Summary
We bieden schaalbare protocollen voor constructontwerp, voorbijgaande transfectie en expressie en zuivering van volledige menselijke huntingtine-eiwitvarianten in HEK293-cellen.
Abstract
Full-length huntingtine (FL HTT) is een groot (aa 1-3.144), alomtegenwoordig tot expressie gebracht, polyglutamine (polyQ) bevattend eiwit met een massa van ongeveer 350 kDa. Hoewel de cellulaire functie van FL HTT niet helemaal wordt begrepen, is een mutante expansie van het polyQ-kanaal boven ~ 36 herhalingen geassocieerd met de ziekte van Huntington (HD), waarbij de polyQ-lengte ruwweg correleert met de leeftijd van aanvang. Om het effect van structuur op de functie van mutant HTT (mHTT) beter te begrijpen, zijn grote hoeveelheden van het eiwit nodig. Submilligramproductie van FL HTT in zoogdiercellen werd bereikt met behulp van doxycycline-induceerbare stabiele cellijnexpressie. Eiwitproductie uit stabiele cellijnen heeft echter beperkingen die kunnen worden overwonnen met voorbijgaande transfectiemethoden.
Dit artikel presenteert een robuuste methode voor de productie van FL HTT met een lage milligram hoeveelheid en zijn varianten van codon-geoptimaliseerde plasmiden door voorbijgaande transfectie met behulp van polyethylenimine (PEI). De methode is schaalbaar (>10 mg) en levert consequent 1-2 mg/L celkweek van sterk gezuiverde FL HTT op. In overeenstemming met eerdere rapporten bleek de gezuiverde oplossingstoestand van FL HTT zeer dynamisch te zijn; het eiwit heeft de neiging om dimeren en oligomeren van hoge orde te vormen. Een sleutel tot het vertragen van oligomeervorming is het snel isoleren van de monomere fracties van de dimerische en high-order oligomere fracties tijdens grootte-uitsluitingschromatografie.
Grootte-uitsluitingschromatografie met multiangle lichtverstrooiing (SEC-MALS) werd gebruikt om het dimer- en hogere-orde oligomere gehalte van gezuiverde HTT te analyseren. Er werd geen correlatie waargenomen tussen FL HTT polyQ lengte (Q23, Q48 en Q73) en oligomeergehalte. De exon1-verwijderde constructie (aa 91-3.144) vertoonde een vergelijkbare oligomerisatieneiging als FL HTT (aa 1-3.144). Productie-, zuiverings- en karakteriseringsmethoden door SEC / MALS-refractieve index (RI), natriumdodecylsulfate-polyacrylamide gel-elektroforese (SDS-PAGE), western blot, Native PAGE en Blue Native PAGE worden hierin beschreven.
Introduction
De ziekte van Huntington (ZvH) is een zeldzame neurodegeneratieve ziekte die voornamelijk wordt gekenmerkt door onstabiele en onvrijwillige motorische beweging, evenals cognitieve en psychiatrische veranderingen, zoals persoonlijkheidsveranderingen en apathie 1,2. De ZvH is geassocieerd met een uitbreiding van het CAG-herhalingskanaal in exon 1 van het huntingtinegen (HTT) tot meer dan 35 herhalingen, waarbij een hoger aantal CAG-herhalingen correleert met een eerder begin van de ziekte 3,4. Het translationele product van HTT, het huntingtine-eiwit (HTT), is betrokken bij neuronale levensvatbaarheid en hersenontwikkeling 5,6,7,8,9.
HTT is een steigereiwit waarvan wordt gemeld dat het deelneemt aan een breed scala aan cellulaire processen, blaasjestransport, celdeling, ciliogenese en autofagie10,11. De moleculaire pathogenese van de ZvH is echter niet helemaal duidelijk en de identificatie van belangrijke eiwitinterverstoren die de pathologische impact van polyQ-geëxpandeerde mHTT bemiddelen, ontbreekt. Sommige onderzoeken suggereren een winst van toxische functie van mHTT aangedreven door de oligomerisatie neiging van het uitgebreide HTT-eiwit, aangezien HTT-aggregaten zijn geïdentificeerd in neuronen en glia bij ZvH-patiënten en diermodellen van de ziekte 12,13,14,15,16,17 . Om het onderzoek naar de functie en structuur van FL HTT- en mHTT-varianten te stimuleren en onderzoekers te voorzien van hoogwaardige eiwitstandaarden voor de ontwikkeling van assays, is een robuuste en schaalbare toevoer van homogeen recombinant eiwit nodig.
Vanwege de grootte (aa 1-3.144, nummering op basis van polyQ-lengte Q23), proteolytische instabiliteit en neiging tot aggregeren, is FL HTT moeilijk tot expressie te brengen en te isoleren als een oplosbaar eiwit. Voorheen werd het exon 1-gebied (aa 2-90) van HTT op grote schaal tot expressie gebracht en gezuiverd met behulp van verschillende tags die de oplosbaarheid van het eiwit in Escherichia coli 18,19,20 kunnen verhogen. FL HTT werd voor het eerst tot expressie gebracht en gezuiverd in een insectencelexpressiesysteem met behulp van baculovirus 21,22, en lage resolutie 30 Å elektronenmicroscopie (EM) structuren van chemisch verknoopte FL Q23-HTT en Q78-HTT werden gemeld23. Het onderzoek naar de HTT-structuur werd verder gevorderd toen de productie van FL Q17, Q46 en Q128-HTT met native posttranslationele modificaties (PTM's) werd bereikt in menselijke cellen met behulp van stabiele cellijnen of adenovirusexpressiesystemen24. Deze studies suggereren dat hoewel gezuiverde HTT voornamelijk bestaat in de monomere toestand, het ook de neiging heeft om oligomeren en aggregaten van hoge orde te vormen.
Analytische ultracentrifugatie van FL Q128-HTT, met een sterk geëxpandeerd polyQ-gebied, bood meer oligomere en geaggregeerde fracties dan het eiwit met het niet-geëxpandeerde polyQ-gebied24. Met behulp van een stabiele cellijn is een strategie met succes aangepast om FL HTT te stabiliseren door co-expressie met de interactiepartner HAP40. Een cryo-EM structuur van het FL HTT en HAP40 complex is opgelost met een gemiddelde 4 Å resolutie met behulp van het gezuiverde eiwit complex (PDB:6EZ8)25. Deze co-expressiestrategie is met succes aangepast aan een baculovirussysteem en een reeks hoogwaardige HTT-varianten met verschillende polyQ-lengtes zijn tot expressie gebracht en gezuiverd uit insectencellen26. Sindsdien werden meer cryo-EM structuren van het complex van HTT met variabele polyQ lengtes en HAP40 en hogere resolutie structuren opgelost en gedeponeerd in de Protein Data Base27,28 (PDB: 7DXK, 7DXH, 6X9O).
We hebben een transfectie- en expressiemethode in HEK293-cellen geoptimaliseerd, met behulp van polyethylenimine (PEI), voor snelle transiënte expressie van FL HTT. Als proof-of-principle werden FL HTT-varianten met 23 glutamines (FL Q23-HTT) eerst gezuiverd en gekarakteriseerd met behulp van een wijziging van een eerder beschreven zuiveringsmethode24. Deze transiënte transfectiemethode is handig, zeer efficiënt en schaalbaar; het kan gezuiverde HTT produceren met opbrengsten van 1-2 mg / L, vergelijkbaar met de stabiele cellijnmethode gerapporteerd24. Omdat het eiwit wordt geproduceerd in een menselijke cellijn, heeft de htt-geproduceerde meer kans op inheemse menselijke PTM's wanneer het wordt onderworpen aan massaspectrometrie proteomics-analyse 11,29,30,31. Milligramhoeveelheden van de FL Q48-HTT, FL Q73-HTT en exon1-verwijderde (ΔExon1-HTT) varianten van FL HTT werden geproduceerd, wat aantoont dat de transiënte expressiemethode vooral nuttig is bij het snel produceren van alternatieve varianten van HTT zonder afhankelijk te zijn van de tijdrovende inspanning die nodig is om stabiele cellijnen voor productie vast te stellen.
Het volgende protocol is een voorbeeld van de standaardmethode die in het laboratorium van deze auteurs wordt gebruikt voor celkweek, transfectie, eiwitzuivering en postzuivering van eiwitkarakterisering om FL Q23-HTT te produceren uit een 2 L celcultuur. Het protocol kan worden opgeschaald naar grotere culturen of worden aangepast om andere HTT-varianten te zuiveren. Tot 10 L celculturen van FL HTT en verschillende site- of truncation mutaties van HTT en HTT homologen zijn met succes uitgevoerd in het laboratorium met behulp van hetzelfde protocol. Gezuiverde FL HTT bevat een hoog percentage monomeren, samen met dimeren en oligomeren van hogere orde. Hetzelfde geaggregeerde profiel wordt waargenomen bij de geproduceerde varianten (Q23, Q48, Q73 en verwijderde Exon1). Omdat aggregatie kan optreden wanneer niet de juiste zorg wordt besteed, werd een formulerings- en vries-dooistabiliteitsstudie uitgevoerd om de beste omstandigheden voor eiwitverwerking te identificeren. Methoden, zoals Blue Native PAGE en SEC/MALS-RI, worden ook beschreven om het HTT-oligomeergehalte te analyseren als onderdeel van het kwaliteitscontroleproces. Om de ZvH-onderzoeksgemeenschap ten goede te komen, worden plasmiden en HTT-eiwitten die in deze studie worden beschreven ook gedeponeerd in de ZvH Community Repository van het Coriell Institute (www.coriell.org/1/CHDI).
