Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En kontrast mellem tre podningsteknikker, der bruges til at bestemme løbet af ukendt Fusarium oxysporum f.sp. niveum Isolater

Published: October 28, 2021 doi: 10.3791/63181
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 1, 3, 4,5, 6, 1
1Department of Plant Pathology, University of Florida, 2University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences, 3Gulf Coast Research and Education Center, University of Florida, 4Horticultural Sciences Department, University of Florida, 5Tropical Research and Education Center, University of Florida, 6Department of Horticulture, University of Georgia
* These authors contributed equally

Summary

Håndtering af Fusarium vilje af vandmelon kræver viden om de tilstedeværende patogenløb. Her beskriver vi roddyp, inficeret kernesåning og modificerede tray-dip-podningsmetoder for at demonstrere deres effektivitet ved race-typning af den patogene svamp Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).

Abstract

Fusarium vilje af vandmelon (Citrullus lanatus), forårsaget af Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), er genopstået som en stor produktionsbegrænsning i det sydøstlige USA, især i Florida. Indførelse af integrerede skadedyrsbekæmpelsesstrategier, såsom racespecifikke resistente sorter, kræver oplysninger om patogenets mangfoldighed og befolkningstæthed på avlernes marker. På trods af visse fremskridt med at udvikle molekylære diagnostiske værktøjer til identifikation af patogenisolater kræver racebestemmelse ofte bioassay-tilgange.

Race typing blev udført ved rod-dip podning, inficeret kerne såning metode, og den modificerede bakke-dip metode med hver af de fire vandmelon forskelle (Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). Isolater tildeles en racebetegnelse ved beregning af sygdomsforekomst fem uger efter podning. Hvis mindre end 33% af planterne for en bestemt sort var symptomatiske, blev de kategoriseret som resistente. De sorter med en forekomst på over 33 % blev betragtet som modtagelige. Dette papir beskriver tre forskellige metoder til podning for at fastslå race, roddip, inficeret kerne og modificeret bakke-dip-podning, hvis anvendelser varierer alt efter det eksperimentelle design.

Introduction

De jordbårne svampe, der udgør Fusarium oxysporum artskomplekset (FOSC), er virkningsfulde hemibiotrofe plantepatogener, der kan forårsage alvorlig sygdom og udbyttetab i en bred vifte af afgrøder1. Fusarium vilje af vandmelon, forårsaget af F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), har været stigende i omfang, forekomst og sværhedsgrad over hele verden i de sidste årtier 2,3. I frøplanter ligner symptomerne på Fusarium-vilje ofte dæmpning. I ældre planter bliver løvet gråt, klorotisk og nekrotisk. Til sidst udvikler planternes visning sig til fuld plantekollaps og død4. Direkte udbyttetab opstår på grund af symptomerne og plantedøden, mens indirekte udbyttetab kan forekomme på grund af solskader forårsaget af eliminering af bladbaldakinen5. Seksuel reproduktion og tilhørende reproduktive strukturer er aldrig blevet observeret i F. oxysporum. Patogenet producerer imidlertid to typer aseksuelle sporer, mikro- og makrokonidier, samt større, langsigtede overlevelsesstrukturer kaldet chlamydosporer, som kan overleve i jorden i mange år6.

FOSC er klassificeret i formae speciales baseret på observerede værtsområder, normalt begrænset til en eller nogle få værtsarter1. Selvom nyere forskning har vist, at dette artskompleks kan være en sammensætning af 15 forskellige arter, er de særlige arter, der inficerer vandmelon, i øjeblikket ukendte7. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) er navnet på de grupper af stammer, der udelukkende inficerer Citrullus lanatus eller den domesticerede vandmelon 8,9. F. oxysporumstammer inden for de fleste patogene formae speciales viser visse niveauer af mangfoldighed med hensyn til deres genetiske komponenter og virulens over for en værtsart. For eksempel kan en stamme inficere alle sorter af en vært, mens en anden kun kan inficere de mere modtagelige sorter. For at tage højde for en sådan variation klassificeres disse grupper uformelt i racer baseret på evolutionære relationer eller fælles fænotypiske egenskaber. Inden for Fon er fire racer (0, 1, 2 og 3) blevet karakteriseret ud fra deres patogenicitet mod et sæt udvalgte vandmelonsorter, hvor opdagelsen af race 3 for nylig fandt sted10.

På trods af denne tilsyneladende mangfoldighed kan morfologierne af sporer eller hyfer ikke skelnes mellem racerne i Fon-racer, hvilket betyder, at molekylære eller fænotypiske assays er nødvendige for at identificere et isolats unikke race11. Molekylær forskning har identificeret nogle genetiske forskelle. For eksempel er rollen som udskilt i Xylem (SIX) effektorer blevet undersøgt i årevis i F. oxysporum, og nogle af disse effektorer er blevet placeret på kromosomerne udvekslet under vandret genoverførsel12. For eksempel findes SIX6 i Fon-løb 0 og 1, men ikke i løb 213. SEKS effektorer har været impliceret i patogeniciteten af F. oxysporum f. sp. lycopersici og F. oxysporum f. sp. cubense, som forårsager Fusarium vilje på henholdsvis tomat og banan, henholdsvis 14,15,16,17. Analysen af SIX effektorprofiler blandt stammer af F. oxysporum f. sp. spiniciae, Fusarium wilt patogen på spinat, har muliggjort klassificering, der nøjagtigt afspejler genetisk og fænotypisk mangfoldighed18. Imidlertid er forskellene mellem virulensmekanismer i Fon-racer i øjeblikket ikke helt forstået, og molekylære assays udviklet ved deres anvendelse har vist inkonsekvente og unøjagtige resultater19. Derfor er fænotypiske resultater fra infektionsassays i øjeblikket den bedste måde at klassificere isolater på.

F. oxysporum inficerer oprindeligt værter gennem rødderne, før de gør sin vej op ad xylem20. Dette gør direkte podning af rødderne af en given værtskultivar til en effektiv måde at udføre race-typing på og er grundlaget for root-dip og tray-dippodningsmetoderne 21. Når man ikke inficerer en vært, bor F. oxysporum i jorden og kan forblive sovende i årevis. Voksende modtagelige vandmelonsorter i jord fra et interesseområde er en måde at teste for tilstedeværelsen af Fon. Udvidelse af denne metode til at omfatte sorter af forskellige kendte resistensniveauer i jord, der bevidst er inficeret med Fon, er også en god måde at udføre race-typing (tabel 1) og er grundlaget for den inficerede kernesåningsmetode. Den modificerede tray-dip-metode er en variation af den oprindelige tray-dip-metode, der giver mulighed for en race-typing med høj gennemstrømning, hvor mange planter og markisolater hurtigt kan undersøges22. Vigtige faktorer for et hurtigt og vellykket racetypebioassay omfatter anvendelse af sorter, der har dokumenteret forskelle i resistens over for de forskellige patogenracer, sikring af, at inokulumet er både biologisk aktivt og rigeligt under infektion, opretholdelse af et miljø, der både er befordrende for patogenet og værten, og ved hjælp af et konsekvent klassificeringssystem for sværhedsgrad eller forekomst af sygdom. Dette papir beskriver root-dip23,24, inficeret kernesåning25,26 og modificerede tray-dip22 metoder til fænotypisk race-typing baseret på de ovenfor beskrevne principper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bestemmelse af race ved hjælp af roddypmetode (RDM)

