，15，16，17。对菠菜上的镰刀菌枯萎病病原体F . oxysporum f. sp. spiniciae菌株的SIX效应谱的分析使得分类能够准确反映遗传和表型多样性18。然而，Fon种族的毒力机制之间的差异目前尚不完全清楚，并且使用它们时开发的分子测定显示出不一致和不准确的结果19。因此，感染检测的表型结果是目前对分离株进行分类的最佳方法。

F. oxysporum 最初通过根部感染宿主，然后向上进入木质部20。这使得直接接种特定宿主品种的根系成为进行种族分型的有效方法，并且是根浸和托盘浸渍接种方法21的基础。当不感染宿主时， F. oxysporum 居住在土壤中，并且可以保持休眠多年。在土壤中从感兴趣的田地种植易感的西瓜品种是测试Fon存在的一种方法。将这种方法扩展到包括故意用Fon侵扰的土壤中具有不同已知抗性水平的品种也是进行种族分型的好方法（表1），并且是受感染的内核播种方法的基础。改进的托盘浸渍方法是原始托盘浸渍方法的变体，该方法允许高通量的竞赛类型，其中可以快速研究许多植物和田间分离株22。快速和成功的种族分型生物测定的重要因素包括使用已记录对不同病原体种族的抗性差异的品种，确保接种物在感染期间具有生物活性和丰富性，保持对病原体和宿主都有利的环境，以及使用一致的疾病严重程度或发病率评级系统。本文描述了基于上述原理的根浸23，24，出没的内核播种25，26和改进的托盘浸渍22 表型种族分型方法。