Protocol
1. Ontwerp en productie van constructies voor HTT-expressie met vlaglabel
- Haal de volledige menselijke HTT-eiwitsequentie (P42858) op bij het National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
OPMERKING: Onderzoekers moeten bekend zijn met de domeinorganisaties van HTT en de HTT-kern 3D-structuur onderhouden bij het ontwerpen van constructies voor HTT-mutanten. - Vraag een gensyntheseservice aan om codonoptimalisatie uit te voeren voor menselijke celexpressie op basis van de sequentie van P42858. Verander het polyQ-getal van Q16 naar de gewenste Q-lengte (Q23 werd hier als eerste construct gekozen) en synthetiseer het HTT-gen over de volledige lengte.
OPMERKING: Het gesynthetiseerde codon-geoptimaliseerde Q23-HTT-construct over de volledige lengte werd in deze studie geleverd als een insert in het pUC18-plasmide. - Optioneel: Voeg functies toe om het klonen van verschillende Q-lengtes en zuivering in de constructies te vergemakkelijken.
OPMERKING: Een tabaksetsvirus (TEV) splitsingsplaats en FLAG-zuiveringslabel (AAAENLYFQGDYKDDDDK) werden toegevoegd aan het C-terminale uiteinde van de constructies. Twee HindIII-sites werden in de constructen ontworpen om het polyQ-gebied te omvatten (vertaalde eiwitsequentie wordt niet gewijzigd door HindIII-sites te introduceren). Dit stelt de onderzoeker in staat om de Q-lengte van HTT te veranderen door de enzymvertering en ligatie te beperken zonder het volledige HTT-gen opnieuw te synthetiseren.
2. Kloon de gesynthetiseerde HTT-constructies in pcDNA3.1.
- Vergist 5 μg pUC18-Q23-HTT en 5 μg pcDNA3.1 met elk 2 μL NheI en PmeI bij 37 °C gedurende 2 uur.
- Voer een 0,5% w /v agarose-gel uit en zuiver het Q23-HTT-fragment en de verteerde pcDNA3.1-vector met behulp van een agarose-gelextractiekit. Kwantificeer de concentraties van gezuiverd DNA door OD280 met behulp van een UV-spectrometer die microliter monsters kan meten.
OPMERKING: OD260/280 , variërend van 1,8 tot 2,0, wordt meestal waargenomen. De gesynthetiseerde FL HTT wordt geleverd als een insert met NheI en PmeI aan beide uiteinden in een pUC18 plasmide. Gebruik andere restrictie-enzymen als HTT anders wordt gesynthetiseerd. - Gebruik 10 ng verteerde pcDNA3.1 vector in de reactie. Liteer de gezuiverde DNA's in een molaire verhouding van 1:1 (HTT:pcDNA3.1) in een reactie van 10 μL bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten met behulp van T4 DNA-ligase.
- Transformeer het geligeerde product in competente E. coli-cellen (zie de tabel met materialen) met behulp van het protocol dat door de ligasefabrikant is gespecificeerd.
- Pak 6 enkele kolonies op en maak nachtculturen in 4-6 ml LB aangevuld met 100 μg / ml carbenicilline bij 37 °C.
- Wijs 1 ml toe van elke overnachtingscultuur. Voeg glycerol toe aan 25% v/v en bewaar de glycerolbouillon bij -80 °C. Zuiver de resterende nachtcultuur met behulp van een mini-voorbereidingskit volgens de stappen die zijn gespecificeerd in de gebruikershandleiding.
- Sequence alle plasmiden met behulp van sequencing primers verspreid over het transcriptiegebied van het plasmide. Kies een glycerolbouillon met de juiste volgorde als de hoofdglycerolvoorraad en gooi de rest weg.
- Optioneel: Vraag een gensyntheseservice aan om DNA te synthetiseren met de verschillende Q-lengtes (Q48, Q73 en Exon1) die de twee HindIII-locaties in het pcDNA3.1-Q23-HTT-plasmide omvatten. Verwerk pcDNA3.1-Q23-HTT en de nieuw gesynthetiseerde DNA's met HindIII en religateeer ze met T4-ligase zoals in stap 2.2-2.7 om FL HTT te maken met verschillende polyQ-lengtes in het pcDNA3.1-plasmide.
OPMERKING: Plasmideconstructies die in deze studie worden gebruikt, zijn ook rechtstreeks beschikbaar in de HD Community Repository van het Coriell Institute (www.coriell.org/1/CHDI); zie de materiaaltabel.
3. GIGA prep endotoxinevrij plasmide-DNA voor grootschalige transfectie
- Streep de bacteriële glycerolvoorraden van pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG op een LB-agarplaat met carbenicilline (100 μg / ml). Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 16-24 uur totdat er enkele kolonies verschijnen.
- Pak een enkele kolonie, ent een startercultuur van 5 ml in een rijk medium geformuleerd voor plasmideversterking met carbenicilline (100 μg / ml) en kweek bij 37 ° C gedurende 8 uur.
- Kies voor een endotoxinevrije GIGA plasmide zuiveringskit. Volg de stappen in de handleiding van de plasmide GIGA kit om het pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG plasmide te zuiveren.
- Meet de plasmide-endotoxinespiegels met behulp van een op limulus amoebocyte-lysaat (LAL) gebaseerde endotoxinekwantificatiekit. Volg de procedure die is aangegeven in de handleiding van de fabrikant.
OPMERKING: Een hoogwaardige plasmidezuivering met een laag endotoxinegehalte is essentieel om een goede transfectie-efficiëntie te verkrijgen. Met behulp van dit protocol kan 20-40 mg plasmide (supercoiled vorm >80%) worden verkregen per L bacteriekweek bij plasmideconcentraties > 4 mg / ml. Een goed gezuiverd plasmide moet een endotoxinegehalte hebben < 30 EU/mg. OD260/280 , variërend van 1,8 tot 2,0, wordt meestal waargenomen.
4. Grootschalige transfectie van 2 L HEK293-cellen door polyethyleenimine (PEI)
- Voeg 1 g PEI 25K toe aan 1 l endotoxinevrij water onder roeren. Stel de pH in op 2,0 met 100 mM HCl en roer totdat alle PEI 25K is opgelost. Stel de pH in op 7,0 met 100 mM NaOH-oplossing en filtreer door een filter van 0,2 μm. Aliquot en bewaren bij -20 °C gedurende maximaal een jaar.
OPMERKING: Aliquots van PEI kunnen maximaal twee weken bij 4 °C worden bewaard, maar mogen na het ontdooien nooit opnieuw worden ingevroren. - Vermeerder HEK293-cellen in het groeimedium (zie de materiaaltabel) aangevuld met penicilline-streptomycine (eindconcentratie bij 5 U/ml voor penicilline en 5 μg/ml voor streptomycine) in een bevochtigde shakerincubator bij 37 °C, 90 tpm, 5% CO2 gedurende 18-24 uur. Verdun de cellen tot 2 L met een dichtheid van ~1,2 × 106 cellen/ml met behulp van het groeimedium in 5 L Erlenmeyers een dag voorafgaand aan de transfectie.
- Blijf de cellen groeien bij 37 °C, 90 rpm, 5% CO2 gedurende 18-24 uur. Meet de celparameters met behulp van een automatische celteller die in staat is om de celdichtheid en levensvatbaarheid te meten volgens de gebruikershandleiding.
OPMERKING: De celdichtheid moet verdubbelen en de levensvatbaarheid moet >95% zijn. De celdichtheid vóór de transfectie moet ongeveer 2,0 × 10 6-2,4 × 106 cellen / ml zijn. Verdun de cellen tot de gewenste dichtheid vóór transfectie indien nodig. - Bereken de hoeveelheden plasmide en PEI die nodig zijn voor de transfectie; gebruik 1 mg plasmide en 3 mg PEI voor transfectie van elke liter celcultuur. Wijs 2 mg plasmide en 6 mg PEI toe die nodig zijn voor een transfectie van 2 L.
- Verdun het plasmide en PEI afzonderlijk tot een volume fosfaat gebufferde zoutoplossing gelijk aan 1/20dede van het totale volume van de celcultuur (elk 100 ml voor een transfectie van 2 L) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Meng het verdunde plasmide en PEI door voorzichtig te draaien en incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
OPMERKING: Het mengsel zal enigszins troebel lijken na incubatie. - Voeg het mengsel toe aan de celcultuur en draai voorzichtig om ze te mengen.
- Laat de cellen groeien bij 37 °C, 5% CO2, 90 rpm gedurende 24 uur.
- Voeg 2 M natriumbutyraatoplossing toe aan een eindconcentratie van 2 mM. Voeg 1:1000 (v/v) antiklontermiddel en 1:1000 (v/v) antischuim toe aan de kweek.
- Verplaats de kolf naar een bevochtigde schudmachine bij 32 °C, 90 tpm, 5% CO2 en blijf gedurende 48 uur groeien.
- Meet de celparameters, inclusief celdichtheid en levensvatbaarheid, met behulp van de automatische celteller volgens de gebruikershandleiding.
- Breng 2,0 × 106 cellen (Vol = 2,0 × 106/celdichtheid) over in een microcentrifugebuis. Pelleteer de cellen op 2.000 × g gedurende 1 minuut in een centrifuge voor western blotting in sectie 5.
- Oogst de cellen door centrifugeren bij 2.000 × g gedurende 30 minuten en bewaar de celpellet bij -80 °C vóór zuivering.
5. SDS-PAGE en western blot van HEK293 cel lysaat om HTT-expressieniveau te schatten
- Neem een aliquot van 2,0 × 106 cellen die eerder bevroren waren (stap 4.11) uit de grootschalige transfectie van HEK293-celcultuur. Voeg 250 μL Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) toe, aangevuld met 50 μg/ml digitonine, 5 mM EDTA en 1x proteaseremmercocktail, en suspensie de celpellet opnieuw door meerdere keren te aspirateren met een pipet.
- Draai de buizen voorzichtig gedurende 30 minuten bij 4 °C met behulp van een minirotator om de cellen te lyseren. Pelleteer het onoplosbare materiaal door centrifugeren op 17.000 × g gedurende 5 minuten.
- Voeg 1/3rd het volume van 4x reducerende lithiumdodecylsulfaat (LDS) laadbuffer toe aan het supernatant en verwarm bij 70 °C gedurende 10 min.
- Laad 5-20 μL celllysaat op een prefab 3-8% Tris-acetaat PAGE gel. Gebruik de gelcompatibele 1x Tris-acetaat SDS-loopbuffer en laat de gel gedurende 60 minuten in een constante spanningsmodus bij 150 V draaien.
OPMERKING: Tris-acetaat SDS-PAGE werd gebruikt voor FL HTT-analyse omdat het een hogere resolutie genereert dan andere soorten SDS-PAGE voor de eiwitten met een molecuulgewicht van meer dan 300 kDa. Eiwitten die in deze studie worden gebruikt, zijn ook rechtstreeks verkrijgbaar bij de ZvH Community Repository van het Coriell Institute (www.coriell.org/1/CHDI); zie de materiaaltabel. - Om western blotting uit te voeren, assembleert u een transfer sandwich met behulp van een transferbuffer-equilibrated dik transferpapier, een methanol-geactiveerd polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan en een SDS-PAGE-gel. Breng de eiwitten over naar het PVDF-membraan met behulp van een semi-droge westelijke blotter volgens de gebruikershandleiding van de fabrikant.
OPMERKING: Typisch, 20-30 min bij 135 mA is voldoende voor een membraan van 10 cm x 10 cm. - Demonteer de transfer sandwich en blokkeer het membraan in TBST (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl en 0,1% v/v Tween-20) aangevuld met 5% w/v vette melk.
- Incubeer het membraan op een rocker gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 15 ml primair antilichaam (1:2.500 verdunning voor anti-FLAG antilichaam monoklonaal antilichaam en 1:2.000 voor alle andere primaire antilichamen).
OPMERKING: Primaire antilichamen die in deze studie worden gebruikt, zijn anti-FLAG M2, MAB5492, MAB5490, MAB2166, MAB3E10, MAB4E10, MAB2168, MAB8A4 (zie de tabel met materialen). - Was het membraan 3 x 5 min met 30-50 ml TBST.
- Incubeer het membraan op een rocker met een fluorescerend kleurstof-geconjugeerd geiten-antimuis IgG secundair antilichaam bij 1:15.000, kamertemperatuur, in 15 ml TBST met 5% w / v droge melk.
- Visualiseer de western blot-banden op een fluorescerende imager met behulp van de golflengte die specifiek is voor het secundaire antilichaam. Kwantificeer het bandsignaal met behulp van de software bij de imager volgens de gebruikershandleiding.
OPMERKING: Kwantitatieve western blotting kan worden uitgevoerd met behulp van gezuiverde HTT als standaard. Een lineair standaardbereik van HTT is instrumentspecifiek en werd in dit laboratorium vastgesteld van 25 ng tot 250 ng HTT per baan met behulp van een anti-FLAG-antilichaam. De western blot van HTT moet vrij zijn van degradatie; een totaal HTT-expressieniveau van 2-4 pg/cel wordt doorgaans waargenomen. Raadpleeg een eerder gepubliceerd protocol32 voor meer informatie over het uitvoeren van een kwantitatieve western blot.
6. Snelle eiwitvloeistofchromatografie (FPLC) zuivering van HTT met behulp van anti-FLAG kolom en SEC
- Anti-FLAG zuivering
- Schat de hoeveelheid FLAG-hars die nodig is voor zuivering (meestal 12 ml anti-FLAG M2-affiniteitshars voor zuivering van 2-4 L getransfecteerde celcultuur). Verpak 12-25 ml anti-FLAG-hars op een lege kolom (zie de tabel met materialen) met behulp van FPLC bij een stroomsnelheid van 4 ml/min met buffer A (tabel 1). Pas de hoogte van de zuiger aan, zodat er geen opening is tussen het uiteinde van de zuiger en het bed van hars.
- Gebruik een verhouding van 10 ml Lysis buffer per 1 g celpellet, ontdooi en suspensie de celpellet in koude Lysis buffer (tabel 1).
- Laat de celsuspensie eenmaal door een high-shear homogenisator met 10.000 psi gaan. Verduidelijk het lysaat door centrifugatie bij 20.000 × g gedurende 1 uur in een centrifuge die is uitgerust met een compatibele rotor met vaste hoek.
- Programmeer de FPLC (zie de tabel met materialen voor de software die in het onderzoek wordt gebruikt) en voer de volgende reeksen uit.
- Laad het geklaarde lysaat via de monsterpomp.
- Wassen met 4 kolomvolumes (cv's) buffer A (tabel 1).
- Wassen met 4 cv's buffer B (tabel 1).
- Wassen met 8 cv's buffer C (tabel 1).
- Wassen met 3 cv's buffer D (tabel 1).
- Wassen met 3 cv's van elutiebuffer (tabel 1).
- Analyseer 10 μL van de piekfracties met SDS-PAGE. Verzamel en combineer de piekfracties met de gewenste zuiverheid. Bespaar ~50 μL van de gecombineerde eluaten voor SDS-PAGE-analyse.
OPMERKING: Normaal gesproken verschijnt er een enkele piek en alle fracties die in de piek worden geëlueerd, bevatten ~ 90% pure HTT. - Regenereer een anti-FLAG-kolom met behulp van 5 cv's van regeneratiebuffer (tabel 1) en breng de kolom opnieuw in evenwicht met 5 cv's van buffer A.
OPMERKING: Anti-FLAG hars kan tot vijf keer worden hergebruikt of totdat de relatieve opbrengst / liter daalt tot 50% van de eerste zuivering.
- Sec-zuivering (Size Exclusion Column) met behulp van een SEC-kolom
- Preequilibrate een SEC-kolom die scheiding van eiwitten met molecuulgewicht (MW) > 500 kDa mogelijk maakt (zie de tabel met materialen voor de gebruikte kolom) met behulp van 2 × CV van SEC Buffer (tabel 1).
- Laad het anti-FLAG eluaat (vanaf stap 6.1.5) direct via een 50 ml superloop. Voer 1,2 × CV van SEC-buffer per injectie. Voer de SEC-scheiding 's nachts uit op 4 °C.
OPMERKING: Een maximum van 5 ml of 15 ml eiwitmonster kan worden geladen op de SEC-kolommen die in dit onderzoek zijn geselecteerd. Programmeer de FPLC zodat meerdere injecties automatisch kunnen worden uitgevoerd. Voorbeeldmethodescripts zijn ook opgenomen als aanvullend bestand 1 en aanvullend bestand 2. - Vergelijk het elutieprofiel met het standaard HTT-elutieprofiel om de monomeer-, dimer- en hogergeorde oligomere pieken te onderscheiden. Pool de monomere HTT-fracties op basis van het elutieprofiel van de SEC-kolom. Voeg desgewenst de hoger geordende oligomere en dimerische HTT-fracties afzonderlijk samen.
- Concentreer het gepoolde HTT-eiwit met behulp van een 100 kDa centrifugale concentrator bij 4 °C. Bereken de eiwitconcentraties door hun OD280-waarden te delen door de respectieve extinctiecoëfficiënten (de theoretische extinctiecoëfficiënten van Q23-HTT, Q48-HTT, Q73-HTT en ΔExon1-HTT zijn respectievelijk 0,776, 0,769, 0,762 en 0,798 (mg / ml) - 1 cm-1 voor de berekening). Houd de HTT-concentratie ≤ 1,0 mg / ml.
OPMERKING: Het is essentieel om het concentratieproces te bewaken, omdat overconcentratie zal leiden tot aggregatie. - Aliquot het gezuiverde HTT-eiwit in cryoveilige microcentrifugebuizen in een volume < 100 μL. Bevries de aliquots flash-freeze met vloeibare stikstof en bewaar ze bij -80 °C.
7. Analytische HPLC SEC-MALS-dRI om HTT-polydispersiteit te analyseren
- Voer alle analytische SEC-MALS bij 4 °C uit op een high-performance vloeistofchromatografiesysteem (HPLC) in combinatie met een UV-detector, een multiangle lichtverstrooiingsdetector en een differentiële brekingsindex (dRI) detector.
- Voordat u de UHPLC-kolom op het systeem aansluit, reinigt u de pomp en de detectoren met gefilterd (0,1 μm) HPLC-water.
- Sluit de UHPLC-kolom (zie de tabel met materialen voor de gebruikte kolom) aan op het systeem. Breng de kolom in evenwicht met gefilterd (0,1 μm) water en vervolgens de SEC-MALS-buffer (tabel 1) totdat alle detectorsignalen de basislijn bereiken.
- Injecteer 2 μL 6 mg/ml runderserumalbumine (BSA) met een stroomsnelheid van 0,3 ml/min gedurende 15 minuten per injectie en inspecteer de gegevenskwaliteit. Voer normalisatie, piekuitlijning en bandverbredingscorrectie uit op basis van het BSA-profiel en maak een sjabloon voor de volgende HTT-voorbeeldruns.
- Ontdooi snel een injectieflacon van het FL Q23-HTT-monster in een waterbad op kamertemperatuur met behulp van een vlotter. Filtreer de HTT door een 0,1 μm spinfilter. Injecteer 2-4 μL van het HTT-monster en laat gedurende 15 minuten bij 4 °C werken bij een debiet van 0,3 ml/min.
- Analyseer de chromatografische en lichtverstrooiende gegevens met behulp van de bijbehorende software (zie de tabel met materialen). Gebruik de dRI-detector als concentratiedetector en gebruik 0,185 als brekingsindex increment (dn/dc) voor HTT. Genereer een Zimm-plot om de gewichtsgemiddelde moleculaire massa voor elke piek33,34 te bepalen.
OPMERKING: Brekingsindex increment van HTT wordt berekend als 0,185 met behulp van programma SEDFIT software35 en primaire aminozuursequentie van HTT als input.
OPMERKING: HTT monomeer MW wordt bepaald door SEC-MALS bij ~370 kDa ± 30 kDa. Gezuiverde HTT heeft meestal een monomeergehalte tussen 60 en 75% (in dit laboratorium). Een laag monomeergehalte kan erop wijzen dat er meer zorg moet worden besteed aan de hantering om aggregatie te voorkomen.
8. Blue Native PAGE om HTT-polydispersiteit te analyseren
- Bereid 1 L anodebuffer door 50 ml 20x Blue Native PAGE-loopbuffer (zie de tabel met materialen) te mengen met 950 ml H2O. Bereid 2 l donkerblauwe kathodebuffer door 100 ml 20x Blue Native PAGE-loopbuffer en 100 ml Blue Native PAGE-kathodeadditief (20x) te mengen met 1.800 ml H2O. Koel de buffers voor gebruik af tot 4 °C.
- Ontdooi snel een injectieflacon MET FL Q23-HTT-monster in een waterbad op kamertemperatuur met behulp van een vlotter. Bewaar het ontdooide eiwit op ijs voor gebruik.
- Meng 5 μg FL Q23-HTT (~1 mg/ml), 1 μL 0,5% G250 additief, 2,5 μL 4x Blue Native PAGE monsterbuffer en water om het uiteindelijke volume op 10 μL te brengen.
- Laad het gemengde FL Q23-HTT-monster op een 3-12% prefab Bis-Tris-gel. Laad 7,5 μL van de niet-gekleurde eiwitstandaard in dezelfde gel als de standaard.
- Vul de voorkant van de tank met donkerblauwe kathodebuffer en de achterkant van de tank met anodebuffer.
OPMERKING: Vul de buffers nadat het monster is geladen, zodat u het monster eenvoudig kunt visualiseren bij het laden van de monsters. - Laat de gel 120 minuten op 150 V draaien in een koude ruimte.
- Houd de gel vast met Destaining Solution (tabel 1) totdat banden worden waargenomen; breng de gel over op water. Visualiseer en documenteer de gel op een beeldvormingsstation.
OPMERKING: Blue Native PAGE is oorspronkelijk ontworpen om membraaneiwitten te analyseren. Het werd in dit laboratorium aangepast als een alternatieve methode om het monomere gehalte van HTT te schatten. Het bindt zich aan de hydrofobe gebieden van HTT en voorkomt dat het aggregaten vormt onder bufferomstandigheden zonder wasmiddel. Traditionele native PAGE zonder Coomassie blue G250 te gebruiken, zorgt ervoor dat HTT oplosbare oligomeren en aggregaten vormt, waarschijnlijk vanwege de vele hydrofobe pockets die in HTT bestaan.
9. SDS PAGE gevolgd door Coomassie of zilverkleuring om htt-zuiverheid te analyseren
- Voeg 4x LDS-monsterbuffer en 10x reducerend reagens toe aan gezuiverde FL Q23-HTT om de uiteindelijke concentratie van de laadbuffer en het reducerende reagens 1x te maken.
- Verwarm het monster op een droog verwarmingsblok bij 70 °C gedurende 10 min.
- Laad maximaal 1 μg eiwit per putje op een 3-8% Tris-acetaatgel en draai op 150 V gedurende 1 uur met behulp van Tris-acetaat SDS-loopbuffer.
OPMERKING: Eiwitten die in deze studie worden gebruikt, zijn ook rechtstreeks verkrijgbaar bij de ZvH Community Repository van het Coriell Institute (www.coriell.org/1/CHDI); zie de materiaaltabel. - Coomassie vlek
- Was de gel met H2O gedurende 5 min.
- Kleur de gel in de Coomassie-kleuringsoplossing (tabel 1) door de gel gedurende 15 minuten in 30 ml kleuringsoplossing te wiegen.
- Ontkleur de vlekken door de gel gedurende 5 min in 50 ml H2O te wiegen. Herhaal dit tweemaal. Visualiseer en documenteer de Coomassie-gekleurde gel op een beeldvormingsstation.
- Zilveren vlek met behulp van een commerciële zilveren vlek kit.
- Na SDS-PAGE fixeert u de gel met behulp van Fixing Solution (tabel 1) gedurende 1 uur tot een nacht bij kamertemperatuur.
- Voer de vlek uit, was en ontwikkel volgens de instructies van de kit.
- Stop de zich ontwikkelende stap onmiddellijk zodra de banden de gewenste intensiteit bereiken.
- Documenteer de gel in een geldocumentatiesysteem dat is uitgerust met een zichtbare lichtbron.
OPMERKING: HTT gezuiverd op >95% kan worden gedetecteerd door Coomassie en zilverkleuring met dit protocol. Raadpleeg een eerder gepubliceerd protocol32 voor meer informatie over het uitvoeren van kwantitatieve eiwitanalyse.
Representative Results
Een transiënte expressievector (pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG, figuur 1A) is ontworpen voor snelle productie in zoogdiercellen van FL Q23-HTT (aa 1-3.144, gebaseerd op Q23-nummering). Dit construct heeft de kenmerken die zijn ontworpen om snel verschillende HTT-mutatieconstructies te genereren door cassetteklonen, de zuivering van HTT-eiwit tot hoge kwaliteit en homogeniteit te vergemakkelijken met minimale chromatografische stappen, en de mogelijkheid te hebben om ongelabelde FL HTT te produceren. De lijst met de functies bevat 1. HindIII-restrictieverteringsplaatsen, rondom de CAG-herhaling in HTT exon 1, kunnen worden gebruikt om FL HTT-mutanten te genereren met een polyQ-rek van verschillende lengtes door restrictie-enzymvertering en ligatie; 2. het C-terminale uiteinde van FL HTT wordt gelabeld met een FLAG-epitoop met een TEV-proteaseherkenningsplaats voor eenstapsaffiniteitszuivering van FL HTT met een hoge zuiverheid en optionele generatie tag-free FL HTT-eiwit met behulp van TEV-proteasesplitsing; 3. Codon-geoptimaliseerde FL HTT-sequentie voor menselijk celcodongebruik voor expressie op hoog niveau in HEK293-cellen. De pcDNA 3.1 (+) vector wordt gebruikt als de ruggengraat van het construct om te profiteren van de hoge transcriptionele activeringsactiviteit van de CMV-promotor in zoogdiercellijnen.
Met behulp van pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG als de startsjabloon, werden de Q48- en Q73 FL HTT-constructies geproduceerd door DNA-fragmenten te synthetiseren met de juiste Q-lengte verspreid over twee HindIII-restrictie-enzymsites en hetzelfde gebied in de sjabloon te verwisselen. De ΔExon1-mutant van FL HTT (aa 91-3.144) (figuur 1B) werd geproduceerd met behulp van primers gericht op verwijderde residuen verspreid over het exon 1-gebied in de sjabloon. HEK293-cellen getransfecteerd met pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG met PEI werden gekweekt in 5 L-schudkolven onder 5% CO2. Een typische grootschalige zuivering maakt gebruik van een 2-10 L celpellet met 6,0 × 10 9-3,0 × 10 10 cellen. Alvorens over te gaan tot zuivering, werd het HTT-expressieniveau van elke transfectie geschat door kwantitatieve western blotting met behulp van gezuiverde recombinante FLAG-gelabelde HTT als een standaard en anti-FLAG-antilichaam als het eerste antilichaam. Pellets met een geschat HTT-expressieniveau van ≥2 pg HTT/cel werden gebruikt voor zuivering.
Zuivering van FL HTT bestaat uit een 2-staps kolomproces, eerst met anti-FLAG affiniteitszuivering en vervolgens met SEC op een gelfiltratiekolom met een geschikt scheidingsbereik voor HTT (figuur 2A; zie Tabel van materialen voor voorbeelden). Na beide stappen werd HTT verkregen bij >95% monsterzuiverheid, zoals bepaald door SDS-PAGE met Coomassie blauw en >65% monomeergehalte op basis van analytische SEC-MALS. Omdat zowel de verlengde zuiveringstijd als de temperatuur een negatieve invloed hebben op het uiteindelijke HTT-monomeergehalte, werd FPLC in beide zuiveringsstappen gebruikt om de verwerking te minimaliseren en een consistente monsterkwaliteit te verkrijgen. De belangrijkste verontreiniging tijdens de anti-FLAG zuivering was de chaperonne Hsp70 zoals bepaald door massaspectrometrie (Figuur 2B, baan 2). Dit komt overeen met de bevinding dat Hsp70 co-gezuiverd is met FL HTT stabiel tot expressie gebracht in menselijke cellijnen24, wat suggereert dat Hsp70 een veel voorkomende stabilisator kan zijn voor FL HTT in vivo.
Hsp70-verontreiniging kan worden geëlimineerd door uitgebreid te wassen met magnesiumchloride en ATP tijdens de anti-FLAG-affiniteitszuiveringsstap (figuur 2B, baan 1). Na verwijdering van Hsp70 is FL HTT gevoelig voor het vormen van hoger geordende oligomeren24 en moet het worden gehandhaafd op een concentratie ≤ 1 mg / ml. De concentratiestap vóór SEC kan vaak resulteren in een significante aggregatie. Daarom is de beste praktijk om piekfracties van anti-FLAG-zuivering direct op de grootte-uitsluitingskolom te laden zonder zich te concentreren. Na SEC werd het monster geconcentreerd tot ≤1 mg/ml voor maximaal herstel van monomere FL HTT. De hoeveelheid HTT die uit elke zuiveringsstap werd teruggewonnen, werd geschat door Coomassie blue of kwantitatieve western blotting met behulp van gezuiverde FL HTT als kwantificeringsstandaard (tabel 2). De typische opbrengst van gezuiverde FL HTT-eiwitten geproduceerd door de beschreven methode is ongeveer 1 mg / L celkweek, maar kan daar ver onder vallen (tabel 3) als gevolg van batch-to-batch variabiliteit, of als de anti-FLAG zuiveringshars meerdere keren wordt hergebruikt.
Overexpressie van FL HTT kan leiden tot fragmentatie van het eiwit22. FL Q23-HTT geproduceerd volgens de hier beschreven methode opgelost als een enkele band met de juiste MW van 350 kDa door SDS PAGE, gekleurd door Coomassie G250 of door zilverkleuring (figuur 2C). Door western blotting reageerde FL Q23-HTT met antilichamen tegen epitopen op de N-terminal, C-terminal en verschillende tussenliggende domeinen, zonder dat er extra fragmentgerelateerde banden werden waargenomen, wat aangeeft dat het eiwit werd geïsoleerd zonder significante detecteerbare truncaties (figuur 3A). FL HTT polyQ-lengtevarianten Q23, Q48 en Q73 reageerden zoals verwacht in western blot, met een progressief sterker signaal voor polyQ-gerichte mAb MW1 correlerend met toenemende Q-lengte: Q23-HTT < Q48-HTT < Q73-HTT (figuur 3B). Er werd geen signaal waargenomen voor ΔExon1-HTT (aa 91-3,144) bij sonde met de antilichamen MW1 en MAB549, die zich richten op de N-terminal exon 1 (figuur 3B).
SEC-MALS werd gebruikt om de aggregatietoestand en moleculaire massa van het gezuiverde HTT-eiwit te analyseren. Monsters werden geanalyseerd door analytische SEC gemonitord door UV-, MALS- en dRI-detectoren. De absolute molaire massa verkregen uit SEC-MALS is niet afhankelijk van de vorm van de moleculen33,34; daarom biedt SEC-MALS een onbevooroordeelde schatting van MW voor monomere en oligomere fracties wanneer ze goed gescheiden zijn. Van de geteste HPLC-kolommen vertoonde de SEC-kolom (zie de tabel met materialen) voldoende resolutie tussen het HTT-monomeer en het dimeer, zodat molaire massa's konden worden onderscheiden (figuur 4). De eiwitconcentratie werd bepaald door dRI-detectie. Brekingsindexstappen (dn/dc) van FL HTT zijn 0,1853 ml/g zoals berekend door de SEDFIT-software35. Vergelijkbare analytische SEC-elutiepatronen werden waargenomen voor ΔExon1 HTT (91-3.144), FL Q23, Q48 en Q73 HTT (1-3.144), elk bestaande uit een grote monomeerpiek met kleine dimerische en oligomere pieken (tabel 4). De berekende MW voor de monomere vorm is groter dan de theoretische MW. Dit wordt waarschijnlijk veroorzaakt door overlappende soorten van hoger geordende oligomere pieken en fouten als gevolg van zwakke dRI-signalen, aangezien HTT-eiwitten in lage concentratie worden gehouden om te voorkomen dat hoger geordende oligomeren worden gevormd. Door de UV-pieken van verschillende batches gezuiverde FL HTT-varianten te integreren, werd geen duidelijke correlatie tussen polyQ-lengte en aggregaatprofiel waargenomen (tabel 4).
Naast analytische SEC werd traditionele native PAGE uitgevoerd om te bepalen of het kan worden gebruikt als een aanvullende methode om de FL HTT oligomere toestand te karakteriseren. Hoger geordende oligomeren werden opgelost door 3-8% Tris-acetaatgels met behulp van native buffer zonder wasmiddel. Gezuiverde FL HTT van SEC vertoonde meerdere banden die overeenkomen met de oligomerisatietoestanden (figuur 5A). De laagste band bevond zich tussen inheemse marker 480 kDa en 720 kDa, vergelijkbaar met eerdere resultaten gerapporteerd voor FL HTT gezuiverd uit insectencellen22. Het HTT-monomeer was echter niet de meest voorkomende band bij gebruik van traditionele native PAGE, en de resultaten correleren niet met het geaggregeerde profiel bepaald door analytische SEC-MALS. Verschillende hydrofobe pleisters die aanwezig zijn in FL HTT 36,37,38, met name de hydrofobe interface tussen HAP40 en FL HTT25, zullen waarschijnlijk bijdragen aan de vorming van hoger geordende oligomeren tijdens migratie in de gel. Dit komt omdat van hydrofobe regio's bekend is dat ze met elkaar interageren in afwezigheid van wasmiddel of stabiliserende eiwit-eiwitinteracties. In overeenstemming met de hydrofobe eigenschappen van HTT, vormt FL HTT toenemende hoeveelheden hoger geordende oligomere fracties in afwezigheid van CHAPS tijdens de SEC-zuiveringsstap.
Blue Native PAGE, dat veel wordt gebruikt om membraaneiwitten en grote eiwitcomplexen met hydrofobe patches te onderzoeken39, werd vergeleken met traditionele native PAGE. Purified HTT toonde drie belangrijke banden op Blue Native PAGE met geschatte MW van 643, 927 en 1070 kDa (figuur 5B) die waarschijnlijk respectievelijk de monomere, dimerische en trimerische soorten HTT vertegenwoordigen. De monomeerband bleef de meest voorkomende band in de Blue Native PAGE, die goed overeenkomt met het analytische SEC-profiel van dezelfde monsters. De overschatting van MW van het HTT-monomeer door Blue Native PAGE kan het gevolg zijn van de unieke holle bolvormige structuur of hydrofobe gebieden van HTT die een langzamere migratie veroorzaken ten opzichte van overeenkomstige moleculaire gewichtsmarkers 11,23,25. Over het algemeen hebben FL Q23-HTT, FL Q48-HTT, FL Q73-HTT en ΔExon1-HTT vergelijkbare Blue Native PAGE-profielen met slechts kleine verschillen in de eiwitbandmigratie vanwege hun moleculaire gewichtsverschillen.
Als extra controle van de kwaliteit van de gezuiverde eiwitten kan de C-terminal FLAG tag uit FL HTT worden verwijderd door behandeling met TEV protease. Na proteolytische splitsing werden monsters geanalyseerd door western blot met behulp van vier antilichamen om flag tag verwijdering te bevestigen en HTT-degradatie te detecteren. Immunoreactiviteit op anti-FLAG M2 en drie huntingtine-specifieke antilichamen met epitopen tegen de N-terminus, intermediaire domeinen en C-terminus van HTT vertoonden succesvolle FLAG-tagverwijdering en geen HTT-specifieke afbraakproducten (aanvullende figuur S1).
Figuur 1: Construeer voor HTT-expressie over de volledige lengte. (A) Full-length Q23 HTT werd codon-geoptimaliseerd en gekloond in pcDNA3.1 (+) plasmide. Het 3'-uiteinde van HTT werd getagd met Flag-epitoop en TEV-proteasesplitsingsplaats om tag-free HTT-eiwit te produceren. Het polyglutamine stretch en proline-rijke domein werden ontworpen met geflankeerde HindIII-restrictie-endonucleasesites om extra CAG-herhalingen in te voegen met behulp van cassetteklonen , d.w.z. Q48 en Q73, om HTT-varianten met verschillende polyQ-lengtes te produceren. (B) ΔExon1 construct werd pcr-mutagenese gemaakt met pcDNA3.1-Q23-HTT als sjabloon. Residuen 91-3.144 van HTT bleven achter in het ΔExon1-construct voor expressie. Afkortingen: HTT = huntingtine; CMV = cytomegalovirus; Q23 = polyglutamine rek; PRD = proline-rijk domein; TEV = tabak ets virus splitsing site. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Grootschalige zuivering van HTT. (A) SEC-profiel van anti-Vlag-gezuiverde full-length Q23-HTT op een FPLC-kolom. Hooggeordende oligomeren, dimeer- en monomeerpieken van Q23-HTT zijn gelabeld. Fracties die monomeer bevatten, werden verzameld als het uiteindelijke HTT-monster. (B) SDS-PAGE van gezuiverde Q23-HTT met ATP/magnesium wasstap (baan 1) of zonder ATP/magnesium wassen resulteert in Hsp70 co-elutie (baan 2). (C) Definitieve gezuiverde HTT-varianten over de volledige lengte op SDS-PAGE gekleurd met Coomassie blauwe G-250 of zilveren vlek. Afkortingen: FL = volledige lengte; HTT = huntingtine; SEC = grootte-uitsluitingschromatografie; FPLC = snelle eiwitvloeistofchromatografie; O = oligomeer; D = dimeer; M = monomeer; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese; Hsp70 = heat shock eiwit 70. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Western blot analyse van gezuiverde HTT Varianten. (A) Purified FL Q23-HTT werd uitgevoerd op SDS-PAGE en overgebracht naar PVDF membraan. De primaire antilichamen en interagerende epitopen zijn Lane 1, α-FLAG M2, FLAG tag; Baan 2, MAB5492, HTT aa. 1-82; Baan 3, MAB5490, HTT aa 115-129; Baan 4, MAB2166, HTT aa 181-810; Baan 5, MAB3E10, HTT aa 1.171-1.177; Baan 6, MAB4E10, HTT aa 1.844-2.131; Baan 7, MAB2168, HTT aa 2.146-2.541; Baan 8, MAB8A4, HTT aa 2.703-2.911. (B) 1 μg gezuiverde FL HTT-varianten werden uitgevoerd op SDS-PAGE en overgebracht naar PVDF (links), en een dubbele SDS-gel werd uitgevoerd en gekleurd met Coomassie Blue (rechts). De primaire antilichamen en interagerende epitopen zijn Rij 1, MW1, uitgebreide PolyQ-herhalingen; Rij 2, MAB2166, HTT aa 181-810; Rij 3, MAB5492, HTT aa 1-82. Afkortingen: FLL Q23-HTT = huntingtine-eiwit over de volledige lengte dat 23 glutamineresiduen bevat; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese; WB = western blot; M = marker; PVDF = polyvinylideenfluoride. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: SEC-MALS-analyse van HTT over de volledige lengte. Gezuiverde full-length Q23-HTT werd geëlueerd op een UPLC-kolom. Piekposities van voorspeld monomeer, dimeer en oligomeer worden aangegeven. Molecuulgewichten werden berekend voor monomeer-, dimer- en trimerpieken en vermeld in tabel 5. Vergelijkbare elutieprofielen worden waargenomen voor Q48, Q73 en ΔExon1 HTT, met variabele monomeer-, dimer- en oligomeergehaltes in elke zuivering. Afkortingen: SEC-MALS = Grootte-uitsluitingschromatografie met multi-angle lichtverstrooiing; UV = Ultraviolet; LS = Lichtverstrooiing; MW = Molecuulgewicht; Q23-HTT = huntingtine-eiwit dat 23 glutamineresiduen bevat; M = monomeer; D = dimeer; O = oligomeer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Karakterisering van gezuiverde HTT met behulp van duidelijke Native PAGE of Blue Native PAGE gel. Native Marker en schijnbare monomere Q23-HTT van SEC werden opgelost op 3-8% Tris-acetaatgels in een niet-denaturerend PAGE-systeem (A) en een Blue Native PAGE-systeem (B). Afkortingen: FL = full-length; Q23-HTT = huntingtine-eiwit dat 23 glutamineresiduen bevat; PAGE = polyacrylamide gel elektroforese; M = marker. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Stap | Naam | Compositie | ||
| 6.1.1 | Buffer A | 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5% v/v glycerol, 5 mM EDTA, 0,01% v/v Tween-20, pH 8,0. | ||
| 6.1.2 | Lysis Buffer | 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5% v/v glycerol, 5 mM EDTA en 1x proteaseremmer cocktail | ||
| 6.1.4.2 | Buffer A | 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5% v/v glycerol, 5 mM EDTA, 0,01% v/v Tween-20, pH 8,0. | ||
| 6.1.4.3 | Buffer B | 50 mM Tris; 500 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5% v/v glycerol; 0,01% v/v Tween-20, pH 8,0 | ||
| 6.1.4.4 | Buffer C | 20 mM Tris; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM ATP; 0,01% v/v Tween-20; 5% v/v glycerol, pH 8,0 | ||
| 6.1.4.5 | Buffer D | 50 mM Tris; 500 mM NaCl; 5% v/v glycerol; 5 mM EDTA; 0,5% w/v CHAPS, pH 8,0 | ||
| 6.1.4.6 | Elutiebuffer | 50 mM Tris; 500 mM NaCl; 5% v/v glycerol; 0,5% zonder CHAPS; 0,2 mg/ml DYKDDDDK-peptide, pH 8,0 | ||
| 6.1.6 | Regeneratiebuffer | 0,1 M glycine HCl, pH 3,5; 0,01% v/v Tween-20 | ||
| 6.2.1 | SEC-buffer | 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5% v/v glycerol, 0,5% w/v CHAPS, 1 mM TCEP | ||
| 7.3 | SEC-MALS Buffer | 50 mM HEPES, pH 7,2, 500 mM NaCl, 5% v/v glycerol, 0,5% w/v CHAPS | ||
| 8.7 | Oplossing voor bewaring | 40% v/v methanol en 7% v/v azijnzuur | ||
| 9.4.2 | Coomassie Kleuring Oplossing | 0,01% w /v Coomassie G250, 50% v/v/ methanol, 10% v/v azijnzuur | ||
| 9.5.1 | Oplossing voor reparatie | 50% v/v methanol, 10% v/v azijnzuur, 50 μL formaldehyde/100 ml oplossing | ||
Tabel 1: Samenstelling van buffers en oplossingen
| Stappen | HTT-concentratie (mg/ml) | Totaal volume (ml) | HTT-gehalte (mg) | HTT-opbrengst per cel (pg/cel) | % Opbrengst |
| Supernatant | 0.1792 | 220 | 39.4 | 4.4 | 100 |
| Anti-vlag | 1.524 | 8.6 | 13.1 | 1.47 | 33.4 |
| SECONDE | 0.91 | 3.9 | 3.54 | 0.4 | 9.1 |
Tabel 2: HTT-opbrengst van een 2 L HEK293 pellet getransfecteerd met pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-Flag. Afkortingen: FL Q23-HTT = full-length huntingtine-eiwit met 23 glutamineresiduen; TEV = tabaksets virus splitsingsplaats; SEC = grootte-uitsluitingschromatografie.
| HTT-voorbeeld | HTT-opbrengst (mg/L) | Gemiddelde Zuiverheid (%) | ||
| BMA | Een280 | |||
| 1 | FL DEx1-HTT (N=3) | 0.67-1.30 | 0.69-1.18 | 99.3 |
| 2 | FL Q23-HTT (N=3) | 0.25-0.92 | 0.28-0.98 | 96.9 |
| 3 | FL Q48-HTT (N = 3) | 0.28-1.15 | 0.38-1.16 | 97.4 |
| 4 | FL Q73-HTT (N = 3) | 0.58-1.05 | 0.57-0.97 | 98.8 |
Tabel 3: Samenvatting van de eiwitopbrengst van vier FL HTT-variantzuiveringen en hun uiteindelijke zuiverheid. Afkorting: FLL HTT = full-length huntingtine eiwit.
| HTT-voorbeeld | Een | D | M |
| FL Q23-HTT | 4.2-6.9% | 18.7-29.3% | 66.5-76.0% |
| FL Q48-HTT | 4.0-9.4% | 10.6-17.8% | 73.6-85.4% |
| FL Q73-HTT | 2.0-14.0% | 16.9-24.6% | 65.1-81.1% |
Tabel 4: Samenvatting van het representatieve aggregaat-, dimeer- en monomeergehalte van FL HTT-varianten uit de zuivering. Afkortingen: FL HTT = full-length huntingtine-eiwit; A = aggregaat; D = dimeer; M = monomeer; SEC = grootte-uitsluitingschromatografie.
Aanvullende figuur S1: Western blot-analyse na tev-proteasevertering. Gezuiverde FL Q23-HTT en FL Q48-HTT werden uitgevoerd op SDS-PAGE, overgebracht naar PVDF-membranen en geanalyseerd door western blotting na TEV digest. Primaire antilichamen die werden gebruikt waren anti-Flag M2 (Flag tag), MAB5492 (HTT aa 1-82), MAB3E10 (HTT aa 997-1,276) en MAB2168 (HTT aa 2,146-2,541). Baan 1, Eiwitstandaard; Baan 2, Q23-HTT-TEV-vlag; Baan 3, Q48-HTT-TEV-vlag; Baan 4, Q23-HTT-TEV-Flag behandeld met TEV-protease om 1:5, 's nachts bij 4 °C; Baan 5, Q48-HTT-TEV-Flag behandeld met TEV-protease om 1:5, 's nachts bij 4 °C. Afkortingen: FL HTT = full-length huntingtine-eiwit; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese; TEV = tabaksetsvirus; PVDF = polyvinylideenfluoride. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2: SEC-MALS-analyse van FL HTT-varianten die worden onderworpen aan vries-dooicycli. Gezuiverde Q23-HTT (A) en Q48-HTT (B) werden bevroren bij -80 °C en tot 6 keer ontdooid bij kamertemperatuur. Q23-HTT en Q48-HTT na de eerste vries-dooi en de zesde vries-dooicycli werden vervolgens geanalyseerd door SEC-MALS. Een lichte afname van de monomeerfractie en een toename van dimer- en oligomeerfracties van hoge orde werden waargenomen door lichtverstrooiing na herhaalde vries-dooicycli. Piekposities van voorspeld monomeer, dimeer en oligomeer van hoge orde worden aangegeven. Afkortingen: FL HTT = full-length huntingtine-eiwit; O = oligomeer; D = dimeer; M = monomeer; SEC-MALS = Grootte-uitsluitingschromatografie met multi-hoek lichtverstrooiing. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S3: SDS PAGE van FL HTT-varianten die worden onderworpen aan vries-dooicycli. Gezuiverde Q23-HTT (banen 2-7) en Q48-HTT (rijstroken 9-14) werden bevroren bij -80 °C en tot 6 keer ontdooid bij kamertemperatuur. Aliquots van Q23-HTT en Q48-HTT werden na elke vries-dooicyclus opgeslagen en vervolgens geanalyseerd door SDS PAGE. Er werd geen toename van aggregaat- of afbraakproducten waargenomen; de monsters werden als stabiel beschouwd en >95% zuiver door banddensitometrie. Afkortingen: FL HTT = full-length huntingtine-eiwit; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 1: FPLC 15 ml anti-FLAG HTT-script. Afkortingen = FPLC = snelle eiwitvloeistofchromatografie; HTT = huntingtine-eiwit. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2: FPLC-SEC_MALS HTT-script. Afkortingen: SEC-MALS = Grootte-uitsluitingschromatografie met multi-angle lichtverstrooiing; FPLC = snelle eiwitvloeistofchromatografie; HTT = huntingtine-eiwit. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
We beschrijven hier een transiënte transfectie-, expressie- en zuiveringsmethode om meerdere FL HTT-eiwitconstructen te genereren met geschikte zuiverheid en homogeniteit voor gebruik als normen voor immunoassay en MS-testontwikkeling, controles voor western blot-analyse en voor structuurfunctiestudies. Deze transiënte expressiemethode is schaalbaar en veelzijdig en stelt de gebruiker in staat om hoeveelheden FL HTT-varianten met een lage milligram efficiënter te genereren dan met behulp van stabiele cellijnen of virusgebaseerde methoden die eerder zijn beschreven 21,22,23,24. Routinematig kan 2-5 mg sterk gezuiverde FL HTT worden gegenereerd uit een eiwitproductie op schaal 2 L in minder dan een week met behulp van de transiënte expressiemethode zodra het plasmide is geconstrueerd, met een typische opbrengst van 1-2,5 mg FL HTT per liter celcultuur.
De hier beschreven transiënte expressiemethode overwint vele obstakels in stabiele cellijnexpressie, zoals de lange tijd die nodig is om cellijnen vast te stellen en moeilijkheden bij opslag en onderhoud van stabiele cellijnen. PEI is ook relatief goedkoop in vergelijking met andere transfectiereagentia op de markt, waardoor grootschalige transfectie economisch haalbaar is. Er zijn ook beperkingen in het protocol: transfectie-efficiëntie hangt grotendeels af van de kwaliteit van de plasmiden, optimale celgroei en hoe goed PEI wordt opgeslagen en bereid. Operators moeten speciale zorg besteden aan en kwaliteitscontroles uitvoeren in die kritieke stappen om een drastische daling van de eiwitopbrengst te voorkomen. Anti-FLAG hars die in het protocol wordt gebruikt, is ook relatief duur en vertoont een verminderde vangst van FL HTT na verschillende zuiveringen en regeneraties. Sommige onderzoekers vinden het misschien praktischer om over te schakelen naar een andere tag om een robuustere regeneratie van de affiniteitshars mogelijk te maken.
Verschillende cellijnen en expressiecondities werden getest om FL HTT-expressieniveaus te optimaliseren. HEK293-cellen werden gekozen voor de expressie van FL HTT vanwege de hoge expressie van eiwit en het gebruiksgemak in een suspensiecultuurformaat, waardoor de methode geschikt is voor grootschalige expressie in shakers of bioreactoren. Een hoger FL HTT-eiwitexpressieniveau kan worden bereikt bij lagere kweektemperaturen zoals 32 °C in plaats van de gebruikelijke temperatuur van 37 °C. Het is mogelijk dat de lagere temperatuur de eiwitsynthese vertraagt en een correcte vouwing van FL HTT40 bevordert. Dit fenomeen is echter niet specifiek voor FL HTT of de geteste cellijnen. De verlaagde posttransfectietemperatuur is op grote schaal gebruikt bij farmaceutische eiwitexpressie in CHO-cellen. Hoewel het mechanisme niet volledig wordt begrepen, wordt gedacht dat lage temperaturen de celcyclus in de G1-fase stoppen en cellulaire energie omleiden naar eiwitproductie41.
Htt over de volledige lengte gezuiverd uit zoogdiercellen co-elutes met de chaperonne Hsp7024, en Mg-ATP wasstappen kunnen het Hsp70-eiwit verwijderen. Interessant is dat co-geëlueerde Hsp70 niet wordt waargenomen in FL HTT gezuiverd van een insectencelexpressiesysteem 21,22,23. Dit kan een verschil weerspiegelen in de PTM's van FL HTT of heat shock eiwitreacties op de overexpressie van FL HTT in zoogdier- en insectencellen. Zodra het recombinante eiwit is ontdaan van Hsp70, zijn niet-ionische detergentia zoals CHAPS of DDM nodig om de monomere vorm van FL HTT te stabiliseren.
De oligomerisatietoestanden van FL HTT-varianten werden geanalyseerd met behulp van Blue Native PAGE en SEC-MALS. Een kleine fractie van dimerische en hogere orde oligomere HTT was aanwezig wanneer geanalyseerd door Blue Native PAGE of SEC-MALS. Van belang is dat hoger geordende oligomeren gevormd door FL HTT niet lijken te correleren met polyQ-lengte, en zelfs de Exon1-deletiemutant vertoont een vergelijkbare oligomeer-dimer-monomeerverhouding. De werkelijke verschillen in oligomeergehalte tussen deze constructen zijn waarschijnlijk te wijten aan kleine verschillen in de productie en behandeling van elke batch. In tegenstelling tot aggregaten en fibrillen gevormd door HTT Exon1 40,41, bleven de hoger geordende oligomeren van FL HTT oplosbaar en konden ze worden geanalyseerd door SEC en Native PAGE.
Gezuiverde monomere FL HTT is slechts relatief stabiel. Langdurige opslag bij 4 °C, korte incubaties bij kamertemperatuur of concentraties > 1 mg/ml zullen allemaal monomere FL HTT omzetten in dimerische en hoger geordende oligomere vormen, ook al is er onder die omstandigheden geen zichtbare neerslag waargenomen. Gezuiverde monomere FL HTT gehandhaafd op ≤1 mg / ml bleef relatief stabiel bij -80 ° C in opslagbuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, 5% v / v glycerol, 0,5% w / v CHAPS en 5 mM DTT) zoals eerder beschreven24. Tot 6 vries-dooicycli van FL HTT bereid en op deze manier opgeslagen veroorzaakten geen zichtbare neerslag van het eiwit, hoewel een lichte verschuiving naar een hogere oligomere toestand werd waargenomen door SEC-MALS (aanvullende figuur S2). Monsters werden ook geanalyseerd door SDS PAGE na herhaalde vries-dooicycli. Er werden geen zichtbare neerslagen waargenomen; sds-PAGE (supplemental figure S3) heeft geen aggregaten of aanvullende afbraakproducten gezien. De stabiliteit op lange termijn van gezuiverde FL HTT wordt nog onderzocht. Bij gebrek aan sluitende langetermijngegevens raden we aan om gezuiverde FL HTT bij -80 °C niet langer dan 6 maanden te bewaren.
Hoogwaardige, recombinante FL HTT-eiwitvarianten en de methoden om ze te produceren zijn zeer gewild bij de ZvH-onderzoeksgemeenschap. Deze eiwitten worden gebruikt als immunoassay- en MS-analytische normen, in structurele studies en voor de ontwikkeling van nieuwe FL HTT-specifieke testen. De grootschalige transiënte expressiemethoden die hier worden beschreven, hebben consequent milligramhoeveelheden FL HTT-varianten geproduceerd met >95% zuiverheid, wat essentiële hulpmiddelen biedt voor HTT-studies. De productie van tientallen milligrammen sterk gezuiverde FL HTT polyQ-varianten en andere mutanten ter ondersteuning van ZvH-onderzoek is routine geworden.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben met de inhoud van dit artikel.
Acknowledgments
We bedanken het Department of Pharmaceutical Sciences, The State University of New York in Buffalo, voor het uitvoeren van MS-analyse van HTT. Dit werk was een samenwerking met de CHDI Foundation. We bedanken in het bijzonder Elizabeth M. Doherty; Ignacio Munoz-Sanjuan; Douglas Macdonald, CHDI Stichting; en Rory Curtis, Curia, voor hun onschatbare inbreng tijdens de voorbereiding van dit manuscript. We zijn ook Michele Luche, Mithra Mahmoudi en Stephanie Fox dankbaar voor hun steun aan deze onderzoeksinspanning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 kDa concentrator-Amicon | Millipore | UFC910096 | Protocol Section Number-6.2.4 |
| 20x blue native PAGE running buffer | Invitrogen | BN2001 | Protocol Section Number-8.1 |
| 20x TBS | Thermo Fisher | PI28358 | Protocol Section Number-5.1 |
| 4x blue native PAGE sample buffer | Invitrogen | BN2003 | Protocol Section Number-8.3 |
| 4x LDS loading buffer | Invitrogen | NP0007 | Protocol Section Number-5.3 |
| 5 L Erlenmeyer flasks | Corning | 431685 | Protocol Section Number-4.2 |
| Agarose gel extraction kit | Qiagen | 28704 | Protocol Section Number-2.2 |
| Anti-clumping agent | Thermo Fisher | 0010057AE | Protocol Section Number-4.8 |
| anti-FLAG M2 affinity gel | Sigma | A2220 | Protocol Section Number-6.1.1 |
| anti-FLAG M2 | Sigma | F3165 | Protocol Section Number-5.7 |
| Anti foam-Excell anti foam | Sigma | 59920C-1B | Protocol Section Number-4.8 |
| ATP | Sigma | A6419 | Protocol Section Number-6.1.4.4 |
| BEH 450 SEC | Waters | 186006851 | 2.5 µm x 4.6 mm x 150 mm Protocol Section Number-7.3 |
| blue native PAGE 5% G-250 sample additive | Invitrogen | BN2004 | Protocol Section Number-8.3 |
| carbenicillin | Thermo Fisher | 10177012 | Protocol Section Number-2.5 |
| centrifuge - Sorvall Lynx 6000 | Thermo Fisher | 75006590 | Protocol Section Number-6.1.3 |
| Cell Counter - ViCELL | BECKMAN COULTER | Protocol Section Number-4.3 | |
| CHAPS | Anatrace | C316S | Protocol Section Number-6.1.4.6 |
| Competent E. coli cells-TOP10 | Invitrogen | C404010 | Protocol Section Number-2.4 |
| digitonin | Sigma | D141 | Protocol Section Number-5.1 |
| differential refractive index detector | Wyatt | Protocol Section Number-7.1 | |
| DYKDDDDK peptide | Genscript | Peptide synthesis service Protocol Section Number-6.1.4.6 |
|
| EDTA | Sigma | EDS | Protocol Section Number-5.1 |
| EndoFree Plasmid Giga Kit | Qiagen | 12391 | Protocol Section Number-3.3 |
| Endotoxin free water | Cytiva | SH30529.03 | Protocol Section Number-4.1 |
| endotoxin quantification kit-CRL Endosafe Nexgen-PTS detection system | Charles River | PTS150K | Protocol Section Number-3.4 |
| fixed angle rotor A23-6x100 rotor | Thermo Fisher | 75003006 | Protocol Section Number-6.1.3 |
| FPLC software- Unicorn 6.2 | Cytiva | Protocol Section Number-6.1.4 | |
| Gene synthesis | Genscript | Gene synthesis service Protocol Section Number-1.2 |
|
| Glycerol | Fisher Scientific Glycerol (Certified ACS) | G33-4 | Protocol Section Number-5.6 |
| Growth Medium-Expi293 expression medium | Thermo Fisher | A1435102 | Protocol Section Number-4.2 |
| HEK293 cells | Thermo Fisher | R79007 | Protocol Section Number-4 |
| high shear homogenizer-Microfluidizer | MicroFluidics | LM10 | Protocol Section Number-6.1.3 |
| HPLC - 1260 infinity II Bio-Insert HPLC | Agilent | Protocol Section Number-7.1 | |
| Image Studio | LiCor | Image analysis software Protocol Section Number-5.1 |
|
| MAB2166 | Sigma | MAB2166 | Protocol Section Number-5.7 |