  1. Forberedelse af forsøgsmiljøet
    1. Fordi symptomekspression er meget afhængig af miljøforholdene, skal du opretholde planter i et kontrolleret område. Overvåg relativ luftfugtighed, temperatur, fotoopår og lysintensitet (figur 1).
      1. Indstil temperaturen til 26-28 °C, relativ luftfugtighed til 50-75 %, og indstil en fotoperiode på 16 timer for at sikre tilstrækkelig plantevækst og sundhed.
        BEMÆRK: For at forhindre hypoxi, frøplantevisning og / eller frørot må du ikke overvande eller tillade stående vand omkring frøplanterne.
      2. Brug to lysstofrør, hver med mindst 1850 lumen lys og en farvetemperatur på 2.800 K pr. Lysbank for at understøtte fotosyntetisk vækst.
      3. Hold området rent og brug hygiejnisk praksis, herunder fjernelse af affaldsjord og planteaffald, for at forhindre skadedyrsskader og utilsigtet infektion.
    2. Plantning betingelser
      1. Fyld 8 x 16-celle (25 cm bredde x 50 cm længde) startfling med plantemedium og tryk ned for at komprimere jorden lidt (figur 2).
      2. Få frø af de fire differentielle sorter: Black Diamond / Sugar Baby, Charleston Grey / Allsweet / Dixielee, Calhoun Grey og PI-296341-FR.
      3. Så frø med deres spids (spids ende), der peger opad til en dybde svarende til deres længde. Når frøene er sået, skal du dække mediet, der indeholder de begravede frø, med 100% Fuller's Earth eller andet bentonit leralternativ til en dybde på 0,3175-0,635 cm.
      4. Mist lejlighederne for at dæmpe mediet uden at skabe stående eller poolende vand. Hold derefter medierne fugtige ved at dugge i 20 s hvert 180. minut eller vande i hånden en gang om dagen, indtil frøspiring i cirka 5 dage. Efter spiring, vand en gang om dagen og efter behov for at understøtte væksten af kimplanter.
    3. Medieforberedelse
      BEMÆRK: Begge medier er lavet fast med ekstra granuleret agar for at muliggøre sporehøst ved at skrabe overfladen.
      1. Klaret V8 juice medium (V8)
        1. Forbered 500 ml klaret V8-juicemedium (V8)27 ved at tilsætte 100 ml klaret V8 original 100% grøntsagssaft med 1% CaCO3 til 400 ml destilleret vand.
        2. Tilsæt 7,5 g granuleret agar.
        3. Bland ingredienserne godt, autoklave, og lad dem køle af til 50 °C, inden de hældes i sterile petriskåle.
      2. Kvartstyrke kartoffel dextrose agar media (qPDA)
        1. Forbered qPDA-medium ved at tilsætte 4,5 g granuleret agar til 500 ml destilleret vand, tilsæt 3,8 g kartoffeldextrose agar.
        2. Bland ingredienserne godt, autoklave, og lad dem køle af til 50 °C, inden du hælder 12-15 ml i sterile petriskåle.
  2. Forberedelse af eksperimentelle behandlinger
    1. Forbered inokulumet.
      1. Fem dage efter indjagt (dpp) anbringes infiltrerede papirskiver (1-1,25 cm i diameter), der indeholder det foretrukne F. oxysporumisolat , på en V8- og en qPDA-plade og opbevares i en inkubator (~ 28 °C) i otte dage28 (figur 3A).
      2. På den ottende dag med svampevækst og dagen før podning (se pkt. 1.3.2) overføres V8- og qPDA-pladerne fra inkubatoren til et biosikkerhedsskab.
      3. For hvert isolat udleveres 6 ml steriliseret deioniseret vand på hver V8- og qPDA-dyrkningsplade.
      4. Løsn conidier ved at skrabe en steril cellespreder hen over den mellemstore overflade (figur 3B). Pool den flydende conidial suspension og overfør den til et sterilt 50 ml kulturrør (figur 3C).
      5. Gentag denne proces, indtil det samlede flydende konidiale suspensionsvolumen i 50 ml kulturrøret er ca. 12 ml.
      6. Før du går videre til et andet isolat, skal du overfladesterilisere arbejdsområdet og cellesprederen med alkohol. Steriliser cellesprederen ved at føre den gennem en Bunsen-brænder efter at have dyppet den i ≥70% ethanol.
      7. Når de flydende konidiale suspensioner er blevet overført til dyrkningsrør for alle isolater, kvantificeres sporetællingerne. Først hvirvler et individuelt 50 ml kulturrør og dispenserer 10 μL i hvert kammer i et hæmacytometer. Beregn derefter antallet af sporer i hæmacytometeret som tidligere beskrevet29.
      8. Forbered den endelige inokulumopløsning ved at overføre det beregnede volumen for 106 + 10% til et andet sterilt kulturrør og bring det samlede volumen til 30 ml ved tilsætning af sterilt deioniseret vand.
      9. Opbevar disse kulturrør natten over ved 8 ± 1 °C.
        BEMÆRK: Dette kan gøres uden tab af conidial levedygtighed, som angivet af upublicerede data.
  3. Podning
    1. Forbered podningen.
      1. Før podningsdagen skal du robust vande tretten dage gamle frøplanter til jordens bæreevne.
      2. Formærke indsatsen med relevante oplysninger, herunder det isolat, der skal testes, vandmelonsorten og datoen for podning.
      3. Placer 6 x 12-celle (20 cm bredde x 40 cm længde) styrofoamfloder, tidligere desinficeret med 10% blegemiddel og godt skyllet, for at modtage de podede planter.
      4. Præposition af alle nødvendige materialer (se materialetabellen).
    2. Inokuler plantens rødder.
      1. Vand planterne robust flere timer før podningen påbegyndes. Mindst 2 timer efter vanding fjernes planteletterne fra de 8 x 16-cellede styrofoamfloder og skylles deres rødder for at fjerne eventuelle klæbende plantematerialepartikler.
      2. Opbevar midlertidigt de skyllede planter i rene beholdere med postevand indtil brug, og hold sorterne adskilt fra hinanden (figur 4A). Adskil plantletterne i grupper på seks personer, og hold plantegrupperne pakket ind i våde papirhåndklæder på en laboratoriebakke for at forhindre udtørring.
      3. Placer 25-30 cm3 jord i bunden af hver celle i den 6 x 12 array styrofoambakke og brug en sprøjteflaske til at våde jorden, indtil den er synligt fugtig.
      4. Inokuler planterne og genplant dem i henhold til sorten, således at Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey og derefter PI 296341 01 FR plantes fra venstre mod højre.
      5. Begyndende med den sunde kontrol skal du placere en gruppe på seks ubeskadigede frøplanter af samme sort i de 50 ml rør, der indeholder inokulumet. I tilfælde af sund kontrol skal du bruge ledningsvand i stedet for en sporesuspension. Inokuler planterne med den positive kontrol (Fon race 3) sidst.
      6. Når du er inde i røret, skal du sørge for, at plantens rødder når og udsættes for inokulum (ledningsvand).
      7. Vortex rørene med plantlet rødder nedsænket i 30 s (figur 4B). Efter hvirvel skal du placere en enkelt plantlet pr. Celle i de 6 x 12 styrofoamfloder. Placer planterne af samme sort i samme kolonne i bakken.
      8. Efter anbringelse desinficeres handskede hænder ved at holde dem i spande med 0,7% tilgængelig kloropløsning i 30 s, efterfulgt af en skylning af ledningsvand i 1 min.
      9. Dæk derefter de placerede planter med plantemedium og sæt forsigtigt. Brug en sprøjte eller pipette til forsigtigt at vande plantlets med 20 ml pr. Plantlet, mens du undgår stænk.
      10. Før du fortsætter til det næste sæt planter, skal du desinficere handskede hænder igen ved hjælp af kloropløsning og en skylning af ledningsvand.
      11. Når alle plantlets er blevet genplantet, vand dem igen minimalt for at forhindre afstrømning af inokulum.
      12. Hold planterne natten over i et lukket, mørkt miljø med en gennemsnitstemperatur på 27 °C. Den følgende dag overføres planterne til drivhuset og holder gennemsnitstemperaturen ved 27 °C.
  4. Vedligeholdelse og pleje af podede planter
    1. For at forhindre overløb af overskudsvand vandes lejlighederne let tre gange om dagen i 4-5 dage, indtil planterne stabiliserer sig.
    2. Kontroller bakkerne 2-3 gange dagligt i mindst tre dage for at sikre tilstrækkelig og jævn dækning af vanding.
    3. Undgå tørring på grund af sollys eller skygge ved at rotere lejlighederne og / eller sørge for supplerende skygge / vanding efter behov.
    4. Ved 3 dpp befrugtes planterne med en 20-20-20 hurtigopløsende gødning (10 g / 3,78 L) med en hastighed på 3-6 ml pr. Liter vand.
    5. Gød ugentligt i 3-4 uger.
    6. Oprethold de samme lys- og miljøforhold i hele dette trin.

