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Immunology and Infection

प्राथमिक माउस फेफड़े एंडोथेलियल कोशिकाओं का अलगाव

Published: November 10, 2021 doi: 10.3791/63253
Automatic Translation
1,2, 2, 2
1Department of Pediatrics, Division of Critical Care, UCSF Benioff Children's Hospital, 2Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California, San Francisco

Summary

इस लेख में, प्राथमिक फेफड़े के एंडोथेलियल कोशिकाओं को नवजात चूहों से अलग और सुसंस्कृत किया गया था।

Abstract

एंडोथेलियल कोशिकाएं संवहनी स्वर, प्रतिरक्षा, जमावट और पारगम्यता के नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। एंडोथेलियल डिसफंक्शन मधुमेह, एथेरोस्क्लेरोसिस, सेप्सिस और तीव्र फेफड़ों की चोट सहित चिकित्सा स्थितियों में होता है। इन और अन्य स्थितियों के रोगजनन में एंडोथेलियल कोशिकाओं की भूमिका की जांच करने के लिए चूहों से शुद्ध एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल में, फेफड़ों के माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को 5-7 दिन के नवजात माउस पिल्ले से तैयार किया गया था। फेफड़ों को कोलेजनेस आई के साथ काटा जाता है, कीमा किया जाता है, और एंजाइमेटिक रूप से पचाया जाता है, और जारी कोशिकाओं को रात भर सुसंस्कृत किया जाता है। एंडोथेलियल कोशिकाओं को तब एंटी-पीईसीएएम 1 (सीडी -31) आईजीजी का उपयोग करके चुंबकीय मोतियों से संयुग्मित किया जाता है, और कोशिकाओं को फिर से संगम के लिए सुसंस्कृत किया जाता है। एक द्वितीयक सेल चयन तब एंडोथेलियल कोशिकाओं की शुद्धता बढ़ाने के लिए चुंबकीय मोतियों से संयुग्मित एंटी-आईसीएएम 2 (सीडी -102) आईजीजी के साथ होता है, और कोशिकाओं को फिर से संगम के लिए सुसंस्कृत किया जाता है। पूरी प्रक्रिया में लगभग 7-10 दिन लगते हैं इससे पहले कि कोशिकाओं को प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जा सके। यह सरल प्रोटोकॉल अत्यधिक शुद्ध (शुद्धता >92%) एंडोथेलियल कोशिकाओं का उत्पादन करता है जिन्हें तुरंत इन विट्रो अध्ययनों के लिए उपयोग किया जा सकता है, जिसमें एंडोथेलियल साइटोकिन और केमोकाइन उत्पादन, ल्यूकोसाइट-एंडोथेलियल इंटरैक्शन, एंडोथेलियल जमावट मार्ग और एंडोथेलियल पारगम्यता पर केंद्रित अध्ययन शामिल हैं। कई नॉकआउट और ट्रांसजेनिक माउस लाइनें उपलब्ध होने के साथ, यह प्रक्रिया चोट, संक्रमण और सूजन के लिए स्वस्थ और पैथोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं में एंडोथेलियल कोशिकाओं द्वारा व्यक्त विशिष्ट जीन के कार्य को समझने के लिए भी खुद को उधार देती है।

Introduction

संवहनी एंडोथेलियम का अध्ययन करने में रुचि हाल ही में बढ़ी है, क्योंकि माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं की शिथिलता कई मानव रोगों में होती है, जैसे स्ट्रोक, हृदय रोग, मधुमेह, तीव्र फेफड़ों की चोट, सेप्सिस, और गैर-संक्रामक चोटें 1,2,3,4,5। इन स्थितियों के रोगजनन को परिभाषित करने और सुरक्षात्मक और अनियमित एंडोथेलियल सेल प्रतिक्रियाओं में विशिष्ट जीन की भूमिकाओं को समझने के लिए, चूहों से उच्च शुद्धता माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करने और कल्चर करने के लिए विश्वसनीय तरीकों की आवश्यकता है। जबकि कई अध्ययन मानव एंडोथेलियल कोशिकाओं जैसे मानव नाभि शिरा एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचयूवीईसी) या मानव फेफड़ों के माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचएमवीईसी) का उपयोग करते हैं, एंडोथेलियल फ़ंक्शन और डिसफंक्शन का अध्ययन करने के लिए माउस एंडोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग करने के कई कारण हैं। सबसे पहले, विभिन्न मानव दाताओं से एंडोथेलियल कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं में काफी विविधता है, जो व्यक्तिगत प्रयोगों 6,7,8 के बीच परिणामों में परिवर्तनशीलता की ओर जाता है। दूसरा, प्राथमिक मानव कोशिका लाइनों में जीन लक्ष्यों को चुप करने से परिवर्तनीय प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर 9,10 भी हो सकता है। इसके विपरीत, माउस एंडोथेलियल कोशिकाओं11 की प्रतिक्रियाओं में न्यूनतम विषमता है, यह मानते हुए कि आनुवंशिक पृष्ठभूमि अध्ययन समूहों के बीच समान है। इसके अलावा, कई नवजात चूहों से फेफड़ों को पूल करके बड़ी संख्या में माउस एंडोथेलियल कोशिकाओं को तैयार किया जा सकता है। ये कारक प्रयोगों के बीच अधिक सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों की अनुमति देते हैं। अंत में, नॉकआउट या ट्रांसजेनिक चूहों की उपलब्धता भी कोशिका प्रकारों के अलगाव के लिए प्रदान करती है जिसमें रुचि के प्रोटीन की कमी होती है।