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Protocol

1. 通过浸根法（RDM）确定种族

  1. 实验环境的准备
    1. 由于症状表达高度依赖于环境条件，因此将植物保持在受控区域。监测相对湿度、温度、光周期和光照强度（图1）。
      1. 将温度设置为26-28°C，相对湿度设置为50-75%，并设置16小时的光周期，以确保植物足够的生长和健康。
        注意：为了防止缺氧，幼苗枯萎和/或种子腐烂，不要在幼苗周围过度浇水或允许积水。
      2. 使用两个荧光灯管，每个灯管至少具有1850流明的光和每组灯2，800 K的色温，以支持光合生长。
      3. 保持区域清洁，并采取卫生措施，包括清除废土和植物残骸，以防止虫害和偶然感染。
    2. 种植条件
      1. 用种植培养基填充8 x 16个单元（25厘米宽x 50厘米长）的平板，然后点击以略微压缩土壤（图2）。
      2. 获得四个差异品种的种子：黑钻石/糖宝宝，查尔斯顿灰/全甜/迪克西莉，卡尔霍恩灰和PI-296341-FR。
      3. 播种，其顶端（尖端）向上指向等于其长度的深度。播种后，用100%富勒的土壤或其他膨润土覆盖含有埋藏种子的培养基，以替代0.3175-0.635厘米的深度。
      4. 在公寓上喷洒以湿润介质，而不会产生站立或积水。之后，每180分钟喷雾20秒，或每天用手浇水一次，直到种子发芽约5天，以保持培养基湿润。发芽后，每天浇水一次，根据需要支持幼苗的生长。
    3. 培养基制备
      注意：两种培养基都用额外的颗粒琼脂制成坚固，以便通过刮擦表面来收获孢子。
      1. 澄清V8果汁培养基（V8）
        1. 通过加入100 mL澄清的V8原100%蔬菜汁和1%CaCO3至400 mL蒸馏水，制备500 mL澄清V8果汁培养基（V8）27。
        2. 加入7.5克颗粒琼脂。
        3. 充分混合配料，高压灭菌，冷却至50°C，然后倒入无菌培养皿中。
      2. 四分之一强度马铃薯葡萄糖琼脂培养基（qPDA）
        1. 将4.5克颗粒琼脂加入500mL蒸馏水中，加入3.8g马铃薯葡萄糖琼脂，制备qPDA培养基。
        2. 充分混合配料，高压灭菌，冷却至50°C，然后将12-15 mL倒入无菌培养皿中。
  2. 实验处理制剂的制备
    1. 准备接种物。
      1. 种植后五天（dpp），将含有优选 的F. oxysporum 分离物的浸润纸盘（直径1-1.25cm）放在一个V8和一个qPDA板上，并将它们储存在培养箱（〜28°C）中8天28 （图3A）。
      2. 在真菌生长的第八天和接种前一天（见第1.3.2节），将V8和qPDA板从培养箱转移到生物安全柜中。
      3. 对于每个分离物，将6 mL灭菌去离子水分配到每个V8和qPDA培养板上。
      4. 通过在培养基表面上刮取无菌细胞扩张器来驱逐分生孢子（图3B）。将液体分生孢子悬浮液池化，并将其转移到无菌的50mL培养管中（图3C）。
      5. 重复此过程，直到50 mL培养管中的液体分生孢子悬浮液总体积约为12 mL。
      6. 在进行另一种分离物之前，请用酒精对工作区域和细胞扩散器进行表面灭菌。将细胞扩散器浸入≥70%乙醇后，通过本生燃烧器将其通过本生燃烧器进行灭菌。
      7. 一旦液体分生孢子悬浮液被转移到所有分离物的培养管中，量化孢子计数。首先，涡旋单独的50 mL培养管，并将10μL分配到血细胞计数器的每个腔室中。然后，计算血细胞计数器中孢子的数量，如前面描述的29。
      8. 通过将计算体积的106 + 10%转移到另一个无菌培养管中来制备最终的接种溶液，并通过添加无菌去离子水使总体积达到30mL。
      9. 将这些培养管在8±1°C下储存过夜。
        注意：这可以在不损失分生孢子活力的情况下完成，如未发表的数据所示。
  3. 接种
    1. 准备接种。
      1. 在接种日之前，将13天龄的幼苗强力浇水至土壤承载能力。
      2. 使用相关信息预先标记木桩，包括要测试的分离株，西瓜品种和接种日期。
      3. 放置6 x 12细胞（20厘米宽x 40厘米长）泡沫塑料平板，事先用10%漂白剂消毒并冲洗干净，以接收接种的植物。
      4. 介置所有需要的材料（见 材料表）。
    2. 接种植物根部。
      1. 在开始接种前几个小时给植物浇水。浇水后至少2小时，从8×16细胞泡沫塑料平板上取出试管苗并冲洗其根部以除去任何粘附的种植材料颗粒。
      2. 将漂洗的植物暂时存放在干净的容器中，用自来水直到使用，使品种彼此分开（图4A）。将幼苗分成六组，每组六个，并将幼苗组用湿纸巾包裹在实验室托盘上，以防止干燥。
      3. 将25-30厘米3 的土壤放在6 x 12阵列聚苯乙烯泡沫托盘的每个细胞的底部，并使用喷瓶将土壤弄湿，直到它明显潮湿。
      4. 根据栽培品种接种植物并重新种植，以便从左到右种植黑钻石，查尔斯顿灰，卡尔霍恩灰，然后从左到右种植PI 296341 01 FR。
      5. 从健康对照开始，将同一品种的六个未损坏的幼苗放入含有接种物的50mL管中。在健康对照的情况下，使用自来水代替孢子悬浮液。最后用阳性对照（Fon race 3）接种植物。
      6. 一旦进入管内，确保植物根部到达并暴露于接种物（自来水）中。
      7. 涡旋管与试管根浸没30秒（图4B）。涡旋后，将每个细胞的单个试管苗放在6 x 12泡沫塑料平板中。将同一栽培品种的植物放在托盘的同一列中。
      8. 放置后，将戴手套的手放在0.7%可用氯溶液的桶中30秒，然后自来水冲洗1分钟，对戴手套的手进行消毒。
      9. 然后，用种植培养基覆盖放置的试管苗并轻轻设置。使用注射器或移液器，小心地用水/试管苗20 mL浇灌试管苗，同时避免飞溅。
      10. 在进入下一组植物之前，使用氯溶液和自来水冲洗再次消毒戴手套的双手。
      11. 在所有幼苗重新种植后，再次至少浇水以防止接种物径流。
      12. 将试苗在平均温度为27°C的封闭黑暗环境中过夜。 第二天，将植物转移到温室中，将平均气温保持在27°C。
  4. 接种植物的维护和保养
    1. 为了防止多余的水溢出，每天轻轻浇水三次，持续4-5天，直到植物稳定。
    2. 每天检查托盘2-3次，持续至少三天，以确保浇水充分均匀。
    3. 避免因阳光或遮阳而干燥，方法是旋转公寓和/或在必要时提供补充遮阳/浇水。
    4. 在3 dpp时，以每升水3-6 mL的速度用20-20-20速释肥料（10 g / 3.78 L）为植物施肥。
    5. 每周受精3-4周。
    6. 在整个步骤中保持相同的照明和环境条件。

