Summary
Vi tillhandahåller skalbara protokoll som täcker konstruktionsdesign, övergående transfektion och uttryck och rening av humana huntingtinproteinvarianter i full längd i HEK293-celler.
Abstract
Fullängds huntingtin (FL HTT) är ett stort (aa 1-3,144), allestädes närvarande uttryckt, polyglutamin (polyQ) -innehållande protein med en massa av cirka 350 kDa. Medan den cellulära funktionen hos FL HTT inte är helt förstådd, är en mutant expansion av polyQ-kanalen ovanför ~ 36 upprepningar associerad med Huntingtons sjukdom (HD), med polyQ-längden som korrelerar ungefär med debutåldern. För att bättre förstå effekten av struktur på funktionen av mutant HTT (mHTT) krävs stora mängder av proteinet. Submilligramproduktion av FL HTT i däggdjursceller uppnåddes med användning av doxycyklininducerbart stabilt cellinjeuttryck. Proteinproduktion från stabila cellinjer har dock begränsningar som kan övervinnas med övergående transfektionsmetoder.
Detta dokument presenterar en robust metod för produktion av FL HTT med låg milligram och dess varianter från kodonoptimerade plasmider genom övergående transfektion med polyetylenimin (PEI). Metoden är skalbar (>10 mg) och ger konsekvent 1-2 mg/L cellodling av högrenad FL HTT. I överensstämmelse med tidigare rapporter befanns det renade lösningstillståndet för FL HTT vara mycket dynamiskt; Proteinet har en benägenhet att bilda dimerer och högordnade oligomerer. En nyckel till att bromsa oligomerbildningen är att arbeta snabbt för att isolera de monomera fraktionerna från de dimeriska och högordnade oligomerfraktionerna under storleksuteslutningskromatografi.
Storleksuteslutningskromatografi med multiangle ljusspridning (SEC-MALS) användes för att analysera dimer- och högre ordningens oligomerinnehåll i renad HTT. Ingen korrelation observerades mellan FL HTT polyQ-längd (Q23, Q48 och Q73) och oligomerinnehåll. Den exon1-borttagna konstruktionen (aa 91-3,144) visade jämförbar oligomeriseringsbenägenhet med FL HTT (aa 1-3,144). Produktions-, renings- och karakteriseringsmetoder med SEC / MALS-brytningsindex (RI), natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE), western blot, Native PAGE och Blue Native PAGE beskrivs häri.
Introduction
Huntingtons sjukdom (HD) är en sällsynt neurodegenerativ sjukdom som främst kännetecknas av ostadig och ofrivillig motorisk rörelse, liksom kognitiva och psykiatriska förändringar, såsom personlighetsförändringar och apati 1,2. HD är associerad med en expansion av CAG-repetitionskanalen som ligger i exon 1 av huntingtingenen (HTT) till mer än 35 upprepningar, med ett högre antal CAG-upprepningar som korrelerar med en tidigare debut av sjukdomen 3,4. Den translationella produkten av HTT, huntingtinproteinet (HTT), är inblandad i neuronal livskraft och hjärnans utveckling 5,6,7,8,9.
HTT är ett ställningsprotein som rapporteras delta i ett brett spektrum av cellulära processer, vesikeltransport, celldelning, ciliogenes och autofagi10,11. Den molekylära patogenesen av HD är dock inte helt klar, och identifieringen av viktiga proteininteractmedlemmar som förmedlar den patologiska effekten av polyQ-expanderad mHTT saknas. Viss forskning tyder på en vinst av toxisk funktion från mHTT som drivs av oligomeriseringsbenägenheten hos det expanderade HTT-proteinet, eftersom HTT-aggregat har identifierats i neuroner och glia hos HS-patienter och djurmodeller av sjukdomen 12,13,14,15,16,17 . För att driva på undersökningen av funktionen och strukturen hos FL HTT- och mHTT-varianter och förse forskare med högkvalitativa proteinstandarder för analysutveckling behövs en robust och skalbar tillförsel av homogent rekombinant protein.
På grund av sin storlek (aa 1-3,144, numrering baserad på polyQ-längd Q23), proteolytisk instabilitet och benägenhet att aggregera har FL HTT visat sig vara svårt att uttrycka och isolera som ett lösligt protein. Tidigare har exon 1-regionen (aa 2-90) av HTT uttryckts och renats i stor skala med hjälp av olika taggar som kan öka lösligheten av proteinet i Escherichia coli18,19,20. FL HTT uttrycktes och renades först i ett insektscelluttryckssystem med baculovirus 21,22, och lågupplösta 30 Å elektronmikroskopistrukturer (EM) av kemiskt tvärbundna FL Q23-HTT och Q78-HTT rapporterades23. Undersökningen av HTT-strukturen avancerades ytterligare när produktionen av FL Q17, Q46 och Q128-HTT med inbyggda posttranslationella modifieringar (PTM) uppnåddes i mänskliga celler med hjälp av stabila cellinjer eller adenovirusuttryckssystem24. Dessa studier tyder på att även om renad HTT huvudsakligen existerar i det monomera tillståndet, tenderar det också att bilda högordnade oligomerer och aggregat.
Analytisk ultracentrifugering av FL Q128-HTT, med en mycket expanderad polyQ-region, gav mer oligomera och aggregerade fraktioner än proteinet med den icke-expanderade polyQ-regionen24. Med hjälp av en stabil cellinje har en strategi framgångsrikt anpassats för att stabilisera FL HTT genom samuttryck med interaktionspartnern HAP40. En kryo-EM-struktur av FL HTT- och HAP40-komplexet har lösts med en genomsnittlig 4 Å-upplösning med hjälp av det renade proteinkomplexet (PDB: 6EZ8)25. Denna samuttrycksstrategi har framgångsrikt anpassats till ett baculovirussystem, och en serie högkvalitativa HTT-varianter med olika polyQ-längder har uttryckts och renats från insektsceller26. Sedan dess löstes och deponerades fler kryo-EM-strukturer av HTT-komplexet med varierande polyQ-längder och HAP40 och strukturer med högre upplösning i Protein Data Base27,28 (PDB: 7DXK, 7DXH, 6X9O).
Vi optimerade en transfektions- och uttrycksmetod i HEK293-celler, med polyetylenimin (PEI), för snabbt övergående uttryck av FL HTT. Som ett principbevis renades FL HTT-varianter innehållande 23 glutaminer (FL Q23-HTT) först och karakteriserades med hjälp av en modifiering av en reningsmetod som beskrivits tidigare24. Denna övergående transfektionsmetod är bekväm, mycket effektiv och skalbar; den kan producera renad HTT med utbyten på 1-2 mg / L, jämförbar med den stabila cellinjemetoden som rapporterats24. Eftersom proteinet produceras i en mänsklig cellinje är det mer sannolikt att den HTT som produceras har inhemska humana PTM när de utsätts för masspektrometriproteomikanalys 11,29,30,31. Milligrammängder av FL Q48-HTT, FL Q73-HTT och exon1-raderade (ΔExon1-HTT) varianter av FL HTT producerades, vilket visar att den övergående uttrycksmetoden är särskilt användbar för att snabbt producera alternativa varianter av HTT utan att bero på den tidskrävande ansträngning som krävs för att upprätta stabila cellinjer för produktion.
Följande protokoll exemplifierar standardmetoden som används i dessa författares laboratorium för cellodling, transfektion, proteinrening och postpurifieringsproteinkarakterisering för att producera FL Q23-HTT från en 2 L cellodling. Protokollet kan skalas upp till större kulturer eller anpassas för att rena andra HTT-varianter. Upp till 10 L cellkulturer av FL HTT och olika plats- eller trunkeringsmutationer av HTT- och HTT-homologer har utförts framgångsrikt i laboratoriet med samma protokoll. Renad FL HTT innehåller en hög andel monomerer tillsammans med dimerer och oligomerer av högre ordning. Samma aggregerade profil observeras bland de varianter som produceras (Q23, Q48, Q73 och borttagna Exon1). Eftersom aggregering kan ske när rätt skötsel inte tas, genomfördes en formulerings- och frys-tina stabilitetsstudie för att identifiera de bästa förutsättningarna för proteinhantering. Metoder, såsom Blue Native PAGE och SEC/MALS-RI, beskrivs också för att analysera HTT-oligomerinnehållet som en del av kvalitetskontrollprocessen. För att gynna HS-forskarsamhället deponeras också plasmider och HTT-proteiner som beskrivs i denna studie i HD Community Repository vid Coriell Institute (www.coriell.org/1/CHDI).
Protocol
1. Design och produktion av konstruktioner för FLAG-taggade HTT-däggdjursuttryck
- Hämta den mänskliga HTT-proteinsekvensen i full längd (P42858) från National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
OBS: Forskare måste vara bekanta med HTT: s domänorganisationer och upprätthålla HTT-kärn 3D-struktur när de utformar konstruktioner för HTT-mutanter. - Begär en gensyntestjänst för att utföra kodonoptimering för mänskligt celluttryck baserat på sekvensen av P42858. Ändra polyQ-numret från Q16 till önskad Q-längd (Q23 valdes som den första konstruktionen här) och syntetisera HTT-genen i full längd.