प्रकाशित विधियों 12,13,14,15,16 का उपयोग करके माउस फेफड़े एंडोथेलियल कोशिकाओं की स्वस्थ और शुद्ध आबादी को अलग करने के साथ काफी चुनौतियों ने उच्च गुणवत्ता वाले माउस फेफड़े के माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक अधिक विश्वसनीय और सीधा तरीका विकसित किया। वर्तमान प्रोटोकॉल के लाभों में नवजात चूहों का उपयोग करना शामिल है, जो आसानी से उपलब्ध हैं, पशुपालन और आवास लागत को सीमित करते हैं। इसके अतिरिक्त, हमारे अनुभव में, नवजात चूहों से एंडोथेलियल कोशिकाओं की व्यवहार्यता वयस्क चूहों से तैयार एंडोथेलियल कोशिकाओं की तुलना में काफी अधिक है। चूंकि नवजात चूहों में छोटे फेफड़े के ऊतक होते हैं, एंडोथेलियल कोशिकाओं को कोलेजनेस के श्वासनली के इंजेक्शन का उपयोग करने के बजाय कोलेजनेज में उत्पादित फेफड़ों को पचाकर काटा जा सकता है, जिसेवयस्क चूहों से संग्रह के लिए अनुशंसित किया जाता है। यह शुद्धता या उपज या एंडोथेलियल प्रतिक्रियाओं की प्रजनन क्षमता को प्रभावित किए बिना चूहों को यूथेनाइज करने और सेल कल्चर मीडिया और इनक्यूबेटर में उनकी एंडोथेलियल कोशिकाओं को प्राप्त करने के बीच के समय को भी कम करता है। अंत में, शुद्ध सेल आबादी को फ्लो साइटोमेट्री के बिना अलग किया गया था, जो एंडोथेलियल कोशिकाओं 14,15,17 की कम पैदावार को नुकसान पहुंचा सकता है या जन्म दे सकता है।

वर्तमान संशोधित प्रोटोकॉल लगातार 7-10 दिनों में उच्च शुद्धता और व्यवहार्य एंडोथेलियल कोशिकाओं की ओर जाता है जिनका उपयोग इन विट्रो प्रयोगों के लिए तुरंत किया जा सकता है। नॉकआउट जानवरों से सीधे कोशिकाओं को अलग करना भी प्रयोग से पहले कोशिकाओं के हेरफेर को कम करता है। इन विधियों का उपयोग एंडोथेलियल फ़ंक्शन में विभिन्न प्रोटीनों की भूमिका की जांच करने के लिए किया जा सकता है ताकि कई बीमारियों के लिए एंडोथेलियल-आधारित चिकित्सीय लक्ष्यों की खोज की जा सके।

Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं को कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, सैन फ्रांसिस्को की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। अध्ययन के लिए नर C57BL/6 नवजात माउस पिल्ले (उम्र 5-7 दिन) का उपयोग किया गया था। पूरे प्रोटोकॉल में 7-10 दिन लगते हैं (चित्रा 1)।

1. एंडोथेलियल सेल माध्यम की तैयारी

  1. बेसल माध्यम तैयार करें: डलबेकको के संशोधित ईगल माध्यम में 4,500 मिलीग्राम / लीटर ग्लूकोज और 4 एमएम एल-ग्लूटामाइन (डीएमईएम) के साथ 20% (वी / वी) गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम, पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 यू / 100 μg / mL और एचईपीईएस के 25 मिमी के साथ पूरक है (सामग्री की तालिका देखें)। 22 μM फ़िल्टर के साथ बाँझ फ़िल्टर. बेसल माध्यम को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और तैयारी के एक महीने के भीतर इसका उपयोग करें।
  2. पूर्ण माध्यम तैयार करें: बेसल माध्यम हेपरिन के 100 μg / mL, एंडोथेलियल सेल विकास पूरक के 100 μg / mL, 1x गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, और 1 mM सोडियम पाइरूवेट के साथ पूरक है ( सामग्री की तालिका देखें)। 22 μM फ़िल्टर के साथ बाँझ फ़िल्टर. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और तैयारी के एक महीने के भीतर उपयोग करें।

2. एंटी-रैट मैग्नेटिक बीड्स की प्रीकोटिंग13

  1. 50 एमएल बीड वॉश बफर बनाएं: फॉस्फेट-बफर्ड समाधान (पीबीएस) 0.1% (डब्ल्यू / वी) गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के साथ पूरक। 22 μM फ़िल्टर के साथ बाँझ फ़िल्टर और 4 °C पर स्टोर करें और तैयारी के एक महीने के भीतर उपयोग करें।
  2. चुंबकीय मोतियों को कुछ सेकंड के लिए भंवर में डालें और मोतियों के 50 μL (2 x 107 मोती ) को दो 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में फिर से निलंबित करें, एक सीडी -31 के लिए और एक सीडी -102 के लिए ( सामग्री की तालिका देखें)। १ एमएल बीड वॉश बफर डालें और अच्छी तरह मिलाएं।
    नोट: सभी उल्लिखित संस्करणों का उपयोग 3-4 नवजात माउस पिल्ले (5-7 दिन पुराने) से एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया गया था। सीडी -31 और सीडी -102 एंडोथेलियल सेल सतह मार्कर हैं जिनका उपयोग चुंबकीय इम्यूनोबीड चयन के लिए किया जाता है।
  3. ट्यूबों को चुंबकीय विभाजक पर रखें और एक ग्लास पाश्चर पाइप के साथ सतह पर तैरनेवाला को हटा दें। हर बार 1 एमएल बीड वॉश बफर के साथ 3 बार धोने को दोहराएं।
  4. मोती धोने के बफर के साथ मूल मोती की मात्रा, 50 μL में मोतियों को फिर से निलंबित करें। फिर प्रत्येक 50 μL मोतियों में एंटीबॉडी (CD-31/CD-102) के 5 μL (2.5 μg) जोड़ें।
  5. मोती निलंबन को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर या कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए एंड-ओवर-एंड रोटेटर पर कोमल रोटेशन पर इनक्यूबेट करें। इसे 4 बार धोएं।
  6. मूल मात्रा, 50 μL में इम्यूनोबीड्स को फिर से निलंबित करें, मोती धोने के बफर के साथ और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और 1-2 सप्ताह के भीतर उपयोग करें।

3. फेफड़ों की कोशिकाओं का अलगाव और चढ़ाना

  1. अलगाव के दिन टाइप 1 कोलेजनेस समाधान तैयार करें: एचबीएसएस के 25 एमएल में टाइप 1 कोलेजनेस के 25 मिलीग्राम जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। 22 μM फ़िल्टर का उपयोग करके कोमल रोटेशन और बाँझ फ़िल्टर के साथ 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। घोल को 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म रखें।
  2. एंडोथेलियल सेल सक्रियण और थक्केके गठन को कम करने के लिए इच्छामृत्यु से 10 मिनट पहले हेपरिन (25 μL / माउस, 1,000 यू / एमएल) के साथ 5-7 दिन के माउस पिल्ले को इंट्रामस्क्युलर रूप से इंजेक्ट करें।
  3. इच्छामृत्यु के लिए 2020 एवीएमए दिशानिर्देशों के अनुसार तेज कैंची का उपयोग करके चूहे के पिल्ले को डिकैपिटेशन के साथ इच्छामृत्यु करें। फिर, माउस को वेंट्रल साइड के साथ विच्छेदन बोर्ड पर पिन करें।
  4. 70% इथेनॉल के साथ शव को स्प्रे करें, फिर पहले डायाफ्राम को काटकर और फिर छाती की पूरी पार्श्व दीवारों के साथ ऊपर की ओर काटकर वक्ष गुहा को उजागर करें। पसली के पिंजरे को वापस प्रतिबिंबित करना तब हृदय और फेफड़ों को उजागर करता है।
    नोट: नवजात चूहों के छोटे आकार को देखते हुए इस कदम के लिए छोटे बल और कैंची का उपयोग करें, और सुनिश्चित करें कि दिल या फेफड़ों को छेदना न करें क्योंकि इससे फेफड़ों से अपर्याप्त रक्त निष्कासन होगा।
  5. 10 एमएल सिरिंज में 25 ग्राम सुई संलग्न करें, और फेफड़ों से रक्त निकालने के लिए दिल के दाहिने वेंट्रिकल में 5 मिलीलीटर ठंडे डीएमईएम इंजेक्ट करें। फेफड़े सफेद हो जाएंगे।
  6. वक्ष गुहा से फेफड़ों को हटा दें, एक समय में एक लोब, लोब को संबंधित ब्रोंची से काटकर।
  7. सभी फेफड़ों के लोब को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में पूल करें जो 20 एमएल बर्फ-ठंडे बेसल माध्यम (चरण 1.1 से) से भरा हुआ है।
  8. अन्य माउस पिल्ले के साथ चरण 3.2-3.7 दोहराएं, सभी फेफड़ों के लोब को एक ही 50-एमएल शंक्वाकार ट्यूब में पूल करें।
  9. फेफड़ों की सतह पर किसी भी अतिरिक्त लाल रक्त कोशिकाओं को धोने के लिए 10-15 सेकंड के लिए ट्यूब को धीरे से हिलाएं।
    नोट: फेफड़ों के भीतर या आसपास से सभी रक्त को निकालना आवश्यक नहीं है; हालांकि, यह शुद्धता में सुधार करता है। किसी भी आगे ऊतक हैंडलिंग को बाँझ हुड में किया जाना चाहिए।
  10. मीडिया से फेफड़ों को हटाने के लिए एक सेल छन्नी का उपयोग करें, और ऊतक को बाँझ, डिस्पोजेबल 100 मिमी व्यास ऊतक संवर्धन डिश में स्थानांतरित करें और निष्फल कैंची के साथ कीमा करें।
  11. कीमा ऊतक को 25 मिलीलीटर पूर्व-गर्म कोलेजनेस समाधान (चरण 3.1) के साथ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए घूर्णन मिक्सर पर धीरे से हिलाएं।
    नोट: यहां तक कि 60 मिनट के लिए ओवरडाइजेशन से कम पैदावार हो सकती है।
  12. 20 एमएल सिरिंज को 15 ग्राम ब्लंट कैनुला ( सामग्री की तालिका देखें) में संलग्न करें और ऊतक को सेलुलर निलंबन में तोड़ने के लिए निलंबन को 10-15 बार ट्रिट्यूरेट करें। जोरदार रहें, लेकिन अधिक झाग से बचें।
    नोट: अब फेफड़े के टुकड़े दिखाई नहीं देंगे, और इसके बजाय, इस चरण के पूरा होने पर निलंबन बादल होगा।
  13. निलंबन को 70 μm सेल छन्नी के माध्यम से एक ताजा 50 mL शंक्वाकार ट्यूब में फ़िल्टर करें। इसके अलावा, पाचन के लिए उपयोग की जाने वाली शंक्वाकार ट्यूब और सेल छन्नी को अतिरिक्त 15 मिलीलीटर बेसल माध्यम से कुल्ला करें।
  14. सेलुलर निलंबन को 400 x g पर 8 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  15. एक ग्लास पाश्चर पाइप के साथ सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और पूर्ण माध्यम के 2 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें। टी -75 फ्लास्क में स्थानांतरित करें और एक ह्यूमिडिफाइड, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 8 एमएल पूर्ण मध्यम-संस्कृति जोड़ें।
  16. अगले दिन, कैल्शियम और मैग्नीशियम (एचबीएसएस / सीएमएफ) के बिना हैंक के संतुलित नमक समाधान के 10 मिलीलीटर के साथ फ्लास्क को दो बार धोएं ( सामग्री की तालिका देखें) और 10 एमएल पूर्ण माध्यम जोड़ें।
    नोट: 2-3 दिनों के बाद, संस्कृति 90-95% कंफ्लुएंट होगी और प्राथमिक इम्यूनोबीड अलगाव के लिए तैयार होगी।