2. Bestemmelse af race ved inficeret kernemetode (IKM)

  1. Angreb af kernerne
    1. Forbered inokulumet.
      1. Enten fra en lagret eller nyligt indsamlet prøve, isolere og dyrke en F. oxysporum f. sp. niveum stamme af interesse på en plade af qPDA til det punkt, at dens vækst dækker halvdelen af pladen.
        BEMÆRK: Dette viser, at det er aktivt og levedygtigt, hvilket er nødvendigt for betydelig angreb af kornet i senere trin.
    2. Forbered kernerne.
      1. På en skala måles 200 g rug (Secale spp.) bær (eller Maxie var. hvede (Triticum spp.) kerner) i enhver tilstrækkelig stor beholder og hældes i en eller flere 1 L glas Erlenmeyer kolber. Der tilsættes sterilt postevand til kolberne for at dække kornene helt op til mindst 5 cm (figur 5A).
      2. Kernerne lægges i blød ved stuetemperatur (~24 °C) i 2 timer. Tøm vandet fra kolberne; tilslut åbningen med et stykke bomuldsrulle indpakket i ostekloth; og dæk åbningen med aluminiumsfoliefolie (figur 5B).
    3. Dekontaminere kernerne. Når kornet har imbibed vand, autoklave det to gange på to forskellige måder for at dræbe andre uønskede mikrober før podning.
      1. I løbet af den første tid autoklaveres kornet i de tilberedte kolber i en tyngdekraftscyklus (121,2 °C, 1,06 kg/cm2) i 1 time med 5 minutters tørretid. Lad kolberne køle af til stuetemperatur.
      2. Før autoklavering anden gang, overfør kornene til en lille svampedyrkningspose med et 0,5 μm filter. Fjern luften fra posen, og fold derefter den overskydende plast rundt om posen.
      3. Læg posen i en plastikbeholder, der er autoklavesikker. Dæk skraldespanden med aluminiumsfoliefolie (figur 5C).
        BEMÆRK: Brug ikke en metalbeholder, når du autoklaverer kornene i poserne, da det kan få poserne til at smelte.
      4. Autoklaver skraldespanden på en tyngdekraftscyklus i 1 time med 5 minutters tørretid, den samme cyklus som før.
        BEMÆRK: Autoklaver kun posen anden gang, ikke den første, da filteret og porten kan blive kompromitteret, hvis poserne autoklaveres to gange. Undgå kondens på filteret ved at lade poserne køle langsomt og helt af, før de fjernes fra autoklaven, fordi vækstposefilteret bliver kompromitteret, hvis det bliver vådt.
    4. Inokuler kernerne.
      1. Arbejde med kulturpladen og posen i et biosikkerhedsskab, skære agarskiver, 6 mm i diameter, fra zonen med aktiv vækst på kulturpladen med en steril # 4-størrelse korkboring. Fold posen ud. Brug en streng steril teknik til at placere 5 agarskiver i posen. Brug en steril 50 ml gradueret cylinder til at måle 35 ml sterilt ledningsvand og tilsæt det til posen.
      2. Rul åbningen af posen noget, og sprøjt derefter ydersiden med 70% ethanol for at overfladesterilisere.
        BEMÆRK: Sprøjt ikke filteret, da fugt også vil kompromittere det.
      3. Luk posen ved at folde hjørnerne mod midten og derefter over to gange over filteret. Fastgør posen med poseklemmer og klare vinylrør leveret af producenten.
        BEMÆRK: Klemmerne kan genbruges.
      4. Fjern posen fra biosikkerhedsskabet.
    5. Opbevar patogenet til vækst.
      1. Opbevar posen oprejst. Sørg for, at filteret trækkes væk fra den modsatte side af posen for at muliggøre maksimal gasudveksling (figur 5D).
      2. Inkuber materialerne ved stuetemperatur i ca. tre uger. Omfordel kornene regelmæssigt for at sikre jævn vækst af patogenet.
        BEMÆRK: Poserne kan ikke genbruges.
  2. Infektion af vandmelonplanter med inficeret korn
    1. Kilde vandmelonfrø som tidligere beskrevet.
    2. Bestem de eksperimentelle grupper.
      BEMÆRK: Den eller de eneste stammer af patogenet, der kræves, er de isolater, der testes til raceidentifikation. Imidlertid vil negative og positive kontroller hjælpe med at foretage sammenligninger med planter uden infektion eller et specifikt infektionsniveau.
      1. For at forberede en negativ kontrol skal du bruge hvedekerner steriliseret i henhold til den tidligere nævnte metode, men uden podning.
      2. For at forberede en positiv kontrol skal du bruge hvedekerner podet med en allerede klassificeret stamme til sammenligning med det ukendte isolat.
    3. Kombiner jord og korn.
      1. Mål 14 korn af angrebne kerner i en stor plastikpose (figur 5E). Fyld plastikpotter (15 cm diameter x 10 cm i højden) med potteblanding for at måle den nødvendige mængde blanding. Tøm blandingen i posen. Opret en luftpude i posen og drej eller forsegl den lukket.
      2. Bland kernerne og jorden ved at vende posen flere gange. For en negativ kontrol skal du udføre den samme proces i en anden pose med rene kerner. For en positiv kontrol skal du udføre den samme proces i en anden pose med kerner inficeret med sammenligningsstammen.
      3. Fyld fire overfladeriliserede gryder med den angrebne jordblanding. For en negativ kontrol, pot den blanding før håndtering af enhver Fon-forurenet jord.
    4. Så vandmelonfrøene.
      1. Så seks frø i hver gryde. Sørg for, at hver gryde kun indeholder frø fra en sort. Placer frøene med den øverste ende af frøet vendt op for at muliggøre korrekt vækst under fremkomsten (figur 6A).
      2. Brug en sprøjteflaske til at våd den øverste 0,3-0,6 cm jord med vand. Anbring en klar plastskål (15 cm diameter) under og over hver gryde for at skabe et fugtigt miljø for frøspiring (figur 6B).
    5. Etablere vækstbetingelser.
      1. Vand potterne tre gange om dagen med en sprøjteflaske for at opretholde turgiditet uden afstrømning, indtil frøene er spiret (ca. 5 dage).
        BEMÆRK: Mængden af vand, der bruges, vil stige med plantestørrelse og pottestørrelse.
      2. Når frøene er spiret, skal du flytte topskålen til undersiden af potten.
      3. Vand planterne dagligt efter behov for optimal plantevækst. Planterne udsættes for en fotoperiode på 16 timer under lysforhold, der svarer til dem, der tidligere er beskrevet, og en temperatur på 27 °C (± 1 °C).