2. 通过受感染的内核方法 （IKM） 确定种族

  1. 内核感染
    1. 准备接种物。
      1. 无论是从储存的还是新收集的样品中，在qPDA平板上分离并培养感兴趣的 F. oxysporum f. sp. niveum 菌株，直到其生长覆盖板的一半。
        注意：这表明它是活跃和可行的，这对于在后续步骤中对谷物的大量侵扰是必要的。
    2. 准备内核。
      1. 在任何足够大的容器中，测量出200克黑麦（Secale spp.）浆果（或Maxie var.小麦（小麦属）仁），并将它们倒入一个或多个1升玻璃锥形瓶中。将无菌自来水加入烧瓶中，以完全覆盖至少5厘米的谷物（图5A）。
      2. 将果仁在室温（~24°C）下浸泡2小时。从烧瓶中排出水;用一块用干酪布包裹的棉卷堵塞开口;并用铝箔包装盖住开口（图5B）。
    3. 对内核进行去污。一旦谷物吸收了水，就以两种不同的方式将其高压灭菌两次，以在接种前杀死其他不需要的微生物。
      1. 在第一次中，在重力循环（121.2°C，1.06 kg/ cm 2）上在制备的烧瓶中高压灭菌1小时，干燥时间为5分钟。让烧瓶冷却至室温。
      2. 在第二次高压灭菌之前，将谷物转移到带有0.5μm过滤器的小蘑菇生长袋中。从袋子中取出空气，然后将多余的塑料折叠在袋子周围。
      3. 将袋子放在塑料、高压灭菌器安全的垃圾箱中。用铝箔包装盖住垃圾箱（图5C）。
        注意：在高压灭菌袋中的谷物时，请勿使用金属箱，因为这可能会导致袋子融化。
      4. 在重力循环上高压灭菌1小时，干燥时间为5分钟，与以前相同的循环。
        注意：仅第二次高压灭菌袋，而不是第一次，因为如果袋子被高压灭菌两次，过滤器和端口可能会受到损害。在将袋子从高压釜中取出之前，让袋子缓慢而完全地冷却，以防止过滤器上的冷凝，因为如果袋子变湿，生长袋过滤器会受到损害。
    4. 接种果仁。
      1. 在生物安全柜中与培养板和袋子一起工作，从培养板上的活性生长区切割直径为6毫米的琼脂盘，并带有无菌的#4尺寸软木孔。展开袋子。使用严格的无菌技术，将5个琼脂盘放在袋子里。使用无菌 50 mL 量筒测量 35 mL 无菌自来水，并将其添加到袋中。
      2. 稍微滚动袋子的开口，然后用70%乙醇喷洒外部以进行表面灭菌。
        注意：请勿喷洒过滤器，因为水分也会损害过滤器。
      3. 通过将角落向中心折叠，然后在过滤器上方两次以上来关闭袋子。用制造商提供的袋子夹和透明乙烯基管固定袋子。
        注：夹子可重复使用。
      4. 从生物安全柜中取出袋子。
    5. 储存病原体以生长。
      1. 将袋子直立存放。确保将过滤器从滤袋的另一侧拉开，以实现最大的气体交换（图5D）。
      2. 将材料在室温下孵育约三周。定期重新分配谷物，以确保病原体的均匀生长。
        注意：这些袋子不可重复使用。
  2. 西瓜幼苗感染受感染的谷物
    1. 如前所述，源西瓜种子。
    2. 确定实验组。
      注意：唯一需要的病原体菌株是正在测试种族鉴定的分离株。然而，阴性和阳性对照将有助于与没有感染或特定感染水平的植物进行比较。
      1. 为了制备阴性对照，使用根据前面提到的方法灭菌但不接种的小麦粒。
      2. 为了制备阳性对照，使用接种了已分类菌株的小麦粒与未知分离株进行比较。
    3. 将土壤和谷物混合。
      1. 将14粒受感染的内核测量到一个大塑料袋中（图5E）。用灌封混合物填充塑料罐（直径15厘米x高10厘米），以测量所需的混合物量。将混合物倒入袋中。在袋子里做一个气垫，然后拧紧或密封。
      2. 将果仁和土壤倒置几次混合。对于阴性对照，在具有干净内核的不同袋子中执行相同的过程。对于阳性对照，在不同的袋子中执行相同的过程，其中的内核被比较菌株感染。
      3. 用受感染的土壤混合物填充四个表面灭菌的花盆。对于阴性对照，请在处理任何受Fon污染的土壤之前将混合物罐装。
    4. 播种西瓜种子。
      1. 在每个盆中播下六粒种子。确保每个花盆只包含一个品种的种子。将种子的顶端朝上放置，以便在出苗期间正常生长（图6A）。
      2. 使用喷雾瓶，用水润湿0.3-0.6厘米的土壤。在每个花盆的下方和上方放置一个透明的塑料皿（直径15厘米），为种子发芽创造潮湿的环境（图6B）。
    5. 建立生长条件。
      1. 每天用喷雾瓶浇灌花盆三次，以保持没有径流的浑浊度，直到种子发芽（约5天）。
        注意：用水量将随着植物大小和盆的大小而增加。
      2. 种子发芽后，将顶盘移到花盆的下面。
      3. 根据需要每天给植物浇水，以实现最佳的植物生长。在与前面描述的相似的照明条件下将植物暴露在16小时的光周期下，温度为27°C（±1°C）。