| MAB2168 | EMD | MAB2168 | Protocol Section Number-5.7 |
| MAB3E10 | Santa Cruz | SC-47757 | Protocol Section Number-5.7 |
| MAB4E10 | Santa Cruz | SC-7757 | Protocol Section Number-5.7 |
| MAB5490 | Sigma | MAB5490 | Protocol Section Number-5.7 |
| MAB5492 | Sigma | MAB5492 | Protocol Section Number-5.7 |
| MAB8A4 | Santa Cruz | SC-47759 | Protocol Section Number-5.7 |
| multi-angle light scattering detector | Wyatt | Protocol Section Number-7.1 | |
| NativeMark Unstained Protein Standard | Invitrogen | LC0725 | Protocol Section Number-8.4 |
| NaCl | Sigma | S9888 | Protocol Section Number-5.6 |
| NheI | New England Biolab | R0131S | Hi-Fi version available Protocol Section Number-2.2 |
| NuPAGE 3–8% Tris acetate gels | Invitrogen | EA0375PK2 | Protocol Section Number-5.4 |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running buffer | Invitrogen | LA0041 | Protocol Section Number-5.4 |
| PEI 25K | Polysciences | 23966-1 | Protocol Section Number-4.1 |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15070063 | Protocol Section Number-4.2 |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Cytiva | SH30256.02 | Protocol Section Number-4.5 |
| plasmid miniprep kit | Qiagen | 27104 | Protocol Section Number-2.6 |
| PmeI | New England Biolab | R0560S | Protocol Section Number-2.2 |
| precast Bis-tris gel- 3-12% NativePAGE Novex Bis-Tris Gel | Invitrogen | BN1003BOX | Protocol Section Number-8.4 |
| protease inhibitor cocktail | GoldBio | GB-331-1 | Protocol Section Number-5.1 |
| SEC-MALS analysis software - Astra 7 | Wyatt Technology | Protocol Section Number-7.6 | |
| secondary antibody -IRdye 800 CW goat anti-mouse IgG | LiCor | 926-32210 | Protocol Section Number-5.9 |
| Superose 6 pg XK 16/70 | Cytiva | 90100042 | Protocol Section Number-6.2 |
| Tris base | Fisher | BP152 | Protocol Section Number-5.6 |
| Tween-20 | Thermo Fisher | AAJ20605AP | Protocol Section Number-6.1.1 |
| UV spectrometer - Nanodrop 8000 | Thermo Fisher | ND-8000-GL | Protocol Section Number-2.2 |
| XK26/100 | Cytiva | 28988951 | Protocol Section Number-6.1.1 |
References
- Walker, F. O.
- McColgan, P., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: a clinical review. European Journal of Neurology. 25 (1), 24-34 (2018).
- Duyao, M., et al. Trinucleotide repeat length instability and age of onset in Huntington's disease. Nature Genetics. 4 (4), 387-392 (1993).
- MacDonald, M. E., et al. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Nasir, J., et al. Targeted disruption of the Huntington's disease gene results in embryonic lethality and behavioral and morphological changes in heterozygotes. Cell. 81 (5), 811-823 (1995).
- Dragatsis, I., Levine, M. S., Zeitlin, S. Inactivation of Hdh in the brain and testis results in progressive neurodegeneration and sterility in mice. Nature Genetics. 26 (3), 300-306 (2000).
- Anne, S. L., Saudou, F., Humbert, S. Phosphorylation of huntingtin by cyclin-dependent kinase 5 is induced by DNA damage and regulates wild-type and mutant huntingtin toxicity in neurons. Journal of Neuroscience. 27 (27), 7318-7328 (2007).
- Dietrich, P., Johnson, I. M., Alli, S., Dragatsis, I. Elimination of huntingtin in the adult mouse leads to progressive behavioral deficits, bilateral thalamic calcification, and altered brain iron homeostasis. PLoS Genetics. 13 (7), 1006846 (2017).
- Dragatsis, I., et al. Effect of early embryonic deletion of huntingtin from pyramidal neurons on the development and long-term survival of neurons in cerebral cortex and striatum. Neurobiology of Disease. 111, 102-117 (2018).
- Benn, C. L., et al. Huntingtin modulates transcription, occupies gene promoters in vivo, and binds directly to DNA in a polyglutamine-dependent manner. Journal of Neuroscience. 28 (42), 10720-10733 (2008).
- Saudou, F., Humbert, S.
- Davies, S. W., et al. Formation of neuronal intranuclear inclusions underlies the neurological dysfunction in mice transgenic for the HD mutation. Cell. 90 (3), 537-548 (1997).
- DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).
- Gutekunst, C. A., et al. Nuclear and neuropil aggregates in Huntington's disease: Relationship to neuropathology. Journal of Neuroscience. 19 (7), 2522-2534 (1999).
- Hodgson, J. G., et al. A YAC mouse model for Huntington's disease with full-length mutant huntingtin, cytoplasmic toxicity, and selective striatal neurodegeneration. Neuron. 23 (1), 181-192 (1999).
- Hoffner, G., Djian, P. Polyglutamine aggregation in Huntington disease: does structure determine toxicity. Molecular Neurobiology. 52 (3), 1297-1314 (2015).
- Waldvogel, H. J., Kim, E. H., Tippett, L. J., Vonsattel, J. P. G., Faull, R. L. M.
- Kim, M. Beta conformation of polyglutamine track revealed by a crystal structure of huntingtin N-terminal region with insertion of three histidine residues. Prion. 7 (3), 221-228 (2013).
- Hoop, C. L., et al. Huntingtin exon 1 fibrils feature an interdigitated β-hairpin-based polyglutamine core. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1546-1551 (2016).
- Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. An intein-based strategy for the production of tag-free huntingtin exon 1 proteins enables new insights into the polyglutamine dependence of Httex1 aggregation and fibril formation. Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).
- Seong, I. S., et al. Huntingtin facilitates polycomb repressive complex 2. Human Molecular Genetics. 19 (4), 573-583 (2009).
- Li, W., Serpell, L. C., Carter, W. J., Rubinsztein, D. C., Huntington, J. A. Expression and characterization of full-length human huntingtin, an elongated HEAT repeat protein. Journal of Biological Chemistry. 281 (23), 15916-15922 (2006).
- Vijayvargia, R., et al. Huntingtin's spherical solenoid structure enables polyglutamine tract-dependent modulation of its structure and function. eLife. 5, 11184 (2016).
- Huang, B., et al. Scalable production in human cells and biochemical characterization of full-length normal and mutant huntingtin. PLoS ONE. 10 (3), 0121055 (2015).
- Guo, Q., et al. The cryo-electron microscopy structure of huntingtin. Nature. 555 (7694), 117-120 (2018).
- Harding, R. J., et al. Design and characterization of mutant and wildtype huntingtin proteins produced from a toolkit of scalable eukaryotic expression systems. Journal of Biological Chemistry. 294 (17), 6986-7001 (2019).
- Harding, R. J., et al. HAP40 orchestrates huntingtin structure for 1 differential interaction with polyglutamine 2 expanded exon 1. bioRxiv. , (2021).
- Huang, B., et al. Pathological polyQ expansion does not alter the conformation of the Huntingtin-HAP40 complex. Structure. 29 (8), 804-809 (2021).
- Colin, E., et al. Huntingtin phosphorylation acts as a molecular switch for anterograde/retrograde transport in neurons. EMBO Journal. 27 (15), 2124-2134 (2008).
- Thompson, L. M., et al. IKK phosphorylates Huntingtin and targets it for degradation by the proteasome and lysosome. Journal of Cell Biology. 187 (7), 1083-1099 (2009).
- Ratovitski, T., et al. Post-translational modifications (PTMs), identified on endogenous Huntingtin, cluster within proteolytic domains between HEAT repeats. Journal of Proteome Research. 16 (8), 2692-2708 (2017).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of western blot data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
- Tarazona, M. P., Saiz, E. Combination of SEC/MALS experimental procedures and theoretical analysis for studying the solution properties of macromolecules. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 56 (1-3), 95-116 (2003).
- Folta-Stogniew, E. Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors. Methods in Molecular Biology. 328, Clifton, N.J. 97-112 (2006).
- McMeekin, T. L., Wilensky, M., Groves, M. L. Refractive indices of proteins in relation to amino acid composition and specific volume. Biochemical and Biophysical Research Communications. 7 (2), 151-156 (1962).
- Atwal, R. S., et al. Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity. Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).
- Kegel-Gleason, K. B. Huntingtin interactions with membrane phospholipids: Strategic targets for therapeutic intervention. Journal of Huntington's Disease. 2 (3), 239-250 (2013).
- Michalek, M., Salnikov, E. S., Werten, S., Bechinger, B. Membrane interactions of the amphipathic amino terminus of huntingtin. Biochemistry. 52 (5), 847-858 (2013).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schägger, H.
- Nissley, D. A., O'Brien, E. P. Altered co-translational processing plays a role in huntington's pathogenesis-A hypothesis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 54 (2016).
- Kumar, N., Gammell, P., Clynes, M. Proliferation control strategies to improve productivity and survival during CHO based production culture: A summary of recent methods employed and the effects of proliferation control in product secreting CHO cell lines. Cytotechnology. 53 (1-3), 33-46 (2007).