3. Bestemmelse af race ved modificeret bakke-dip metode (MTDM)

  1. Fremstilling af materialerne til podninger
    1. Etabler plantningsbetingelser.
      1. Fyld 48-celle (3,68 cm bredde x 5,98 cm længde x 4,69 cm dybde) indsatser med damppasteuriseret sand: tørv: vermikulit (4: 1: 1) og tryk ned for at komprimere jorden lidt. Anbring indsatserne i plastbakker (27,9 cm bredde x 53,3 cm længde x 5,1 cm dybde).
      2. Så frøene med deres spids (proksimal ende), der peger opad til en dybde svarende til deres længde.
      3. Kilde frøene som tidligere beskrevet.
      4. Bagefter skal du holde medierne fugtige ved at tåge i 20 s hvert 180. minut eller vande i hånden en gang om dagen.
      5. Efter spiring (ca. 5 dage), vand en gang om dagen og efter behov for at understøtte plantens vækst.
    2. Forbered medierne.
      1. Forbered qPDA-medium ved at tilsætte 5,625 g granuleret agar til 500 ml destilleret vand; Tilsæt 4.875 g kartoffel dextrose agar. Bland ingredienserne godt, autoklave og afkøl til 50 °C, inden de hældes i sterile petriskåle. Forsegl petriskålene med parafilm, og opbevar pladerne i køleskab (4 °C) indtil brug.
      2. For at forberede bouillonmedium skal du veje og tilsætte 24 g kartoffeldextrose i en 1 L flaske. Bring blandingen til 1000 ml ved at tilsætte destilleret vand til flasken, og læg flasken på en varm plade og rør, indtil den er opløst. Dispenser 100 ml af bouillonen i 250 ml Erlenmeyer-kolber. Brug ostekloth til at forsegle kolberne og autoklaven.
    3. Forbered inokulumet.
      1. Syv dage før plantning podes fem qPDA-plader med infiltreret papir28 og opbevares i et inkuberet område i otte dage på en 14 timer / 10 timers mørk cyklus22.
      2. På den syvende dag overføres to 1 cm2 agarpropper til hver 250 ml Erlenmeyer-kolbe indeholdende 100 ml kartoffeldextrose. Anbring Erlenmeyer-kolberne på en bordryster ved 200 o / min i 7 dage på en 14 timer / 10 timers lys / mørk cyklus.
      3. På podningsdagen (14 dage efter såning) høstes sporerne ved at filtrere inokulumet gennem fire lag steril ostekloth.
      4. Mikrokonidialkoncentrationen i kolberne bestemmes ved hjælp af et hæmocytometer som tidligere beskrevet. Forbered en 7 L inokulumsuspension i et plastkar (40,6 cm bredde x 67,3 cm længde x 16,8 cm dybde) ved at overføre det korrekte volumen sporesuspension til sterilt vand til en endelig sporekoncentration på 1 × 106 ml-1 (figur 7A).
  2. Podning
    1. Fjorten dage efter såning (i det mindste første ægte bladstadium) overføres celleindsatserne med frøplanterne til webbed bakker (26,9 cm bredde x 53,7 cm længde x 6,28 cm dybde). Anbring forsigtigt webbedbakkerne med frøplanterne i et plastikkar, der indeholder 7 L podningssuspensionen. Inokuler hver bakke en ad gangen (figur 7B).
    2. Lad frøplanterne forblive i inokulumet uforstyrret i 15 minutter. Efter 15 minutter overføres forsigtigt celleindsatserne, der indeholder de podede frøplanter, til hulløse bakker (27,9 cm bredde x 53,3 cm længde x 5,1 cm dybde). Gentag denne proces for hver bakke.
    3. Placer de hulløse bakker på drivhusbænken og vand efter behov. Oprethold de samme lys- og miljøforhold som beskrevet for root-dip bioassay.