OBS: Den syntetiserade kodonoptimerade Q23-HTT-konstruktionen i full längd levererades som en insats i pUC18-plasmiden i denna studie. - Valfritt: Lägg till funktioner för att underlätta kloning av olika Q-längder och rening i konstruktionerna.
OBS: En klyvningsplats för tobaksetsvirus (TEV) och FLAG-reningstagg (AAAENLYFQGDYKDDDDK) lades till i C-terminaländen av konstruktionerna. Två HindIII-platser designades i konstruktionerna för att omfatta polyQ-regionen (översatt proteinsekvens ändras inte genom att införa HindIII-platser). Detta gör det möjligt för forskaren att ändra HTT: s Q-längd genom att begränsa enzymets matsmältning och ligering utan att resyntetisera hela HTT-genen .
2. Klona de syntetiserade HTT-konstruktionerna till pcDNA3.1.
- Digest 5 μg pUC18-Q23-HTT och 5 μg pcDNA3.1 med 2 μL NheI och PmeI vardera vid 37 °C i 2 timmar.
- Kör en 0,5% w / v agarosgel och rena Q23-HTT-fragmentet och den smälta pcDNA3.1-vektorn med hjälp av ett agarosgelextraktionssats. Kvantifiera koncentrationerna av renat DNA med OD280 med hjälp av en UV-spektrometer som kan mäta mikroliter prover.
OBS: OD260/280 från 1,8 till 2,0 observeras vanligtvis. Den syntetiserade FL HTT levereras som en insats med NheI och PmeI i båda ändarna i en pUC18-plasmid. Använd andra restriktionsenzymer om HTT syntetiseras annorlunda. - Använd 10 ng smält pcDNA3.1-vektor i reaktionen. Ligate de renade DNA: erna vid 1: 1 (HTT: pcDNA3.1) molärt förhållande i en 10 μL reaktion vid rumstemperatur i 5 minuter med användning av T4 DNA-ligas.
- Omvandla den ligerade produkten till kompetenta E. coli-celler (se materialförteckningen) med hjälp av det protokoll som anges av ligastillverkaren.
- Plocka upp 6 enskilda kolonier och gör över natten kulturer i 4-6 ml LB kompletterat med 100 μg / ml karbenicillin vid 37 ° C.
- Tilldela 1 ml från varje nattkultur. Tillsätt glycerol till 25 % v/v och spara glycerolbuljongen vid -80 °C. Rena den återstående nattkulturen med hjälp av ett mini-prep-kit enligt stegen som anges i bruksanvisningen.
- Sekvensera alla plasmider med hjälp av sekvenseringsprimrar som sträcker sig över plasmidens transkriptionsområde. Välj en glycerolbuljong som har rätt sekvens som huvudglycerolbuljong och kassera resten.
- Valfritt: Begär en gensyntestjänst för att syntetisera DNA med de olika Q-längderna (Q48, Q73 och Exon1) som sträcker sig över de två HindIII-platserna i pcDNA3.1-Q23-HTT-plasmiden. Smält pcDNA3.1-Q23-HTT och de nyligen syntetiserade DNA: erna med HindIII och religera dem med T4-ligas som i steg 2.2-2.7 för att göra FL HTT med olika polyQ-längder i pcDNA3.1-plasmiden.
OBS: Plasmidkonstruktioner som används i denna studie är också tillgängliga direkt från HD Community Repository vid Coriell Institute (www.coriell.org/1/CHDI); se materialförteckningen.
3. GIGA prep endotoxinfritt plasmid-DNA för storskalig transfektion
- Stryk de bakteriella glycerollagren av pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG på en LB-agarplatta med karbenicillin (100 μg / ml). Inkubera plattan vid 37 °C i 16–24 timmar tills enstaka kolonier uppträder.
- Plocka upp en enda koloni, inokulera en 5 ml startkultur i ett rikt medium formulerat för plasmidförstärkning med karbenicillin (100 μg / ml) och växa vid 37 ° C i 8 timmar.
- Välj ett endotoxinfritt GIGA-plasmidreningssats. Följ stegen som beskrivs i manualen för plasmiden GIGA-kit för att rena pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG-plasmiden.
- Mät plasmidendotoxinnivåerna med hjälp av ett limulus amoebocytlysat (LAL)-baserat endotoxinkvantifieringskit. Följ proceduren som anges i tillverkarens manual.
OBS: En högkvalitativ plasmidrening på låg endotoxinnivå är avgörande för att uppnå god transfektionseffektivitet. Med hjälp av detta protokoll kan 20-40 mg plasmid (supercoiled form >80%) erhållas per L bakteriekultur vid plasmidkoncentrationer > 4 mg / ml. En korrekt renad plasmid bör ha en endotoxinnivå < 30 EU/mg. OD260/280 från 1,8 till 2,0 observeras vanligtvis.
4. Storskalig transfektion av 2 liter HEK293-celler med polyetylenimin (PEI)
- Tillsätt 1 g PEI 25K till 1 L endotoxinfritt vatten under omrörning. Justera pH-värdet till 2,0 med 100 mM HCl och rör om tills all PEI 25K har lösts upp. Justera pH-värdet till 7,0 med 100 mM NaOH-lösning och filtrera genom ett 0,2 μm-filter. Alikvot och förvaras vid -20 °C i upp till ett år.
OBS: Alikvoter av PEI kan förvaras vid 4 °C i upp till två veckor men bör aldrig frysas igen efter upptining. - Föröka HEK293-celler i tillväxtmediet (se materialförteckningen) kompletterat med penicillin-streptomycin (slutlig koncentration vid 5 U/ml för penicillin och 5 μg/ml för streptomycin) i en fuktad shakerinkubator vid 37 °C, 90 rpm, 5%CO2 i 18-24 timmar. Späd cellerna till 2 liter med en densitet av ~1,2 × 106 celler/ml med hjälp av tillväxtmediet i 5 L Erlenmeyerkolvar en dag före transfektionen.
- Fortsätt att odla cellerna vid 37 °C, 90 rpm, 5%CO2 i 18-24 timmar. Mät cellparametrarna med hjälp av en automatisk cellräknare som kan mäta celldensitet och viabilitet enligt bruksanvisningen.
OBS: Celltätheten bör fördubblas och livskraften bör vara >95%. Celltätheten före transfektionen bör vara ungefär 2,0 × 10 6-2,4 × 106 celler/ml. Späd cellerna till önskad densitet före transfektion vid behov. - Beräkna de mängder plasmid och PEI som krävs för transfektionen; använd 1 mg plasmid och 3 mg PEI för transfektion av varje liter cellodling. Fördela 2 mg plasmid och 6 mg PEI som behövs för en 2 L transfektion.
- Späd plasmiden och PEI individuellt i en volym fosfatbuffrad saltlösning som är lika med 1/20av den totala volymen cellodling (100 ml vardera för en 2 L transfektion) och inkubera vid rumstemperatur i 5 minuter. Blanda den utspädda plasmiden och PEI genom att försiktigt virvla och inkubera blandningen vid rumstemperatur i 30 minuter.
OBS: Blandningen kommer att se något grumlig ut efter inkubation. - Tillsätt blandningen till cellkulturen och virvla försiktigt för att blanda dem.
- Odla cellerna vid 37 °C, 5% CO2, 90 rpm i 24 timmar.
- Tillsätt 2 M natriumbutyratlösning till en slutlig koncentration av 2 mM. Tillsätt 1:1000 (v/v) klumpmedel och 1:1000 (v/v) antiskum till kulturen.
- Flytta kolven till en fuktad skakinkubator vid 32 °C, 90 rpm, 5% CO2 och fortsätt att växa i 48 timmar.
- Mät cellparametrarna, inklusive celldensitet och viabilitet, med hjälp av den automatiska cellräknaren enligt användarhandboken.
- Överför 2,0 × 10 6 celler (Vol = 2,0 × 106/celltäthet) i ett mikrocentrifugrör. Pelletera cellerna vid 2 000 × g i 1 min i en centrifug för western blotting i avsnitt 5.
- Skörda cellerna genom centrifugering vid 2 000 × g i 30 minuter och förvara cellpelleten vid -80 °C före rening.
5. SDS-PAGE och western blot av HEK293-celllysat för att uppskatta HTT-uttrycksnivån
- Ta en alikvot av 2,0 × 106 celler som tidigare frysts (steg 4.11) från storskalig transfektion av HEK293-cellodling. Tillsätt 250 μL Tris-buffrad saltlösning (TBS) kompletterad med 50 μg/ml digitonin, 5 mM EDTA och 1x proteashämmare och suspendera cellpelleten igen genom att aspirera flera gånger med pipett.
- Vrid rören försiktigt i 30 minuter vid 4 °C med hjälp av en minirotator för att lysera cellerna. Pelletera det olösliga materialet genom centrifugering vid 17 000 × g i 5 minuter.
- Tillsätt 1/3rd volymen av 4x reducerande litiumdodecylsulfat (LDS) laddningsbuffert till supernatanten och värm vid 70 ° C i 10 min.
- Ladda 5-20 μL celllysat på en prefabricerad 3-8% Tris-acetat PAGE-gel. Använd den gelkompatibla 1x Tris-acetat SDS-körbufferten och kör gelén i ett konstant spänningsläge vid 150 V i 60 minuter.
OBS: Tris-acetat SDS-PAGE användes för FL HTT-analys eftersom det genererar högre upplösning än andra typer av SDS-PAGE för proteiner med molekylvikt över 300 kDa. Proteiner som används i denna studie är också tillgängliga direkt från HD Community Repository vid Coriell Institute (www.coriell.org/1/CHDI); se materialförteckningen. - För att utföra western blotting, montera en överföringssmörgås med hjälp av ett överföringsbuffertekvilibrerat tjockt överföringspapper, ett metanolaktiverat polyvinylidenfluoridmembran (PVDF) och en SDS-PAGE-gel. Överför proteinerna till PVDF-membranet med en halvtorr western blotter enligt tillverkarens användarmanual.
OBS: Vanligtvis räcker det med 20-30 min vid 135 mA för ett membran på 10 cm x 10 cm. - Demontera överföringssmörgåsen och blockera membranet i TBST (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl och 0,1% v / v Tween-20) kompletterat med 5% w / v fettfri mjölk.
- Inkubera membranet på en vippa i 1 timme vid rumstemperatur med 15 ml primär antikropp (1:2 500 utspädning för monoklonal antikroppsantikropp och 1:2 000 för alla andra primära antikroppar).
OBS: Primära antikroppar som används i denna studie är anti-FLAG M2, MAB5492, MAB5490, MAB2166, MAB3E10, MAB4E10, MAB2168, MAB8A4 (se materialtabellen). - Tvätta membranet 3 x 5 min med 30-50 ml TBST.
- Inkubera membranet på en vippa med en fluorescerande färgämneskonjugerad get-antimus IgG sekundär antikropp vid 1:15 000, rumstemperatur, i 15 ml TBST innehållande 5% w/v torrmjölk.
- Visualisera de västra blottbanden på en fluorescerande avbildning med hjälp av våglängden som är specifik för den sekundära antikroppen. Kvantifiera bandsignalen med hjälp av programvaran som medföljer avbildaren enligt bruksanvisningen.
OBS: Kvantitativ western blotting kan utföras med renad HTT som standard. Ett linjärt standardintervall för HTT är instrumentspecifikt och etablerades i detta laboratorium från 25 ng till 250 ng HTT per körfält med hjälp av en anti-FLAG-antikropp. Den västra fläcken av HTT bör vara fri från nedbrytning; en total HTT-uttrycksnivå på 2-4 pg/cell observeras vanligtvis. Se ett tidigare publicerat protokoll32 för detaljer om hur man utför en kvantitativ western blot.
6. Snabb proteinvätskekromatografi (FPLC) rening av HTT med hjälp av anti-FLAG-kolonn och SEC
- Anti-FLAG-rening
- Uppskatta mängden FLAG-harts som behövs för rening (vanligtvis 12 ml anti-FLAG M2-affinitetsharts för rening av 2-4 L transfekterad cellodling). Packa 12–25 ml anti-FLAG-harts på en tom kolonn (se materialförteckningen) med FPLC med en flödeshastighet på 4 ml/min med buffert A (tabell 1). Justera kolvens höjd, så det finns inget mellanrum mellan kolvens ände och hartsbädden.
- Använd ett förhållande på 10 ml lysbuffert per 1 g cellpellet, tina och suspendera cellpelleten i kall lysbuffert (tabell 1).
- För cellsuspensionen en gång genom en högskjuvningshomogenisator vid 10 000 psi. Klargör lysatet genom centrifugering vid 20 000 × g i 1 timme i en centrifug utrustad med en kompatibel rotor med fast vinkel.
- Programmera FPLC (se materialförteckningen för programvaran som används i studien) och kör följande sekvenser.
- Ladda det klarade lysatet via provpumpen.
- Tvätta med 4 kolumnvolymer (CV) av buffert A (tabell 1).
- Tvätta med 4 CV av buffert B (tabell 1).
- Tvätta med 8 CV för buffert C (tabell 1).
- Tvätta med 3 CV för buffert D (tabell 1).
- Tvätta med 3 CV för elutionsbuffert (tabell 1).
- Analysera 10 μL av toppfraktionerna med SDS-PAGE. Samla och kombinera toppfraktionerna med önskad renhet. Spara ~50 μL av de kombinerade eluaterna för SDS-PAGE-analys.
OBS: Normalt kommer en enda topp att visas, och alla fraktioner som elueras i toppen innehåller ~ 90% ren HTT. - Återskapa en anti-FLAG-kolumn med 5 CV:n för regenereringsbuffert (tabell 1) och balansera kolumnen igen med 5 CV:n för buffert A.
OBS: Anti-FLAG-harts kan återanvändas upp till fem gånger eller tills det relativa utbytet / liter sjunker till 50% av den första reningen.
- Rening av storleksuteslutningskolumn (SEC) med hjälp av en SEC-kolumn
- Förbalansera en SEC-kolonn som tillåter separation av proteiner med molekylvikt (MW) > 500 kDa (se materialtabellen för den använda kolonnen) med hjälp av 2 × CV för SEC-buffert (tabell 1).
- Ladda anti-FLAG-eluatet direkt (från steg 6.1.5) via en 50 ml superloop. Kör 1,2 × CV för SEC-buffert per injektion. Kör SEC-separationen över natten vid 4 °C.
OBS: Högst 5 ml eller 15 ml proteinprov kan laddas på SEC-kolumnerna som valts i denna studie. Programmera FPLC så att flera injektioner kan utföras automatiskt. Exempel på metodskript ingår också som tilläggsfil 1 och kompletterande fil 2. - Jämför elueringsprofilen med den vanliga HTT-elueringsprofilen för att skilja monomer-, dimer- och högre ordnade oligomeriska toppar. Slå samman de monomera HTT-fraktionerna baserat på sec-kolumnens elueringsprofil. Om så önskas, slå samman de högre ordnade oligomera och dimeriska HTT-fraktionerna separat.
- Koncentrera det poolade HTT-proteinet med hjälp av en centrifugalkoncentrator på 100 kDa vid 4 °C. Beräkna proteinkoncentrationerna genom att dividera deras OD280-värden med respektive extinktionskoefficienter (de teoretiska extinktionskoefficienterna för Q23-HTT, Q48-HTT, Q73-HTT och ΔExon1-HTT är 0,776, 0,769, 0,762 respektive 0,798 (mg/ml)-1 cm-1för beräkningen). Håll HTT-koncentrationen ≤ 1,0 mg/ml.
OBS: Det är viktigt att övervaka koncentrationsprocessen eftersom överkoncentration kommer att resultera i aggregering. - Alikvotera det renade HTT-proteinet i kryosäkra mikrocentrifugrör i en volym < 100 μl. Flashfrys alikvoterna med flytande kväve och förvara dem vid -80 °C.
7. Analytisk HPLC SEC-MALS-dRI för att analysera HTT-polydispersitet
- Utför all analytisk SEC-MALS vid 4 °C på ett högpresterande vätskekromatografisystem (HPLC) i kombination med en UV-detektor, en multiangle ljusspridningsdetektor och en detektor för differentiellt brytningsindex (dRI).
- Innan du ansluter UHPLC-kolonnen till systemet, rensa pumpen och detektorerna med filtrerat (0,1 μm) HPLC-vatten.
- Anslut UHPLC-kolumnen (se materialförteckningen för den kolumn som används) till systemet. Balansera kolonnen med filtrerat (0,1 μm) vatten och därefter SEC-MALS-buffert (tabell 1) tills alla detektorsignaler når baslinjen.
- Injicera 2 μl 6 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) med en flödeshastighet på 0,3 ml/min i 15 minuter per injektion och inspektera datakvaliteten. Utför normalisering, toppjustering och korrigering av bandbreddning baserat på BSA-profilen och skapa en mall för följande HTT-exempelkörningar.
- Tina snabbt en injektionsflaska med FL Q23-HTT-provet i ett rumstempererat vattenbad med en flottör. Filtrera HTT genom ett 0,1 μm spinnfilter. Injicera 2–4 μl av HTT-provet och kör i 15 minuter vid 4 °C med en flödeshastighet på 0,3 ml/min.
- Analysera kromatografiska och ljusspridande data med hjälp av medföljande programvara (se materialförteckningen). Använd dRI-detektorn som en koncentrationsdetektor och använd 0,185 som brytningsindexökning (dn/dc) för HTT. Generera ett Zimm-diagram för att bestämma den viktgenomsnittliga molekylmassan för varje topp33,34.
OBS: Brytningsindexökning av HTT beräknas som 0,185 med hjälp av programmet SEDFIT programvara35 och primär aminosyrasekvens av HTT som indata.
OBS: HTT-monomer MW bestäms av SEC-MALS vid ~ 370 kDa ± 30 kDa. Renad HTT har vanligtvis monomerinnehåll mellan 60 och 75% (i detta laboratorium). Lågt monomerinnehåll kan tyda på att mer försiktighet måste iakttas vid hanteringen för att förhindra aggregering.
8. Blue Native PAGE för att analysera HTT-polydispersitet
- Förbered 1 L anodbuffert genom att blanda 50 ml 20x Blue Native PAGE-körbuffert (se materialtabellen) med 950 mlH2O. Förbered 2 L mörkblå katodbuffert genom att blanda 100 ml 20x Blue Native PAGE-löpbuffert och 100 ml Blue Native PAGE-katodadditiv (20x) med 1 800 mlH2O. Kyl buffertarna till 4 °C före användning.
- Tina snabbt en injektionsflaska med FL Q23-HTT-prov i ett rumstempererat vattenbad med en flottör. Förvara det tinade proteinet på is före användning.
- Blanda 5 μg FL Q23-HTT (~1 mg/ml), 1 μl 0,5 % G250 tillsats, 2,5 μl 4x Blue Native PAGE-provbuffert och vatten för att få den slutliga volymen till 10 μl.
- Ladda det blandade FL Q23-HTT-provet på en 3-12% prefabricerad Bis-Tris-gel. Ladda 7,5 μL av den ofärgade proteinstandarden i samma gel som standarden.
- Fyll tankens framsida med mörkblå katodbuffert och tankens baksida med anodbuffert.
Fyll i buffertarna när exemplet har lästs in för att möjliggöra enkel visualisering när du läser in exemplen. - Kör gelén vid 150 V i 120 min i ett kallrum.
- Avstain gelén med avfärgningslösning (tabell 1) tills band observeras; Överför gelén till vatten. Visualisera och dokumentera gelén på en bildstation.
OBS: Blue Native PAGE designades ursprungligen för att analysera membranproteiner. Det anpassades i detta laboratorium som en alternativ metod för att uppskatta HTT: s monomera innehåll. Det binder till de hydrofoba regionerna i HTT och förhindrar att det bildar aggregat under buffertförhållanden som saknar tvättmedel. Traditionell native PAGE utan att använda Coomassie blue G250 får HTT att bilda lösliga oligomerer och aggregat, troligen på grund av de många hydrofoba fickorna som finns i HTT.
9. SDS-SIDA följt av Coomassie eller silverfärgning för att analysera HTT-renhet
- Tillsätt 4x LDS-provbuffert och 10x reducerande reagens till renad FL Q23-HTT för att göra den slutliga koncentrationen av lastbuffert och reducerande reagens till 1x.
- Värm provet på ett torrt värmeblock vid 70 °C i 10 minuter.
- Ladda maximalt 1 μg protein per brunn på en 3-8% Trisacetatgel och kör vid 150 V i 1 h med Tris-acetat SDS-löpande buffert.
OBS: Proteiner som används i denna studie är också tillgängliga direkt från HD Community Repository vid Coriell Institute (www.coriell.org/1/CHDI); se materialförteckningen. - Coomassie fläck
- Tvätta gelén medH2Oi 5 min.
- Färga gelén i Coomassie-färgningslösningen (tabell 1) genom att gunga gelén i 30 ml färgningslösning i 15 minuter.
- Avfläcka genom att gunga gelén i 50 mlH2Oi 5 min. Visualisera och dokumentera den Coomassie-färgade gelén på en bildstation.
- Silverfläck med en kommersiell silverfläcksats.
- Efter SDS-PAGE, fixera gelén med fixeringslösning (tabell 1) i 1 h till över natten vid rumstemperatur.
- Utför fläcken, tvätta och utveckla enligt satsens instruktioner.
- Stoppa utvecklingssteget omedelbart när banden når önskad intensitet.
- Dokumentera gelén i ett geldokumentationssystem utrustat med en synlig ljuskälla.
OBS: HTT renad vid >95% kan detekteras genom Coomassie och silverfärgning med detta protokoll. Se ett tidigare publicerat protokoll32 för detaljer om hur man utför kvantitativ proteinanalys.
Representative Results
En övergående uttrycksvektor (pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG, figur 1A) är konstruerad för snabb produktion i däggdjursceller av FL Q23-HTT (aa 1-3,144, baserat på Q23-numrering). Denna konstruktion har de funktioner som är utformade för att snabbt generera olika HTT-mutationskonstruktioner genom kassettkloning, underlätta rening av HTT-protein till hög kvalitet och homogenitet med minimala kromatografiska steg och har möjlighet att producera otaggad FL HTT. Listan över funktionerna innehåller 1. HindIII-restriktionsställen för matsmältning, som omger CAG-upprepningen i HTT exon 1, kan användas för att generera FL HTT-mutanter med en polyQ-sträcka av olika längder genom restriktionsenzymets matsmältning och ligering; 2. Den C-terminala änden av FL HTT är märkt med en FLAG-epitop med ett TEV-proteasigenkänningsställe för enstegs affinitetsrening av FL HTT med hög renhet och valfri generering av taggfritt FL HTT-protein med TEV-proteasklyvning; 3. Kodonoptimerad FL HTT-sekvens för användning av humant cellkodon för högnivåuttryck i HEK293-celler. PCDNA 3.1 (+) -vektorn används som ryggraden i konstruktionen för att dra nytta av den höga transkriptionella aktiveringsaktiviteten hos CMV-promotorn i däggdjurscellinjer.
Med hjälp av pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG som startmall producerades Q48- och Q73 FL HTT-konstruktionerna genom att syntetisera DNA-fragment med korrekt Q-längd som spänner över två HindIII-restriktionsenzymställen och byta ut samma region i mallen. ΔExon1-mutanten av FL HTT (aa 91-3,144) (figur 1B) framställdes med hjälp av primers riktade mot borttagna rester som spänner över exon 1-regionen i mallen. HEK293-celler transfekterade med pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-FLAG med PEI odlades i 5 L shakerkolvar under 5% CO2. En typisk storskalig rening använder en 2-10 L cellpellets innehållande 6,0 × 10 9-3,0 × 1010 celler. Innan man fortsatte till rening uppskattades HTT-uttrycksnivån från varje transfektion genom kvantitativ western blotting med renad rekombinant FLAG-märkt HTT som standard och anti-FLAG-antikropp som den första antikroppen. Pellets med en uppskattad HTT-uttrycksnivå vid ≥2 pg HTT/cell användes för rening.
Rening av FL HTT består av en 2-stegs kolonnprocess, först med anti-FLAG-affinitetsrening och sedan med SEC på en gelfiltreringskolonn med ett lämpligt separationsområde för HTT (figur 2A; se materialtabell för exempel). Efter båda stegen erhölls HTT vid >95% provrenhet, bestämd av SDS-PAGE med Coomassie blå och >65% monomerinnehåll baserat på analytisk SEC-MALS. Eftersom både förlängd reningstid och temperatur har en negativ inverkan på det slutliga HTT-monomerinnehållet användes FPLC i båda reningsstegen för att minimera hanteringen och få konsekvent provkvalitet. Den viktigaste föroreningen under anti-FLAG-reningen var chaperonen Hsp70 som bestämdes med masspektrometri (figur 2B, körfält 2). Detta överensstämmer med slutsatsen att Hsp70 samrenas med FL HTT stabilt uttryckt i humana cellinjer24, vilket tyder på att Hsp70 kan vara en vanlig stabilisator för FL HTT in vivo.
Hsp70-kontaminering kan elimineras genom omfattande tvättning med magnesiumklorid och ATP under anti-FLAG-affinitetsreningssteget (figur 2B, körfält 1). Vid avlägsnande av Hsp70 är FL HTT benägen att bilda högre beställda oligomerer24 och måste bibehållas i en koncentration ≤ 1 mg / ml. Koncentrationssteget före SEC kan ofta resultera i betydande aggregering. Därför är den bästa praxisen att direkt ladda toppfraktioner från anti-FLAG-rening på storleksuteslutningskolonnen utan att koncentrera sig. Efter SEC koncentrerades provet till ≤1 mg/ml för maximal återvinning av monomer FL HTT. Mängden HTT som återvunnits från varje reningssteg uppskattades genom antingen Coomassie blue eller kvantitativ western blotting med renad FL HTT som kvantifieringsstandard (tabell 2). Det typiska utbytet av renade FL HTT-proteiner som produceras med den beskrivna metoden är ungefär 1 mg/L cellodling men kan falla långt under det (tabell 3) på grund av variation från sats till sats, eller om anti-FLAG-reningshartset återanvänds flera gånger.
Överuttryck av FL HTT kan resultera i fragmentering av proteinet22. FL Q23-HTT framställd med den metod som beskrivs här löst som ett enda band med rätt MW på 350 kDa av SDS PAGE, färgad antingen av Coomassie G250 eller genom silverfärgning (figur 2C). Genom western blotting reagerade FL Q23-HTT med antikroppar upphöjda mot epitoper vid N-terminalen, C-terminalen och flera mellanliggande domäner, utan att några ytterligare fragmentrelaterade band observerades, vilket indikerar att proteinet isolerades utan signifikanta detekterbara trunkeringar (figur 3A). FL HTT polyQ-längdvarianterna Q23, Q48 och Q73 reagerade som förväntat i western blot och visade en gradvis starkare signal för polyQ-riktad mAb MW1 som korrelerar med ökande Q-längd: Q23-HTT < Q48-HTT < Q73-HTT (Figur 3B). Ingen signal observerades för ΔExon1-HTT (aa 91-3,144) vid sondering med antikropparna MW1 och MAB549, som riktar sig mot N-terminalen exon 1 (figur 3B).
SEC-MALS användes för att analysera aggregeringstillståndet och molekylmassan för det renade HTT-proteinet. Prover analyserades av analytisk SEC övervakad av UV-, MALS- och dRI-detektorer. Den absoluta molära massan erhållen från SEC-MALS beror inte på formen på molekylerna33,34; Därför ger SEC-MALS en opartisk uppskattning av MW för monomera och oligomera fraktioner när de är väl separerade. Bland de testade HPLC-kolumnerna visade SEC-kolonnen (se materialtabellen) tillräcklig upplösning mellan HTT-monomeren och dimeren så att molära massor kunde särskiljas (figur 4). Proteinkoncentrationen bestämdes genom dRI-detektion. Brytningsindexsteg (dn / dc) för FL HTT är 0,1853 ml / g beräknat av SEDFIT-programvaran35. Liknande analytiska SEC-elueringsmönster observerades för ΔExon1 HTT (91-3,144), FL Q23, Q48 och Q73 HTT (1-3,144), var och en bestående av en större monomertopp med mindre dimeriska och oligomera toppar (tabell 4). Den beräknade MW för den monomera formen är större än den teoretiska MW. Detta orsakas troligen av överlappande arter från högre ordnade oligomera toppar och fel till följd av svaga dRI-signaler eftersom HTT-proteiner hålls i låg koncentration för att undvika att bilda högre ordnade oligomerer. Genom att integrera UV-topparna för flera satser av renade FL HTT-varianter observerades ingen tydlig korrelation mellan polyQ-längd och aggregatprofil (tabell 4).
Förutom analytisk SEC utfördes traditionell inbyggd PAGE för att avgöra om den kan användas som en kompletterande metod för att karakterisera FL HTT-oligomertillståndet. Högre beställda oligomerer löstes genom 3-8% Tris-acetatgeler med användning av inbyggd buffert utan tvättmedel. Renad FL HTT från SEC visade flera band som motsvarar oligomeriseringstillstånden (figur 5A). Det lägsta bandet var beläget mellan den ursprungliga markören 480 kDa och 720 kDa, liknande tidigare resultat som rapporterats för FL HTT renat från insektsceller22. HTT-monomeren var dock inte det vanligaste bandet när man använde traditionell inbyggd PAGE, och resultaten korrelerar inte med den aggregerade profilen som bestäms av analytisk SEC-MALS. Flera hydrofoba fläckar som finns i FL HTT36,37,38, särskilt det hydrofoba gränssnittet mellan HAP40 och FL HTT25, kommer sannolikt att bidra till bildandet av högre ordnade oligomerer under migration inom gelén. Detta beror på att hydrofoba regioner är kända för att interagera med varandra i frånvaro av tvättmedel eller stabiliserande protein-proteininteraktioner. I överensstämmelse med de hydrofoba egenskaperna hos HTT bildar FL HTT ökande mängder högre ordnade oligomerfraktioner i frånvaro av CHAPS under SEC-reningssteget.
Blue Native PAGE, som används i stor utsträckning för att undersöka membranproteiner och stora proteinkomplex som innehåller hydrofoba fläckar39, jämfördes med traditionell inhemsk PAGE. Renad HTT visade tre huvudband på Blue Native PAGE med uppskattad MW på 643, 927 och 1070 kDa (figur 5B) som sannolikt representerar de monomera, dimeriska respektive trimeriska arterna av HTT. Monomerbandet förblev det vanligaste bandet i Blue Native PAGE, vilket motsvarade väl den analytiska SEC-profilen för samma prover. Överskattningen av MW för HTT-monomeren av Blue Native PAGE kan bero på den unika ihåliga sfäriska strukturen eller hydrofoba regioner i HTT som orsakar långsammare migration i förhållande till motsvarande molekylviktmarkörer 11,23,25. Sammantaget har FL Q23-HTT, FL Q48-HTT, FL Q73-HTT och ΔExon1-HTT liknande Blue Native PAGE-profiler med endast små skillnader i proteinbandmigrationen på grund av deras molekylviktskillnader.
Som en ytterligare kontroll av kvaliteten på de renade proteinerna kan den C-terminala FLAG-taggen tas bort från FL HTT genom behandling med TEV-proteas. Efter proteolytisk klyvning analyserades prover med western blot med hjälp av fyra antikroppar för att bekräfta borttagning av FLAG-taggar och detektera HTT-nedbrytning. Immunreaktivitet mot anti-FLAG M2 och tre jaktinetinspecifika antikroppar med epitoper mot N-terminalen, mellanliggande domäner och C-ändpunkt för HTT visade framgångsrikt borttagning av FLAG-taggar och inga HTT-specifika nedbrytningsprodukter (kompletterande figur S1).
Bild 1: Konstruera för HTT-uttryck i full längd. (A) Q23 HTT i full längd kodonoptimerades och klonades till pcDNA3.1 (+) plasmid. 3'-änden av HTT märktes med flaggepitop och TEV-proteasklyvningsplats för att producera taggfritt HTT-protein. Polyglutaminsträckan och den prolinrika domänen konstruerades med flankerade HindIII-restriktionsendonukleasställen för att infoga ytterligare CAG-upprepningar med hjälp av kassettkloning , dvs Q48 och Q73, för att producera HTT-varianter med olika polyQ-längder. (B) ΔExon1-konstruktion gjordes PCR-mutagenes med pcDNA3.1-Q23-HTT som mall. Rester 91-3 144 av HTT förblev i ΔExon1-konstruktionen för uttryck. Förkortningar: HTT = huntingtin; CMV = cytomegalovirus; Q23 = polyglutaminsträckning; PRD = prolinrik domän; TEV = klyvningsstället för tobaksetsvirus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Storskalig rening av HTT. (A) SEC-profil för anti-flaggrenad fullängds Q23-HTT på en FPLC-kolonn. Högordnade oligomerer, dimer och monomertoppar av Q23-HTT är märkta. Fraktioner innehållande monomer samlades in som det slutliga HTT-provet. (B) SDS-SIDA för renad Q23-HTT med ATP/magnesiumtvättsteg (körfält 1) eller utan ATP/magnesiumtvätt resulterar i Hsp70-samtidig eluering (körfält 2). (C) Slutrenade HTT-varianter i full längd på SDS-PAGE färgade med Coomassie blå G-250 eller silverfläck. Förkortningar: FL = full längd; HTT = huntingtin; SEC = storlek uteslutning kromatografi; FPLC = snabb proteinvätskekromatografi; O = oligomer; D = dimer; M = monomer; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores; Hsp70 = värmechockprotein 70. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Western blot-analys av renade HTT-varianter . (A) Renad FL Q23-HTT kördes på SDS-PAGE och överfördes till PVDF-membran. De primära antikropparna och interagerande epitoperna är Lane 1, α-FLAG M2, FLAG-tagg; Körfält 2, MAB5492, HTT aa. 1-82; Körfält 3, MAB5490, HTT aa 115-129; Bana 4, MAB2166, HTT aa 181-810; Bana 5, MAB3E10, HTT aa 1 171-1 177; Körfält 6, MAB4E10, HTT aa 1 844-2 131; Bana 7, MAB2168, HTT aa 2 146-2 541; Bana 8, MAB8A4, HTT aa 2 703-2 911. (B) 1 μg renade FL HTT-varianter kördes på SDS-PAGE och överfördes till PVDF (vänster), och en duplicerad SDS-gel kördes och färgades med Coomassie Blue (höger). De primära antikropparna och interagerande epitoperna är rad 1, MW1, expanderade PolyQ-upprepningar; Rad 2, MAB2166, HTT aa 181-810; Rad 3, MAB5492, HTT aa 1-82. Förkortningar: FLL Q23-HTT = huntingtinprotein i full längd innehållande 23 glutaminrester; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores; WB = västra fläck; M = markör; PVDF = polyvinylidenfluorid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: SEC-MALS-analys av HTT i full längd. Renad Q23-HTT i full längd eliserades på en UPLC-kolonn. Topppositioner för förutsagd monomer, dimer och oligomer anges. Molekylvikter beräknades för monomer-, dimer- och trimertoppar och listades i tabell 5. Liknande elueringsprofiler observeras för Q48, Q73 och ΔExon1 HTT, med varierande monomer-, dimer- och oligomerinnehåll i varje rening. Förkortningar: SEC-MALS = Storleksuteslutningskromatografi med flervinkelljusspridning; UV = Ultraviolett; LS = Ljusspridning; MW = molekylvikt; Q23-HTT = huntingtinprotein innehållande 23 glutaminrester; M = monomer; D = dimer; O = oligomer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Karakterisering av renad HTT med tydlig Native PAGE eller Blue Native PAGE gel. Native Marker och skenbar monomer Q23-HTT från SEC löstes på 3-8% Tris-acetatgeler i ett icke-denaturerande PAGE-system (A) och ett Blue Native PAGE-system (B). Förkortningar: FL = fullängdare; Q23-HTT = huntingtinprotein innehållande 23 glutaminrester; PAGE = polyakrylamidgelelektrofores; M = markör. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Steg | Namn | Sammansättning | ||
| 6.1.1 | Buffert A | 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5% v/v glycerol, 5 mM EDTA, 0,01% v/v Tween-20, pH 8,0. | ||
| 6.1.2 | Lysis buffert | 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5% v/v glycerol, 5 mM EDTA och 1x proteashämmare cocktail | ||
| 6.1.4.2 | Buffert A | 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5% v/v glycerol, 5 mM EDTA, 0,01% v/v Tween-20, pH 8,0. | ||
| 6.1.4.3 | Buffert B | 50 mM Tris; 500 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5% v / v glycerol; 0,01 % v/v Tween-20, pH 8,0 | ||
| 6.1.4.4 | Buffert C | 20 mM Tris; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM ATP; 0,01% v/v Tween-20; 5% v/v glycerol, pH 8,0 | ||
| 6.1.4.5 | Buffert D | 50 mM Tris; 500 mM NaCl; 5% v / v glycerol; 5 mM EDTA; 0,5 % vikt/v CHAPS, pH 8,0 | ||
| 6.1.4.6 | Elueringsbuffert | 50 mM Tris; 500 mM NaCl; 5% v / v glycerol; 0,5% w/v CHAPS; 0,2 mg/ml DYKDDDDK-peptid, pH 8,0 | ||
| 6.1.6 | Regenereringsbuffert | 0,1 M glycin HCl, pH 3,5; 0,01 % mot tween-20 | ||
| 6.2.1 | SEC-buffert | 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5% v/v glycerol, 0,5% w/v CHAPS, 1 mM TCEP | ||
| 7.3 | SEC-MALS-buffert | 50 mM HEPES, pH 7,2, 500 mM NaCl, 5% v/v glycerol, 0,5% w/v CHAPS | ||
| 8.7 | Avfärgningslösning | 40% v/v metanol och 7% v/v ättiksyra | ||
| 9.4.2 | Coomassie färgningslösning | 0,01% w /v Coomassie G250, 50% v/v/ metanol, 10% v/v ättiksyra | ||
| 9.5.1 | Lösning för fixering | 50% v/v metanol, 10% v/v ättiksyra, 50 μl formaldehyd/100 ml lösning | ||
Tabell 1: Sammansättning av buffertar och lösningar
| Trappsteg | HTT-koncentration (mg/ml) | Total volym (ml) | HTT-innehåll (mg) | HTT-utbyte per cell (pg/cell) | % avkastning |
| Supernatanten | 0.1792 | 220 | 39.4 | 4.4 | 100 |
| Anti-flagga | 1.524 | 8.6 | 13.1 | 1.47 | 33.4 |
| SEK | 0.91 | 3.9 | 3.54 | 0.4 | 9.1 |
Tabell 2: HTT-utbyte från en 2 L HEK293-pellet transfekterad med pcDNA3.1-Q23-HTT-TEV-Flag. Förkortningar: FL Q23-HTT = huntingtinprotein i full längd innehållande 23 glutaminrester; TEV = klyvningsstället för tobaksetsvirus; SEC = storleksuteslutningskromatografi.
| HTT-prov | HTT-utbyte (mg/L) | Genomsnittlig renhet (%) | ||
| Bc | En280 | |||
| 1 | FL DEx1-HTT (N=3) | 0.67-1.30 | 0.69-1.18 | 99.3 |
| 2 | FL Q23-HTT (N=3) | 0.25-0.92 | 0.28-0.98 | 96.9 |
| 3 | FL Q48-HTT (N=3) | 0.28-1.15 | 0.38-1.16 | 97.4 |
| 4 | FL Q73-HTT (N=3) | 0.58-1.05 | 0.57-0.97 | 98.8 |
Tabell 3: Sammanfattning av proteinutbytet för fyra FL HTT-variantreningar och deras slutliga renhet. Förkortning: FLL HTT = jaktinprotein i full längd.
| HTT-prov | A | D | M |
| FL Q23-HTT | 4.2-6.9% | 18.7-29.3% | 66.5-76.0% |
| FL Q48-HTT | 4.0-9.4% | 10.6-17.8% | 73.6-85.4% |
| FL Q73-HTT | 2.0-14.0% | 16.9-24.6% | 65.1-81.1% |
Tabell 4: Sammanfattning av det representativa innehållet av aggregat, dimer och monomer i FL HTT-varianter från reningen. Förkortningar: FL HTT = huntingtinprotein i full längd; A = aggregat; D = dimer; M = monomer; SEC = storleksuteslutningskromatografi.
Kompletterande figur S1: Western blot-analys efter tev-proteasuppslutning. Renad FL Q23-HTT och FL Q48-HTT kördes på SDS-PAGE, överfördes till PVDF-membran och analyserades med western blotting efter TEV-sammandragning. Primära antikroppar som användes var anti-Flag M2 (Flag tag), MAB5492 (HTT aa 1-82), MAB3E10 (HTT aa 997-1,276) och MAB2168 (HTT aa 2,146-2,541). Bana 1, proteinstandard; Körfält 2, Q23-HTT-TEV-flagga; Körfält 3, Q48-HTT-TEV-flagga; Körfält 4, Q23-HTT-TEV-Flag behandlat med TEV-proteas vid 1:5, över natten vid 4 °C; Bana 5, Q48-HTT-TEV-Flag behandlad med TEV-proteas vid 1:5, över natten vid 4 °C. Förkortningar: FL HTT = huntingtinprotein i full längd; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores; TEV = tobaksetsvirus; PVDF = polyvinylidenfluorid. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: SEC-MALS-analys av FL HTT-varianter som utsätts för frys-tining-cykler. Renad Q23-HTT (A) och Q48-HTT (B) frystes vid -80 °C och tinades vid rumstemperatur i upp till 6 gånger. Q23-HTT och Q48-HTT efter den första frys-tina och den sjätte frys-tina cyklerna analyserades sedan av SEC-MALS. En liten minskning av monomerfraktionen och ökningen av dimer- och högordnade oligomerfraktioner observerades genom ljusspridning efter upprepade frys-tina cykler. Topppositioner för förutsagd monomer, dimer och högordningsoligomer anges. Förkortningar: FL HTT = huntingtinprotein i full längd; O = oligomer; D = dimer; M = monomer; SEC-MALS = Storleksuteslutningskromatografi med flervinkelljusspridning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S3: SDS SIDA av FL HTT-varianter som utsätts för frys-tina cykler. Renad Q23-HTT (körfält 2-7) och Q48-HTT (körfält 9-14) frystes vid -80 °C och tinades vid rumstemperatur i upp till 6 gånger. Alikvoter av Q23-HTT och Q48-HTT lagrades efter varje frys-upptiningscykel och analyserades sedan av SDS PAGE. Ingen ökning av ballast eller nedbrytningsprodukter observerades. Proverna ansågs stabila och >95% rena efter banddensitometri. Förkortningar: FL HTT = huntingtinprotein i full längd; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 1: FPLC 15 ml anti-FLAG HTT-skript. Förkortningar = FPLC = snabb proteinvätskekromatografi; HTT = huntingtinprotein. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2: FPLC SEC_MALS HTT-skript. Förkortningar: SEC-MALS = Storleksuteslutningskromatografi med flervinkelljusspridning; FPLC = snabb proteinvätskekromatografi; HTT = huntingtinprotein. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Vi beskriver här en övergående transfektions-, uttrycks- och reningsmetod för att generera flera FL HTT-proteinkonstruktioner med lämplig renhet och homogenitet för användning som standarder för utveckling av immunanalys och MS-analys, kontroller för western blot-analys och för strukturfunktionsstudier. Denna transienta uttrycksmetod är skalbar och mångsidig och gör det möjligt för användaren att generera låga milligrammängder av FL HTT-varianter mer effektivt än att använda stabila cellinjer eller virusbaserade metoder som beskrivits tidigare21,22,23,24. Rutinmässigt kan 2-5 mg högrenad FL HTT genereras från en 2 L-skala proteinproduktion som körs på mindre än en vecka med hjälp av den övergående uttrycksmetoden när plasmiden är konstruerad, med ett typiskt utbyte av 1-2,5 mg FL HTT per liter cellodling.
Den övergående uttrycksmetoden som beskrivs här övervinner många hinder i stabilt cellinjeuttryck, såsom den långa tid som krävs för att etablera cellinjer och svårigheter att lagra och upprätthålla stabila cellinjer. PEI är också relativt billigt jämfört med andra transfektionsreagens på marknaden, vilket gör storskalig transfektion ekonomiskt lönsam. Det finns också begränsningar i protokollet: transfektionseffektiviteten beror till stor del på plasmidernas kvalitet, optimal celltillväxt och hur väl PEI lagras och bereds. Operatörer måste vara särskilt försiktiga och utföra kvalitetskontroller i dessa kritiska steg för att undvika en drastisk minskning av proteinutbytet. Anti-FLAG-harts som används i protokollet är också relativt dyrt och visar minskad infångning av FL HTT efter flera reningar och regenereringar. Vissa forskare kan tycka att det är mer praktiskt att byta till en annan tagg för att möjliggöra mer robust regenerering av affinitetshartset.
Olika cellinjer och uttrycksförhållanden testades för att optimera FL HTT-uttrycksnivåer. HEK293-celler valdes för uttrycket av FL HTT på grund av det höga uttrycket av protein och den enkla hanteringen i ett suspensionsodlingsformat, vilket gör metoden lämplig för storskaligt uttryck i antingen shakers eller bioreaktorer. En högre FL HTT-proteinuttrycksnivå kan uppnås vid lägre odlingstemperaturer som 32 °C snarare än att använda den vanliga temperaturen på 37 °C. Det är möjligt att den lägre temperaturen kan bromsa proteinsyntesen och främja korrekt vikning av FL HTT40. Detta fenomen är dock inte specifikt för FL HTT eller de testade cellinjerna. Den reducerade posttransfektionstemperaturen har använts i stor utsträckning i farmaceutiskt proteinuttryck i CHO-celler. Även om mekanismen inte är helt förstådd, tror man att låga temperaturer stoppar cellcykeln i G1-fasen och avleder cellulär energi till proteinproduktion41.
HTT i full längd renad från däggdjursceller sam-eluerar med chaperonen Hsp7024, och Mg-ATP-tvättsteg kan ta bort Hsp70-proteinet. Intressant nog observeras inte co-eluterad Hsp70 i FL HTT renad från ett insektscelluttryckssystem21,22,23. Detta kan återspegla en skillnad i PTM för FL HTT eller värmechockproteinsvar på överuttryck av FL HTT i däggdjurs- och insektsceller. När det rekombinanta proteinet har avlägsnats från Hsp70 krävs icke-joniska tvättmedel såsom CHAPS eller DDM för att stabilisera den monomera formen av FL HTT.
Oligomeriseringstillstånden för FL HTT-varianter analyserades med hjälp av Blue Native PAGE och SEC-MALS. En liten bråkdel av dimerisk och högre ordningens oligomera HTT var närvarande när den analyserades av antingen Blue Native PAGE eller SEC-MALS. Observera att högre beställda oligomerer bildade av FL HTT inte verkar korrelera med polyQ-längd, och även Exon1-deletionsmutanten visar ett liknande oligomer-dimer-monomerförhållande. De faktiska variationerna i oligomerinnehåll mellan dessa konstruktioner beror sannolikt på mindre skillnader i produktion och hantering av varje sats. I motsats till aggregat och fibriller bildade av HTT Exon140,41 förblev de högre beställda oligomererna av FL HTT lösliga och kunde analyseras av SEC och Native PAGE.
Renad monomer FL HTT är endast relativt stabil. Långvarig lagring vid 4 °C, korta inkubationer vid rumstemperatur eller koncentrationer > 1 mg/ml omvandlar alla monomer FL HTT till dimera och högre ordnade oligomera former även om det inte finns någon synlig nederbörd observerad under dessa förhållanden. Renad monomer FL HTT bibehållen vid ≤1 mg/ml förblev relativt stabil vid -80 °C i lagringsbuffert (50 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, 5% v/v glycerol, 0,5% w/v CHAPS och 5 mM DTT) som tidigare beskrivits24. Upp till 6 frys-tina cykler av FL HTT framställda och lagrade på detta sätt orsakade inte synlig utfällning av proteinet, även om en liten förskjutning till ett högre oligomert tillstånd observerades av SEC-MALS (kompletterande figur S2). Prover analyserades också av SDS PAGE efter upprepade frys-tina cykler. Inga synliga utfällningar observerades; inga aggregat eller ytterligare nedbrytningsprodukter sågs av SDS-PAGE (kompletterande figur S3). Den långsiktiga stabiliteten hos renad FL HTT är fortfarande under utredning. I avsaknad av avgörande långsiktiga data rekommenderar vi att du lagrar renad FL HTT vid -80 °C i högst 6 månader.
Högkvalitativa, rekombinanta FL HTT-proteinvarianter och metoderna för att producera dem är mycket efterfrågade av HS-forskarsamhället. Dessa proteiner används som immunanalys- och MS-analysstandarder, i strukturstudier och för utveckling av nya FL HTT-specifika analyser. De storskaliga övergående uttrycksmetoderna som beskrivs här har konsekvent producerat milligrammängder av FL HTT-varianter med >95% renhet, vilket ger viktiga verktyg för HTT-studier. Produktion av tiotals milligram högrenade FL HTT polyQ-varianter och andra mutanter till stöd för HS-forskning har blivit rutin.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter med innehållet i denna artikel.
Acknowledgments
Vi tackar institutionen för farmaceutiska vetenskaper, State University of New York at Buffalo, för att ha utfört MS-analys av HTT. Detta arbete var ett samarbete med CHDI Foundation. Vi tackar särskilt Elizabeth M. Doherty; Ignacio Munoz-Sanjuan; Douglas Macdonald, CHDI-stiftelsen; och Rory Curtis, Curia, för deras ovärderliga bidrag under utarbetandet av detta manuskript. Vi är också tacksamma mot Michele Luche, Mithra Mahmoudi och Stephanie Fox för deras stöd till denna forskningsinsats.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 kDa concentrator-Amicon | Millipore | UFC910096 | Protocol Section Number-6.2.4 |
| 20x blue native PAGE running buffer | Invitrogen | BN2001 | Protocol Section Number-8.1 |
| 20x TBS | Thermo Fisher | PI28358 | Protocol Section Number-5.1 |
| 4x blue native PAGE sample buffer | Invitrogen | BN2003 | Protocol Section Number-8.3 |
| 4x LDS loading buffer | Invitrogen | NP0007 | Protocol Section Number-5.3 |
| 5 L Erlenmeyer flasks | Corning | 431685 | Protocol Section Number-4.2 |
| Agarose gel extraction kit | Qiagen | 28704 | Protocol Section Number-2.2 |
| Anti-clumping agent | Thermo Fisher | 0010057AE | Protocol Section Number-4.8 |
| anti-FLAG M2 affinity gel | Sigma | A2220 | Protocol Section Number-6.1.1 |
| anti-FLAG M2 | Sigma | F3165 | Protocol Section Number-5.7 |
| Anti foam-Excell anti foam | Sigma | 59920C-1B | Protocol Section Number-4.8 |
| ATP | Sigma | A6419 | Protocol Section Number-6.1.4.4 |
| BEH 450 SEC | Waters | 186006851 | 2.5 µm x 4.6 mm x 150 mm Protocol Section Number-7.3 |
| blue native PAGE 5% G-250 sample additive | Invitrogen | BN2004 | Protocol Section Number-8.3 |
| carbenicillin | Thermo Fisher | 10177012 | Protocol Section Number-2.5 |
| centrifuge - Sorvall Lynx 6000 | Thermo Fisher | 75006590 | Protocol Section Number-6.1.3 |
| Cell Counter - ViCELL | BECKMAN COULTER | Protocol Section Number-4.3 | |
| CHAPS | Anatrace | C316S | Protocol Section Number-6.1.4.6 |
| Competent E. coli cells-TOP10 | Invitrogen | C404010 | Protocol Section Number-2.4 |
| digitonin | Sigma | D141 | Protocol Section Number-5.1 |
| differential refractive index detector | Wyatt | Protocol Section Number-7.1 | |
| DYKDDDDK peptide | Genscript | Peptide synthesis service Protocol Section Number-6.1.4.6 |
|
| EDTA | Sigma | EDS | Protocol Section Number-5.1 |
| EndoFree Plasmid Giga Kit | Qiagen | 12391 | Protocol Section Number-3.3 |
| Endotoxin free water | Cytiva | SH30529.03 | Protocol Section Number-4.1 |
| endotoxin quantification kit-CRL Endosafe Nexgen-PTS detection system | Charles River | PTS150K | Protocol Section Number-3.4 |
| fixed angle rotor A23-6x100 rotor | Thermo Fisher | 75003006 | Protocol Section Number-6.1.3 |
| FPLC software- Unicorn 6.2 | Cytiva | Protocol Section Number-6.1.4 | |
| Gene synthesis | Genscript | Gene synthesis service Protocol Section Number-1.2 |
|
| Glycerol | Fisher Scientific Glycerol (Certified ACS) | G33-4 | Protocol Section Number-5.6 |
| Growth Medium-Expi293 expression medium | Thermo Fisher | A1435102 | Protocol Section Number-4.2 |
| HEK293 cells | Thermo Fisher | R79007 | Protocol Section Number-4 |
| high shear homogenizer-Microfluidizer | MicroFluidics | LM10 | Protocol Section Number-6.1.3 |
| HPLC - 1260 infinity II Bio-Insert HPLC | Agilent | Protocol Section Number-7.1 | |
| Image Studio | LiCor | Image analysis software Protocol Section Number-5.1 |
|
| MAB2166 | Sigma | MAB2166 | Protocol Section Number-5.7 |
| MAB2168 | EMD | MAB2168 | Protocol Section Number-5.7 |
| MAB3E10 | Santa Cruz | SC-47757 | Protocol Section Number-5.7 |
| MAB4E10 | Santa Cruz | SC-7757 | Protocol Section Number-5.7 |
| MAB5490 | Sigma | MAB5490 | Protocol Section Number-5.7 |
| MAB5492 | Sigma | MAB5492 | Protocol Section Number-5.7 |
| MAB8A4 | Santa Cruz | SC-47759 | Protocol Section Number-5.7 |
| multi-angle light scattering detector | Wyatt | Protocol Section Number-7.1 | |
| NativeMark Unstained Protein Standard | Invitrogen | LC0725 | Protocol Section Number-8.4 |
| NaCl | Sigma | S9888 | Protocol Section Number-5.6 |
| NheI | New England Biolab | R0131S | Hi-Fi version available Protocol Section Number-2.2 |
| NuPAGE 3–8% Tris acetate gels | Invitrogen | EA0375PK2 | Protocol Section Number-5.4 |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running buffer | Invitrogen | LA0041 | Protocol Section Number-5.4 |
| PEI 25K | Polysciences | 23966-1 | Protocol Section Number-4.1 |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15070063 | Protocol Section Number-4.2 |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Cytiva | SH30256.02 | Protocol Section Number-4.5 |
| plasmid miniprep kit | Qiagen | 27104 | Protocol Section Number-2.6 |
| PmeI | New England Biolab | R0560S | Protocol Section Number-2.2 |
| precast Bis-tris gel- 3-12% NativePAGE Novex Bis-Tris Gel | Invitrogen | BN1003BOX | Protocol Section Number-8.4 |
| protease inhibitor cocktail | GoldBio | GB-331-1 | Protocol Section Number-5.1 |
| SEC-MALS analysis software - Astra 7 | Wyatt Technology | Protocol Section Number-7.6 | |
| secondary antibody -IRdye 800 CW goat anti-mouse IgG | LiCor | 926-32210 | Protocol Section Number-5.9 |
| Superose 6 pg XK 16/70 | Cytiva | 90100042 | Protocol Section Number-6.2 |
| Tris base | Fisher | BP152 | Protocol Section Number-5.6 |
| Tween-20 | Thermo Fisher | AAJ20605AP | Protocol Section Number-6.1.1 |
| UV spectrometer - Nanodrop 8000 | Thermo Fisher | ND-8000-GL | Protocol Section Number-2.2 |
| XK26/100 | Cytiva | 28988951 | Protocol Section Number-6.1.1 |
References
- Walker, F. O.