4. प्राथमिक इम्यूनोबीड अलगाव और एंडोथेलियल कोशिकाओं का संवर्धन।

  1. 10 एमएल एचबीएसएस / सीएमएफ के साथ दो बार अनुगामी एंडोथेलियल कोशिकाओं को धोएं। ट्रिप्सिन-मुक्त सेल डिटेचमेंट समाधान के 2 एमएल जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) और ~ 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। सुनिश्चित करें कि सभी कोशिकाओं को फ्लास्क से उठाया गया है।
    नोट: ट्रिप्सिन के बजाय एक ट्रिप्सिन-मुक्त डिटेचमेंट समाधान का उपयोग करने की आवश्यकता है क्योंकि ट्रिप्सिन सेल सतह आसंजन मार्कर सीडी -31 को बाधित कर सकता है।
  2. सेल डिटेचमेंट समाधान को बेअसर करने के लिए बेसल माध्यम के 8 एमएल जोड़ें और सामग्री को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए 400 x g पर स्पिन करें।
  3. एक ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और बेसल माध्यम के 2 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। 2 एमएल सेल सस्पेंशन को 5 एमएल गोल तल पॉलीस्टाइनिन ट्यूब में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  4. भंवर एंटी-सीडी -31 लेपित मोती कुछ सेकंड के लिए मोतियों को फिर से निलंबित करने के लिए और सेल निलंबन के प्रत्येक 2 एमएल के लिए 30 μL मोती जोड़ते हैं। ढक्कन को सुरक्षित करें।
  5. एंड-ओवर-एंड रोटेटर पर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए ट्यूब को इनक्यूबेट करें। फिर ट्यूबों को चुंबकीय विभाजक पर रखें और 2 मिनट के लिए छोड़ दें।
  6. धीरे से एक ग्लास पाश्चर पाइप का उपयोग करके, सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें। चुंबक से ट्यूब को हटा दें, ट्यूब में बेसल माध्यम के 3 एमएल जोड़कर मोती-सेल गोली को फिर से निलंबित करें, और कई बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  7. 2 मिनट के लिए चुंबकीय विभाजक पर ट्यूब को बदलें, और फिर ग्लास पाश्चर पाइप का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाले को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें।
  8. कम से कम 4 बार धोएं (चरण 4.6-4.7) जब तक कि सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट न दिखाई दे।
  9. अंतिम धोने के बाद, 3 एमएल पूर्ण विकास माध्यम में मोती-सेल गोली को फिर से निलंबित करें और इसे टी -75 फ्लास्क में स्थानांतरित करें। पूर्ण विकास माध्यम के 7 एमएल जोड़ें, और एक ह्यूमिडिफायर 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  10. अगले दिन एचबीएसएस / सीएमएफ के साथ कोशिकाओं को धोएं, फिर 10 एमएल ताजा पूर्ण माध्यम जोड़ें। मीडिया को हर 2-3 दिनों में 10 एमएल ताजा पूर्ण माध्यम से बदलें जब तक कि 90-95% कंफ्लुएंट न हो।
    नोट: एक बार जब कोशिकाएं ~ 90-95% कॉन्फ्लुएंट होती हैं, जिसमें ~ 3-4 दिन लगते हैं, तो संस्कृति माध्यमिक इम्यूनोबीड अलगाव के लिए तैयार होती है।