4. Sygdomsvurdering

  1. Vælg tidsintervaller for bedømmelse.
    1. For rod-dip og modificerede bakke-dip metoder, begynde rating en uge efter plantlets er podet og fortsætte ugentligt i fire uger mere.
      BEMÆRK: Det kombinerede datasæt vil omfatte fem sæt observationer i denne periode.
    2. Mens du bruger kernemetoden, skal du først begynde at vurdere, når frøplanterne dukker op og fortsætte ugentligt i alt seks ratings.
  2. Overhold og beregn forekomsten.
    1. Under hver vurdering skal du tage digitale billeder for at dokumentere sygdomsforløbet.
    2. Rapporter forekomsten af vilje og plantedød. Beregn incidensen ved at tage summen af symptomatiske planter sammenlignet med den sunde kontrol og antallet af døde planter som en andel af det samlede antal planter i den pågældende sort.
  3. Analyser resultaterne. Sammenlign infektionsmønstrene mellem sorterne og mellem forsøgsgrupperne, hvis der blev anvendt kontrol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Disse eksperimenter hjælper med at definere den relative resistens af almindeligt dyrkede sorter (tabel 1). Disse oplysninger kan derefter bruges til at guide ledelsesanbefalinger baseret på lokale Fon-populationer. Med andre ord, hvis race 0 eller 1 vides at være til stede i et kommercielt felt, kan landmanden være tilbøjelig til at dyrke en "resistent" sort som Calhoun Gray, Sunsugar eller tilsvarende. Resultaterne af bioassays ved hjælp af alle metoder viser, at når frøplanterne blev inficeret med et Race 1-isolat, døde sort diamant- og Charleston Grey-sorterne eller viste alvorlige symptomer, mens Calhoun Grey- og PI-sorterne viste resistens (tabel 2 og figur 8A).

Alle metoder viste, at når frøplanterne blev inficeret med et Race 3-isolat, døde næsten alle planter fra alle sorter eller viste alvorlige symptomer (figur 8B). Disse resultater viser, hvordan bioassays ved hjælp af begge podningsmetoder med succes skelner mellem racer af Fon. Udseendet af syge planter skal være det samme for alle metoder. Den eneste forskel er i, hvordan sorterne er grupperet rumligt. For root-dip og modificerede dray-dip metoder vil sorterne blive organiseret efter kolonner i bakken, mens i kernemetoden vil sorterne blive grupperet i deres egne potter.

Figure 1
Figur 1: Forsøgsområde for RDM. På grund af symptomvariabilitet, som er meget afhængig af miljøforhold som relativ fugtighed, temperatur, fotoophold og lysintensitet, er det vigtigt at opretholde et reguleret eksperimentelt område. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Klargøring af startlejlighederne til RDM. Fyld 8 x 16-celle (25 cm bredde x 50 cm længde) startfling med plantemedium og tryk ned for at komprimere jorden lidt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Fremstilling af konidial suspension for RDM. (A) Isolation og dyrkning. Enten fra en opbevaret eller nyligt indsamlet prøve, isolere og dyrke en F. oxysporum f. sp. niveum stamme af interesse på en plade af qPDA til det punkt, at dens vækst dækker halvdelen af pladen. Dette viser, at det er aktivt og levedygtigt, hvilket er nødvendigt for betydelig angreb af kornet i senere trin. (B) Fordrivelse af conidier. Løsn conidia ved at skrabe en steril cellespreder over den mellemstore overflade. (C) Suspension aflejring. Pool den flydende conidia suspension og overfør den til et sterilt 50 ml kulturrør. Forkortelse: qPDA = en fjerdedel styrke kartoffel dextrose agar medium. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Organisering og hvirvel af kimplanter til RDM. (A) Adskillelse af sorter. Opbevar midlertidigt skyllede planter i rene beholdere med ledningsvand indtil brug, og hold sorter adskilt. (B) Hvirvel af kimplanter. Vortex rørene med plantlet rødder nedsænket i 30 s til plantning af en enkelt plantlet pr. celle i de 6 x 12 styrofoam lejligheder. Planter af samme sort placeres i samme kolonne i bakken. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Forberedelse og angreb af kerner til IKM. (A) Imbibition af rugbær. På en skala måles 200 g rug (Secale spp.) bær (eller Maxie var. hvede (Triticum spp.) kerner) i enhver tilstrækkelig stor beholder og hældes i en eller flere 1 L glas Erlenmeyer kolber. Der tilsættes sterilt postevand i kolberne for at dække kornene helt op til mindst 5 cm. (B) Tøm kolberne tømmes. Tøm vandet fra kolberne, tilslut åbningen med et stykke bomuldsrulle indpakket i ostekloth, og dæk åbningen med aluminiumsfolieindpakning. (C) Opsætning af autoklave. Læg posen i en plastikbeholder, der er autoklavesikker. Brug ikke en metalbeholder, når du autoklaverer kornene i poserne, da det kan få poserne til at smelte. Dæk skraldespanden med aluminiumsfoliefolie. (D) Opbevaring af poser. Opbevar posen oprejst. Sørg for, at filteret trækkes væk fra den modsatte side af posen for at muliggøre maksimal gasudveksling. E) Der måles 14 korn af angrebne kerner i en stor plastikpose. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Såning og spiring af vandmelonfrø. A) Såning af sortsfrø i potter. Så seks frø i hver gryde. Sørg for, at hver gryde kun indeholder frø fra en sort. Placer frøene med den øverste ende af frøet, der vender op for at muliggøre korrekt vækst under fremkomsten. B) Spiring af frø. Brug en sprøjteflaske til at våd den øverste 0,3-0,6 cm jord med vand. Placer en klar plastskål (15 cm diameter) under og over hver gryde for at skabe et fugtigt miljø for frøspiring. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Inokulumpræparation og podning af kimplanter til MTDM. A) Fremstilling af inokulum. Mikrokonidialkoncentrationen i kolberne bestemmes ved hjælp af et hæmocytometer som tidligere beskrevet. Forbered en 7 L inokulumsuspension i et plastkar (40,6 cm bredde × 67,3 cm længde × 16,8 cm dybde) ved at overføre det korrekte volumen sporesuspension til sterilt vand til en endelig sporekoncentration på 1 × 106 ml-1. (B) Podning af kimplanterne. Fjorten dage efter såning (i det mindste første ægte bladstadium) overføres celleindsatserne med frøplanterne til webbed bakker (26,9 cm bredde × 53,7 cm længde × 6,28 cm dybde). Anbring forsigtigt webbedbakkerne med frøplanterne i et plastikkar, der indeholder 7 L podningssuspensionen. Inokuler hver bakke en ad gangen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Fænotypiske resultater af raceidentifikationsmetoder. (A) Løb 1 resultater. Resultaterne af bioassays ved hjælp af (A) alle metoder viser, at når frøplanterne blev inficeret med et Race 1-isolat, døde Black Diamond og Charleston Grey-sorterne eller viste alvorlige symptomer, mens Calhoun Grey- og PI-sorterne viste resistens. (B) Løb 3 resultater. Alle metoder viste, at når frøplanterne blev inficeret med et Race 3-isolat, døde næsten alle planter fra alle sorter eller viste alvorlige symptomer. (Udseendet af syge planter skal være det samme for alle metoder. Beplantningsrækkefølge (venstre mod højre) vist med pile: Black Diamond (blå pil), Charleston Grey (lilla pil), Calhoun Grey (brun pil), Plant Introduction 296341-FR (grøn pil). Klik her for at se en større version af denne figur.