- McColgan, P., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: a clinical review. European Journal of Neurology. 25 (1), 24-34 (2018).
- Duyao, M., et al. Trinucleotide repeat length instability and age of onset in Huntington's disease. Nature Genetics. 4 (4), 387-392 (1993).
- MacDonald, M. E., et al. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Nasir, J., et al. Targeted disruption of the Huntington's disease gene results in embryonic lethality and behavioral and morphological changes in heterozygotes. Cell. 81 (5), 811-823 (1995).
- Dragatsis, I., Levine, M. S., Zeitlin, S. Inactivation of Hdh in the brain and testis results in progressive neurodegeneration and sterility in mice. Nature Genetics. 26 (3), 300-306 (2000).
- Anne, S. L., Saudou, F., Humbert, S. Phosphorylation of huntingtin by cyclin-dependent kinase 5 is induced by DNA damage and regulates wild-type and mutant huntingtin toxicity in neurons. Journal of Neuroscience. 27 (27), 7318-7328 (2007).
- Dietrich, P., Johnson, I. M., Alli, S., Dragatsis, I. Elimination of huntingtin in the adult mouse leads to progressive behavioral deficits, bilateral thalamic calcification, and altered brain iron homeostasis. PLoS Genetics. 13 (7), 1006846 (2017).
- Dragatsis, I., et al. Effect of early embryonic deletion of huntingtin from pyramidal neurons on the development and long-term survival of neurons in cerebral cortex and striatum. Neurobiology of Disease. 111, 102-117 (2018).
- Benn, C. L., et al. Huntingtin modulates transcription, occupies gene promoters in vivo, and binds directly to DNA in a polyglutamine-dependent manner. Journal of Neuroscience. 28 (42), 10720-10733 (2008).
- Saudou, F., Humbert, S.
- Davies, S. W., et al. Formation of neuronal intranuclear inclusions underlies the neurological dysfunction in mice transgenic for the HD mutation. Cell. 90 (3), 537-548 (1997).
- DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).
- Gutekunst, C. A., et al. Nuclear and neuropil aggregates in Huntington's disease: Relationship to neuropathology. Journal of Neuroscience. 19 (7), 2522-2534 (1999).
- Hodgson, J. G., et al. A YAC mouse model for Huntington's disease with full-length mutant huntingtin, cytoplasmic toxicity, and selective striatal neurodegeneration. Neuron. 23 (1), 181-192 (1999).
- Hoffner, G., Djian, P. Polyglutamine aggregation in Huntington disease: does structure determine toxicity. Molecular Neurobiology. 52 (3), 1297-1314 (2015).
- Waldvogel, H. J., Kim, E. H., Tippett, L. J., Vonsattel, J. P. G., Faull, R. L. M.
- Kim, M. Beta conformation of polyglutamine track revealed by a crystal structure of huntingtin N-terminal region with insertion of three histidine residues. Prion. 7 (3), 221-228 (2013).
- Hoop, C. L., et al. Huntingtin exon 1 fibrils feature an interdigitated β-hairpin-based polyglutamine core. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1546-1551 (2016).
- Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. An intein-based strategy for the production of tag-free huntingtin exon 1 proteins enables new insights into the polyglutamine dependence of Httex1 aggregation and fibril formation. Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).
- Seong, I. S., et al. Huntingtin facilitates polycomb repressive complex 2. Human Molecular Genetics. 19 (4), 573-583 (2009).
- Li, W., Serpell, L. C., Carter, W. J., Rubinsztein, D. C., Huntington, J. A. Expression and characterization of full-length human huntingtin, an elongated HEAT repeat protein. Journal of Biological Chemistry. 281 (23), 15916-15922 (2006).
- Vijayvargia, R., et al. Huntingtin's spherical solenoid structure enables polyglutamine tract-dependent modulation of its structure and function. eLife. 5, 11184 (2016).
- Huang, B., et al. Scalable production in human cells and biochemical characterization of full-length normal and mutant huntingtin. PLoS ONE. 10 (3), 0121055 (2015).
- Guo, Q., et al. The cryo-electron microscopy structure of huntingtin. Nature. 555 (7694), 117-120 (2018).
- Harding, R. J., et al. Design and characterization of mutant and wildtype huntingtin proteins produced from a toolkit of scalable eukaryotic expression systems. Journal of Biological Chemistry. 294 (17), 6986-7001 (2019).
- Harding, R. J., et al. HAP40 orchestrates huntingtin structure for 1 differential interaction with polyglutamine 2 expanded exon 1. bioRxiv. , (2021).
- Huang, B., et al. Pathological polyQ expansion does not alter the conformation of the Huntingtin-HAP40 complex. Structure. 29 (8), 804-809 (2021).
- Colin, E., et al. Huntingtin phosphorylation acts as a molecular switch for anterograde/retrograde transport in neurons. EMBO Journal. 27 (15), 2124-2134 (2008).
- Thompson, L. M., et al. IKK phosphorylates Huntingtin and targets it for degradation by the proteasome and lysosome. Journal of Cell Biology. 187 (7), 1083-1099 (2009).
- Ratovitski, T., et al. Post-translational modifications (PTMs), identified on endogenous Huntingtin, cluster within proteolytic domains between HEAT repeats. Journal of Proteome Research. 16 (8), 2692-2708 (2017).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of western blot data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
- Tarazona, M. P., Saiz, E. Combination of SEC/MALS experimental procedures and theoretical analysis for studying the solution properties of macromolecules. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 56 (1-3), 95-116 (2003).
- Folta-Stogniew, E. Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors. Methods in Molecular Biology. 328, Clifton, N.J. 97-112 (2006).
- McMeekin, T. L., Wilensky, M., Groves, M. L. Refractive indices of proteins in relation to amino acid composition and specific volume. Biochemical and Biophysical Research Communications. 7 (2), 151-156 (1962).
- Atwal, R. S., et al. Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity. Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).
- Kegel-Gleason, K. B. Huntingtin interactions with membrane phospholipids: Strategic targets for therapeutic intervention. Journal of Huntington's Disease. 2 (3), 239-250 (2013).
- Michalek, M., Salnikov, E. S., Werten, S., Bechinger, B. Membrane interactions of the amphipathic amino terminus of huntingtin. Biochemistry. 52 (5), 847-858 (2013).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schägger, H.
- Nissley, D. A., O'Brien, E. P. Altered co-translational processing plays a role in huntington's pathogenesis-A hypothesis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 54 (2016).
- Kumar, N., Gammell, P., Clynes, M. Proliferation control strategies to improve productivity and survival during CHO based production culture: A summary of recent methods employed and the effects of proliferation control in product secreting CHO cell lines. Cytotechnology. 53 (1-3), 33-46 (2007).