3. 通过改进的托盘浸渍法 （MTDM） 确定竞速

  1. 接种材料的制备
    1. 建立种植条件。
      1. 用蒸汽巴氏杀菌沙填充 48 单元（3.68 厘米宽 x 5.98 厘米长 x 4.69 厘米深）嵌件：泥炭：蛭石 （4：1：1），然后向下敲击以略微压缩土壤。将插入物放入塑料托盘中（27.9 厘米宽 x 53.3 厘米长 x 5.1 厘米深）。
      2. 播种时，种子的顶端（近端）向上指向等于其长度的深度。
      3. 如前所述采购种子。
      4. 之后，每 180 分钟喷 20 秒或每天用手浇水一次，以保持介质湿润。
      5. 发芽后（约5天），每天浇水一次，并根据需要支持幼苗的生长。
    2. 准备介质。
      1. 通过将5.625g颗粒琼脂加入500mL蒸馏水中制备qPDA培养基;加入4.875克马铃薯葡萄糖琼脂。将配料充分混合，高压灭菌，冷却至50°C，然后倒入无菌培养皿中。用石蜡膜密封培养皿，并将板存放在冰箱（4°C）中直至使用。
      2. 要制备肉汤培养基，称量并将24克马铃薯葡萄糖加入1升瓶中。通过将蒸馏水加入瓶中，将混合物至1000 mL，然后将瓶子放在热板上搅拌直至溶解。将 100 mL 肉汤分配到 250 mL 锥形瓶中。使用干酪布密封烧瓶和高压灭菌器。
    3. 准备接种物。
      1. 种植前7天，用浸润的纸28 接种5个qPDA板，并在14小时/ 10小时黑暗循环22的培养区储存8天。
      2. 在第七天，将两个1 cm2 琼脂塞转移到每个含有100 mL马铃薯葡萄糖的250 mL锥形瓶中。将锥形瓶放在台式摇床上，以200rpm的速度在14小时/ 10小时的光/暗循环中持续7天。
      3. 在接种当天（播种后14天），通过四层无菌干酪布过滤接种物来收获孢子。
      4. 如前所述，使用血细胞计数器测定烧瓶中的微分生孢子浓度。通过将正确体积的孢子悬浮液转移到无菌水中，在塑料桶（40.6cm宽x 67.3cm长x 16.8cm深）中制备7 L接种悬浮液，最终孢子浓度为1 ×06 mL−1 （图7A）。
  2. 接种
    1. 播种后十四天（至少第一个真正的叶阶段），将细胞插入物与幼苗一起转移到织带托盘中（26.9厘米宽x 53.7厘米长x 6.28厘米深）。轻轻地将带有幼苗的织带托盘放入装有7 L接种悬浮液的塑料桶中。一次接种一个托盘（图7B）。
    2. 让幼苗保持接种物不受干扰15分钟。15分钟后，将含有接种幼苗的细胞插入物轻轻转移到无孔托盘（27.9厘米宽x 53.3厘米长x 5.1厘米深）中。对每个纸盒重复此过程。
    3. 将无孔托盘放在温室工作台上，并根据需要浇水。保持与根浸生物测定相同的照明和环境条件。

4. 疾病评级

  1. 选择评级的时间间隔。
    1. 对于根部浸渍和改良的托盘浸渍方法，在接种试管苗后一周开始评分，每周持续四周。
      注：合并后的数据集将包括在此期间的五组观测值。
    2. 在使用内核方法时，仅在幼苗出现后开始评级，并每周继续一次，总共六次评级。
  2. 观察并计算发病率。
    1. 在每次评级期间，拍摄数字图像以记录疾病进展。
    2. 报告枯萎和植物死亡的发生率。通过将有症状的植物与健康对照组的比较和死亡植物的数量与该品种中植物总数的比例来计算发病率。
  3. 分析结果。如果使用对照，比较品种之间和实验组之间的感染模式。

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Representative Results

这些实验有助于确定通常生长的品种的相对抗性（表1）。然后，这些信息可用于指导基于当地Fon人口的管理建议。换句话说，如果已知种族0或1存在于商业田地中，那么农民可能倾向于种植“抗性”品种，如Calhoun Gray，Sunsugar或同等品种。使用所有方法的生物测定结果表明，当幼苗感染Race 1分离株时，黑钻石和查尔斯顿灰品种死亡或表现出严重症状，而Calhoun Grey和PI品种表现出抗性（表2 和 图8A）。

所有方法都表明，当幼苗感染了Race 3分离株时，几乎所有来自所有品种的所有植物都死亡或表现出严重的症状（图8B）。这些结果证明了使用两种接种方法的生物测定如何成功地区分Fon种族。所有方法的患病植物的外观都应相同。唯一的区别在于品种在空间上的分组方式。对于根浸法和改良的蘸法，栽培品种将按托盘的柱子组织，而在内核法中，栽培品种将分组在自己的花盆中。

Figure 1
图 1：RDM 的实验区域。 由于症状的可变性高度依赖于环境条件，如相对湿度，温度，光周期和光强度，因此保持调节的实验区域非常重要。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 2
图 2：为 RDM 准备起始平面。 用种植介质填充8 x 16个单元（25厘米宽x 50厘米长）的开始平地，然后点击以略微压缩土壤。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 3
图3：用于RDM的分生孢子悬浮液的制备。 （A） 隔离和养殖。无论是从储存的还是新收集的样品中，在qPDA平板上分离并培养感兴趣的 F. oxysporum f. sp. niveum 菌株，直到其生长覆盖板的一半。这表明它是活跃和可行的，这对于在后续步骤中对谷物的大量侵扰是必要的。（B） 移位分生孢子。通过在培养基表面上刮擦无菌细胞扩散器来清除分生孢子。（C） 悬浮沉积。将液体分生孢子悬浮液池池化，并将其转移到无菌的50mL培养管中。简称：qPDA =四分之一强度的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 4
图4：RDM幼苗的组织和涡旋（A）品种的分离。将漂洗的植物暂时存放在干净的容器中，用自来水直至使用，保持品种分开。（B）幼苗的涡旋。涡旋管子，将试管苗根部浸没30秒，以便在6 x 12泡沫塑料平板中每个细胞种植单个试管苗。将同一栽培品种的植物放在托盘的同一列中。请点击此处查看此图的大图。