Sort Løb 0 Løb 1 Løb 2 Løb 3
Sugar Baby, Sort Diamant S S S S
Charleston Grå, Allsweet, Dixielee R S S S
Calhoun Gray, Sunsugar R R S S
PI-296341-FR R R R S

Tabel 1: Race af Fusarium oxysporum f. sp. Niveum. Løbet af Fusarium oxysporum f. sp. niveum bestemmes af modtagelige eller resistente reaktioner på et sæt vandmelonforskelle. De sorter, der er anført i hver række, er de mest anvendte til at repræsentere hvert resistensniveau under evalueringen af et isolats race. Denne tabel er blevet ændret fra 4. Forkortelser: S = modtagelig; R = resistent.

Isolere Metode BD CH. G Jørgen Jørgensen PI Race
S SOM S SOM S SOM S SOM
X Dyppe 6 0 6 0 0 6 0 6 1
X Kerne 6 0 6 0 0 6 0 6 1
X MTD 6 0 6 0 0 6 0 6 1
Y Dyppe 6 0 6 0 6 0 6 0 3
Y Kerne 6 0 6 0 6 0 6 0 3
Y MTD 6 0 6 0 6 0 6 0 3
S = Symptomatisk; AS = Asymptomatisk

Tabel 2: Identifikation af løb. De værdier, der anvendes i denne tabel, afspejler incidensen eller antallet af symptomatiske planter sammenlignet med den sunde kontrol og antallet af døde planter som en andel af det samlede antal planter i den pågældende sort. Tallene i hver celle afspejler den incidens, der blev rapporteret ved udgangen af observationsperioden. En sort anses for modtagelig, når mindst 1/3rd eller 33% af planterne i den pågældende sort er symptomatiske eller døde. Patogenets race bestemmes derefter ud fra, hvilke sorter der er blevet anset for modtagelige. Med andre ord, hvordan patogenet klarer sig mod sorter med stigende resistens bestemmer isolatets race. Disse resultater er ikke fra et egentligt forsøg og viser sig snarere at formidle, hvordan racer identificeres ud fra resultaterne af disse metoder. Forkortelser: MTD = modificeret bakke-dryp metode; BD = Sort diamant; CH. G = Charleston Grå; Cal G. = Calhoun Grå; PI = Planteintroduktion 296341-FR; S = symptomatisk; AS = asymptomatisk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tre metoder til race typing er blevet præsenteret. Hver af disse metoder er bedst egnet til bestemte spørgsmål og eksperimentelle forhold. Den angrebne kernepodningsmetode (jordangreb) er måske enklere og mere ligetil, hvilket gør den særlig nyttig til vurdering af patogenicitet30. Brug af denne metode til simpel race-typing er yderst effektiv. Det kan imidlertid være en udfordring at anvende metoden til at bestemme resistensen af en bestemt sort, da hver plante muligvis ikke står over for den samme grad af infektion eller eksponering, og der kan være behov for lige så høje sygdomsniveauer for at teste resistensen af de sorter, der er af interesse. Dette er tilfældet, fordi inokulum produceret på denne måde ikke er godt kvantificeret, og andelen af levedygtige propaguler eller antallet af infektiøse propaguler, der når rodzonen, er ikke godt reguleret31. Derudover er denne metode begrænset af uoverensstemmelser i nærheden af de plantede kerner til rodzonen. Hvis det er for fjernt, kan sporerne ikke spire, eller hyfer kan ikke udvikle sig nok til at nå rødderne.

Root-dip-metoden 32,33 er mere besværlig og tidskrævende; Men fordi mængden af levedygtige propaguler, der interagerer med planten, måles mere præcist, kan værtsresistens beskrives mere præcist, hvilket letter resistensscreening. Desuden kan forskelle i virulens inden for samme race lettere opdages. Denne metode har den ekstra fordel, at planter generelt bliver symptomatiske tidligere og mere udtryksfuldt end i kernemetoden. En variant af root-dip-metoden, der anvender chlamydosporer i inokulumsuspensionen i stedet for conidier, kan mangle denne fordel6. Tilsvarende er den modificerede bakke-dip-metode22 arbejdskrævende, men giver mulighed for fænotyping med høj gennemstrømning, når mange isolater og frøplanter skal screenes.

Fælles faktorer for de tre metoder omfatter udvælgelse af sorter, vækstbetingelser og krav til hygiejne. Afhængigt af hvad der er kommercielt tilgængeligt, kan visse sorter erstattesmed 21,34. Sugar Baby og Black Diamond kan begge bruges til at bestemme race 0-isolater, mens Charleston Gray, Allsweet og Dixielee er blevet beskrevet som resistente over for race 0, men modtagelige for race 1. Calhoun Gray og Sunsugar er modstandsdygtige over for løb 0 og 1 og modtagelige for løb 2 og 3. Fon sygdomsudvikling er meget afhængig af temperaturen. Der skal sørges for, at forsøgsbetingelserne styrer denne variabel. Når du vælger et plantemedium, bør generelle kommercielle blandinger, der omfatter tørvemos og/eller gips og giver mulighed for god beluftning, være tilfredsstillende. Der bør træffes forholdsregler for at forhindre krydskontaminering af plantemediet i begge metoder, især fra kildeposen.

Efter anvendelse af en af de beskrevne metoder skal sygdommen vurderes nøjagtigt og konsekvent. Tidligere forskere har typisk besluttet sig for en tærskel, hvor planter kategoriseres som enten modtagelige eller resistente35,36. For eksempel, hvis mindre end 33% af planterne i en bestemt sort var symptomatiske, ville denne sort blive kategoriseret som resistent med isolatet defineret i forhold til sortens modtagelige profil. Den fastsatte tærskel defineres af forskeren og det spørgsmål, de ønsker at behandle. Variabilitet mellem raters og af samme rater mellem planter er blevet bredt rapporteret 37,38. Faktorer som kvaliteten af det anvendte frø, jordkvalitet, podningstæthed, isolaternes opbevaringsalder og raterbias39,40 bidrager alle til denne variabilitet8. På grund af denne variabilitet i podning og PI-kultivarresponser er der behov for flere eksperimentelle replikationer; ideelt set anbefales mindst tre, men fem replikationer, med 6 planter pr. replikation pr. Sort.