5. द्वितीयक इम्यूनोबीड अलगाव और एंडोथेलियल कोशिकाओं का संवर्धन।

  1. 10 एमएल एचबीएसएस / सीएमएफ के साथ दो बार अनुगामी एंडोथेलियल कोशिकाओं को धोएं। ट्रिप्सिन-मुक्त सेल डिटेचमेंट समाधान के 2 एमएल जोड़ें और ~ 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। सुनिश्चित करें कि सभी कोशिकाओं को फ्लास्क से उठाया गया है।
  2. सेल डिटेचमेंट समाधान को बेअसर करने और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए बेसल माध्यम के 8 एमएल जोड़ें। कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए 400 x g पर स्पिन करें।
  3. एक ग्लास पाश्चर पाइप का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और बेसल माध्यम के 2 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। 2 एमएल सेल सस्पेंशन को 5 एमएल गोल नीचे पॉलीस्टाइनिन ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. भंवर एंटी-सीडी -102 लेपित मोतियों को कुछ सेकंड के लिए मोतियों को फिर से निलंबित करने और सेल निलंबन के प्रत्येक 2 एमएल के लिए 30 μL मोती जोड़ने के लिए। ढक्कन को सुरक्षित करें।
  5. ट्यूब को कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए एंड-ओवर-एंड रोटेटर पर इनक्यूबेट करें। ट्यूबों को चुंबकीय विभाजक पर रखें और 2 मिनट के लिए छोड़ दें। फिर धीरे से एक ग्लास पाश्चर पाइप का उपयोग करके सुपरनैटेंट को एस्पिरेट करें।
  6. चुंबक से ट्यूब को हटा दें, ट्यूब में बेसल माध्यम के 3 एमएल जोड़कर मोती-सेल गोली को फिर से निलंबित करें, और कई बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  7. ग्लास पाश्चर पाइप का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाले को सावधानीपूर्वक घुमाने से पहले चुंबकीय विभाजक पर ट्यूब को 2 मिनट के लिए बदलें।
  8. सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट दिखाई देने तक 4 बार या उससे अधिक बार धोएं (चरण 5.6-5.7)।
  9. अंतिम धोने के बाद, 3 एमएल पूर्ण विकास माध्यम में मोती-सेल गोली को फिर से निलंबित करें और इसे टी -75 फ्लास्क में स्थानांतरित करें। 7 एमएल पूर्ण विकास माध्यम जोड़ें, और एक ह्यूमिडिफायर 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  10. अगले दिन एचबीएसएस / सीएमएफ के साथ कोशिकाओं को धोएं, फिर 10 एमएल ताजा पूर्ण माध्यम जोड़ें। मीडिया को हर 2-3 दिनों में 10 एमएल ताजा पूर्ण माध्यम से बदलें जब तक कि 90-95% कंफ्लुएंट न हो। एक बार जब एंडोथेलियल कोशिकाएं पूरी तरह से कंफ्लुएंट हो जाती हैं, तो वे प्रयोग के लिए तैयार होती हैं। कोशिकाओं को मार्ग छह से परे उपयोग नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि सेनेसेंस हो सकता है, और अन्य सेल प्रकार ले सकते हैं।

6. फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एंडोथेलियल सेल सतह मार्करों की पुष्टि

  1. कोशिकाओं को अलग करने के लिए ट्रिप्सिन-मुक्त सेल डिटेचमेंट समाधान का उपयोग करने के बाद, सेल पेलेट को 1 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल में पुन: निलंबित करें और सेल निलंबन के एलिकोट 100 μ एल को तीन1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में बदलें, जिन्हें 1, 2 और 3 लेबल किया गया है।
  2. 1 x PBS के 1 mL के साथ कोशिकाओं को धोएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज। वॉश बफर निकालें और दो बार दोहराएं।
  3. 1x PBS के 100 μL में सेल गोली को पुन: निलंबित करें। ट्यूब 1 में, संयुग्मित एंटी-माउस सीडी -31 (पीईसीएएम -1) एंटीबॉडी (उदा: फाइकोएरिथ्रिन (पीई) एंटी-माउस सीडी -31 एंटीबॉडी) के 1 μL और संयुग्मित एंटी-माउस सीडी -102 (ICAM-2) के 1 μL जोड़ें (उदा: फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) एंटी-माउस सीडी 102 एंटीबॉडी) (सामग्री की तालिका देखें)। ट्यूब 2 में, उपयुक्त आइसोटाइप नियंत्रण जोड़ें। ट्यूब नंबर 3 बिना दाग के रहेगा।
  4. ट्यूबों को बर्फ पर और अंधेरे में 30-45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. प्रत्येक ट्यूब में पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें, धीरे से भंवर, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। धो लें और तीन बार दोहराएं। पीबीएस के 500 μL में अंतिम गोली को पुन: निलंबित करें।
  6. विश्लेषण तक ट्यूबों को एल्यूमीनियम पन्नी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर कवर रखें। विश्लेषण 3-4 घंटे के भीतर पूरा करने की आवश्यकता है।
  7. साइटोमीटर का उपयोग करके प्रवाह डेटा प्राप्त करें। सेल ऑटोफ्लोरेसेंस के अनुसार लेजर वोल्टेज को ठीक से सेट करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक बिना दाग वाले नमूने का उपयोग करें। आगे बिखरे हुए भूखंड और साइड स्कैटर प्लॉट के साथ गेट कुल सेल आबादी।
    नोट: डबल्स को छोड़कर, सीडी 31 + सीडी 102 + डबल-पॉजिटिव कोशिकाओं को एंडोथेलियल कोशिकाओं के रूप में परिभाषित किया गया है।

Representative Results

यह सरल प्रोटोकॉल 7-10 दिनों में माउस माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करने, कल्चर करने और चिह्नित करने की अनुमति देता है (चित्रा 1)। संक्षेप में, प्लेटिंग से पहले फेफड़ों को एक्साइज और एंजाइमेटिक रूप से पचाया जाता है। चढ़ाना के तुरंत बाद, एंडोथेलियल कोशिकाएं और अन्य कोशिकाएं सेल कल्चर मीडिया में तैरेंगी। अगले दिन तक, एंडोथेलियल कोशिकाओं और दूषित कोशिकाओं को प्लेट का पालन किया जाएगा, और मलबे और फ्लोटिंग कोशिकाओं को हटाने के लिए एक जोरदार धोने की तकनीक की आवश्यकता होती है। एक बार जब कोशिकाएं संगम पर पहुंच जाती हैं, तो पहला इम्यूनोबीड चयन किया जाता है। सीडी -31-पॉजिटिव कोशिकाएं तब एक कोबलस्टोन गठन (चित्रा 2) में बढ़ने लगती हैं। जिन कोशिकाओं में कोबलस्टोन आकृति विज्ञान नहीं होता है या अधिक वृद्धि होती है, वे दूषित होते हैं और एंडोथेलियल कोशिकाएं 13,14,15,16 नहीं होती हैं।

एंडोथेलियल कोशिकाओं की शुद्धता बढ़ाने के लिए एंटी-सीडी -102 लेपित मोतियों का उपयोग करके एक दूसरा इम्यूनोबीड चयन किया जाता है, जो अन्य प्रोटोकॉल13,16 के समान है। कोशिकाएं जो दूसरे इम्यूनोबीड चयन के बाद संगम में बढ़ गई हैं, उनका उपयोग प्रयोग के लिए किया जा सकता है। प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) का उपयोग यह पुष्टि करने के लिए किया जाता है कि सेल आबादी सीडी -31- और सीडी -102-पॉजिटिव है (चित्रा 3)।

इन एंडोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग तब कई अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जैसे कि एंडोथेलियल भड़काऊ मार्गों और एंडोथेलियल बैरियर फ़ंक्शन का अध्ययन करना। उदाहरण के लिए, यह देखा गया कि म्यूरिन साइटोमिक्स (आईएफएनजी, टीएनएफए, और आईएल 1 बी, प्रत्येक 10 एनजी / एमएल पर) के साथ उपचार ने एंडोथेलियल कोशिकाओं द्वारा आईएल -6 उत्पादन को प्रेरित किया (चित्रा 4 ए)। तब इलेक्ट्रिक सेल-सब्सट्रेट प्रतिबाधा संवेदन (ईसीआईएस) 18 का उपयोग मुराइन फेफड़े एंडोथेलियल सेल मोनोलेयर में विद्युत प्रवाह के प्रवाह के लिए ट्रांसेंडोथेलियल प्रतिरोध (टीईआर) को मापने के लिए किया गया था। यह देखा गया कि साइटोमिक्स के साथ इलाज की गई कोशिकाओं ने टीईआर (चित्रा 4 बी) में कमी का नेतृत्व किया, जो एंडोथेलियल पारगम्यता में वृद्धि के अनुरूप है। ये उदाहरण बताते हैं कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके तैयार एंडोथेलियल कोशिकाएं विभिन्न एंडोथेलियल प्रक्रियाओं का अध्ययन कैसे कर सकती हैं। यह जांचकर्ताओं को एंडोथेलियल कोशिकाओं में रुचि के जीन का अधिक आसानी से अध्ययन करने की अनुमति देता है, उपलब्ध नॉकआउट और ट्रांसजेनिक चूहों की बढ़ती संख्या को देखते हुए।

Figure 1
चित्रा 1: मुराइन फेफड़े एंडोथेलियल कोशिकाओं के अलगाव के लिए योजनाबद्ध। 5-7 दिन के नवजात पिल्लों के फेफड़ों को काटा और काटा जाता है। कीमा ऊतक को कोलेजनेज के साथ एंजाइमेटिक रूप से पचाया गया था I. सेलुलर निलंबन को 2-3 दिनों के लिए चढ़ाया और सुसंस्कृत किया जाता है। कोशिकाएं तब सीडी -31-लेपित मोतियों के साथ प्राथमिक इम्यूनोबीड अलगाव से गुजरती हैं और अगले 3-4 दिनों के लिए सुसंस्कृत होती हैं। सीडी -102-लेपित मोतियों के साथ दूसरा इम्यूनोबीड अलगाव 2-3 दिनों की खेती से पहले। कोशिकाएं अब कार्यात्मक प्रयोग के लिए तैयार हैं। छवि एक वेब-आधारित चित्रण उपकरण, बायोरेंडर द्वारा बनाई गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: मुराइन फेफड़े एंडोथेलियल कोशिकाओं की आकृति विज्ञान। सुसंस्कृत मुराइन फेफड़े एंडोथेलियल कोशिकाएं एक कोबलस्टोन आकृति विज्ञान प्रदर्शित करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एंडोथेलियल कोशिकाओं का विश्लेषण । (ए) सभी घटनाओं को फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) और साइड स्कैटर (एसएससी) के डॉट प्लॉट पर देखा जाता है। (बी) एंडोथेलियल-विशिष्ट सेल सतह एंटीजन सीडी -31 और सीडी -102 दोनों के लिए मुराइन फेफड़े एंडोथेलियल कोशिकाओं के सकारात्मक होने की स्कैटर प्लॉट पुष्टि। (ग) आइसोटाइप नमूने का हिस्टोग्राम और सीडी-31/सीडी-102 विशिष्ट एंटीबॉडी से सना हुआ नमूना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: साइटोमिक्स मुराइन फेफड़े एंडोथेलियल सेल आईएल -6 उत्पादन और एंडोथेलियल सेल पारगम्यता को प्रेरित करता है। सी 57बीएल / 6 चूहों से मुराइन फेफड़ों के माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को साइटोमिक्स (आईएफएनजी, टीएनएफए, और आईएल 1 बी, प्रत्येक 10 एनजी / एमएल पर) के साथ इलाज किया गया था। (ए) आईएल -6 के स्तर को तब 15 घंटे (*पी<0.01, एन = 4 कुएं / स्थिति) पर कल्चर सुपरनैटेंट में निर्धारित किया गया था। (बी) इलेक्ट्रिक सेल-सब्सट्रेट प्रतिबाधा संवेदन का उपयोग 15 घंटे से अधिक बार-बार ट्रांसेंडोथेलियल प्रतिरोध (टीईआर) को मापने के लिए किया गया था। निर्दिष्ट साइटोमिक्स को जोड़ने से तुरंत पहले डेटा को प्रतिरोध के लिए सामान्यीकृत किया गया था और विचरण के दो-तरफा विश्लेषण (एनोवा) द्वारा विश्लेषण किया गया था, जिसके बाद टुकी पोस्ट-टेस्ट19 (** पी < 0.01, एन = 4 कुएं / स्थिति) था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह सरल प्रोटोकॉल म्यूरिन फेफड़ों से उच्च शुद्धता वाले एंडोथेलियल कोशिकाओं को उधार देता है। यद्यपि शुरू से अंत तक का कुल समय 7-10 दिन है, लेकिन हैंड्स-ऑन समय लगभग 3-4 घंटे है। अन्य तरीकों13,14,15,16 की तुलना में, वर्तमान प्रोटोकॉल सुव्यवस्थित है, उपज और शुद्धता से समझौता किए बिना आवश्यक कदम रखता है।

यह इस प्रोटोकॉल के कुछ महत्वपूर्ण पहलुओं पर ध्यान देने योग्य है। सबसे पहले, वयस्क चूहों के बजाय नवजात पिल्ले का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। हमारे अनुभव में, वयस्क चूहों से एंडोथेलियल कोशिकाएं नवजात पिल्ले की कोशिकाओं के रूप में आसानी से प्रसार नहीं करती हैं, और वे फाइब्रोब्लास्ट या मेसेनकाइमल स्टेम सेल15,16 के अनुरूप स्पिंडल जैसी आकृति विज्ञान वाली कोशिकाओं द्वारा आसानी से ओवररन हो जाती हैं। अंतर के लिए एक संभावित स्पष्टीकरण यह है कि फेफड़ों का विकास नवजात चूहों में वायुकोशीय चरण में है, जो एंडोथेलियल कोशिकाओंके अधिक तेजी से प्रसार की विशेषता है। 21 साल की उम्र के साथ कुछ हद तक सेनेसेंस भी हो सकता है। एंजाइमेटिक पाचन समय भी सटीक होना चाहिए, क्योंकि अंडरडाइजेशन से कम उपज एकल-कोशिका निलंबन हो सकता है। इसके विपरीत, अधिक पाचन से कोशिका मृत्यु की पर्याप्त मात्रा हो सकती है। हमने निर्धारित किया है कि कोलेजनेस पाचन के लिए इष्टतम समय 45 मिनट निर्धारित किया गया है। इसके बाद एक कुंद प्रवेशनी के साथ यांत्रिक पृथक्करण होता है। एंजाइमेटिक पाचन के दौरान इंट्राट्रेकियल कोलेजनेस को स्थापित करना भी14,15 बताया गया है; हालांकि, यह समय लेने वाला हो सकता है और वर्तमान काम के दौरान अपूर्ण पाचन की ओर जाता है। अंत में, कुछ प्रोटोकॉल एंजाइमेटिक पाचन13,16 के तुरंत बाद सीधे इम्यूनोबीड अलगाव के लिए आगे बढ़ते हैं। हमने पाया है कि इम्यूनोबीड चयन करने से पहले एक या दो दिन के लिए माध्यम में विघटित फेफड़े से कोशिकाओं का संवर्धन करने से व्यवहार्य और अत्यधिक शुद्ध एंडोथेलियल कोशिकाओं की उपज में काफी वृद्धि होती है। यह ऊतक संवर्धन माध्यम में पृथक कोशिकाओं को प्राप्त करने की गति से संबंधित हो सकता है, जिससे चूहों से हटाने के बाद शुरुआती चरणों में कम कोशिका मृत्यु होती है, उच्च प्रारंभिक सीडिंग घनत्व, और एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए पहले इम्यूनोबीड अलगाव से पहले पालन और प्रसार करने का समय।