Figure 5
图5：IKM内核的制备和侵扰（A）黑麦浆果的吸收。在任何足够大的容器中，测量出200克黑麦（Secale spp.）浆果（或Maxie var.小麦（小麦属）仁），并将它们倒入一个或多个1升玻璃锥形瓶中。将无菌自来水加入烧瓶中，以完全覆盖至少5厘米的谷物。从烧瓶中沥干水分，用一块用干酪布包裹的棉卷堵塞开口，并用铝箔包装覆盖开口。（C） 高压灭菌器设置。将袋子放在塑料、高压灭菌器安全的垃圾箱中。在对袋子中的谷物进行高压灭菌时，不要使用金属仓，因为这可能会导致袋子融化。用铝箔包装盖住垃圾箱。（D） 袋子的存放。将袋子直立存放。确保将过滤器从袋子的另一侧拉开，以实现最大的气体交换。（E）将14粒受感染的果仁放入一个大塑料袋中。请点击此处查看此图的大图。

Figure 6
图6：西瓜种子的播种和发芽。 （A）在花盆中播种。在每个盆中播下六粒种子。确保每个花盆只包含一个品种的种子。将种子的顶端朝上放置，以便在出苗期间正常生长。（B） 种子发芽。使用喷雾瓶，用水润湿0.3-0.6厘米的土壤。在每个花盆的下面和上面放一个透明的塑料盘（直径15厘米），为种子发芽创造一个潮湿的环境。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 7
图7：用于MTDM的接种制剂和幼苗接种。 （A）接种物的制备。如前所述，使用血细胞计数器测定烧瓶中的微分生孢子浓度。通过将正确体积的孢子悬浮液转移到无菌水中，将正确体积的孢子悬浮液转移到无菌水中，在塑料桶（40.6厘米宽×67.3厘米长×6.8 厘米深）中制备7 L接种悬浮液，最终孢子浓度为1×10 6 mL-1。（B） 接种幼苗。播种后14天（至少是第一个真正的叶期），将细胞插入物与幼苗一起转移到织带托盘中（26.9厘米宽×53.7厘米长×6.28厘米深）。轻轻地将带有幼苗的织带托盘放入装有7 L接种悬浮液的塑料桶中。一次接种一个托盘。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 8
图8：种族鉴定方法的表型结果。 （A） 第1场比赛结果。使用（A）所有方法的生物测定结果表明，当幼苗感染Race 1分离株时，黑钻石和查尔斯顿灰品种死亡或出现严重症状，而Calhoun Grey和PI品种表现出抗性。（B） 第3场比赛结果。所有方法均表明，当幼苗感染了第3种分离株时，几乎所有栽培品种的植物都死亡或出现严重症状。（所有方法的患病植物的外观都应相同。箭头显示的种植顺序（从左到右）：黑钻石（蓝色箭头），查尔斯顿灰（紫色箭头），卡尔霍恩灰（棕色箭头），植物介绍296341-FR（绿色箭头）。 请点击此处查看此图的大图。

栽培品种 第0场 第1场比赛 第2场比赛 第3场比赛
糖宝贝， 黑钻石 S S S S
查尔斯顿·格雷， 全甜， 迪克西莉 R S S S
卡尔霍恩·格雷， 桑苏加 R R S S
PI-296341-FR R R R S

表1：尖孢镰刀菌的种族尼维姆。尖孢镰刀菌f. sp. niveum的种族是通过对一组西瓜差异的敏感或抗性反应决定的。每行中列出的品种最常用于表示在评估分离物的种族期间的每个抗性水平。此表已从 4 修改。缩写：S = 易感;R = 耐药性。

隔离 方法 屋宇 署 第G章 卡尔· 圆周率 比赛
S 如 S 如 S 如 S 如
X 浸 6 0 6 0 0 6 0 6 1
X 内核 6 0 6 0 0 6 0 6 1
X 美特达 6 0 6 0 0 6 0 6 1
Y 浸 6 0 6 0 6 0 6 0 3
Y 内核 6 0 6 0 6 0 6 0 3
Y 美特达 6 0 6 0 6 0 6 0 3
S = 有症状;AS = 无症状

表2：种族的确定。 该表中使用的值反映了与健康对照相比的有症状植物的发生率或数量，以及死亡植物的数量占该品种中植物总数的比例。每个细胞中的数字反映了观察期结束时报告的发病率。当该品种的至少1/3或 33%的植物有症状或死亡时，该品种被认为是易感的。然后根据哪些品种被认为易感来确定病原体的种族。换句话说，病原体对抗性增加的品种的表现决定了分离株的种族。这些结果不是来自实际的试验，而是被证明传达了如何从这些方法的结果中识别种族。缩写：MTD =修改后的托盘滴灌法;BD = 黑钻石;CH. G = 查尔斯顿·格雷;Cal G. = Calhoun Grey;PI = 工厂介绍 296341-FR;S =有症状;AS = 无症状。

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Discussion

已经提出了三种种族分型方法。这些方法中的每一种都最适合特定的问题和实验条件。侵扰的籽粒接种方法（土壤侵扰）可能更简单，更直接，使其对于评估致病性30特别有用。使用这种方法进行简单的种族分型是非常有效的。然而，应用该方法来确定特定品种的抗性可能具有挑战性，因为每种植物可能不面临相同程度的感染或暴露，并且可能需要同样高水平的疾病来测试感兴趣品种的抗性。之所以如此，是因为以这种方式生产的接种物不能很好地量化，并且活繁殖体的比例或到达根区的感染性繁殖体的数量没有得到很好的调节31。此外，这种方法受到种植的内核与根区附近的不一致的限制。如果距离太远，孢子可能不会发芽，或者菌丝可能无法发育到足以到达根部。

植根法32，33 更加费力和耗时;然而，由于与植物相互作用的活繁殖体的数量可以更准确地测量，因此可以更准确地描述宿主抗性，从而促进抗性筛选。此外，同一种族内毒力的差异可以更容易地被发现。这种方法具有额外的好处，通常，植物比内核方法更早，更具表现力。在接种悬浮液中使用衣原体孢子代替分生孢子的根浸法的一种变体可能缺乏这种益处6。类似地，改进的托盘浸渍方法22 是劳动密集型的，但是当需要筛选许多分离株和幼苗时，允许高通量表型。

这三种方法的共同因素包括品种选择，生长条件和卫生要求。根据市售情况，某些品种可以被替代21，34。Sugar Baby和Black Diamond都可以用来确定种族0分离物，而Charleston Gray，Allsweet和Dixelee被描述为对种族0有抵抗力，但对种族1敏感。Calhoun Gray和Sunsugar对第0和第1场比赛有抵抗力，并且容易受到第2和第3场比赛的影响。Fon病的发展高度依赖于温度。应注意确保实验条件控制该变量。在选择种植介质时，包括泥炭藓和/或石膏并允许良好通风的一般商业混合物应该是令人满意的。应采取预防措施，防止两种方法的种植介质交叉污染，特别是来自源袋的污染。

使用所描述的方法之一后，必须准确一致地评估疾病。以前的研究人员通常已经决定了植物被归类为易感或抗药的阈值35，36。例如，如果特定栽培品种中少于33%的植物有症状，则该栽培品种将被归类为抗性，并根据该品种的易感性特征定义分离株。阈值设置由研究人员和他们希望解决的问题定义。评分者之间和同一评分者之间的变异性已被广泛报道为37，38。所用种子的质量、土壤质量、接种物密度、分离株的储存年龄和评分者偏倚39，40 等因素都有助于这种变异性8.由于接种和PI品种反应的这种可变性，需要多次实验复制;理想情况下，建议至少进行三次但五次复制，每个品种每次复制6株。

虽然已经开发了分子测定来检测Fon分离物41，42，43，但由于F. oxysporum的多系性质以及物种复合物44，45，46的地理和基因组变异性，结果并不一致。此外，尽管先前的研究已经确定了木质部分泌效应子（SIX）在完全毒力中的重要性，但定义Fon分离物种族结构的效应子的确切补充尚未确定13。种族的分子诊断仍在开发中，对于这些表型技术对于评估它们在Fon种族分型19，47中的准确性和实用性至关重要。

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Disclosures

作者声明，他们没有相互竞争的经济利益。

Acknowledgments

我们要感谢阿里博士和植物分子诊断实验室以及佐治亚大学的平升吉博士，他们的领导和支持帮助建立了我们的Fon计划。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% Fuller’s Earth Sigma-Aldrich F200-5KG
1 L glass Erlenmeyer Flask PYREX 4980-1L
15 mL falcon tubes Fisher Scientific 14-959-49B
50 mL graduated cylinder Lab Safety Supply 41121805
50 mL Eppendorf Conical Tubes Fisher Scientific 05-413-921
Aluminum foil wrap Reynolds Wrap 720
Bleach Walmart 587192290
Bunsen burner Fisher Scientific 03-391-301
CaCO3 sigma-Aldrich 239216
cell spreaders Fisher Scientific 08-100-11
Cheesecloth Lions Services, Inc 8305-01-125-0725
Clear plastic dishes Visions Wave 999RP6CLSS ~15 cm diameter
Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Cotton Balls Fisherbrand 22-456-885 Sterile
Ethanol Fisher Chemical A4094 100%, then combine with water to make 70% for use
Flourescent Tube Lights MaxLume Model T5 2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long
granulated agar VWR International 90000-786
Hand-held Spray Bottle Ability One 24122002 ~0.95 L
hemacytometer Fisher Scientific 02-671-55A Two chamber hemacytometer
Lab trays Fisher Scientific 15-236-2A
Large, sealable plastic bags Ziploc 430805 38 cm x 38 cm
Mister / watering can Bar5F B10H22
Mushroom Bag Clamp Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Nitrile Gloves Fisher Scientific 19-130-1597D
Organic Rye Berries Shroom Supply 0.5 gallon or 25 lb bags
P1000 pipette and tips Fisher Scientific 14-388-100
Petri dishes Fisherbrand FB0875713 Round, 100 mm diameter, 15 mm height
Planting media Jolly Gardener Pro-Line C/B
Plastic Pitcher BrandTech UX0600850 1 L or larger
Plastic planting pots Neo/SCI 01-1177 ~15 cm diameter and ~10 cm height
Plastic, autoclave-safe bin Thermo Scientific UX0601022 3 L
Quarter-strength potato dextrose agar media Cole-Parmer UX1420028 Use powder in combination with recipe for QPDA
Scientific Balance Scale, measuring in g Ohaus 30208458 Any precise scale that can hold and measure 200g will work
Size #4 cork bore Cole-Parmer NC9585352
Small Mushroom grow bag Shroom Supply 0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes
Soil trowel Walmart 563876946
Styrofoam flats (6 x 12 cells) Speedling Model TR72A
Styrofoam flats (8 x 16 cells) Speedling Model TR128A
Syringe (5 or 10 mL) fisher Scientific 14-829-19C
Timer Walmart TM-01
V8 Original 100% Vegetable Juice Walmart 564638212
vortex Fisher Scientific 02-215-418
Watermelon Seed - Black Diamond Willhite Seed Inc 17
Watermelon Seed - Calhoun Gray Holmes Seed Company 4440
Watermelon Seed - Charleston Gray Bonnie Plants 7.15339E+11
Watermelon Seed - PI 296341-FR Contact authors Contact authors
Wheat Kernels (Maxie var.) (optional) Alachua County Feed & Seed

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References

  1. Edel-Hermann, V., Lecomte, C. Current status of Fusarium oxysporum formae speciales and races. Phytopathology. 109 (4), 512-530 (2019).
  2. Everts, K. L., Himmelstein, J. C. Fusarium wilt of watermelon: Towards sustainable management of a re-emerging plant disease. Crop Protection. 73, 93-99 (2015).
  3. Martyn, R. Cucurbitaceae 2012. Proceedings of the Xth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae. , University of Cukurova, Ziraat Fakultesi. Antalya, Turkey. 136-156 (2012).
  4. Roberts, P., Dufault, N., Hochmuth, R., Vallad, G., Paret, M. [PP352] Fusarium wilt (Fusarium oxysporum f. sp. niveum) of watermelon. EDIS. 2019 (5), 4 (2019).
  5. Keinath, A. Integrated management for Fusarium wilt of watermelon. Land-Grant Press by Clemson Extension, LGP 1022. , Available from: http://lgpress.clemson.edu/publication/integrated-management-for-fusarium-wilt-of-watermelon (2019).
  6. Costa, A. E. S., et al. Resistance to Fusarium wilt in watermelon accessions inoculated by chlamydospores. Scientia Horticulturae. 228, 181-186 (2018).
  7. Lombard, L., Sandoval-Denis, M., Lamprecht, S. C., Crous, P. Epitypification of Fusarium oxysporum-clearing the taxonomic chaos. Persoonia: Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi. 43, 1 (2019).
  8. Martyn, R. D. Fusarium wilt of watermelon: 120 years of research. Horticultural Reviews. 42 (1), 349-442 (2014).
  9. Zhou, X., Everts, K. Characterization of a regional population of Fusarium oxysporum f. sp. niveum by race, cross pathogenicity, and vegetative compatibility. Phytopathology. 97 (4), 461-469 (2007).
  10. Zhou, X., Everts, K., Bruton, B. Race 3, a new and highly virulent race of Fusarium oxysporum f. sp. niveum causing Fusarium wilt in watermelon. Plant Disease. 94 (1), 92-98 (2010).
  11. Leslie, J. F., Summerell, B. A. The Fusarium laboratory manual. , John Wiley & Sons. (2008).
  12. Lo Presti, L., et al. Fungal effectors and plant susceptibility. Annual Review of Plant Biology. 66, 513-545 (2015).
  13. Niu, X., et al. The FonSIX6 gene acts as an avirulence effector in the Fusarium oxysporum f. sp. niveum-watermelon pathosystem. Scientific Reports. 6 (1), 1-7 (2016).
  14. Lievens, B., Houterman, P. M., Rep, M. Effector gene screening allows unambiguous identification of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici races and discrimination from other formae speciales. FEMS Microbiology Letters. 300 (2), 201-215 (2009).
  15. Houterman, P. M., Cornelissen, B. J., Rep, M. Suppression of plant resistance gene-based immunity by a fungal effector. PLoS Pathogens. 4 (5), 1000061 (2008).
  16. Houterman, P. M., et al. The effector protein Avr2 of the xylem-colonizing fungus Fusarium oxysporum activates the tomato resistance protein I-2 intracellularly. The Plant Journal. 58 (6), 970-978 (2009).
  17. Czislowski, E., et al. Investigation of the diversity of effector genes in the banana pathogen, Fusarium oxysporum f. sp. cubense, reveals evidence of horizontal gene transfer. Molecular Plant Pathology. 19 (5), 1155-1171 (2018).
  18. Batson, A. M., Fokkens, L., Rep, M., du Toit, L. J. Putative effector genes distinguish two pathogenicity groups of Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 34 (2), 141-156 (2021).
  19. Keinath, A. P., DuBose, V. B., Katawczik, M. M., Wechter, W. P. Identifying races of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in South Carolina recovered from watermelon seedlings, plants, and field soil. Plant Disease. 104 (9), 2481-2488 (2020).
  20. Gordon, T. R. Fusarium oxysporum and the Fusarium wilt syndrome. Annual Review of Phytopathology. 55, 23-39 (2017).
  21. Martyn, R., Netzer, D. Resistance to races 0, 1, and 2 of Fusarium wilt of watermelon in Citrullus sp. PI-296341-FR. HortScience. 26 (4), 429-432 (1991).
  22. Meru, G., McGregor, C. Genotyping by sequencing for SNP discovery and genetic mapping of resistance to race 1 of Fusarium oxysporum in watermelon. Scientia Horticulturae. 209, 31-40 (2016).
  23. Freeman, S., Rodriguez, R. A rapid inoculation technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and F. o. melonis on cucurbits. Plant Disease. 77 (12), 1198-1201 (1993).
  24. Martyn, R. Fusarium oxysporum f. sp. niveum race 2: A highly aggressive race new to the United States. Plant Disease. 71 (3), 233-236 (1987).
  25. Lai, X., et al. Evaluating inoculation methods to infect sugar beet with Fusarium oxysporum f. Beat and F. secorum. Plant Disease. 104 (5), 1312-1317 (2020).