Mens molekylære assays er blevet udviklet til påvisning af Fon-isolater 41,42,43, har resultaterne ikke været konsistente på grund af F. oxysporums polyfyletiske karakter og den geografiske og genomiske variabilitet af artskomplekset 44,45,46. Desuden, selvom tidligere forskning har fastslået betydningen af Secreted in Xylem (SIX) effektorer i fuld virulens, er det nøjagtige supplement af effektorer, der definerer racestrukturen af Fon-isolater, endnu ikke bestemt13. Molekylær diagnostik for race er stadig under udvikling, for hvilke disse fænotypiske teknikker er afgørende for at vurdere deres nøjagtighed og anvendelighed i Fon race typing19,47.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi vil gerne anerkende Dr. Ali og Plant Molecular Diagnostic Laboratory samt Dr. Pingsheng Ji ved University of Georgia, hvis ledelse og støtte hjalp med at etablere vores Fon-program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% Fuller’s Earth Sigma-Aldrich F200-5KG
1 L glass Erlenmeyer Flask PYREX 4980-1L
15 mL falcon tubes Fisher Scientific 14-959-49B
50 mL graduated cylinder Lab Safety Supply 41121805
50 mL Eppendorf Conical Tubes Fisher Scientific 05-413-921
Aluminum foil wrap Reynolds Wrap 720
Bleach Walmart 587192290
Bunsen burner Fisher Scientific 03-391-301
CaCO3 sigma-Aldrich 239216
cell spreaders Fisher Scientific 08-100-11
Cheesecloth Lions Services, Inc 8305-01-125-0725
Clear plastic dishes Visions Wave 999RP6CLSS ~15 cm diameter
Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Cotton Balls Fisherbrand 22-456-885 Sterile
Ethanol Fisher Chemical A4094 100%, then combine with water to make 70% for use
Flourescent Tube Lights MaxLume Model T5 2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long
granulated agar VWR International 90000-786
Hand-held Spray Bottle Ability One 24122002 ~0.95 L
hemacytometer Fisher Scientific 02-671-55A Two chamber hemacytometer
Lab trays Fisher Scientific 15-236-2A
Large, sealable plastic bags Ziploc 430805 38 cm x 38 cm
Mister / watering can Bar5F B10H22
Mushroom Bag Clamp Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Nitrile Gloves Fisher Scientific 19-130-1597D
Organic Rye Berries Shroom Supply 0.5 gallon or 25 lb bags
P1000 pipette and tips Fisher Scientific 14-388-100
Petri dishes Fisherbrand FB0875713 Round, 100 mm diameter, 15 mm height
Planting media Jolly Gardener Pro-Line C/B
Plastic Pitcher BrandTech UX0600850 1 L or larger
Plastic planting pots Neo/SCI 01-1177 ~15 cm diameter and ~10 cm height
Plastic, autoclave-safe bin Thermo Scientific UX0601022 3 L
Quarter-strength potato dextrose agar media Cole-Parmer UX1420028 Use powder in combination with recipe for QPDA
Scientific Balance Scale, measuring in g Ohaus 30208458 Any precise scale that can hold and measure 200g will work
Size #4 cork bore Cole-Parmer NC9585352
Small Mushroom grow bag Shroom Supply 0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes
Soil trowel Walmart 563876946
Styrofoam flats (6 x 12 cells) Speedling Model TR72A
Styrofoam flats (8 x 16 cells) Speedling Model TR128A
Syringe (5 or 10 mL) fisher Scientific 14-829-19C
Timer Walmart TM-01
V8 Original 100% Vegetable Juice Walmart 564638212
vortex Fisher Scientific 02-215-418
Watermelon Seed - Black Diamond Willhite Seed Inc 17
Watermelon Seed - Calhoun Gray Holmes Seed Company 4440
Watermelon Seed - Charleston Gray Bonnie Plants 7.15339E+11
Watermelon Seed - PI 296341-FR Contact authors Contact authors
Wheat Kernels (Maxie var.) (optional) Alachua County Feed & Seed