माउस एंडोथेलियल कोशिकाओं की तैयारी और विश्लेषण की सीमाएं इस प्रकार हैं। प्रत्येक माउस केवल सीमित संख्या में कोशिकाएं प्रदान करता है जिनका उपयोग कुछ अंशों के भीतर किया जाना चाहिए। इस समस्या को कई चूहों से फेफड़ों के पाचन को इकट्ठा करके दूर किया जा सकता है। दुर्भाग्य से, हम भविष्य के उपयोग के लिए कोशिकाओं को क्रायोप्रिजर्व और पिघलाने के अपने प्रयासों में असफल रहे हैं। इन सीमाओं के बावजूद, माउस एंडोथेलियल कोशिकाओं के कुछ फायदे हैं। वे सहायक हो सकते हैं, विशेष रूप से उन स्थितियों में जहां मानव एंडोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग नहीं किया जा सकता है (जैसे, जीन नॉकआउट), जब मानव कोशिकाओं के साथ परिणामों की पुष्टि करने के लिए पूरक अध्ययन की आवश्यकता होती है, या जब विभिन्न मानव दाताओं से एंडोथेलियल कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं की विविधता प्रयोगों के बीच प्रजनन क्षमता को समस्याग्रस्त बनाती है।. आनुवंशिक रूप से समान चूहों से समरूप एंडोथेलियल सेल की आबादी प्रयोगों और स्थिर पृष्ठभूमि स्थितियों के तहत विशिष्ट जीन और मार्गों के अध्ययन के बीच प्रजनन क्षमता की अनुमति देती है।

माउस एंडोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग विभिन्न रोग प्रक्रियाओं में एंडोथेलियल सक्रियण और शिथिलता में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए कई अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एंडोथेलियल कोशिकाएं सेप्सिस में एक अभिन्न भूमिका निभाती हैं, स्थानीयकृत और प्रणालीगत सूजन को सक्रिय करने, ल्यूकोसाइट तस्करी और ऊतकों में सक्रियण को बढ़ावा देने, जमावट को विनियमित करने और एंडोथेलियल पारगम्यताको संशोधित करने में अपनी भूमिकाओं के माध्यम से लाभकारी और पैथोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं दोनों में योगदान करती हैं।. यह सरल प्रोटोकॉल व्यवहार्य, कार्यात्मक एंडोथेलियल कोशिकाएं प्रदान करता है जिनका उपयोग इन एंडोथेलियल प्रक्रियाओं में से प्रत्येक के लिए परख में किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम एनआईएच टी 32 जीएम 008440 (जेएच / ईडब्ल्यू) और एनआईएच आर 01 एआई 058106 (जेएच) द्वारा समर्थित था। हम अनुदान एनआईएच पी 30 डीके 063720 और एनआईएच एस 10 इंस्ट्रूमेंटेशन ग्रांट एस 10 1 एस 10 ओडी 021822-01 द्वारा समर्थित यूसीएसएफ परनासस फ्लो साइटोमेट्री कोर (आरआरआईडी: SCR_018206) को स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL conicals Corning Life Sciences 430829
Accutase Cell Detachment Solution Innovative Cell Technologies, Inc AT-104
BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8" Becton Disckinson 305122
BioRender.com BioRender
Blunt Cannula 15 G x 1-1/2" Covidien 8881202314
CD-102 Rat anti-mouse (3C4 (MIC2/4)) BD Biosciences 553326
CD-31 Rat anti-mouse (MEC 13.3) BD Biosciences 557355
Collagenase, Type 1 Worthington Biochemical Corp LS004194
DMEM, high glucose Gibco 11965092
Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG Invitrogen 11035
Endothelial Cell Growth Supplment EMD Millipore Corp 02-102
Falcon cell strainers (70 µm) Corning Life Sciences 352350
Fetal Bovine Serum, heat inactivated Gibco 10082-147
Fine Scissors Fine Science Tools 14060-09
Fine Scissors Fine Science Tools 14060-10
Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20B
FITC Rat Anti-mouse CD102 (3C4) BD Biosciences 557444
FITC Rat IgG2a, κ Isotype Control (R35-95) BD Biosciences 553929
Graefe Forceps Fine Science Tools 11050-10
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco 14175095
Heparin Sodium Injections (1,000 Units/mL) Medline 0409-2720-02
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma H3393
HEPES (1 M) Gibco 15630106
Nonessential amino acids (100x) Gibco 11140050
PE Rat Anti-mouse CD31 (MEC 13.3) BD Biosciences 553373
PE Rat IgG2a,  κ Isotype Control R35-95) BD Biosciences 553930
Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL, 10,000 µg/mL) Gibco 15140122
Recombinant Murine IFN-γ Peprotech 315-05
Recombinant Murine IL-1β Peprotech 211-11B
Recombinant Murine TNF-α Peprotech 315-01A
Round bottom polystyrene test tubes Corning Life Sciences 352058
Semken Forceps Fine Science Tools 11008-13
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360070
Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System, 250 mL Millipore S2GPU02RE
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit Milipore SCGP00525
Sterile syringe (10 mL) Fisher Scientific 14-955-459
Sterile syringe (20 mL) Fisher Scientific 14-955-460
T-75 cell culture flask with vent cap, CellBIND treated Corning Life Sciences 3290

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 177
प्राथमिक माउस फेफड़े एंडोथेलियल कोशिकाओं का अलगाव
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Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J.… More

Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J. Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (177), e63253, doi:10.3791/63253 (2021).

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