  26. Kirk, W., et al. Optimizing fungicide timing for the control of Rhizoctonia crown and root rot of sugar beet using soil temperature and plant growth stages. Plant Disease. 92 (7), 1091-1098 (2008).
  27. Ferguson, A., Jeffers, S. Detecting multiple species of Phytophthora in container mixes from ornamental crop nurseries. Plant Disease. 83 (12), 1129-1136 (1999).
  28. Fong, Y., Anuar, S., Lim, H., Tham, F., Sanderson, F. A modified filter paper technique for long-term preservation of some fungal cultures. Mycologist. 14 (3), 127-130 (2000).
  29. Rice, W. N. The hemocytometer method for detecting fungus spore load carried by wheat. Proceedings of the Association of Official Seed Analysts of North America. 31, 124-127 (1939).
  30. Kleczewski, N. M., Egel, D. S. A diagnostic guide for Fusarium wilt of watermelon. Plant Health Progress. 12 (1), 27 (2011).
  31. Dhingra, O. D., Sinclair, J. B. Basic plant pathology methods. , CRC Press. (2017).
  32. Latin, R., Snell, S. Comparison of methods for inoculation of muskmelon with Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Plant Disease. 70 (4), 297-300 (1986).
  33. Martyn, R. An iInitial survey of the United States for races of Fursarium oxysporum f. HortScience. 24 (4), 696-698 (1989).
  34. Zhou, X., Everts, K. Races and inoculum density of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in commercial watermelon fields in Maryland and Delaware. Plant Disease. 87 (6), 692-698 (2003).
  35. Fulton, J. C., et al. Phylogenetic and phenotypic characterization of Fusarium oxysporum f. sp. niveum isolates from Florida-grown watermelon. PLoS One. 16 (3), 0248364 (2021).
  36. Zhou, X., Everts, K. Quantification of root and stem colonization of watermelon by Fusarium oxysporum f. sp. niveum and its use in evaluating resistance. Phytopathology. 94 (8), 832-841 (2004).
  37. Nutter, F. W., Esker, P. D., Netto, R. A. C. Disease assessment concepts and the advancements made in improving the accuracy and precision of plant disease data. European Journal of Plant Pathology. 115 (1), 95-103 (2006).
  38. Nutter, F., Gleason, M., Jenco, J., Christians, N. Assessing the accuracy, intra-rater repeatability, and inter-rater reliability of disease assessment systems. Phytopathology. 83 (8), 806-812 (1993).
  39. Chiang, K. -S., Bock, C. H., Lee, I. -H., El Jarroudi, M., Delfosse, P. Plant disease severity assessment-how rater bias, assessment method, and experimental design affect hypothesis testing and resource use efficiency. Phytopathology. 106 (12), 1451-1464 (2016).
  40. Nita, M., Ellis, M., Madden, L. Reliability and accuracy of visual estimation of Phomopsis leaf blight of strawberry. Phytopathology. 93 (8), 995-1005 (2003).
  41. Zhang, Z., Zhang, J., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil. FEMS Microbiology Letters. 249 (1), 39-47 (2005).
  42. Lin, Y. -H., et al. Development of the molecular methods for rapid detection and differentiation of Fusarium oxysporum and F. oxysporum f. sp. niveum in Taiwan. New Biotechnology. 27 (4), 409-418 (2010).
  43. van Dam, P., de Sain, M., Ter Horst, A., vander Gragt, M., Rep, M. Use of comparative genomics-based markers for discrimination of host specificity in Fusarium oxysporum. Applied and Environmental Microbiology. 84 (1), 01868 (2018).
  44. Baayen, R. P., et al. Gene genealogies and AFLP analyses in the Fusarium oxysporum complex identify monophyletic and nonmonophyletic formae speciales causing wilt and rot disease. Phytopathology. 90 (8), 891-900 (2000).
  45. O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2044-2049 (1998).
  46. Laurence, M., Summerell, B., Liew, E. Fusarium oxysporum f. sp. canariensis: evidence for horizontal gene transfer of putative pathogenicity genes. Plant Pathology. 64 (5), 1068-1075 (2015).
  47. Hudson, O., et al. Marker development for differentiation of Fusarium oxysporum f. sp. Niveum race 3 from races 1 and 2. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 822 (2021).

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生物学， 第176期，
用于确定未知 <em>尖孢镰刀菌</em> f.sp的种族的三种接种技术的对比。 <em>尼维姆</em> 分离
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Fulton, J. C., Cullen, M. A., Beckham, K., Sanchez, T., Xu, Z., Stern, P., Vallad, G., Meru, G., McGregor, C., Dufault, N. S. A Contrast of Three Inoculation Techniques used to Determine the Race of Unknown Fusarium oxysporum f.sp. niveum Isolates. J. Vis. Exp. (176), e63181, doi:10.3791/63181 (2021).

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