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edel-Hermann, V., Lecomte, C. Current status of Fusarium oxysporum formae speciales and races. Phytopathology. 109 (4), 512-530 (2019).
  2. Everts, K. L., Himmelstein, J. C. Fusarium wilt of watermelon: Towards sustainable management of a re-emerging plant disease. Crop Protection. 73, 93-99 (2015).
  3. Martyn, R. Cucurbitaceae 2012. Proceedings of the Xth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae. , University of Cukurova, Ziraat Fakultesi. Antalya, Turkey. 136-156 (2012).
  4. Roberts, P., Dufault, N., Hochmuth, R., Vallad, G., Paret, M. [PP352] Fusarium wilt (Fusarium oxysporum f. sp. niveum) of watermelon. EDIS. 2019 (5), 4 (2019).
  5. Keinath, A. Integrated management for Fusarium wilt of watermelon. Land-Grant Press by Clemson Extension, LGP 1022. , Available from: http://lgpress.clemson.edu/publication/integrated-management-for-fusarium-wilt-of-watermelon (2019).
  6. Costa, A. E. S., et al. Resistance to Fusarium wilt in watermelon accessions inoculated by chlamydospores. Scientia Horticulturae. 228, 181-186 (2018).
  7. Lombard, L., Sandoval-Denis, M., Lamprecht, S. C., Crous, P. Epitypification of Fusarium oxysporum-clearing the taxonomic chaos. Persoonia: Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi. 43, 1 (2019).
  8. Martyn, R. D. Fusarium wilt of watermelon: 120 years of research. Horticultural Reviews. 42 (1), 349-442 (2014).
  9. Zhou, X., Everts, K. Characterization of a regional population of Fusarium oxysporum f. sp. niveum by race, cross pathogenicity, and vegetative compatibility. Phytopathology. 97 (4), 461-469 (2007).
  10. Zhou, X., Everts, K., Bruton, B. Race 3, a new and highly virulent race of Fusarium oxysporum f. sp. niveum causing Fusarium wilt in watermelon. Plant Disease. 94 (1), 92-98 (2010).
  11. Leslie, J. F., Summerell, B. A. The Fusarium laboratory manual. , John Wiley & Sons. (2008).
  12. Lo Presti, L., et al. Fungal effectors and plant susceptibility. Annual Review of Plant Biology. 66, 513-545 (2015).
  13. Niu, X., et al. The FonSIX6 gene acts as an avirulence effector in the Fusarium oxysporum f. sp. niveum-watermelon pathosystem. Scientific Reports. 6 (1), 1-7 (2016).
  14. Lievens, B., Houterman, P. M., Rep, M. Effector gene screening allows unambiguous identification of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici races and discrimination from other formae speciales. FEMS Microbiology Letters. 300 (2), 201-215 (2009).
  15. Houterman, P. M., Cornelissen, B. J., Rep, M. Suppression of plant resistance gene-based immunity by a fungal effector. PLoS Pathogens. 4 (5), 1000061 (2008).
  16. Houterman, P. M., et al. The effector protein Avr2 of the xylem-colonizing fungus Fusarium oxysporum activates the tomato resistance protein I-2 intracellularly. The Plant Journal. 58 (6), 970-978 (2009).
  17. Czislowski, E., et al. Investigation of the diversity of effector genes in the banana pathogen, Fusarium oxysporum f. sp. cubense, reveals evidence of horizontal gene transfer. Molecular Plant Pathology. 19 (5), 1155-1171 (2018).
  18. Batson, A. M., Fokkens, L., Rep, M., du Toit, L. J. Putative effector genes distinguish two pathogenicity groups of Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 34 (2), 141-156 (2021).
  19. Keinath, A. P., DuBose, V. B., Katawczik, M. M., Wechter, W. P. Identifying races of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in South Carolina recovered from watermelon seedlings, plants, and field soil. Plant Disease. 104 (9), 2481-2488 (2020).
  20. Gordon, T. R. Fusarium oxysporum and the Fusarium wilt syndrome. Annual Review of Phytopathology. 55, 23-39 (2017).
  21. Martyn, R., Netzer, D. Resistance to races 0, 1, and 2 of Fusarium wilt of watermelon in Citrullus sp. PI-296341-FR. HortScience. 26 (4), 429-432 (1991).
  22. Meru, G., McGregor, C. Genotyping by sequencing for SNP discovery and genetic mapping of resistance to race 1 of Fusarium oxysporum in watermelon. Scientia Horticulturae. 209, 31-40 (2016).
  23. Freeman, S., Rodriguez, R. A rapid inoculation technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and F. o. melonis on cucurbits. Plant Disease. 77 (12), 1198-1201 (1993).
  24. Martyn, R. Fusarium oxysporum f. sp. niveum race 2: A highly aggressive race new to the United States. Plant Disease. 71 (3), 233-236 (1987).
  25. Lai, X., et al. Evaluating inoculation methods to infect sugar beet with Fusarium oxysporum f. Beat and F. secorum. Plant Disease. 104 (5), 1312-1317 (2020).
  26. Kirk, W., et al. Optimizing fungicide timing for the control of Rhizoctonia crown and root rot of sugar beet using soil temperature and plant growth stages. Plant Disease. 92 (7), 1091-1098 (2008).
  27. Ferguson, A., Jeffers, S. Detecting multiple species of Phytophthora in container mixes from ornamental crop nurseries. Plant Disease. 83 (12), 1129-1136 (1999).
  28. Fong, Y., Anuar, S., Lim, H., Tham, F., Sanderson, F. A modified filter paper technique for long-term preservation of some fungal cultures. Mycologist. 14 (3), 127-130 (2000).
  29. Rice, W. N. The hemocytometer method for detecting fungus spore load carried by wheat. Proceedings of the Association of Official Seed Analysts of North America. 31, 124-127 (1939).
  30. Kleczewski, N. M., Egel, D. S. A diagnostic guide for Fusarium wilt of watermelon. Plant Health Progress. 12 (1), 27 (2011).
  31. Dhingra, O. D., Sinclair, J. B. Basic plant pathology methods. , CRC Press. (2017).
  32. Latin, R., Snell, S. Comparison of methods for inoculation of muskmelon with Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Plant Disease. 70 (4), 297-300 (1986).
  33. Martyn, R. An iInitial survey of the United States for races of Fursarium oxysporum f. HortScience. 24 (4), 696-698 (1989).
  34. Zhou, X., Everts, K. Races and inoculum density of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in commercial watermelon fields in Maryland and Delaware. Plant Disease. 87 (6), 692-698 (2003).
  35. Fulton, J. C., et al. Phylogenetic and phenotypic characterization of Fusarium oxysporum f. sp. niveum isolates from Florida-grown watermelon. PLoS One. 16 (3), 0248364 (2021).
  36. Zhou, X., Everts, K. Quantification of root and stem colonization of watermelon by Fusarium oxysporum f. sp. niveum and its use in evaluating resistance. Phytopathology. 94 (8), 832-841 (2004).
  37. Nutter, F. W., Esker, P. D., Netto, R. A. C. Disease assessment concepts and the advancements made in improving the accuracy and precision of plant disease data. European Journal of Plant Pathology. 115 (1), 95-103 (2006).
  38. Nutter, F., Gleason, M., Jenco, J., Christians, N. Assessing the accuracy, intra-rater repeatability, and inter-rater reliability of disease assessment systems. Phytopathology. 83 (8), 806-812 (1993).
  39. Chiang, K. -S., Bock, C. H., Lee, I. -H., El Jarroudi, M., Delfosse, P. Plant disease severity assessment-how rater bias, assessment method, and experimental design affect hypothesis testing and resource use efficiency. Phytopathology. 106 (12), 1451-1464 (2016).
  40. Nita, M., Ellis, M., Madden, L. Reliability and accuracy of visual estimation of Phomopsis leaf blight of strawberry. Phytopathology. 93 (8), 995-1005 (2003).
  41. Zhang, Z., Zhang, J., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil. FEMS Microbiology Letters. 249 (1), 39-47 (2005).
  42. Lin, Y. -H., et al. Development of the molecular methods for rapid detection and differentiation of Fusarium oxysporum and F. oxysporum f. sp. niveum in Taiwan. New Biotechnology. 27 (4), 409-418 (2010).
  43. van Dam, P., de Sain, M., Ter Horst, A., vander Gragt, M., Rep, M. Use of comparative genomics-based markers for discrimination of host specificity in Fusarium oxysporum. Applied and Environmental Microbiology. 84 (1), 01868 (2018).
  44. Baayen, R. P., et al. Gene genealogies and AFLP analyses in the Fusarium oxysporum complex identify monophyletic and nonmonophyletic formae speciales causing wilt and rot disease. Phytopathology. 90 (8), 891-900 (2000).
  45. O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2044-2049 (1998).
  46. Laurence, M., Summerell, B., Liew, E. Fusarium oxysporum f. sp. canariensis: evidence for horizontal gene transfer of putative pathogenicity genes. Plant Pathology. 64 (5), 1068-1075 (2015).
  47. Hudson, O., et al. Marker development for differentiation of Fusarium oxysporum f. sp. Niveum race 3 from races 1 and 2. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 822 (2021).

Tags

Biologi udgave 176
En kontrast mellem tre podningsteknikker, der bruges til at bestemme løbet af ukendt <em>Fusarium oxysporum</em> f.sp. <em>niveum</em> Isolater
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fulton, J. C., Cullen, M. A.,… More

Fulton, J. C., Cullen, M. A., Beckham, K., Sanchez, T., Xu, Z., Stern, P., Vallad, G., Meru, G., McGregor, C., Dufault, N. S. A Contrast of Three Inoculation Techniques used to Determine the Race of Unknown Fusarium oxysporum f.sp. niveum Isolates. J. Vis. Exp. (176), e63181, doi:10.3791/63181 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter